Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Escuela de Química y Farmacia

PROFESOR PATROCINANTE: INSTITUTO: Química FACULTAD: Ciencias

Prof. Juan Carlos Paredes G.

PROFESOR CO-PATROCINANTE: Dr. Eduardo Valenzuela F. INSTITUTO: Microbiología FACULTAD: Ciencias

“EXTRACCION, AISLAMIENTO Y ANALISIS CUALITATIVO DE POLISACÁRIDOS, TERPENOS Y PROTEINAS PRESENTES EN Flammulina velutipes”

Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al Título de Químico Farmacéutico

PERLA JANNELA PILLANCARI VARGAS VALDIVIA – CHILE 2010

Esta tesis fue realizada en el Instituto de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile, y fue financiada por el fondo de fomento al desarrollo científico tecnológico (Proyecto FONDEF DO5I10196).

AGRADECIMIENTOS Quisiera agradecer en primer lugar, a mis queridos Padres Freddi y Elvira por su amor incondicional, y por hacer posible mi formación en la Universidad como también mi importante formación valórica. Al profesor Juan Carlos Paredes por su excelente disposición y apoyo en esta tesis, ya que aunque hubieron hartos obstaculos siempre estuvo presente alentandome a seguir adelante. A Marianela por apoyarme, y por su buena disposición durante todo el trancurso de mi tesis, gracias nela. A la profesora Monica Quiñones por su buena disposición y gran carisma. A Joel Pardo por su ayuda desinteresada no solo en esta tesis sino durante todo mi transcurso en la Universidad. A mi querido hermano Fabián, por darme tu alegría y compañía cada día. A mi pololo Marco Antonio y su familia, muchas gracias por todo el amor, apoyo y alegría que me han brindado. A mis amigos del alma, Natalia, Tiare y Adrian, gracias por estar presentes en todo momento, en las buenas y en las malas, su amistad será eterna. A la Universidad por entregarme la oportunidad de desarrollarme no solo en los estudios sino en la música y artes plásticas. A mis profesores de artes en general quienes permitieron que complemente mi vida universitaria con mi pasión por la música y las artes plásticas. A todas las personas que siempre me han estado apoyando durante todo el transcurso de mi vida universitaria, quienes han dejado una huella en mi corazón.

i

INDICE DE CONTENIDOS

1.

RESUMEN………………………………………………………………………..

1

SUMMARY……………………………………………………………………….. 2 2.

INTRODUCCION………………………………………………………………...

3

2.1.

Generalidades de los Hongos……………………………………………….....

3

2.2.

Hongos comestibles……………………………………………………………..

3

2.3.

Ultraestructura de los Hongos……………………………………………….....

4

a) Carbohidratos…………………………………………………………………. 4 b) Proteínas: Aminoácidos…………………………….................................... 10 c)Lípidos: Terpenos……………………………………………………………... 11 2.4.

Análisis instrumental……………………………………………………………

12

2.5.

Flammulina velutipes……………………………………………………………

12

3.

MATERIALES Y METODOS…………………………………………………...

16

3.1.

Materiales………………………………………………………………………..

16

3.1.1.

Material biológico………………………………………………………………..

16

3.1.2.

Reactivos…………………………………………………………………………. 16

3.1.3.

Equipos……………………………………………………………………………

3.1.4.

Otros………………………………………………………………………………. 17

3.2.

Métodos………………………………………………………………………….. 17

3.2.1.

Obtención de Flammulina velutipes……………………………………………

18

3.2.2.

Tratamiento previo de micelio de Flammulina velutipes…………………….

18

3.2.3.

Fraccionamiento de las paredes celulares y Aislamiento de β-D glucanos 18

17

ii

y quitina en micelio y cuerpo fructífero………………………………………... 3.2.4.

Obtención de quitosano a partir de la fracción PF1………………………..... 20

3.2.5.

Precipitación alcalina del quitosano soluble…………………………………..

3.2.6.

Análisis instrumental…………………………………………………………….. 21

20

a) Espectroscopia infrarroja de las fracciones PF1, PF2 y PF3……………. 21 3.2.7.

Obtención de hidratos de carbono a partir de las fracciones F1 y F2……..

21

Estimación de pesos moleculares de los precipitados de las fracciones F1 22 3.2.8. y F2……………………………………………………………………………….. 3.2.9.

Obtención de monómeros………………………………………………………

23

3.2.10. Análisis cualitativo de carbohidratos…………………………………………..

23

a) Reacciones de Identificación para carbohidratos presentes en 23 precipitados hidrolizados y no hidrolizados de micelio y cuerpo fructífero... b) Cromatografía de capa fina (TLC)………………………………………….. 24 3.2.11. Obtención de terpenos de las fracciones FA1 y FA2 de micelio y cuerpo 25 fructífero………………………………………………………………………….. 3.2.12. Obtención de terpenos de cuerpo fructífero puro…………………………..

25

3.2.13. Cromatografía capa fina de terpenos de las fracciones FA1 y FA2 ( de 26 micelio y cuerpo fructífero), FA3,FA4…………………………………………. 3.2.14. Cromatografía

de

gases

(fracción

FA1

de

cuerpo 26

fructífero)………………………………………………………………………… 3.2.15. Obtención de la fracción proteica………………………………………………

26

3.2.16. Análisis cualitativo de la fracción proteica……………………………………

27

a) Reacciones de Identificación………………………………………………..

27

iii

b) Cromatografía capa fina de aminoácidos……………………………….....

27

4.

RESULTADOS…………………………………………………………………..

29

4.1.

Aislamiento del complejo β-D- glucanos- quitina en micelio y cuerpo 29 fructífero…………………………………………………………………………..

4.2.

Análisis instrumental…………………………………………………………….. 29 a) Espectroscopia infrarroja del complejo β-D- glucanos- quitina………….. 29

4.3.

Obtención de quitosano a partir de la fracción PF1………………………….

4.4.

Análisis instrumental…………………………………………………………….. 31 a) Espectroscopia infrarroja de quitina (fracción PF2)

30

y quitosano 31

(fracción PF3)……………………………………………………………………. 4.5.

Obtención de hidratos de carbono a partir de las fracciones F1 y F2……..

33

4.6.

Estimación de pesos moleculares de los precipitados de las fracciones F1 34 y F2………………………………………………………………………………..

4.7.

Análisis cualitativo de carbohidratos…………………………………………..

36

a) Reacciones de Identificación para carbohidratos presentes en 36 precipitados hidrolizados y no hidrolizados de micelio y cuerpo fructífero... b) Cromatografía de capa fina (TLC)………………………………………….. 38 4.8.

Identificación de proteínas en las fracciones F1 y F2 de micelio y cuerpo 42 fructífero………………………………………………………………………….. a) Reacciones de identificación………………………………………………..

42

b) Espectroscopia infrarroja de precipitados no hidrolizados de las 42 fracciones F2 de micelio y cuerpo fructífero…………………………………..

iv

4.9.

Extracción de terpenos de cuerpo fructífero……………………………….....

44

4.10.

Cromatografía capa fina de terpenos (fracciones FA1 y FA2 de micelio y 44 cuerpo fructífero, FA3,FA4)……………………………………………………..

4.11.

Cromatografía de gases (fracción FA1 cuerpo fructífero)…………………... 45

4.12.

Análisis cualitativo de la fracción proteica FF1 de cuerpo fructífero…….....

46

a) Reacciones de identificación………………………………………………..

46

b) Cromatografía capa fina de aminoácidos……………………………….....

47

5.

DISCUSION………………………………………………………………………

49

6.

CONCLUSION…………………………………………………………………… 55

7.

BIBLIOGRAFIA……………………………………………………………….....

56

8.

ANEXOS………………………………………………………………………….

64

v

INDICE DE FIGURAS Figura 1.

Estructura Beta- Glucano

6

Figura 2.

Estructura quitina

6

Figura 3.

Representación esquemática de las cadenas de a) quitina totalmente 7 acetilada y b) quitosano totalmente desacetilado

Figura 4.

Galactomanano guaran

8

Figura 5.

Una porción (GGMM) del glucomanano. La segunda glucosa tiene un 9 grupo acetato

Figura 6.

Estructura del aminoácido alanina.

10

Figura 7.

Flammulina velutipes (enokitake).

13

Figura 8.

Esquema de fraccionamiento de las paredes celulares y aislamiento 19 de β-D- glucanos y quitina en micelio y cuerpo fructífero de Flammulina velutipes.

Figura 9.

Fracción PF1 (complejo quitina-β-D-glucanos) de: a) micelio

b) 20

Cuerpo fructífero. Figura 10.

Esquema de estimación de pesos moleculares de los precipitados de 22 las fracciones F1 y F2.

Figura 11.

Espectro infrarrojo fracción PF1 (complejo β-D-glucanos- quitina) 29 micelio

Figura 12.

Espectro infrarrojo fracción PF1 cuerpo fructífero

(complejo β-D-glucanos- quitina) 30

vi

Figura 13.

a) precipitado F1 de cuerpo fructífero. b) precipitado F2 de cuerpo 34 fructífero.

Figura 14.

Cromatoplaca de celulosa revelada con Ftalato de anilina para 39 comparar la presencia azucares simples entre los precipitados no hidrolizados de las fracciones F1 y F2 de micelio (F1 m, F2 m) y cuerpo fructífero (F1 c, F2 c) versus los precipitados hidrolizados de las fracciones F1 y F2 de micelio (F1 mH, F2 mH) y cuerpo fructífero (F1 cH, F2 cH)

Figura 15.

Cromatoplaca de celulosa revelada con Ftalato de Anilina usada para 41 identificar azucares en muestras de precipitados hidrolizados de las fracciones F1 y F2 de micelio (PF1h M, PF2h M) y cuerpo fructífero (PF1h C, PF2h C), comparada con patrones puros

Figura 16.

Cromatoplaca de silica gel revelada con el revelador MnCl2/ MeOH/ 45 H2SO4, para identificar terpenos en las fracciones apolares: a) Solubles en Cloroformo (FA1 y FA2 de micelio y cuerpo fructífero). b) solubles en Diclorometano (FA3 de cuerpo fructífero) y Acetato de Etilo (FA4 de cuerpo fructífero)

Figura 17.

a) Cromatograma de la fracción FA1 de cuerpo fructífero, por 46 cromatografía gas-masas. b) Espectro de Masas de la fracción FA1 de cuerpo fructífero a un tiempo de retención 26,13 minutos.

vii

Figura 18.

Cromatoplaca de celulosa revelada con ninhidrina usada para 47 identificar aminoácidos presentes en la fracción proteica FF1 de cuerpo fructífero comparada con patrones puros.

Figura 19.

TLC Paralela en placa de celulosa revelada con ninhidrina usada 48 para identificar la presencia de aminoácidos superpuestos en la fracción FF1 de cuerpo fructífero.

ANEXOS Figura 1.

Espectro infrarrojo de la fracción PF2 de micelio.

66

Figura 2.

Espectro infrarrojo de la fracción PF2 de cuerpo fructífero

66

Figura 3.

Espectro infrarrojo de la fracción PF3 de micelio

67

Figura 4.

Espectro infrarrojo de la fracción PF3 de cuerpo fructífero

67

Figura 5.

Espectro infrarrojo de la fracción F2 de micelio

68

Figura 6.

Espectro Infrarrojo de la fracción F2 de cuerpo fructífero

68

viii

INDICE DE TABLAS Tabla 1.

Porcentaje de rendimiento del quitosano obtenido a

partir de la 31

fracción PF1 de micelio y de cuerpo fructífero Tabla 2.

Número de bandas de absorción y posición en el espectro infrarrojo de 32 la fracción PF2 (quitina libre de β-D-glucanos) de micelio

Tabla 3.

Número de bandas de absorción y posición en el espectro infrarrojo de 32 la fracción PF2 (quitina libre de β-D-glucanos) de cuerpo fructífero

Tabla 4.

Número de bandas de absorción y posición en el espectro infrarrojo de 32 la fracción PF3 (quitosano) de micelio

Tabla 5.

Número de bandas de absorción y posición en el espectro infrarrojo de 33 la fracción PF3 (quitosano) de cuerpo fructífero

Tabla 6.

Cantidad de precipitados de hidratos de carbono obtenidos de las 34 fracciones F1 y F2 de micelio y cuerpo fructífero

Tabla 7.

Cantidad de muestra retenida y filtrada de micelio y cuerpo fructífero 35 utilizando una membrana cuyo tamaño de poro correspondía a 10 KD.

Tabla 8.

Cantidad de muestra retenida y filtrada de micelio y cuerpo fructífero 35 utilizando una membrana cuyo tamaño de poro correspondía a 3 KD

Tabla 9.

Resultados de las reacciones de identificación de hidratos de carbonos 37 para precipitados no hidrolizados de las fracciones F1 y F2 de micelio y cuerpo fructífero.

ix

Tabla 10.

Resultados de las reacciones de identificación de hidratos de 38 carbonos para precipitados hidrolizados de las fracciones F1 y F2 de micelio y cuerpo fructífero

Tabla 11.

Distancia de migración (Rf) de estándares puros de glúcidos y de 40 precipitados hidrolizados de las fracciones F1 y F2 de micelio y cuerpo fructífero

Tabla 12

Número de bandas de absorción y posición en el espectro infrarrojo 43 de la fracción F2 de micelio

Tabla 13.

Número de bandas de absorción y posición en el espectro infrarrojo 43 de la fracción F2 de cuerpo fructífero

1

RESUMEN Desde tiempos ancestrales se han usado los hongos comestibles no tan sólo con un fin alimenticio, sino también para mantener la salud y promover la longevidad. La gran diversidad de propiedades medicinales que se le han atribuido a Flammulina velutipes hacen necesario la identificación clara y precisa de sus compuestos biológicamente activos, entre los que se encuentran: polisacáridos, lípidos y proteínas. En el presente trabajo de tesis se aislaron y analizaron cualitativamente quitina, quitosano, polisacáridos, proteínas y terpenos extraídos desde micelio y cuerpo fructífero de F. velutipes. La extracción fue a través de tratamiento químico con solventes de diferente polaridad permitiendo, de esta manera, separar compuestos apolares (terpenos) de compuestos polares (polisacáridos y proteínas). Se obtuvo quitosano

mediante

tratamiento de quitina en medio alcalino (NaOH). El análisis cualitativo consistió en la identificación de biomoléculas por TLC y espectroscopia. La TLC permitió identificar la presencia de carbohidratos, proteínas y terpenos utilizando reveladores y estándares. Respecto al análisis espectroscópico, se identificaron bandas características de quitina y quitosano utilizando FTIR, y también se identificó la presencia de una molécula monoterpénica utilizando GC-MS.

2

SUMMARY. Edible mushrooms have, since ancient times, been consumed with the goals of maintaining health and promotion of longevity. The diversity of medicinal properties that has been attributed to Flammulina velutipes, requires the clear and precise identification of its biological active compounds, which include: polysaccharides, lipids and proteins.In current thesis work, chitin, chitosan, polysaccharides, proteins and terpenes were extracted from micelio and fruit body of F. velutipes, then isolated and analized qualitatively. The extraction was across chemical treatment with solvents of different polarity allowing separation of apolar compounds (terpenes and chitin) from polar compounds (polysaccharides and proteins). The chitosan was obtained through alkaline treatment of chitin (NaOH). The qualitative analysis consisted of the biomolecules identification through the use of TLC and spectroscopy methods. The TLC allowed the identification of the presence of carbohydrates, proteins and terpenes using visualizing reagents and standards. With regard to the spectroscopic analysis, typical bands were identified of chitin and chitosan using FTIR, and the presence of a monoterpenic molecule through the use of GC-MS.

3

2. INTRODUCCION

2.1. Generalidades de los Hongos. Los hongos son microorganismos terrestres y acuáticos que forman un reino viviente totalmente independiente de los vegetales y no muy relacionado con los animales, por lo que actualmente se les incluye en el Reino llamado “Fungi” o “Mycota” (Valenzuela, 1998). Se diferencian del resto de los organismos vivos en su estructura microscópica a base de hifas, en su carácter perenne y en sus procesos de reproducción a través de esporas sexuales y asexuales (Alexopoulos, et al., 1996; Guzmán, 2003).Este amplísimo filum tiene representantes prácticamente en todos los hábitats de la tierra y muchos hongos son de gran importancia médica o económica para el hombre. Se han estimado que podrían existir 1,5 millones de especies en este reino (Hawsworth, 1991, 2001), muchas de las cuales se cultivan o recolectan para alimento (Chang & Miles, 2004).

2.2. Hongos comestibles. Desde tiempos ancestrales se han usado los hongos con un fin alimenticio. Se estima que cerca de 7,000 especies poseen varios grados de comestibilidad, y más de 3,000 especies de 31 géneros se consideran como las principales comestibles (Chang & Miles, 2004). En Chile existen aproximadamente 53 especies de hongos comestibles (autóctonos y alóctonos), que pertenecen a

la División Basidiomycota, dentro de los cuales se

encuentra Flammulina velutipes (Valenzuela, 2003).

4

2.3. Ultraestructura de los Hongos. En su estructura microscópica, los hongos presentan muchos aspectos comunes a pesar de su variedad morfológica. La pared celular es el

principal componente

estructural y ocupa el primer lugar, ya que constituye una cubierta rígida que protege al citoplasma de las variaciones osmóticas del medio y proporciona protección frente a factores ambientales adversos (Mahadevan & Tatum, 1965; Villanueva, 1966). La pared celular de los hongos está compuesta por carbohidratos, proteínas, lípidos, pigmentos y sales minerales en orden decreciente, siendo los carbohidratos los que constituyen, por si solos, más del 80% del peso seco de la pared celular (Prieto, 1992).

a) Carbohidratos. Los carbohidratos constituyen la forma principal de almacenamiento de energía y son elementos estructurales de las células. (Lehninger, 1985).

Clasificación de los carbohidratos. Los carbohidratos se clasifican por lo general en dos grupos: simples y complejos. Los azúcares simples, o monosacáridos, son aquellos carbohidratos que no se pueden convertir por hidrólisis en azúcares más pequeños, estos pueden a su vez clasificarse en aldosas o cetosas dependiendo de la naturaleza del grupo carbonilo

(Mc Murry

2000). Dentro de los monosacáridos el que se encuentra en mayor proporción en los hongos es la glucosa, acompañada de galactosa y manosa. Pueden encontrarse también cantidades variables de otros monosacáridos menos abundantes y restringidos a determinados grupos taxonómicos, como ramnosa, xilosa, arabinosa, ribosa y fucosa.

5

Los carbohidratos complejos están formados por dos o más azúcares simples enlazados; pueden ser, disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. Entre los polisacáridos más comunes en los hongos se encuentran los beta-glucanos, la quitina y los galactomananos.

Beta-Glucano. Los beta-glucanos son polisacáridos formados por monómeros de β-D-Glucosa como la celulosa, pero con un enlace 1β→3 por cada tres o cuatro enlaces 1β→4 (Figura 1). Posiblemente es el tipo de polímero más ampliamente distribuido en las paredes celulares fúngicas, y cuando está presente representa entre un 15 y un 30% de los polisacáridos de la pared. Es insoluble en álcali y parece estar íntimamente ligado a la quitina (Wessels & Sietsma, 1981). Tanto sus propiedades fisicoquímicas como sus propiedades biológicas dependen de su estructura, la longitud de sus cadenas, y su organización tridimensional. Dentro de los Beta-glucanos, los homopolímeros pertenecientes al grupo de los Dglucano conforman mayoritariamente la pared celular de los hongos, principalmente los (1→3) y (1→6)-β-glucanos (Klis et al., 2006; Lesage & Bussey 2006). Estos polisacáridos pueden existir también en forma libre como exopolisácaridos, y unidos estructuralmente a proteínas, lípidos y otros

polisacáridos presentes en la pared

celular de los hongos (Williams, 1997; Klis et al., 2006,). Se considera que los beta-glucanos poseen propiedades revitalizantes, actúan como antiinflamatorios, protegen contra la radiación UV y contra el envejecimiento, poseen efectos anti-acné y antiarrugas (Gautier et al., 2008).

6

Figura 1. Estructura Beta-Glucano.

Quitina. La quitina fue aislada por primera vez por Braconnot en 1811, a partir de hongos superiores, y por su origen la denominó “fungina” (Braconnot, 1811). Es uno de los biopolímeros mas abundantes y se encuentra mayoritariamente como polisacárido estructural en conchas de crustáceos y muchos hongos (Heux et al., 2000). Este polímero está compuesto por aminoazúcares unidos entre sí por enlaces glicosídicos β (1→4) formando una cadena lineal de unidades de N-acetil-2-amino-2desoxi-D-glucosa (Figura 2) algunas de las cuales se encuentran desacetiladas (Prieto, 1992).

Figura 2. Estructura Quitina.

La quitina en su forma natural es insoluble en solventes acuosos diluidos y en la mayoría de los disolventes comunes.

7

Se argumenta que la quitina natural posee un grado de acetilación, DA (fracción del total de unidades glucosídicas que están acetiladas), de 0.66, es decir, que una de cada tres de sus unidades se encuentran desacetiladas (Peniche, 2006). Cuando la quitina es parcialmente desacetiliada (DA