UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA ELABORACIÓN DE UNA CURVA DE

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

ELABORACIÓN DE UNA CURVA DE CALIBRACIÓN PARA PERFIL DE AMINOÁCIDOS EN PASTA DE SOYA A TRAVÉS DEL MÉTODO DE ESPECTROSCOPIA DE REFLECTANCIA EN EL INFRARROJO CERCANO (NIRS).

Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar el Título de Médico Veterinario Zootecnista

Autora:

Diana Patricia Figueroa Lafuente

Tutora:

Dra. Alexandra del Pilar Naranjo Herrera

Quito, Septiembre 2014.

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DEDICATORIA

Principalmente a Dios por ser mi soporte, estar en cada momento de mi vida y llenarme de bendiciones.

A mi hijo Santiago Sebastián, por ser mi inspiración y la fuerza que necesito para emprender nuevos proyectos. A mi esposo Santiago, que me dió su apoyo incondicional en el transcurso de este proyecto. A mi hermana Cynthia, porque su buen ánimo me brinda alegría en momentos difíciles y a mis padres por hacer de mi una persona de bien.

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AGRADECIMIENTOS

A mi tutora, Dra. Alexandra Naranjo, por su dirección y confianza en este tema de tesis.

Agradezco de manera especial al Dr. Eduardo Aragón, por brindarme su tiempo y paciencia, además por facilitar los medios necesarios para la elaboración de este proyecto.

Al Ingeniero Jorge Grijalva por su colaboración en la parte estadística de esta tesis.

A la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia y a mis profesores, que fueron guías durante el transcurso de mi carrera y formaron parte de esta importante etapa en mi vida.

Gracias a mi familia y amigos que estuvieron pendientes del desarrollo de esta investigación.

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INDICE GENERAL RESUMEN....................................................................................................................... xvi INTRODUCCION ............................................................................................................. 1 CAPITULO I ...................................................................................................................... 3 EL PROBLEMA ............................................................................................................... 3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ..................................................................... 3 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ........................................................................... 4 SISTEMATIZACIÓN DEL PROBLEMA .................................................................... 4 OBJETIVOS .................................................................................................................. 4 JUSTIFICACIÓN .......................................................................................................... 5 CAPITULO II ..................................................................................................................... 7 MARCO TEORICO .......................................................................................................... 7 ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACIÓN ........................................................... 7 FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA. ............................................................................... 9 Soya. .......................................................................................................................... 9 Origen de la soya ................................................................................................. 10 La Soya en el Ecuador .......................................................................................... 10 Producción nacional de soya y pasta de soya .................................................. 10 Zonas principales de producción ......................................................................... 11 Pasta de soya ........................................................................................................ 11 Obtención de pasta de soya.............................................................................. 12 Composición de la pasta de soya. .................................................................. 13 Perfil nutricional de la soya integral pre cocida y la pasta de soya. ...... 15 La pasta de soya en la alimentación animal ................................................. 16 Espectroscopia de Infrarrojo Cercano (NIRS) ................................................... 17 Infrarrojo Cercano .................................................................................................. 17 Principios de la Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano ................................ 17 Bandas de absorción en el NIRS ......................................................................... 18 Instrumentación del NIRS ..................................................................................... 19 Equipos NIRS Serie Spectra Star XL .................................................................. 22 Calibración del Instrumento NIRS ....................................................................... 23 Métodos de Regresión .......................................................................................... 23 HIPÓTESIS ................................................................................................................. 24 CARACTERIZACIÓN DE LAS VARIABLES. ......................................................... 24 -

Variable independiente ............................................................................... 24

-

Variable Dependiente. ................................................................................. 24

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DEFINICIÓN DE TÉRMINOS BÁSICOS ................................................................ 25 FUNDAMENTACIÓN LEGAL ................................................................................... 26 CAPITULO III .................................................................................................................. 29 METODOLOGIA ............................................................................................................ 29 DETERMINACIÓN DE LOS MÉTODOS A UTILIZAR ......................................... 29 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN. ......................................................................... 29 TIPO DE INVESTIGACIÓN ...................................................................................... 30 De acuerdo a la intervención del investigador............................................. 30 POBLACIÓN Y MUESTREO .................................................................................... 30 -

Localización................................................................................................... 30

Características de la población ............................................................................ 31 Muestra .................................................................................................................... 31 COMPROBACIÓN DE LA HIPÓTESIS .................................................................. 31 OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES ................................................. 32 TÉCNICAS E INSTRUMENTOS DE INVESTIGACIÓN....................................... 33 Materiales de campo ............................................................................................. 33 Materiales para recolección de muestra ............................................................. 33 Procedimiento de obtención de la muestra ........................................................ 33 Materiales de laboratorio....................................................................................... 34 Cromatografía Líquida de alta Eficiencia (HPLC) ............................................. 34 Procedimiento de la Espectroscopia de Reflectancia en el Infrarrojo Cercano (NIRS) ...................................................................................................................... 34 Elaboración de la curva de calibración para el perfil de aminoácidos de la pasta de soya.......................................................................................................... 35 VALIDEZ Y CONFIABILIDAD DE LOS INSTRUMENTOS ............................... 36 TÉCNICAS DE PROCESAMIENTOS Y ANÁLISIS DE DATOS ...................... 36 CAPITULO IV ................................................................................................................. 38 RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................... 38 RESULTADOS ........................................................................................................... 38 CALIBRACIÓN NIRS ................................................................................................. 38 Discusión: .................................................................................................................... 40 PERFIL DE AMINOÁCIDOS .................................................................................... 40 ACIDO ASPARTICO.................................................................................................. 40 TREONINA .................................................................................................................. 41 SERINA........................................................................................................................ 42 ACIDO GLUTÁMICO ................................................................................................. 43 PROLINA ..................................................................................................................... 44 GLICINA ...................................................................................................................... 45

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ALANINA ..................................................................................................................... 46 VALINA ........................................................................................................................ 47 METIONINA ................................................................................................................ 48 ISOLEUCINA .............................................................................................................. 49 LEUCINA ..................................................................................................................... 50 TIROSINA.................................................................................................................... 51 FENILALANINA .......................................................................................................... 52 HISTIDINA ................................................................................................................... 53 LISINA .......................................................................................................................... 54 ARGININA ................................................................................................................... 55 TRIPTOFANO ............................................................................................................. 56 DISCUSIONES ........................................................................................................... 57 CAPITULO V .................................................................................................................. 60 CONCLUSIONES .......................................................................................................... 60 CAPITULO VI ................................................................................................................. 61 RECOMENDACIONES ................................................................................................. 61 REFERENCIAS .............................................................................................................. 62

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INDICE DE CUADROS

Cuadro Nº 1. Composición del Grano y Pasta de Soya…………

14

Cuadro Nº 2. Perfil nutricional de la soya integral pre cocida y la pasta de soya. ………………………………………………………

15

Cuadro Nº 3. Bandas de absorción de los principales componentes de los alimentos. ………………………………………

18

Cuadro Nº 4. Población......................................................

31

Cuadro Nº 5. OPERACIONALIZACIÓN DE LAS

32

VARIABLES…….. Cuadro Nº 6: Coeficientes de variación (CV%) de las variables aminoácidos para los tratamientos HPLC y NIRS.....................

39

Cuadro Nº 7. Análisis de Varianza al 5% para la variable Ácido Aspártico entre tratamientos HPLC y NIRS..............................

40

Cuadro Nº 8. Medias de la variable Ácido Aspártico obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS.........

40

Cuadro Nº 9. Análisis de Varianza al 5% para la variable Treonina entre tratamientos HPLC y NIRS...............................

41

Cuadro Nº 10. Medias de la variable Treonina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS.........

41

Cuadro Nº 11. Análisis de Varianza al 5% para la variable Serina entre tratamientos HPLC y NIRS.................................

42

Cuadro Nº 12. Medias de la variable Serina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS........

42

Cuadro Nº 13. Análisis de Varianza al 5% para la variable Ácido Glutámico entre tratamientos HPLC y NIRS……...............

43

Cuadro Nº 14. Medias de la variable Ácido Glutámico obtenidas mediante

Duncan

al

5%

entre

tratamientos

HPLC

y

NIRS.................................................................................

43

Cuadro Nº 15. Análisis de Varianza al 5% para la variable Prolina entre tratamientos HPLC y NIRS................................. Cuadro Nº 16. Medias de la variable Prolina obtenidas mediante

44

xi

Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS..........

44

Cuadro Nº 17. Análisis de Varianza al 5% para la variable Glicina entre tratamientos HPLC y NIRS..................................

45

Cuadro Nº 18. Medias de la variable Glicina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS.........

45

Cuadro Nº 19. Análisis de Varianza al 5% para la variable Alanina entre tratamientos HPLC y NIRS.……………………………………

46

Cuadro Nº 20. Medias de la variable Alanina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS........

46

Cuadro Nº 21. Análisis de Varianza al 5% para la variable Valina entre tratamientos HPLC y NIRS.................................

47

Cuadro Nº 22. Medias de la variable Valina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS.........

47

Cuadro Nº 23. Análisis de Varianza al 5% para la variable Metionina entre tratamientos HPLC y NIRS.............................

48

Cuadro Nº 24. Medias de la variable Metionina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS........

48

Cuadro Nº 25. Análisis de Varianza al 5% para la variable Isoleucina entre tratamientos HPLC y NIRS.............................

49

Cuadro Nº 26. Medias de la variable Isoleucina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS.........

49

Cuadro Nº 27. Análisis de Varianza al 5% para la variable Leucina entre tratamientos HPLC y NIRS................................

50

Cuadro Nº 28. Medias de la variable Leucina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS.........

50

Cuadro Nº 29. Análisis de Varianza al 5% para la variable Tirosina entre tratamientos HPLC y NIRS................................

51

Cuadro Nº 30. Medias de la variable Tirosina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS.........

51

Cuadro Nº 31. Análisis de Varianza al 5% para la variable Fenilalanina entre tratamientos HPLC y NIRS..........................

52

Cuadro Nº 32. Medias de la variable Fenilalanina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS.........

52

xii

Cuadro Nº 33. Análisis de Varianza al 5% para la variable Histidina entre tratamientos HPLC y NIRS...............................

53

Cuadro Nº 34. Medias de la variable Histidina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS.........

53

Cuadro Nº 35. Análisis de Varianza al 5% para la variable Lisina entre tratamientos HPLC y NIRS..................................

54

Cuadro Nº 36. Medias de la variable Lisina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS.......................

54

Cuadro Nº 37. Análisis de Varianza al 5% para la variable Arginina entre tratamientos HPLC y NIRS...............................

55

Cuadro Nº 38. Medias de la variable Arginina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS.........

55

Cuadro Nº 39. Análisis de Varianza al 5% para la variable Triptófano entre tratamientos HPLC y NIRS.............................

56

Cuadro Nº 40. Medias de la variable Triptófano obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS........

56

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INDICE DE GRAFICOS

Grafico Nº 1. Q-Q plot para las Distribuciones de Acido Aspártico HPLC (VS) Acido Aspártico NIRS.........................

41

Grafico Nº 2. Q-Q plot para las Distribuciones de Treonina HPLC (VS) Treonina NIRS................................................

42

Grafico Nº 3. Q-Q plot para las Distribuciones de Serina HPLC (VS) Serina NIRS.............................................................

43

Grafico Nº 4. Q-Q plot para las Distribuciones de Acido Glutámico HPLC (VS) Acido Glutámico NIRS.......................

44

Grafico Nº 5. Q-Q plot para las Distribuciones de Prolina HPLC (VS) Prolina NIRS....................................................

45

Grafico Nº 6. Q-Q plot para las Distribuciones de Glicina HPLC (VS) Glicina NIRS...................................................

46

Grafico Nº 7. Q-Q plot para las Distribuciones de Alanina HPLC (VS) Alanina NIRS...................................................

47

Grafico Nº 8. Q-Q plot para las Distribuciones de Valina HPLC (VS) Valina NIRS............................................................. Grafico Nº 9. Q-Q plot para

48

las Distribuciones de Metionina

HPLC (VS) Metionina NIRS................................................

49

Grafico Nº 10. Q-Q plot para las Distribuciones de Isoleucina HPLC (VS) Isoleucina NIRS.................................................

50

Grafico Nº 11. Q-Q plot para las Distribuciones de Leucina HPLC (VS) Leucina NIRS....................................................

51

Grafico Nº 12. Q-Q plot para las Distribuciones de Tirosina HPLC (VS) Tirosina NIRS...................................................

52

Grafico Nº 13. Q-Q plot para las Distribuciones de Tirosina HPLC (VS) Tirosina NIRS...................................................

53

Grafico Nº 14. Q-Q plot para las Distribuciones de Histidina HPLC (VS) Histidina NIRS.................................................

54

Grafico Nº 15. Q-Q plot para las Distribuciones de Lisina HPLC (VS) Lisina NIRS......................................................

55

xiv

Grafico Nº 16. Q-Q plot para las Distribuciones de Arginina HPLC (VS) Arginina NIRS..................................................

56

Grafico Nº 17. Q-Q plot para las Distribuciones de Triptófano HPLC (VS) Triptófano NIRS.................................................

57

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INDICE DE FIGURAS

Figura Nº1: Rangos de longitud de onda.............................

17

Figura Nº 2. Esquema básico de la instrumentación del NIRS.

19

Figura Nº 3. Esquema de las 3 configuraciones de registro de espectros NIRS..................................................................

21

Figura Nº 4. Espectro de 25 muestras de pasta de soya, correspondiente

a

la

calibración

NIRS

para

perfil

aminoácidos......................................................................

de 38

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA ELABORACIÓN DE UNA CURVA DE CALIBRACIÓN PARA PERFIL DE AMINOÁCIDOS EN PASTA DE SOYA A TRAVÉS DEL MÉTODO DE ESPECTROSCOPIA DE REFLECTANCIA EN EL INFRARROJO CERCANO (NIRS). AUTORA: Diana Figueroa. TUTOR: Dra. Alexandra Naranjo Quito, Septiembre 2014.

RESUMEN

El objetivo de este proyecto fue elaborar la curva de calibración para el perfil de aminoácidos de pasta de soya proveniente de Ecuador, Argentina y Estados Unidos; a través del equipo NIRS que se encuentra en el laboratorio de Nutrición Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia en la Universidad Central del Ecuador. Se usó 1 muestra proveniente de Ecuador, 2 de Argentina y 2 de Estados Unidos. Cada muestra fue dividida en 5 sub-muestras, dando un total de 25, de las cuales se obtuvo el perfil de aminoácidos (17 aminoácidos) mediante Cromatografía Líquida de alta Eficiencia (HPLC); estos resultados fueron incluidos al sistema del equipo NIRS, de esta manera se creó una base de datos que sirvió de referencia para la distribución de la curva. Posteriormente se analizaron las sub-muestras con el NIRS y se procedió a generar la curva de calibración. Al finalizar el proyecto se comparó estadísticamente los resultados de la Cromatografía Líquida de alta Eficiencia (HPLC), con los de la Espectroscopia de Reflectancia en el Infrarrojo Cercano (NIRS) y no se encontró diferencia significativa entre ambas técnicas, demostrando que el NIRS es un método confiable y eficaz para la obtención del perfil de aminoácidos de pasta de soya.

PALABRAS CLAVE: ESPECTROSCOPIA DE REFLECTANCIA EN EL INFRARROJO CERCANO / PERFIL DE AMINOÁCIDOS / PASTA DE SOYA / CURVA DE CALIBRACIÓN / CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA.

xvii

DEVELOPMENT OF A CALIBRATION CURVE FOR THE AMINO ACID PROFILE OF SOYBEAN MEAL, THROUGH THE NEAR INFRARED REFLECTANCE SPECTROSCOPY (NIRS)

AUTHOR: Diana Figueroa. TUTOR: Dra. Alexandra Naranjo. Quito, September 2014.

ABSTRACT The purpose of the current project was preparing a calibration curve for amonoacid profile in soya paste in Ecuador, Argentina and the United States, by using a NIRS equipment of the Animal Nutrition Laboratory in the School of Veterinary Medicine and Zootechnics of the Universidad Central del Ecuador. A sample from Ecuador, 2 from Argentina and 2 from the United States were used. Each sample was divided into 5 subsamples with a total of 25 out of which amino acid profile was obtained (17 amino acids) through High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Results were included in the NIRS equipment system. A database was created, that was used as a reference for distribution of the curve. Afterwards, sub-samples were analyzed with NIRS and a calibration curve was generated. At the end of the project, results of the High Performance Liquid Chromatography were statistically compared (HPLC) with Near Infrared Reflectance Spectroscopy (NIRS) and no significant difference was found between techniques; hence NIRS was found a reliable method for the obtaining of amino acids in soya paste.

KEYWORDS: NEAR INFRARED REFLECTANCE SPECTROSCOPY / AMINO ACID PROFILE / SOYA PASTE / CALIBRATION CURVE / HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

INTRODUCCION

La soya ha encontrado un amplio panorama en lo que respecta a la elaboración de concentrados de consumo animal; hasta el punto de considerarse la principal fuente de proteína, energía, aminoácidos y ácidos grasos esenciales en la formulación de dietas.

Su potencial como un producto de calidad nutricional se conservó como un secreto de los orientales hasta el siglo XX. A partir del año 1900 se inició su introducción a otras culturas de Europa y América. A pesar de que las primeras semillas de soya ingresaron a los Estados Unidos desde 1904, el primer aprovechamiento comercial realmente se realizó en 1911. Después de 1920 la soya se estableció en el medio oeste americano donde encontró las mejores condiciones climáticas para convertirse en un cultivo comercial de gran impacto productivo y económico. (CPI, Ministerio del poder popular para la salud de Venezuela; 2007)

El interés inicial de la soya en la industria se orientó hacia la utilización del aceite como sustituto de las grasas animales. La proteína de la soya se incluyó inicialmente en la alimentación animal a través de la pasta de soya, resultante de la extracción del aceite o mediante procesos de cocción para eliminar los factores anti-nutricionales (factores que interfieren en la absorción de micronutrientes), y así obtener el su máximo aprovechamiento. (CPI, Ministerio del poder popular para la salud de Venezuela; 2007)

Es de suma importancia conocer la composición química de materias primas y de productos alimenticios, esto muchas veces determina su calidad. Para este fin se requiere de un método que permita obtener resultados rápidamente, que no implique altos costos ni requiera de personal especializado.

1

La técnica NIRS o Espectroscopia de Infrarrojo Cercano es un método de análisis en tiempo real, no destructivo ni contaminante, que permite la medición cualitativa y cuantitativa de un constituyente químico; obtiene información sobre los componentes del alimento según el número y tipo de enlaces orgánicos presentes en el producto, basado en el principio de que los enlaces moleculares absorben frecuencias específicas de luz (Van Kempen, 1996).

NIRS ha sido aceptado por la industria como un método de medición de diferentes componentes; sin embargo, es un método secundario pues requiere de valores de referencia, obtenidos por métodos de laboratorio, para el desarrollo de las curvas de calibración. Después de su obtención, la principal ventaja que ofrece el NIRS es la oportunidad de realizar controles de calidad con resultados instantáneos. (Borjas E., 2002)

La estructura de este trabajo está constituida por los siguientes elementos:

CAPITULO I EL PROBLEMA: Planteamiento del problema, Formulación del problema, Sistematización del problema, Objetivos y Justificación.

CAPÍTULO II MARCO TEÓRICO: Antecedentes, Fundamentación teórica, Hipótesis, Caracterización de las variables, Definición de términos básicos y Fundamentación legal.

CAPITULO III METODOLOGIA: Determinación de los métodos a utilizar, Diseño de la investigación, Población y muestra, Técnicas e instrumentos de investigación, Validez y confiabilidad de los Instrumentos, Técnicas de procesamiento y Análisis de datos y Caracterización de la propuesta.

CAPITULO IV ASPECTOS ADMNISTRATIVOS: Recursos, Presupuesto y Cronograma.

2

CAPITULO I

EL PROBLEMA

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La composición del alimento balanceado y de sus materias primas es una información vital, para el fabricante, nutricionista y el productor ya que permite producir un alimento con un balance de componentes adecuados para los requerimientos nutricionales de los animales y la planificación de su alimentación.

Los métodos analíticos clásicos, han servido durante décadas a este propósito, pero los mismos no responden de una manera eficiente a la dinámica de la situación, por ejemplo a menudo la materia prima es utilizada antes de tener los resultados de los análisis químicos, además de lo costoso que significa contar con el equipamiento para determinar todos

los

parámetros

de

rutina.

(http://www.engormix.com/MA-

balanceados/articulos/analisis-alimentos-nirs/800-topic_81-p0.htm).

En muchas ocasiones cada laboratorio utiliza diferentes métodos para la identificación y cuantificación de los parámetros que se buscan determinar; lo que incrementa la posibilidad de cometer errores humanos en la obtención y preparación de la muestra y durante el análisis.

La tecnología NIRS ha sido usada por más de 50 años para el análisis de propiedades

como

humedad,

proteínas,

grasa,

fibras,

cenizas,

aminoácidos y más. El NIRS proporciona datos en tiempo real y con alta 3

reproducibilidad; además de ser compatible con el medio ambiente ya que requiere mínima preparación de la muestra y no utiliza reactivos por lo que no genera residuos tóxicos. (Salomón F., 2010).

FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ¿Se puede elaborar la curva de calibración para el perfil de aminoácidos en pasta de soya utilizando el método de espectroscopia de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS)?.

-

Variable Independiente: Curva de Calibración del perfil de aminoácidos.

-

Variable Dependiente: Espectroscopia de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS).

SISTEMATIZACIÓN DEL PROBLEMA

-

¿Cuál es la composición del perfil de aminoácidos en la pasta de soya?

-

¿Existen ventajas en la obtención del perfil de aminoácidos de la pasta de soya a través de la metodología NIRS vs la cromatografía líquida de alta eficiencia?

OBJETIVOS

General -

Elaborar la curva de calibración del perfil de aminoácidos de la pasta de soya utilizando la cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC), y la tecnología de espectroscopia de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS). 4

Específicos -

Determinar la composición del perfil de aminoácidos de la pasta de soya a través de la cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC).

-

Determinar ventajas y desventajas en la obtención del perfil de aminoácidos de la pasta de soya a través de la metodología NIRS vs la cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC).

JUSTIFICACIÓN

Conseguir una elevada calidad en el producto acabado es un reto cada día más importante en la industria moderna, esto implica un amplio y exhaustivo control de múltiples parámetros relacionados con el producto final y con cada etapa del proceso de su obtención (Peguero 2010).

La espectroscopia de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS) se ha desarrollado en el mundo como una opción para el análisis de la composición de productos y de sus materias primas. Se caracteriza por realizar análisis rápidos, con alta reproducibilidad y exactitud; además, requiere nula o escasa preparación de la muestra, haciendo un análisis no destructivo, y finalmente no utiliza reactivos ni genera residuos químicos contaminantes (Cajarville 2002 y Cozzolino 2005).

Además el uso de NIRS genera análisis de tipo cuantitativo y cualitativo, permitiendo diferenciar sustancias parecidas, pero con diferentes grupos funcionales, mediante el análisis discriminante. Esto abre un importante campo de aplicación en el control de calidad a nivel agropecuario e industrial (Valenciaga D. y Oliveira E. 2006).

Para el uso adecuado del NIRS se requiere la obtención de ecuaciones de calibración para cada uno de los productos que se requiera evaluar. Una de las principales fuentes de proteína (más del 40%) en la 5

elaboración de balanceados de consumo animal es la pasta de soya; sin embargo es imprescindible constatar su calidad y su adecuada composición nutricional antes de incluirla en la alimentación animal. (G.G Mateos 2009).

Por lo tanto este trabajo de tesis tiene como objetivo obtener las curvas de calibración para determinar la composición de la pasta de soya mediante la técnica NIRS.

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CAPITULO II

MARCO TEORICO

ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACIÓN

Según Gándara D. y Calero Cinthya, 2001; en su trabajo: Comparación de los métodos de Espectroscopia de Reflectancia en el Infrarrojo Cercano (NIRS) y Weende (Proximal), en el análisis bromatológico del maíz aplicando el método de Bland-Altman. Concluyeron que la aplicación del método de NIRS no es factible para la utilización de análisis bromatológicos en forma precisa frente al método Weende, siendo este último, el aceptado por la AOAC. Sin embargo se pudo comprobar que la aplicación de NIRS permite a la agroindustria y a los laboratorios de evaluación de alimentos analizar en pocos segundos distintos parámetros de calidad de los alimentos, aunque no de forma muy precisa.

Borjas Eva Danira, 2002; en su tema: Establecimiento y validación de curvas de calibración NIRS para determinar la calidad química del jamón Virginia. Concluyó que Las curvas de calibración NIRS establecidas para jamón Virginia son confiables y se obtuvo valores de R2 de 0.997, 0.993 y 0.996 para humedad, grasa y proteína, respectivamente. En la validación de las curvas de calibración no se encontraron diferencias (P>0.01) entre los valores estimados y los obtenidos por los análisis químicos. Y puesto que la composición química del jamón Virginia presenta diferencias significativas entre lotes de producción en la composición química del producto no permite utilizar estos datos para incluir una etiqueta nutricional. 7

En el trabajo: La espectroscopia de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS) y sus potencialidades para la evaluación de forrajes de Valenciaga D. y Oliveira E. (2006); las conclusiones fueron que el Infrarrojo Cercano (NIRS) es una técnica alternativa a los métodos químico-biológicos tradicionales, con buen potencial para obtener, de modo rápido y seguro, estimaciones de la composición química y nutricional de los forrajes, así como de los productos agropecuarios.

El éxito de la técnica puede atribuirse, en gran parte, a su habilidad para la realización del análisis de rutina rápido, con alta repetibilidad, reproducibilidad y exactitud en laboratorios de nutrición animal. Esto permite tomar decisiones rápidamente. Requiere además, una nula o escasa preparación de la muestra (análisis no destructivo de las muestras) e implica un ahorro considerable de reactivos. No genera residuos químicos contaminantes (tecnología limpia). En los últimos años se han desarrollado numerosas aplicaciones para evaluar la composición, controlar el procesamiento y certificar la calidad de alimentos, tanto para los animales, como para la población humana. La realidad hace suponer que las aplicaciones de esta técnica aumentarán.

En el tema: Identificación de Harinas de Yuca (manihot esculenta crantz) con

alto

contenido proteico mediante espectroscopia

de infrarrojo

cercano (NIRS), de Torres P. (2007). Se concluyó que la fácil colección de espectros a través del NIRS permite una rápida determinación del contenido de proteína cruda en harinas de raíces de yuca y un aumento de la velocidad en la realización del análisis de rutina en los laboratorios.

Es posible obtener una buena predicción del contenido de proteína cruda de harinas de raíces de yuca en la longitud de onda entre1108-2492,8 nm en NIRS. Las ecuaciones evaluadas en calibración presentaron coeficientes de determinación superiores al 95%, y correlaciones por encima del 97%.

8

FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA.

Soya.

Nombre científico: Glycine max.

Según Figueroa L. (2006) la soya es un vegetal de origen subtropical. Tiene las siguientes características.

-

Altura: entre 60cm. Y 1.50m, según las variedades y condiciones de cultivo.

-

Tallos: rígidos, erectos, ramificados y muy leñosos, cubiertos de pelusa.

-

Hojas: color variable entre el verde claro y el oscuro, generalmente dispuestas de a 3 y cubiertas de pelo fino.

-

Chauchas: de entre 30 a 60cm. de largo, revestidas de pelo fino, contienen entre 1 y 4 semillas.

-

Semillas: pequeñas, redondas y, según la variedad, de color crema, verde, marrón, negro o una combinación

de varios de

ellos. -

Raíz: conformada por abundantes tubérculos de gran tamaño

-

Temperatura óptima para su desarrollo: entre los 20 y 30ºC

Exigencias del suelo:

La soya no es muy exigente, por lo que a menudo es un vegetal que se emplea como alternativa para terrenos poco fertilizados que no son aptos para otros cultivos. Prefiere suelos neutros o ligeramente ácidos.

Tiempo requerido para alcanzar la madurez: de 75 a 200 días.

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Origen de la soya

Es originaria de China y usada en Japón hace más de 2000 años. El nombre que se ha dado a la soya, proviene del vocablo antiguo usado por los chinos: sou, así la denominaban en tiempos remotos, en la actualidad se la conoce como Ta Tou (Gran Frijol). Se supone que la costumbre del cultivo de la soya se originó en Mongolia o en el norte de China. La leyenda atribuye a Yuhsuing y a Kungkung el descubrimiento del grano. Cuenta la tradición que estos personajes legendarios habrían vivido 5000 años antes de Cristo. Otra versión cuenta que la soya fue descubierta por el emperador Sheng-Nung en el año 2027 antes de Cristo. A este rey se lo considera autor del libro Materia Médica, donde hace un recuento de las propiedades de esta semilla. El frijol de soya, pasó desde la China al Japón, por Corea. A principios del siglo XX los japoneses empezaron a exportar el grano a Occidente (http://hoy.com.do/la-soya-el-alimentomascompleto-2/).

La Soya en el Ecuador

En los proyectos "Estudio de las Cuencas de los Ríos Santiago y Mira; y la Planificación del Desarrollo de la Región I" realizados en Esmeraldas, Carchi e Imbabura por la Ssecretaria General de la Organización de los Estados Americanos, se obtuvo algunos datos sobre la producción y comercialización de la soya en el Ecuador.

Producción nacional de soya y pasta de soya

En los últimos años se ha incrementado en forma importante el cultivo de soya destinado a la industrialización para el abastecimiento de pasta y/o harinas de soya para consumo animal y para la extracción de aceite. La producción de pasta y/o harina de soya ha sido absorbida, especialmente por las fábricas de alimentos balanceados para aves. En el año 1975 se

10

cultivaron 8 200 hectáreas de soya, y en 1978 el área de cultivo alcanzó a 16 900 hectáreas.

Zonas principales de producción

La producción de soya, se encuentra en las provincias de Los Ríos y Guayas pues reúnen condiciones favorables para este cultivo, que se realiza en grandes extensiones y en forma mecanizada. La producción de soya y semilla de algodón abastece a las nueve plantas agroindustriales existentes en el país, de las cuales se hallan localizadas seis en Guayaquil, dos en Manta y una en Quito. Es de señalar que hay interés en instalar otra en la ciudad de Quevedo, pues cubriría un área con buen potencial para el cultivo de la soya. Esta planta podría absorber la producción de soya de los valles del río Esmeraldas y el río Verde.

Pasta de soya

Es el residuo o subproducto resultante de la obtención del aceite de las semillas de la soya mediante métodos mecánicos de presión, la aplicación de solventes o una combinación de ambos. Los procesos mecánicos ofrecen un menor rendimiento en la extracción de aceite que los solventes, resultando en el primer caso una pasta con un contenido en grasa de hasta un 6%, mientras que la obtenida con solventes tiene generalmente menos del 2%. Actualmente, los métodos más utilizados son la extracción con solventes y el mixto. El proceso mecánico lleva siempre consigo la aplicación de temperaturas altas, lo cual es beneficioso para inactivar los factores anti nutritivos de la semilla, pero, si son demasiado elevadas o se prolonga el tiempo de actuación, se pueden desencadenar reacciones de Maillard entre los aminoácidos y los hidratos de carbono, provocando un descenso en la digestibilidad, sobre todo de la lisina, la arginina, la histidina y el triptófano. (Buxadé Carlos, 1995).

11

Obtención de pasta de soya

-

Por presión

Una vez que las semillas de soya han sido molidas, se las somete al prensado. Las prensas pueden ser hidráulicas o discontinuas y continuas.

En la actualidad la extracción por presión se lleva a cabo casi exclusivamente por prensas continuas, por la economía de sus instalaciones, pero no realiza una profunda extracción de las materias grasas contenidas en sus semillas.

En recipientes calentadores de doble fondo se calientan las semillas molidas a temperaturas que oscilan entre 90 ºC y 95 ºC, dependiendo del material con que se trabaje. El calentamiento busca eliminar el exceso de humedad, con lo cual se aumenta el rendimiento al lograrse mayores presiones.

Luego el material pasa a una cuba de acero, que posee en su interior un tornillo sinfín, en el cual, el número de espiras y el diámetro aumenta de un extremo al otro, viéndose el material obligado a pasar por espacios cada vez más reducidos, aumentando de esa manera la compresión se logra extraer el aceite quedando como residuo la pasta de soya.

-

Por solvente

Este sistema se caracteriza por su gran rendimiento, poco empleo de mano de obra y fuerza motriz. Permitiendo la recuperación del solvente utilizado.

Para el eficaz cumplimiento de los fenómenos de ósmosis, difusión y extracción, la materia prima debe recibir una adecuada preparación. Esta consiste en el laminado de la misma, donde el material, sin sufrir 12

extracción ni molienda, toma forma de láminas delgadas que favorecen la difusión.

La semilla laminada circula por una cinta transportadora, donde queda sometida a un rociado intenso del disolvente. La solución obtenida de aceite-solvente, denominada “micela”, es enviada a destilación para separar el aceite del solvente. A su vez la materia prima agotada se seca y tuesta para recuperar el resto del solvente.

El disolvente usado es hexano, siendo este el más inofensivo para la salud y el que produce aceite más puros.

-

Sistema combinado

Se hace una primera extracción utilizando el método por presión continua y luego una segunda extracción con solvente.

http://www.made-inargentina.com/alimentos/aceites/temas%20relaci onados/metodos%20de%20extraccion%20del%20aceite%20de%20soja.h tm

Composición de la pasta de soya.

Según Buxadé C. (1996); la semilla de soya se compone de proteínas, lípidos, hidratos de carbono y minerales; siendo las proteínas y los lípidos las partes principales, constituyendo aproximadamente un 60 % de la semilla. Las proteínas tienen un alto contenido del aminoácido Lisina comparado con otros cereales.

Se comercializan dos tipos de pasta de soya con 44% y 48% de PB; se diferencian fundamentalmente en el nivel de inclusión de cascarilla, más elevado en la primera, por lo que es mayor su contenido en fibra bruta (FB) y menor su valor energético. 13

Cuadro Nº 1. Composición del Grano y Pasta de Soya

Según Figueroa L. (2006); entre los principales aminoácidos; que componen la proteína de la soya se encuentran. ⁻

Isoleucina: aminoácido esencial, interviene en la formación y reparación del tejido muscular



Leucina: aminoácido esencial, interviene en la formación y reparación de los tejidos; también cumple una función importante en el equilibrio de nitrógeno.



Lisina: uno de los aminoácidos esenciales más importantes ya que en asociación con otros interviene en procesos como el crecimiento, la reparación de tejidos y la síntesis de las hormonas.



Metionina: aminoácido esencial. Colabora en la síntesis de las proteínas y cumple una función limitante de las proteínas de la dieta.



Fenilalanina: aminoácido esencial que interviene en la producción de colágeno, elemento fundamental para la estructura de la piel y del tejido conectivo.



Treonina: aminoácido esencial que junto con la metionina y el ácido aspártico

ayuda

al

hígado

en

sus

funciones

generales

de

desintoxicación. ⁻

Triptófano: aminoácido esencial que interviene en el proceso de crecimiento, en la producción hormonal y en la síntesis de serotonina, neurohormona involucrada en la relajación y el sueño. 14



Valina: aminoácido esencial que estimula el crecimiento, colabora en la reparación de tejidos y ayuda en el mantenimiento de los diversos sistemas orgánicos.



Cistina: aminoácido no esencial, muy importante en la síntesis de insulina.



Tirosina: aminoácido no esencial, importante para la trasmisión de estímulos nerviosos y que, en combinación con otros aminoácidos, parece ser sumamente efectivo en el tratamiento de la depresión.

Cuadro Nº 2. Perfil nutricional de la soya integral pre cocida y la pasta de soya.

Fuente: Ministerio del poder popular para la salud de Venezuela Elaborado por: CPI 2007

15

La pasta de soya en la alimentación animal

Garzón Vitaliano (n/a), dice que actualmente la soya está considerada como la fuente proteica de mejor elección para la alimentación de cerdos y aves en crecimiento y finalización por su alto contenido proteico (37.5%), alta digestibilidad (82%), buen balance de aminoácidos, calidad consistente y bajos costos comparada con otras fuentes proteicas.

La principal desventaja para la utilización del grano de soya en su estado natural en la alimentación de monogástricos es la presencia de factores anti nutricionales siendo ellos la Antitripsina, Lipoxigenasa, Ureasa, Hemaglutinina y factor Antitiroideo. Los dos primeros tienen gran interés por ser elementos que afectan negativamente la utilización de la proteína, la grasa y los carbohidratos a nivel intestinal y se manifiestan en una pobre digestibilidad, traduciéndose en disminución del crecimiento y pérdida de peso tanto en aves como en cerdos.

Se ha demostrado que el grano integral de soya debe ser sometido a un proceso térmico, el cual destruye los factores anti nutricionales; este proceso se logra durante la obtención de la pasta de soya.

Al realizar los análisis nutricionales de la soya tanto en forma de grano crudo como procesado (tostado) y como subproducto (pasta de soya), encontraron que la principal diferencia se observa en el porcentaje de grasa en el grano entero el cual es del 17.5% comparado con la torta de soya que solo tiene el 1.5%. También observaron que el mayor porcentaje de proteína correspondía a la torta de soya siendo del 45% comparado con el grano de soya entero que solo tiene el 37.5%.

16

Espectroscopia de Infrarrojo Cercano (NIRS)

Infrarrojo Cercano

La luz es la energía radiante en la región espectral que es visible al ojo humano. El rango de longitud de onda para la luz es de aproximadamente 380 a 780 nm, ocupando una región bien pequeña del espectro electromagnético. La radiación infrarroja cubre el rango espectral aproximado de 780 nm a 30,000 nm, pero el rango más utilizado para los análisis de muestras es de 2,500 nm a 25,000 nm (Reyes Y. 2002).

Figura Nº1: Rangos de longitud de onda

Se le denomina infrarrojo cercano a la parte comprendida entre 750 a 2,500 nm del espectro electromagnético. La mayoría de las bandas de absorción, en la región del infrarrojo cercano pertenecen a la absorción de la región infrarroja del espectro electromagnético, que comprende una longitud de onda de 750 a 25,000 nm. (Davies y Grant 1987).

Principios de la Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano

Los alimentos están compuestos básicamente de materia orgánica. Los enlaces moleculares más comunes en los alimentos son entre hidrógeno y los elementos carbono, oxígeno, fósforo, azufre y nitrógeno. La frecuencia de vibración entre estas moléculas hace que estos enlaces generalmente absorban luz en la región infrarroja. NIRS utiliza el principio de absorción de frecuencia de luz específica por los enlaces, para obtener información acerca del número y tipo de enlaces orgánicos presentes en las muestras. 17

Según Van Kempen (1996), para comprender el principio básico de NIRS es necesario entender las bases del color. La luz blanca está compuesta por todos los colores del arco iris. Cuando esta luz cae sobre un objeto, ciertos colores dentro del espectro son absorbidos por el mismo, mientras el resto es reflejado. La luz reflejada puede ser observada por el ojo y es interpretada como el color del objeto.

El principio del instrumento es la iluminación del producto con luz de frecuencia (longitud de onda) específica y conocida, en la región del infrarrojo cercano. La luz absorbida por el producto es medida como la diferencia entre la cantidad de luz emitida por el instrumento NIRS y la cantidad de luz reflejada por la muestra (Van Kempen, 1996).

De acuerdo a Wehling (1998), la reflectancia puede ser calculada por la siguiente fórmula:

R = I / Io Donde: R = Reflectancia. I = Intensidad de la radiación reflejada de la muestra a longitud de onda dada. Io = Intensidad de radiación reflejada de la referencia a la misma longitud de onda

Bandas de absorción en el NIRS

La espectroscopía en el infrarrojo cercano se basa en la absorción de grupos funcionales que tienen un átomo de hidrógeno unido a un carbono, nitrógeno u oxígeno, estas absorciones son los sobretonos y bandas de combinación. Estos enlaces son los más comunes en los principales constituyentes del alimento, como el agua, proteínas, lípidos y carbohidratos (Wehling, 1998). 18

Cuadro Nº 3. Bandas de absorción de los principales componentes de los alimentos.

Instrumentación del NIRS

Según Cueva Rubén (2012). El esquema básico de un espectrofotómetro NIR consta de: fuente de radiación, selector de longitudes de onda, el compartimiento de la muestra y el detector.

Figura Nº 2. Esquema básico de la instrumentación del NIRS

Fuente de radiación.

Dispositivo capaz de generar el haz de luz necesario para irradiar la muestra. La fuente de radiación más usada es la lámpara halógena de filamento de tungsteno con ventana de cuarzo, capaz de proporcionar un espectro continuo en la región de 320nm a 2500nm. Otras fuentes de radiación que pueden utilizarse son los denominados LED`S (Light

19

Emiting Diodes), que dependiendo de su composición puede llegar a emitir hasta 1600nm.

Sistemas de selección de longitudes de onda

Un buen sistema de selección de longitudes de onda debe ser capaz de: ⁻

Proporcionar un ancho de banda preciso y exacto para la longitud de onda analítica.



Proporcionar señales altas a fin de conseguir una relación señal/ruido satisfactoria.

En función del dispositivo utilizado para la selección de longitudes de onda, los instrumentos NIRS pueden ser clasificados en sistemas dispersivos o no dispersivos.

Dentro de los equipos dispersivos, los sistemas de selección de longitud de onda más utilizados son los monocromadores, constituidos por un conjunto de colimadores de los haces de entrada y salida, junto con un elemento dispersante que descompone el haz incidente.

Los equipos no dispersivos son los más comunes. La variedad de sistemas de selección es elevada. Existen instrumentos de filtros convencionales, filtros optoacústicos e instrumentos de transformada de Fourier.

Compartimiento de la muestra.

Una de las grandes ventajas de la espectroscopia NIR es la versatilidad y adaptabilidad que presenta para analizar muestras de distinta naturaleza. La ausencia de pre-tratamiento de la muestra para el registro del espectro, permite disponer de gran cantidad de accesorios adaptables a cada situación.

20

Existen 3 tipos de registros de espectros NIRS: transmitancia, reflectancia y transflectancia.

Figura Nº 3: Esquema de las 3 configuraciones de registro de espectros NIRS.



Modo transmitancia: puede registrar gases, líquidos, semilíquidos y sólidos; en este modo el haz de luz atraviesa la muestra hasta el detector.



Modo reflectancia: registra sólidos y semisólidos, el haz de luz es reflejado por la propia muestra y el haz reflejado es recogido por el detector.



Modo transflectancia: líquidos y semilíquidos, donde el haz de luz atraviesa la muestra, se refleja en un reflector que está en contacto con la misma y finalmente llega al detector.

Detector

Los detectores más utilizados en Espectroscopia NIR están construidos con semiconductores. El detector más común posee sensibilidad entre 900nm y 2600nm. Para medidas por transmisión en sólidos se utilizan detectores operativos de 600 a 1900nm.

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Equipos NIRS Serie Spectra Star XL Descripción Básica ⁻

Monitor de 17 "; pantalla táctil de alta resolución.



Fácil integración de datos (táctil o teclado).



5 puertos USB.



Sistema Operativo: Windows ® 7 Professional



Procesador Intel ®



Paquete de Software: InfoStar y Ucal

-

Resultados precisos en 30 segundos.

Instrumentos Fuente de luz: Lámpara halógena de tungsteno de larga duración (10.000 horas).

Detector: Custom dual tipo InGaAs con detección de hasta 2500nm.

Compartimiento para muestras: permite que el manejo de las muestras sea flexible, sistema de transmitancia que puede registrar líquidos, semilíquidos, semisólidos y sólidos.

Para el análisis de gran variedad de materias el compartimiento para muestras consta de:

Adaptador multicopas y copas El adaptador se puede ubicar en tres posiciones según el material que se desea analizar:

-

Red position: copa grande, materias solidas de gran granulación

-

Black position: powder cup, materiales sólidos de granulación pequeña, polvos, semisólidos.

22

-

Blue position: copa pequeña con placa de oro, semilíquidos y líquidos.

Además se puede colocar un anillo adaptador el cual permite colocar cajas petri directamente para realizar análisis.

Para colocar las muestras correcta y herméticamente en la copa correspondiente se usa el preparador de muestras y la espátula. (Manual Equipo Infostar 2500x marca UNITY, 2012). Calibración del Instrumento NIRS

Según López (2001), las ecuaciones de calibración cuantifican la relación de la absorción del NIRS y los datos de referencia de laboratorio (DRL). La precisión de esta conversión es medida como el error estándar de calibración (EEC), que indica la variación dentro de la población que no es explicada por la calibración, y como el error estándar de validación cruzada (EECC), que indica la variabilidad esperada de un valor estimado.

Métodos de Regresión

Los métodos de

regresión

son procedimientos estadísticos que

cuantifican el grado de relación entre dos o más variables. El modelo matemático del sistema de regresión es: Y = BO + B1X1 + B2X2 + ... + BPXP

Donde Y es la variable a ser predicha y BO es el intercepto en la ecuación, B1 y Bp son los coeficientes y relacionan los cambios en la variable X y Y. El valor p es el número de variables X.

En nuestro ejemplo, Y es un valor de referencia del laboratorio y X1 y XP son los valores de absorción NIRS.

23

HIPÓTESIS

Hipótesis alternativa ( H1) -

Se puede elaborar la curva de calibración para perfil de aminoácidos

de

pasta

de

soya

través

del

método

de

espectroscopia de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS).

Hipótesis nula (Ho) -

No se puede elaborar la curva de calibración para perfil de aminoácidos

de

pasta

de

soya

través

del

método

de

espectroscopia de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS).

CARACTERIZACIÓN DE LAS VARIABLES.

-

Variable independiente

Curva de calibración: Es la representación gráfica de una señal que se mide en función de la concentración de un analito; selecciona un modelo para estimar la capacidad de un método analítico de obtener resultados que sean directamente proporcionales a valores conocidos de un material o sustancia.

Perfil de aminoácidos: Es la descripción de las unidades elementales constitutivas de las proteínas; se puede apreciar cuales aminoácidos la conforman y sus concentraciones.

-

Variable Dependiente.

NIRS: Espectroscopia de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS), es una metodología moderna para determinar la composición química de alimentos, suelos, forrajes, etc. Se basa en la absorbancia que presentan los diferentes compuestos orgánicos en ciertas regiones de longitud de onda. 24

DEFINICIÓN DE TÉRMINOS BÁSICOS

Pasta de soya: Es uno de los subproductos que se obtiene del procesamiento del frijol soya. Una vez completado el proceso de extracción del aceite, el residuo que queda es un ingrediente con alto nivel de proteínas (más del 40%), y un buen nivel del aminoácido esencial lisina en base a lo anterior es un ingrediente muy utilizado en la alimentación animal como fuente de proteína de buena calidad.

HPLC: Cromatografía líquida de alta eficacia o High performance liquid chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna utilizada frecuentemente en bioquímica y química analítica. También se la denomina a veces Cromatografía líquida de alta presión o Cromatografía Líquida de Alta Resolución (High pressure liquid chromatography) (HPLC), aunque esta terminología se considera antigua y está en desuso. El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica.

Aminoácidos: Principales constituyentes de las proteínas, son moléculas orgánicas que constan de un grupo amino (-NH2) y un grupo carboxilo (COOH). Las plantas pueden sintetizar todos los aminoácidos a partir de sustancias básicas, mientras que el hombre y los animales necesitan el aporte de algunos aminoácidos esenciales mediante la alimentación.

25

FUNDAMENTACIÓN LEGAL

El estatuto de la Universidad Central del Ecuador

(2010), en su

Capitulo segundo de los egresados menciona: “Art. 211. Títulos y grados. La Universidad central del Ecuador concederá a sus egresados los títulos y grados correspondientes, mediante el cumplimiento de todos los requisitos establecidos en la ley de Educación Superior, su Reglamento General, el Reglamento de Régimen Académico, el Estatuto y los Reglamentos pertinentes. Los egresados tendrán un plazo máximo de dos años para titularse, que se contaran desde su fecha de egresamiento. En caso contrario, deberán actualizar sus conocimientos de acuerdo con los programas vigentes”. “Art. 212.

El trabajo de graduación o titulación constituye un

requisito obligatorio para la obtención del título o grado para cualquiera de los niveles de formación. Dichos trabajos pueden ser estructurados de manera independiente o como consecuencia de un seminario de fin de carrera. Para la obtención del grado académico de licenciado o del título profesional universitario de pre o pos grado, el estudiante debe realizar y defender un proyecto de investigación conducente a una propuesta que resolverá un problema o situación práctica, con característica de viabilidad, rentabilidad y originalidad. ”

La Ley Agraria del Ecuador en su Capítulo Tercero: INVESTIGACIÓN, ASISTENCIA TÉCNICA Y DIÁLOGO DE SABERES menciona.

Artículo 9. Investigación y extensión para la soberanía alimentaria.El Estado asegurará y desarrollará la investigación científica y tecnológica en materia agroalimentaria, que tendrá por objeto mejorar la calidad nutricional de los alimentos, la productividad, la

26

sanidad alimentaria, así como proteger y enriquecer la agro biodiversidad.

Además, asegurará la investigación aplicada y participativa y la creación de un sistema de extensión, que transferirá la tecnología generada en la investigación, a fin de proporcionar una asistencia técnica, sustentada en un diálogo e intercambio de saberes con los pequeños y medianos productores, valorando el conocimiento de mujeres y hombres.

El Estado velará por el respeto al derecho de las comunidades, pueblos y nacionalidades de conservar y promover sus prácticas de manejo de biodiversidad y su entorno natural, garantizando las condiciones necesarias para que puedan mantener, proteger y desarrollar sus conocimientos colectivos, ciencias, tecnologías, saberes ancestrales y recursos genéticos que contienen la diversidad biológica y la agro biodiversidad.

Se prohíbe cualquier forma de apropiación del conocimiento colectivo y saberes ancestrales asociados a la biodiversidad nacional.

Artículo 10. Institucionalidad de la investigación y la extensión.- La ley que regule el desarrollo agropecuario creará la institucionalidad necesaria encargada de la investigación científica, tecnológica y de extensión, sobre los sistemas alimentarios, para orientar las decisiones y las políticas públicas y alcanzar los objetivos señalados en el artículo anterior; y establecerá la asignación presupuestaria progresiva anual para su financiamiento.

El Estado fomentará la participación de las universidades y colegios técnicos agropecuarios en la investigación acorde a las demandas

27

de los sectores campesinos, así como la promoción y difusión de la misma.

Artículo 11. Programas de investigación y extensión.- En la instancia de la investigación determinada en el artículo anterior y en el marco del Sistema Nacional de Ciencia y Tecnología y el Plan Nacional de Desarrollo, se creará:

a)

Un programa de difusión y transferencia de tecnología dirigido al

sector agroalimentario, con preferencia en los pequeños y medianos productores que tendrá un enfoque de demanda considerando la heterogeneidad de zonas agro bioclimáticas y patrones culturales de producción; y,

b)

Un programa para el análisis de los diversos sistemas

alimentarios existentes en las diferentes regiones del país, a fin de orientar las políticas de mejoramiento de la soberanía alimentaria.

28

CAPITULO III

METODOLOGIA

DETERMINACIÓN DE LOS MÉTODOS A UTILIZAR

Método Experimental Las muestras de pasta de soya se enviaron a un laboratorio para realizar la cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC); posteriormente se realizaron análisis en el equipo NIRS en la facultad de Medicina Veterinaria. Método Sintético La síntesis tiene un carácter creador e integrador, al unir elementos produce un todo nuevo. Lo utilizamos en el análisis de los resultados del perfil de aminoácidos; se procedió a unificarlos y crear la curva de calibración.

DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN. En el presente trabajo se utilizó el diseño experimental, “está integrada por un conjunto de actividades metódicas y técnicas que se realizó para recabar la información y datos necesarios sobre el tema para resolver el problema, sustentada por una investigación de campo”, Moreno (2009). Se recopiló muestras de pasta de soya y se las sometió al análisis de cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC) para luego elaborar la curva de calibración de aminoácidos a través de la metodología espectroscopia de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS). 29

de

TIPO DE INVESTIGACIÓN

Investigación Descriptiva: Se obtuvieron resultados de los análisis de cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC) los que fueron registrados, analizados e interpretados con el fin de elaborar la curva de calibración a través de la metodología NIRS.

Investigación Cuantitativa: Se compararon los resultados obtenidos en los análisis de HPLC y NIRS, se estableció una base de datos y se creó la curva de calibración del perfil de aminoácidos de la pasta de soya.

De acuerdo a la intervención del investigador

-

Investigación de Campo: se la utilizó al obtener información proveniente

de

entrevistas,

cuestionarios,

encuestas,

observaciones, entre otras.

-

Investigación

documental:

apoyada

en

las

fuentes

de

documentación y referencias bibliográficas de libros, revistas científicas, archivos PDF y net grafía consultados.

POBLACIÓN Y MUESTREO

-

Localización

Se realizó la investigación en el laboratorio de Nutrición Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Central del Ecuador, ubicada en la ciudad de Quito. Este laboratorio cuenta con un equipo NIRS, balanza y otros materiales necesarios para el estudio.

30

Cuadro Nº 4. Población Muestra de pasta de soya



Argentina

2

Estados Unidos

2

Ecuador

1

Total

5 Fuente: Directa Elaboración: La Autora

Características de la población

Usamos muestras de pasta de soya homogéneas, libres de impurezas y provenientes de Argentina, Estados Unidos y Ecuador.

Muestra

Muestreo: Diseño completamente al azar. - Cada muestra fue subdividida al azar en 5 sub-muestras, en total quedaron 25 sub-muestras con las que se realizaron los análisis.

COMPROBACIÓN DE LA HIPÓTESIS Inferencia estadística: Media aritmética(x), Desviación estándar (S), Desviación de la media (Sx), Coeficiente de variación (CV). Pruebas de Significancia: ANADEVA y DUNCAN entre tratamientos (HPLC Y NIRS) para cada aminoácido. Gráficos: Q-Q plot para las distribuciones de cada aminoácido y tratamiento.

31

Cuadro Nº 5.

OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES

Variable

Dimensión

Indicadores

Ítems

Técnica

Independiente.Curva de calibración del perfil de aminoácidos. Representación gráfica

Observación

de

descripción

la

de

las

Concentración

Valor

%aa/100gr.

Aminoácidos

porcentual

Composición

Aminoácidos

de

resultados

y Análisis.

unidades elementales constitutivas proteínas,

de

las

que

se

mide en función de la concentración

de

aminoácidos.

Dependiente.-

NIRS

Espectroscopia

de

reflectancia infrarrojo

en

el

aa.

química

Observación

cercano,

de

metodología moderna para

determinar

composición de alimentos.

la

química

resultados

y Análisis Concentración

Porcentaje

%aa/100gr.

de Aminoácidos Fuente: Investigación Directa. Elaboracion: La autora

32

TÉCNICAS E INSTRUMENTOS DE INVESTIGACIÓN

Materiales de campo Materiales para recolección de muestra -

Pasta de soya proveniente de Argentina, Estados Unidos y Ecuador.

-

Balanza.

-

Frascos plásticos estériles.

-

Fundas plásticas con abertura re-sellable.

-

Etiquetas.

-

Marcadores.

-

Hojas papel bond.

-

Cámara fotográfica digital.

-

Mandil.

Procedimiento de obtención de la muestra -

Se obtuvieron 5 muestras de pasta de soya: 2 provenientes de Argentina; 2 de Estados Unidos y 1 de Ecuador.

-

Por medio de recipientes de aluminio se tomo al azar 5 submuestras de cada una de las muestras antes mencionadas.

-

El contenido de cada recipiente de aluminio, con ayuda de una balanza se dividió: 250gr en una funda plástica y 100gr en un frasco plástico estéril.

-

Quedó un total de 25 fundas y 25 frascos.

-

Se utilizó marcadores, hojas papel bond y etiquetas para rotular cada sub-muestra.

-

El contenido de las fundas fue destinado para los análisis de HPLC y el contenido de los frascos para el análisis NIRS.

33

Materiales de laboratorio.

Para el análisis de HPLC ⁻

Reactivos químicos.



Material de laboratorio.

Para el análisis NIRS. -

Muestras de pasta de soya.



Equipo NIRS Infostar 2500x marca UNITY.



Paquete de software estadístico (Infostar y Ucal).

Cromatografía Líquida de alta Eficiencia (HPLC)

-

Los análisis de cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) se realizaron en el laboratorio de nutrición del Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP); este valor fue asumido por la empresa Alfaquímica y los resultados se obtuvieron 45 días después del envío de muestras.

Procedimiento de la Espectroscopia de Reflectancia en el Infrarrojo Cercano (NIRS)

Este primer análisis en NIRS se realizó con el fin de obtener el espectro de la pasta de soya, sobre el cual se generó la curva de calibración del perfil de aminoácidos.

-

Después de ingresar en el programa Infostar, se creó una carpeta para el nuevo producto a ser analizado, la pasta de soya.

34

-

En el área de análisis del NIRS, se ubicó en black position el adaptador multi-copas y se ajustó correctamente el adaptador para sólidos.

-

Se colocó la muestra en el recipiente correspondiente para materiales molidos o polvos, llamado powder cup, con ayuda de una espátula y el preparador de muestras.

-

Se colocó el powder cup herméticamente cerrado en el adaptador para sólidos.

-

Antes de correr la muestra se la nombró y finalmente se procedió al análisis.

-

Los resultados se guardaron automáticamente en la carpeta pasta de soya.

-

Para realizar los siguientes análisis de pasta de soya se procedió a limpiar el powder cup con una brocha, se colocó la muestra, se ubicó el powder cup en el adaptador para sólidos, se identificó la muestra y se corrió el análisis.

-

Los resultados que se obtuvieron de este análisis fueron de grasa, proteína, almidón, fibra y cenizas.

Elaboración de la curva de calibración para el perfil de aminoácidos de la pasta de soya.

Cuando los resultados de la cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) estuvieron listos, se procedió a realizar la curva de calibración del perfil de aminoácidos de la pasta de soya.

-

Los resultados de la cromatografía líquida fueron transcritos a Excel y guardados en una memoria flash (USB).

-

En el equipo NIRS, se ingresó en el programa Ucal, desde aquí se extrajeron los resultados de la cromatografía hacia una nueva carpeta llamada spectra, donde se encuentran los espectros de los materiales analizados. 35

-

En la opción Ucalibrate, se configuró las opciones para la calibración y se procedió con la generación de la curva.

-

Los datos de esta curva fueron guardados en la misma carpeta donde

estaban

los

resultados

de

los

análisis

realizados

anteriormente en el programa Infostar. -

El espectro de la curva quedo listo para análisis posteriores de pasta de soya.

-

Se procedió a analizar nuevamente las muestras de pasta de soya en el equipo NIRS siguiendo el procedimiento antes descrito; esta vez se pudieron obtener los resultados del perfil de aminoácidos de la pasta de soya.

VALIDEZ Y CONFIABILIDAD DE LOS INSTRUMENTOS

Para la confiabilidad y respaldo de los datos obtenidos se creó una base de datos en hojas de cálculo Excel, con los resultados obtenidos en los análisis

de

Cromatografía

líquida

de

alta

eficiencia

(HPCL)

y

Espectroscopia de reflectancia en el Infrarrojo Cercano (NIRS).

Como datos de referencia para la elaboración de la curva de calibración se utilizaron los resultados del método de laboratorio Cromatografía líquida de alta eficiencia (HPCL).

TÉCNICAS DE PROCESAMIENTOS Y ANÁLISIS DE DATOS

Los datos obtenidos fueron ordenados e incorporados a la base de datos en Excel.

Posteriormente fueron

seleccionados para

estadístico donde se realizaron análisis de:

36

añadirlos

al programa

-

ANADEVA y DUNCAN para determinar si existe o no diferencia significativa, dónde. Tratamientos (t-1): métodos: NIRS y HPLC. Repeticiones (r-1): son las 25 sub-muestras de pasta de soya.

-

GRAFICOS Q-Q plot para comparar las distribuciones de cada aminoácido y tratamiento.

37

CAPITULO IV

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

RESULTADOS Se obtuvo el perfil de aminoácidos de 25 sub-muestras de pasta de soya proveniente de Ecuador, Argentina y Estados Unidos;

mediante

Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (Anexo D) y Espectroscopia de reflectancia en el Infrarrojo Cercano (Anexo E), los datos se expresaron en porcentaje de materia seca y de ellos se obtuvo los siguientes resultados.

CALIBRACIÓN NIRS

Figura Nº 4. Espectro de 25 muestras de pasta de soya, correspondiente a la calibración NIRS para perfil de aminoácidos. Fuente: NIRS Spectro Star 2500x

38

La Figura Nº 4 da a conocer los espectros obtenidos para el perfil de aminoácidos de las 25 muestras de pasta de soya procedentes de Ecuador, Argentina y Estados Unidos. El rango espectral fue de 700 a 2500 nm.

Cuadro Nº 6: Coeficientes de variación (CV%) de las variables aminoácidos para los tratamientos HPLC y NIRS. COEFICIENTES DE VARIACIÓN (CV %) PARA CADA TRATAMIENTO Nº

AMINOACIDO

HPLC

NIRS

1

Ácido Aspártico

6,64

2,58

2

Treonina

7,84

1,26

3

Serina

7,32

2,31

4

Acido Glutámico

8,13

3,66

5

Prolina

19,25

9,44

6

Glicina

5,89

2,04

7

Alanina

11,45

3,79

8

Valina

10,13

4,67

9

Metionina

24,85

1,20

10

Isoleucina

7,86

1,76

11

Leucina

8,09

2,60

12

Tirosina

13,81

4,18

13

Fenilalanina

8,64

3,08

14

Histidina

11,24

2,07

15

Lisina

10,33

2,52

16

Arginina

14,59

13,11

17

Triptófano

13,43

3,62

39

Discusión:

Se puede apreciar que los resultados del perfil de aminoácidos obtenidos mediante Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC), tuvieron altos porcentajes en sus coeficientes de variación en comparación con los obtenidos por medio de la Espectroscopia de Reflectancia en el Infrarrojo Cercano (NIRS). Esto da a relucir la precisión del método NIRS en la obtención de datos y la posible variación de procedimientos o manejo de las muestras en HPLC.

PERFIL DE AMINOÁCIDOS

ACIDO ASPARTICO

Cuadro Nº 7. Análisis de Varianza al 5% para la variable Ácido Aspártico entre tratamientos HPLC y NIRS. Fuentes de Variación

Gl

SC

CM

FC

p-valor

Tratamiento

1

0,01

0,01

0,14

0,7075

Error (E)

48

3,21

0,07

Total (T)

49

3,22

Cuadro Nº 8. Medias de la variable Ácido Aspártico obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS.

Tratamientos

NIRS

HPLC

5,11 a

5,14 a

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

40

Valores DISTRIBUCIONES observado s

DE ÁCIDO ASPÁRTICO

Valores esperados

Grafico Nº 1. Q-Q plot para las Distribuciones de Acido Aspártico HPLC (VS) Acido Aspártico NIRS.

TREONINA

Cuadro Nº 9. Análisis de Varianza al 5% para la variable Treonina, entre tratamientos HPLC y NIRS.

Fuentes de Variación

Gl

SC

CM

FC

p-valor

Tratamiento

1

0,04

0,04

5,17

0,0274

Error (E)

48

0,39

0,01

Total (T)

49

0,43

Cuadro Nº 10. Medias de la variable Treonina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS.

Tratamientos

NIRS

HPLC

1,55 a

1,61 b

Medias con letras distintas son significativamente diferentes (p ≤ 0,05)

41

Valores observad os

DISTRIBUCIONES DE TREONINA

Valores esperad os

Grafico Nº 2. Q-Q plot para las Distribuciones de Treonina HPLC (VS) Treonina NIRS.

SERINA

Cuadro Nº 11. Análisis de Varianza al 5% para la variable Serina, entre tratamientos HPLC y NIRS.

Fuentes de Variación

Gl

SC

CM

FC

p-valor

Tratamiento

1

1,3E-04

1,3E-04

0,01

0,9157

Error (E)

48

0,54

0,01

Total (T)

49

0,54

Cuadro Nº 12. Medias de la variable Serina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS.

Tratamientos

NIRS

HPLC

1,95 a

1,96 a

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

42

Valores observados

DISTRIBUCIONES DE SERINA

Valores esperados

Grafico Nº 3. Q-Q plot para las Distribuciones de Serina HPLC (VS) Serina NIRS.

ACIDO GLUTÁMICO

Cuadro Nº 13. Análisis de Varianza 5% para la variable Ácido Glutámico entre tratamientos HPLC y NIRS. Fuentes de Variación

Gl

SC

CM

FC

p-valor

Tratamiento

1

0,01

0,01

0,02

0,8849

Error (E)

48

13,21

0,28

Total (T)

49

13,21

Cuadro Nº 14. Medias de la variable Ácido Glutámico obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS.

Tratamientos

NIRS

HPLC

8,30 a

8,32 a

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

43

Valores observados

DISTRIBUCIONES DE ÁCIDO GLUTÁMICO

Valores esperados

Grafico Nº 4. Q-Q plot para las Distribuciones de Acido Glutámico HPLC (VS) Acido Glutámico NIRS.

PROLINA

Cuadro Nº15. Análisis de Varianza al 5% para la variable Prolina, entre tratamientos HPLC y NIRS. Fuentes de Variación

Gl

SC

CM

FC

p-valor

Tratamiento

1

0,16

0,16

1,55

0,2186

Error (E)

48

4,91

0,10

Total (T)

49

5,07

Cuadro Nº 16. Medias de la variable Prolina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS. Tratamientos

NIRS

HPLC

2,02 a

2,13 a

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

44

Valores observados

DISTRIBUCIONES DE PROLINA

Valores esperados

Grafico Nº 5. Q-Q plot para las Distribuciones de Prolina HPLC (VS) Prolina NIRS.

GLICINA

Cuadro Nº17. Análisis de Varianza al 5% para la variable Glicina entre tratamientos HPLC y NIRS. Fuentes de Variación

Gl

SC

CM

FC

p-valor

Tratamiento

1

3,9E-03

3,9E-03

0,54

0,4649

Error (E)

48

0,34

0,01

Total (T)

49

0,35

Cuadro Nº 18. Medias de la variable Glicina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS.

Tratamientos

NIRS

HPLC

1,90 a

1,92 a

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

45

Valores observados

DISTRIBUCIONES DE GLICINA

Valores esperados

Grafico Nº 6. Q-Q plot para las distribuciones de Glicina HPLC (VS) Glicina NIRS

ALANINA

Cuadro Nº 19. Análisis de Varianza al 5% para la variable Alanina, entre tratamientos HPLC y NIRS. Fuentes de Variación

Gl

SC

CM

FC

p-valor

Tratamiento

1

3,4E-04

3,4E-04

0,54

0,8929

Error (E)

48

0,88

0,02

Total (T)

49

0,89

Cuadro Nº 20. Medias de la variable Alanina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS.

Tratamientos

NIRS

HPLC

1,59 a

1,59 a

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p >

46

0,05)

Valores observados

DISTRIBUCIONES DE ALANINA

Valores esperados

Grafico Nº 7. Q-Q plot para las Distribuciones de Alanina HPLC (VS) Alanina NIRS

VALINA

Cuadro Nº21. Análisis de Varianza al 5% para la variable Valina entre tratamientos HPLC y NIRS. Fuentes de Variación

Gl

SC

CM

FC

p-valor

Tratamiento

1

2,5E-03

2,5E-03

0,07

0,7947

Error (E)

48

1,72

0,04

Total (T)

49

1,72

Cuadro Nº 22. Medias de la variable Valina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS.

Tratamientos

HPLC

NIRS

2,40 a

2,41 a

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

47

Valores observados

DISTRIBUCIONES DE VALINA

Valores esperados

Grafico Nº 8. Q-Q plot para las Distribuciones de Valina HPLC (VS) Valina NIRS

METIONINA

Cuadro Nº 23. Análisis de Varianza al 5% para la variable Metionina entre tratamientos HPLC y NIRS. Fuentes de Variación

Gl

SC

CM

FC

Tratamiento

1

0,10

0,10

18,1

Error (E)

48

0,25

0,01

Total (T)

49

0,35

p-valor 0,0001

Cuadro Nº 24. Medias de la variable Metionina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS. Tratamientos

HPLC

NIRS

0,41 a

0,50 b

Medias con letras distintas son significativamente diferentes (p ≤ 0,05)

48

Valores observados

DISTRIBUCIONES DE METIONINA

Valores esperados

Grafico Nº 9. Q-Q plot para las Distribuciones de Metionina HPLC (VS) Metionina NIRS

ISOLEUCINA

Cuadro Nº 25. Análisis de Varianza al 5% para la variable Isoleucina entre tratamientos HPLC y NIRS. Fuentes de Variación

Gl

SC

CM

FC

p-valor

Tratamiento

1

8,8E-04

8,8E-04

0,06

0,8014

Error (E)

48

0,66

0,01

Total (T)

49

0,66

Cuadro Nº 26. Medias de la variable Isoleucina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS.

Tratamientos

NIRS

HPLC

2,05 a

2,06 a

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

49

Valores observados

DISTRIBUCIONES DE ISOLEUCINA

Valores esperados

Grafico Nº 10. Q-Q plot para las Distribuciones de Isoleucina HPLC (VS) Isoleucina NIRS

LEUCINA

Cuadro Nº 27. Análisis de Varianza al 5% para la variable Leucina entre tratamientos HPLC y NIRS. Fuentes de Variación

Gl

SC

CM

FC

p-valor

Tratamiento

1

0,01

0,01

0,18

0,6712

Error (E)

48

1,83

0,04

Total (T)

49

1,84

Cuadro Nº 28. Medias de la variable Leucina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS.

Tratamientos

NIRS

HPLC

3,23 a

3,25 a

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

50

DISTRIBUCIONES DE LEUCINA

Valores observados

Valores esperados

Grafico Nº 11. Q-Q plot para las Distribuciones de Leucina HPLC (VS) Leucina NIRS

TIROSINA

Cuadro Nº 29. Análisis de Varianza al 5% para la variable Tirosina entre tratamientos HPLC y NIRS. Fuentes de Variación

Gl

SC

CM

FC

p-valor

Tratamiento

1

0,01

0,01

0,41

0,5251

Error (E)

48

0,90

0,02

Total (T)

49

0,91

Cuadro Nº 30. Medias de la variable Tirosina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS.

Tratamientos

HPLC

NIRS

1,34 a

1,37 a

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

51

Valores observados

DISTRIBUCIONES DE TIROSINA

Valores esperados

Grafico Nº 12. Q-Q plot para las Distribuciones de Tirosina HPLC (VS) Tirosina NIRS

FENILALANINA

Cuadro Nº 31. Análisis de Varianza al 5% para la variable Fenilalanina entre tratamientos HPLC y NIRS. Fuentes de Variación

Gl

SC

CM

FC

p-valor

Tratamiento

1

8,8E-04

8,8E-04

0,04

0,8447

Error (E)

48

1,09

0,02

Total (T)

49

1,09

Cuadro Nº 32. Medias de la variable Fenilalanina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS. Tratamientos

NIRS

HPLC

2,32 a

2,33 a

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

52

DISTRIBUCIONES DE FENILALANINA Valores observados

Valores esperados

Grafico Nº 13. Q-Q plot para las Distribuciones de Fenilalanina HPLC (VS) Fenilalanina NIRS

HISTIDINA

Cuadro Nº 33. Análisis de Varianza al 5% para la variable Histidina entre tratamientos HPLC y NIRS. Fuentes de Variación

Gl

SC

CM

FC

p-valor

Tratamiento

1

2,0E-06

2,0E-06

2,3E-04

0,9881

Error (E)

48

0,42

Total (T)

49

0,42

0,01

Cuadro Nº 34. Medias de la variable Histidina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS.

Tratamientos

NIRS

HPLC

1,16 a

1,16 a

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

53

DISTRIBUCIONES DE HISTIDINA Valores observados

Valores esperados

Grafico Nº 14. Q-Q plot para las Distribuciones de Histidina HPLC (VS) Histidina NIRS

LISINA

Cuadro Nº 35. Análisis de Varianza al 5% para la variable Lisina entre tratamientos HPLC y NIRS. Fuentes de Variación

Gl

SC

CM

FC

p-valor

Tratamiento

1

1,1E-03

1,1E-03

0,03

0,8705

Error (E)

48

1,89

Total (T)

49

1,89

0,04

Cuadro Nº 36. Medias de la variable Lisina obtenidas mediante Duncan al 5% entre tratamientos HPLC y NIRS.

Tratamientos

NIRS

HPLC

2,63 a

2,64 a

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

54

DISTRIBUCIONES DE LISINA Valores observados

Valores esperados

Grafico Nº 15. Q-Q plot para las Distribuciones de Lisina HPLC (VS) Lisina NIRS

ARGININA

Cuadro Nº 37. Análisis de Varianza al 5% para la variable Arginina entre tratamientos HPLC y NIRS.

Fuentes de Variación

Gl

SC

CM

FC

p-valor

Tratamiento

1

12,64

12,64

73,45

0,05)

56

Valores observadosDISTRIBUCIONES

DE TRIPTOFANO

Valores esperados

Grafico Nº 17. Q-Q plot para las Distribuciones de Triptófano HPLC (VS) Triptófano NIRS

DISCUSIONES

En el Análisis de Varianza y la prueba de Duncan al 5%, para 14 de 17 aminoácidos: Ácido Aspártico, Serina, Ácido Glutámico, Prolina, Glicina, Alanina, Valina, Isoleucina, Leucina, Tirosina, Fenilalanina, Histidina, Lisina y Triptófano (cuadros 6, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 25, 28 y 29), se observó que no existe diferencia significativa, demostrando que, la Espectroscopia de Reflectancia en el Infrarrojo Cercano

(NIRS) es un método tan confiable como la Cromatografía

Líquida de Alta Eficiencia (HPLC), para la obtención del perfil de aminoácidos de la pasta de soya.

Sin embargo en el Análisis de Varianza y la prueba de Duncan al 5% para los aminoácidos Treonina, Metionina y Arginina (cuadros 8, 9, 22, 23, 26 y 27), existió diferencia significativa. Tomando en cuenta que las medias de Treonina fueron 1,55 NIRS y 1,61 HPLC, las de Metionina 0,41 HPLC y 57

0,50 NIRS, y las de Arginina 2,39 NIRS y 3,40 HPLC; se puede apreciar que las medias de NIRS a excepción de la metionina fueron menores que las de HPLC,

mostrando mayor homogeneidad en los resultados

obtenidos por este método. Estos resultados concuerdan con el trabajo realizado por Aguilar L. (2014), en soya integral, donde se encontró que de 17 aminoácidos analizados, en 10 no existió diferencia significativa y en 7 si existió; y de estos, en 4 aminoácidos (Treonina, Prolina, Alanina y Triptófano) se observó mayor homogeneidad en los resultados obtenidos por el método NIRS.

Cabe mencionar que según Gerrie Scholtz y el Profesor Hentie Van der Merwe de la Universidad de Free State en Sudáfrica; los factores que pueden afectar la exactitud de los resultados tanto en NIRS como en análisis de laboratorio son: variación de muestreo, variación de laboratorio, variación en la pulverización de la muestra, condiciones ambientales del laboratorio, muestras variables por

condiciones

estacionales, ambientales, variedades de especies, grado de madurez, y factores externos tales como pesticidas, métodos de control de maleza y muchos otros; es decir que mientras más robusta y variada sea la base de datos con la que se realice la curva de calibración para cualquier materia prima, mayor será la precisión del NIRS.

Tomando en cuenta que los gráficos Q-Q plot se utilizan para evaluar el grado de ajuste de un conjunto de observaciones a una distribución teórica (Manual Infostat, 2008). En los gráficos Q-Q plot realizados en este trabajo para las distribuciones de HPLC y NIRS de los 17 aminoácidos se observó que: en la mayoría de aminoácidos las distribuciones de HPLC y NIRS se asemejaron a la recta Y=X o distribución esperada; sin embargo en los resultados de HPLC se observó algunos puntos dispersos. En los casos de Treonina, Metionina, Histidina, Lisina y Triptófano (gráficos 2, 9, 14, 15 y 17); se observó que los valores de la distribución de NIRS se mostraron homogéneos por lo que se vieron distribuciones muy compactas. 58

Una importante fuente de variación entre los resultados obtenidos por el método de Cromatografía Líquida de alta Eficiencia (HPLC) y la Espectroscopía de reflectancia en el Infrarrojo Cercano (NIRS), es el contenido de humedad residual de la muestra, este varía con el tiempo de conservación en el laboratorio, tiempo transcurrido entre análisis y la lectura NIRS. (Cozzolino et al., 2000).

La pulverización es otra causa importante de variación en resultados analíticos. El tamaño de partícula, la distribución del tamaño de partícula y la señal difusa de reflectancia pueden ser afectado por el molino utilizado en la preparación de la muestra. (Groenewald and Koster, 2006).

59

CAPITULO V

CONCLUSIONES

En las condiciones en que se desarrolló este experimento, se establecieron las siguientes conclusiones:

-

Se desarrolló la curva de calibración para el perfil de aminoácidos de pasta de soya a través de NIRS. Donde la estadística demostró que de los 17 aminoácidos analizados, en 14 aminoácidos (el 82,35%) no existe diferencia significativa entre la metodología NIRS y HPLC; considerando a la espectroscopia de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS), un método confiable y eficaz para obtención del perfil de aminoácidos de la pasta de soya.

-

La obtención del perfil de aminoácidos de la pasta de soya mediante la tecnología NIRS, resultó más rápida vs el análisis de HPLC; además no requirió preparación de la muestra, reactivos químicos, ni personal especializado para su ejecución.

-

NIRS es un método que requiere una base de datos robusta y variada (procedencia, estación del año, condiciones ambientales de la muestra), obtenida mediante procedimientos de laboratorio que sirvan

de referencia para la elaboración de curvas de

calibración de las distintas materias primas para realizar análisis futuros más precisos.

60

CAPITULO VI

RECOMENDACIONES

-

Para próximas calibraciones en pasta de soya o cualquier otro producto, se sugiere contar con el mayor número de datos referencia posibles con el fin de conseguir curvas más confiables.

-

Realizar

investigaciones

con

pastas

de

soya

procedencia con el fin de comparar su composición.

61

de

distinta

REFERENCIAS

Fuentes Físicas.

-

Calero Pogo Cynthia Lorena (2011). Comparación de los métodos de espectroscopia de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS) y weende

proximal,

en

el

análisis

bromatológico

del

maíz.

Universidad Central del Ecuador.

-

Daiky Valenciaga, Eloisa de Oliveira Simoes Saliba (2006). La espectroscopia de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS) y sus potencialidades para la evaluación de Forrajes. Red de Revistas Científicas. Revista Cubana de Ciencia Agrícola, vol. 40, núm. 3, pp. 259-267.

-

Figueroa Laura y equipo (2006). El libro de la Soya. Argentina pg. 14 y 22.

-

Manual Equipo Infostar 2500x marca UNITY, 2012.

Fuentes Electrónicas.

-

Arenas Sosa Iván, López José Luis (2004). Curso

Métodos de

Laboratorio, Espectrofotometría de Absorción. Manual Instituto de Biotecnología,

Universidad

Nacional

Autónoma

de

México,

Cuernavaca – México. Recuperado de -

Borjas Orellana Eva Danira (2002). Establecimiento y validación de curvas de calibración NIRS para determinar la calidad química del jamón Virginia. Tesis Ingeniería en agroindustria, Universidad Zamorano – Honduras. Recuperada de 62

-

Buxadé Carlos (1995). Zootecnia, bases de producción animal; Tomo III alimentos y racionamientos. Barcelona – España pg. 6568. Recuperado de

-

Cajarville C. & Cozzolino D. 2002. Determination of dry matter (DM) and nitrogen (N) degradability in forages by near infrared reflectance spectroscopy (NIRS). Proceedings British Society of Animal Science. Annual Meeting. pp.154.

-

Cueva Rubén (2012). Aplicación de la Espectroscopía NIR para la determinación de parámetros críticos en la Fabricación de comprimidos

en

la

industria

farmacéutica.

Tesis

Doctoral

Universidad Autónoma de Barcelona. Recuperada de

-

Instituto Nacional de Nutrición, Ministerio del Poder Popular para la Salud (2007). La Soya. Caracas - Venezuela. Recuperado de http://www.inn.gob.ve/pdf/docinves/lasoya.pdf

-

Manual Software Estadístico Infostat, 2008.

-

Mariana Soto Cámara (2012). Análisis multivariante para el control de calidad en Materias primas de uso agroalimentario mediante Espectroscopía de infrarrojo cercano. Tesis Doctoral Universidad de Córdova. Recuperada de

-

Mateos G.G. (2009). Actividad ureásica en la pasta de soya. http://www.oocities.com/mvz_jmtz/ureasic.html.

-

Meléndez Márquez Herbert Ariel (2006). Establecimiento y validación de curvas de calibración NIRS para café oro de Honduras. Tesis en

Ingeniería en Agroindustria, Universidad

Zamorano – Honduras. Recuperada de 63

-

Peguero Gutiérrez Anna (2010). La espectroscopia NIR en la determinación de propiedades físicas y composición química de intermedios de producción y productos acabados. Tesis Doctoral Universidad Autónoma de Barcelona. Recuperada de http://www.tdx.cat/bitstream/10803/3316/1/apg1de1.pdf

-

Portal Made in Argentina, creado para promocionar la exportación de productos Argentinos hacia el mundo. Recuperado de http://www.made-inargentina.com/alimentos/aceites/temas%20relacionados/metodos% 20de%20extraccion%20del%20aceite%20de%20soja.htm

-

Reyes Cruz Yury Rodolfo (2002). Establecimiento y validación de curvas de calibración NIRS para la composición química del queso cabaña. Tesis Ingeniería Agroindustrial, Universidad Zamorano – Honduras. Recuperado de

-

Secretaria general de la organización de los estados americanos. Plan de desarrollo región I (Esmeraldas - Carchi – Imbabura). República de Ecuador. Recuperado de http://www.oas.org/dsd/publications/Unit/oea60s/begin.htm#Conten ts

-

Vásquez Diana Rocío, Abadía Beatriz, Arreaza Luis Carlos (2004). Aplicación de la Espectroscopía de Reflectancia en el Infrarrojo Cercano (NIRS) para la caracterización nutricional del pasto Guinea y del grano de maíz. Artículo Técnico, Revista Corpoica vol 5. Recuperado de

64

ANEXOS

ANEXO A Instrumentación del NIRS para realizar análisis.

Equipo NIRS.

Adaptador multicopas.

Anillo adaptador para copas.

Anillo adaptador para cajas petri.

Preparador de muestras y espátula. 65

Brocha para limpieza de instrumentos.

ANEXO B

Copas para colocación de muestras.

Powder cup

Copa Grande

Copa pequeña mas placa de oro

66

ANEXO C

Muestras.

67

ANEXO D Perfil de aminoácidos de las 25 sub-muestras de pasta de soya, obtenido mediante Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC).

68

69

70

71

72

ANEXO E Perfil de aminoácidos de las 25 sub-muestras de pasta de soya, obtenido mediante Espectroscopía de Reflectancia en el Infrarrojo Cercano (NIRS).

73

74

ANEXO F

Costos del proyecto asumidos por la autora.

75

ANEXO G

76

77

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