Universidad de Colima

MAESTRIA EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS

REGULACIÓN DE CANALES IÓNICOS EN EL PROCESO DE MUERTE CELULAR PROGRAMADA EN LINFOCITOS

TESIS Que para obtener el grado de Maestro en Ciencias Fisiológicas

PRESENTA Ing. Georgina Valencia Cruz

ASESOR Dra. Oxana Dobrovinskaya

COASESOR Dr. Igor Pottosin

Colima, Col., agosto del 2005.

I

AGRADECIMIENTOS •

A mis padres, por apoyarme siempre. Ellos con su perseverancia me han enseñado que para lograr una meta tienes que luchar hasta el final.

•

A Edgar, que ha estado conmigo en todo momento y me ha brindado su apoyo incondicional.

•

A mis maestros y compañeros de la maestría por compartir conmigo sus experiencias y conocimientos.

II

INDICE INDICE…………………………………………………………………………………..I TABLAS Y FIGURAS………………………………………………………………..III ABREVIATURAS…………………………………………………………………….VI RESUMEN……………………………………………………………………………...1 ABSTRACT…………………………………………………………………………….2 INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………3 OBJETIVO GENERAL………………………………………………………………..5 Capítulo I Fisiología de la muerte celular programada (Apoptosis) Apoptosis y estímulos iniciadores………………………………………..6 Cambios morfológicos y moleculares durante la apoptosis…………7 Principales moléculas en apoptosis……………………………………...8 Caspasas……………………………………………………………….8 Proteínas adaptadoras……………………………………………….12 Familia Bcl-2…………………………………………………………..13 Familia de receptores TNF: Receptores muerte………………….16 ¿Y los canales iónicos?................................................................17 Canales de K+…………………………………………………17 Importancia del ion K+ en el proceso apoptótico………….18 Canales de Cl-....................................................................20 Canales de Ca+2………………………………………………21 Mitocondria y apoptosis…………………………………………………...21 Mitocondria, ER y Ca+2………………………………………………22 Regulación de la apoptosis vía mitocondrial………………………23 Mecanismos celulares en la inhibición de la apoptosis……………..25

III

Señalización en apoptosis………………………………………………...27 Capítulo II Modulación del receptor a IP3 durante la apoptosis Distribución, localización celular e isoformas del IP3R……………...31 Estructura de IP3R…………………………………………………………..34 Relación estructura-función del IP3R……………………………….38 Regulación del IP3R………………………………………………………...40 Regulación por Ca+2………………………………………………….40 Regulación por Nucleótidos…………………………………………41 Regulación del IP3R por fosforilación………………………………42 Papel del IP3R durante la apoptosis en linfocitos…………………….44 IP3R, Citocromo c y Apoptosis………………………………………46 Caspasas, IP3R y Apoptosis………………………………………..49 Bcl2 e IP3R…………………………………………………………….52 Capítulo III Regulación de Canales de Kv durante Apoptosis en Linfocitos Estructura molecular de Kv1.3…………………………………………...55 Topología general del Kv1.3 ………………………………………..55 Relación Estructura-Función de Kv1.3……………………………..57 Regulación de Kv1.3………………………………………………………..63 Modulación de Kv1.3 por p56lck……………………………………..63 Modulación de Kv1.3 por ceramida y lipid rafts…………………..65 Modulación del canales de K+ por BcL-2………………………….70 Expresión,

distribución

celular,

y

funciones

de

Kv1.3

en

linfocitos……………………………………………………………………...70 Kv1.3 y Apoptosis…………………………………………………………..74 Actividad del Kv1.3 durante la apoptosis…………………………..74

IV

TABLAS Y FIGURAS

Figura 1. Diagrama que muestra el orden cronológico de los cambios morfológicos y bioquímicos durante la estimulación apoptótica………………….7 Figura 2 Comparación estructural de las pro-caspasas y especificidad de sustrato………………………………………………………………………………….9 Figura 3. Diagrama que muestra las estructuras de zimogenes para la caspasa iniciadora, caspasa 8, y caspasa efectora, caspasa-3………………….9 Figura 4. Mecanismos de activación de caspasas……………………………...11 Figura 5. Cortes proteolíticos por caspasas……………………………………..12 Figura 6. Proteínas adaptadoras mostrando dominio muerte (DD), dominio efector muerte (DED) y dominio de reclutamiento de caspasas (CARD)……...13 Figura 7.

Comparación estructural entre los miembros de la familia de

proteínas Bcl-2……………………………………………………………………….14 Figura 8. Mecanismos de participación de los miembros de la familia Bcl-2 en apoptosis (ruta intrínseca)…………………………………………………………..15 Figura 9. Comparación estructural ente los receptores muerte……………….17 Figura 10. Salida de K+ celular en células apoptóticas es simultáneo con otros eventos………………………………………………………………………………..18 Figura 11. La actividad de caspasas y nucleasas es restringida en células con bajo K+ intracelular…………………………………………………………………..19 Figura 12. Relación de la salida de K+, actividad de caspasas y nucleasas en apoptosis………………………………………………………………………………20 Figura 13. Regulación mitocondrial en la muerte celular apoptótica…………..23 Figura 14. Inhibición de la apoptosis a nivel de caspasas……………………..26 Figura 15. Inhibición de la apoptosis a nivel de mitocondria………….………..26 Figura 16. Inhibición de la apoptosis a nivel de membrana plasmática……….27 Figura 17. Las dos rutas apoptóticas que envuelven la estimulación de receptores muerte (camino extrínseco) y/o disrupción mitocondrial (camino intrínseco)……………………………………………………………………………..30 Figura 18. Señalización por Ca+2 en células DT40 que expresan un solo subtipo de recetor tras la estimulación del receptor BCR……………………….33 Figura 19. Inmunocitoquímica de IP3R en linfocitos humanos T (Jurkat)……34

V

Figura 20.

Representación esquemática para la estructura primaria del

receptor a IP3…………………………………………………………………………36 Figura 21. Representación de superficie de la reconstrucción tridimensional del IP3R………………………………………………………………………………..37 Figura 22. Efectos del Ca+2 en la proteólisis parcial del IP3R nativo………….39 Figura 23. Modelo global tridimensional para la re-localización a gran escala del dominio de unión al IP3 que permite la transición entre el estado-S y el estado-W………………………………………………………………………………39 Figura 24. Modelo estructural de cinco dominios para IP3R……………………43 Figura25. Células Jurkat deficientes en IP3R1 no presentan liberación de calcio en respuesta a estimulación de TCR……………………………………………...45 Figura 26. Resistencia a la apoptosis inducida por distintos estímulos apoptóticos en células Jurkat deficientes en IP3R1………………………………46 Figura 27. Citocromo c interactúa con IP3R1……………………………………47 Figura 28. Curvas concentración- respuesta para IP3 y Ca+2…………………..48 Figura 29. Cambios en el calcio citosólico coinciden con la liberación coordinada de citocromo c de la mitocondria. ……………………………………49 Figura 30. IP3R1 es escindido por caspasa-3……………………………………50 Figura 31. Papel del receptor a IP3 durante la apoptosis……………………..54 Figura 32. Topología transmembranal de una subunidad de Kv1.3…………..56 Figura 33. Plegamiento y poro del canal KcsA………………………………….56 Figura 34. Activación del canal Kv1.3 en linfocitos Jurkat………………………60 Figura 35. Inactivación del canal Kv1.3 en linfocitos Jurkat…………………….61 Figura36. Recuperación de la inactivación del canal Kv1.3 en linfocitos Jurkat…………………………………………………………………………………..62 Figura 37. Kv1.3 es tirosina-fosforilado tras un tratamiento con Fas………….64 Figura 38. Localización de Kv1.3 en lipid rafts después de la estimulación de CD95. ………………………………………………………………………………...66 Figura 39. Transformación de los rafts en membranas ricas en ceramida bajo estímulo con anti-CD95, Ceramida C16 o Esfingomielinasa inhiben la actividad de Kv1.3……………………………………………………………………………….67 Figura 40. Corrientes de K+ inducidas por rampas de voltaje en células Jurkat tratadas con 1mM de β-ciclodextrina en configuración “cell-attached”………...69

VI

Figura 41. Esquema que muestra el número promedio de canales Kv1.3 y canales KCa1 en células en estado de reposo, células memoria central (TCM) y células efectoras (TEM)…………………………………………………………...72 Figura 42. Representación esquemática de la regulación del volumen celular por Kv1.3………………………………………………………………………………73 Figura43. La estimulación del receptor Fas inhibe el canal Kv1.3 en linfocitos T Jurkat…………………………………………………………………………………..75 Figura44. Esquema propuesto para la cascada de señalización por rafts bajo el estímulo al receptor CD95………………………………………………………..76 Figura 45. Análisis de Western Blot de las subunidades α y β de la ATPasa Na+/K+ en apoptosis………………………………………………………………………………………77

Figura 46. Efecto del ligando Fas (L-Fas) sobre la corriente de potasio en células Jurkat…………………………………………………………………………79 Figura 47. Efecto de Fas-L en las propiedades iónicas de células Jurkat……80 Figura 48. Estimulación de corrientes de K+ no identificadas, mediante succión en parches “cell-attached”…………………………………………………………..84 Figura 49. Esquema propuesto para la señalización vías Fas-L y modulación de Kv1.3 e IP3R durante la apoptosis……………………………………………...85 Tabla 1. Características de Kv1.3 …………………………………………………59 Tabla 2. Canales de K+ en linfocitos……………………………………………….71

VII

ABREVIATURAS ∆ψ ψm, Potencial de membrana mitocondrial 4-AP, 4-aminopiridina A/T, adenina/timina Ac-DEVD-CHO, Inhibidor de caspasa-3 AIF, Factor de inducción apoptótica Apaf-1, Factor activador de apoptosis ASM, Esfingomienlinasa ácida ATN, Transportador del nucleótido de adenosina AVD, Disminución del volumen celular apoptótico BCR, Receptores de células B BH, Dominios:1-4 homólogos Bcl-2 CAD, DNasa activada por caspas CARD, Dominios de reclutamiento de caspasas CTX, Caribdotoxina DED, Dominio efector muerte DED, Dominios efectores muerte DISC, Complejo de señalización de inducción de muerte DT40, Linfocitos B deficientes en IP3R FADD, Proteína con dominio muerte asociada a Fas GFP, Proteína verde fluorescente ICRAC, Canales de Ca+2 activados por la liberación de Ca+2 IMM, Membrana interna mitocondrial IP3, Inositol 1,4,5 trifosfato IP3R, Receptor a Inositol 1,4,5 trifosfato KSR, Cinasa supresora de Ras KTX, Kaliotoxina LPC, Lisofosfatidilcolina MgTx, Margatoxina mtCK, Creatina cinasa mitocondrial NTX, Noxiustoxina OMM, Membrana externa mitocondrial PASMC, Células vasculares de epitelio pulmonar PS, Fosfatidilserina PTP, Poro de transición de permeabilidad RE, Retículo endoplásmico ROS, Especies de oxígeno reactivas RVD, Regulación de la disminución del volumen celular SERCA, Bomba de Ca+2 del RE Shk-Dap, Toxina Stichodactyla helianthusAcido diaminopropiónico

smac/Diablo, Second mitochondria-derived activator of caspases/direct inhibitor of apoptosis binding-protein with low pI STS, Estaurosporina TCM, Células (linfocitos) memoria central TCR, Receptores de células T TEA, Tetraetilamonio TEM, Células efectoras (linfocitos) TNF, Factor de Necrosis Tumoral VDAC, Canal aniónico voltaje dependiente YFP, Proteína amarilla fluorescente Z-VAD.fmk, Inhibidor de caspasas general z-VAD-CH2-DCB, Inhibidor general de caspasas.

VIII

RESUMEN

Análisis del canal de potasio voltaje-dependiente Kv1.3 y el canal de calcio intracelular, receptor a inositol 1,4,5 trifosfato (IP3R), canales bien caracterizados en linfocitos T Jurkat, fueron estudiados para revisar algunos mecanismos de su modulación durante apoptosis. Moléculas como nucleótidos, cinasas, Ca+2, modulan la actividad de IP3R y la señal de Ca+2. Dicha señal es amplificada tras un estímulo apoptótico por miembros de la familia BcL-2, citocromo c y caspasa-3. La fosforilación del Kv1.3 por proteína cinasa p56lck permite la inactivación del Kv1.3 tras un estímulo con L-Fas en fases tempranas de la apoptosis. El mecanismo pude incluir activación de esfingomielinasas, liberación de ceramida y reorganización de lipid rafts, luego el Kv1.3 es activado como parte de la disminución del volumen apoptótico (AVD) modulando la actividad de caspasas y nucleasas. La activación tardía de Kv1.3 es dependiente de caspasa-8 y proteína cinasa C. Finalmente, la posible participación de otro tipo de canales de potasio en apoptosis es discutido.

9

ABSTRACT

Analysis of two ion channels, voltage-gated potassium channel Kv1.3 and intracellular calcium channel inositol 1,4,5-trisphosphate receptor (IP3R),

well

characterized in lymphocytes T was undertaken to reveal some mechanisms of their modulation in apoptosis. Molecules such as nucleotides, kinasas, Ca+2 modules the activity of IP3R and Ca2+ signal. Ca2+

signal is amplified after

apoptotic stimuli by members of family BcL-2, cytochrome c and caspase-3. Phosphorilation of Kv1.3 by proteine kinase p56lck leads to inactivation of Kv1.3 after L-Fas stimulation in early phases of apoptosis. The mechanism may include activation of sphyngomyelinases, liberation of ceramide and reorganization of membrane lipid rafts, Later Kv1.3 is activated as part of apoptotic volume decrease (AVD) and modules the activity of caspases and nucleasas. Late activation of Kv1.3 is dependent on caspase-8 and protein kinase C. Finally, possible role of other type of potassium channels in apoptosis is discussed.

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INTRODUCCIÓN

La apoptosis o muerte celular programada

es un proceso biológico

altamente conservado que ocurre en organismos multicelulares. Dicho proceso valiéndose de una maquinaria celular altamente especializada resulta en alteraciones

bioquímicas y morfológicas particulares en la célula. La muerte

celular programada

puede ser inducida por diversos estímulos fisiológicos o

fisiopatológicos que activan distintas cascadas de señalización apoptótica (Gulbins, Jekle et al. 2000). En ella intervienen distintas moléculas como receptores,

ligandos,

canales

iónicos,

moléculas

reguladoras,

moléculas

adaptadoras y proteasas. Algunos de estos elementos, como las caspasas, son específicos para la apoptosis mientras que otros, como los canales de potasio y de calcio son adoptados en distintos procesos vitales (Barros, Castro et al. 2002). En años recientes,

ha sido demostrado, que el papel de los iones

intracelulares en apoptosis va más allá

de una mera participación en la

disminución del volumen celular, rasgo distintivo de una célula apotótica. La capacidad de los iones para regular otros aspectos de la muerte celular se ha vuelto cada vez más aparente. Durante la apoptosis los iones monovalentes han sido involucrados en la modulación de actividad de caspasas y nucleasas (Gulbins, Jekle et al. 2000; Thompson, Langlais et al. 2001; Remillard and Yuan 2004; Szabo, Adams et al. 2004).

El mantenimiento de un ambiente iónico

intracelular en condiciones fisiológicas favorece la sobrevivencia de la célula o contrariamente es un aspecto importante en la represión de la apoptosis (Bortner and Cidlowski 2002). El calcio es un mensajero secundario universal involucrado en varios procesos celulares. Oscilaciones de diferente duración, amplitud y frecuencia para el calcio, están generadas como resultado de la modulación e interacción de diferentes procesos, que incluyen entre otros, la actividad de canales de calcio de la membrana plasmática y canales de calcio intracelulares. El canal de potasio Kv1.3 esta involucrado en el control de la concentración de potasio intracelular, del volumen celular del potencial de la membrana y a través del último, la entrada de calcio a la célula. Todos estos aspectos se cambian durante la apoptosis. En la formación de la señal del calcio en apoptosis en células linfoides el receptor a trifosfato de inositol (IP3R) juega un papel 11

importante. Aunque los mecanismos que modulan la actividad de los canales iónicos durante la muerte celular programada hasta

la fecha han sido poco

explorados, estos dos canales son un ejemplo de cómo se modifica su regulación durante la muerte celular programada en linfocitos.

12

OBJETIVO GENERAL

Revisar y analizar los mecanismos responsables de la modulación de los canales iónicos Kv1.3 e IP3R durante la muerte celular programada en linfocitos.

13

Capítulo I Fisiología de la muerte celular programada (Apoptosis) Apoptosis y estímulos iniciadores La apoptosis es una forma de suicidio celular que es ampliamente observado en la naturaleza. Es un proceso biológico donde células individuales son eliminadas de distintos tejidos en organismos multicelulares en respuesta a una señal específica

sin afectar a células vecinas o inducir una respuesta

inflamatoria (Bortner y Cidlowski 2002). Una célula entra en apoptosis cuando ésta pierde el contacto con sus alrededores o cuando existe un daño interno irreparable;

otra

razón

se

presenta

cuando

la

célula

recibe

señales

simultáneamente para inducir o atenuar su división celular, pero además, en el caso del sistema inmune, los linfocitos T inician su propia autodestrucción bajo un programa “instructivo” en donde los receptores muerte juegan un papel central (Ashkenazi y Dixit 1998). La muerte celular programada puede ser inducida por diversos estímulos fisiológicos o fisiopatológicos que activan distintas cascadas de señalización apoptótica. Entre ellos destacan moléculas receptoras como CD95, Trail o Factor de Necrosis Tumoral (TNF), glucocorticoides, distintas formas de estrés como la supresión de factores de crecimiento, irradiación, luz ultravioleta (UV), fármacos citotóxicos, peróxido de hidrógeno (H2O2), tratamiento con ceramida, bacterias, toxinas o virus (Gulbins, Jekle et al. 2000). La apoptosis ha sido considerada como un proceso relevante en el desarrollo y mantenimiento de la homeostasis de un tejido; un balance entre la muerte y la proliferación celular mantienen a la célula en homeostasis y una desviación en este balance puede contribuir a una condición fisiopatológica. La acumulación celular vía insuficiencia en apoptosis puede contribuir en enfermedades como cáncer, inflamación y desórdenes linfoproliferativos. Por el contrario,

exceso

de

apoptosis

puede

influir

en

enfermedades

neurodegenerativas, SIDA, osteoporosis, falla cardiaca, etc. (Rudin y Thompson 1997; Bortner y Cidlowski 2002).

14

Cambios morfológicos y moleculares durante la apoptosis Hace varias décadas, algunos investigadores evidenciaron cambios morfológicos y moleculares durante el desarrollo de la apoptosis; entre los cambios morfológicos identificados se encuentran la condensación de la cromatina, pérdida del volumen celular o encogimiento celular y formación de burbujas en la membrana plasmática para la desintegración celular, llevando a la formación de cuerpos apoptóticos que serán fagocitados por macrófagos subsecuentemente (Figura 1) (Lang, Lepple-Wienhues et al. 1998; Lang, Ritter et al. 2000; Bortner y Cidlowski 2002; Danial y Korsmeyer 2004).

Figura 1. Diagrama que muestra el orden cronológico de los cambios morfológicos y bioquímicos durante la estimulación apoptótica. A diferencia de la necrosis, el contenido celular nunca se libera en una célula en proceso apoptótico, por lo tanto se previene una respuesta inflamatoria al tejido huésped. (Remillard et al., 2004).

Después de estos cambios morfológicos se ha reportado hinchamiento en la membrana mitocondrial externa así como liberación del citocromo c y el factor de inducción apoptótica (AIF) del espacio intramembranal mitocondrial hacia el citoplasma (Strasser, O'Connor et al. 2000). Dentro de los cambios moleculares destaca la fragmentación del ADN, estos fragmentos son escindidos en regiones ricas en adenina/timina (A/T) localizados en sitios de andamiaje nuclear dando fragmentos entre 50-200pb (Danial y Korsmeyer 2004); y por otro lado la

15

exposición al azar de la fosfatidilserina (PS) en la cara externa de la membrana plasmática (Strasser et al 2000, Danial et al.2004). Recientemente se ha propuesto que además de PS se libera otro fosfolípido, posiblemente lisofosfatidilcolina (LPC), que actúa como un quimio-atrayente (Leyton y Quest 2004). Dichos cambios han sido observados de manera exclusiva en este tipo de muerte celular por análisis con microscopía electrónica así como técnicas basadas en la detección de estos cambios, por ejemplo, tinción con anexina V de la superficie celular expuesta con fosfatidilserina (PS), detección de células con contenido de ADN aparentemente subdiploide por tinción del ADN con marcadores intercalados y terminal deoxynucleotidiltransferasa que media la incorporación de nucleótidos marcados en ADN escindido (Strasser et al. 2000).

Principales moléculas en apoptosis Caspasas Los cambios morfológicos y bioquímicos observados durante la apoptosis se deben a un grupo de proteasas cisteína denominadas caspasas. Estas moléculasproteicas han sido consideradas como las ejecutoras centrales en este proceso. Todas las caspasas conocidas poseen en su sitio activo una cisteína, y escinden sustratos en enlaces Asp-Xxx (esto es, tras un residuo de ácido aspártico) (Hengartner 2000). Al menos 14 caspasas han sido identificadas en mamíferos (Figura 2). Muchas de ellas están presentes en células saludables como pro-enzimas catalíticamente inactivas (zymogenos de 30 a 50kD) (Marsden y Strasser 2003) y contienen tres dominios: un dominio terminal NH2 o prodominio, una subunidad grande (∼20kD o p20), y una subunidad pequeña (∼10kD o p10) (Figura 3). Las pro-enzimas para su maduración requieren de un mínimo de dos cortes, uno que separe el prodominio de la subunidad grande y otro que separe la subunidad grande de las subunidad pequeña (Earnshaw, Martins et al. 1999). La enzima ya madura, es un heterotetrámero compuesto por dos heterodímeros constituidos por dos sitios catalíticos que funcionan de manera independiente. Entre cada dominio catalítico las subunidades grande y pequeña están íntimamente asociadas y ambas contribuyen con los residuos necesarios para la unión al sustrato y catálisis (Thornberry y Lazebnik 1998).

16

Figura 2 Comparación estructural de las pro-caspasas y especificidad de sustrato. Los sitios de corte de aspartato entre la subunidad grande (barras abiertas) y pequeña (barras con color) son indicados. Los dominios efectores muerte (DED) y los dominios de reclutamiento de caspasas (CARD) también se muestran. Caspasas humanas 1-10, caspasas de ratón 1114, Ced-3 de C. elegans. (Strasser et al., 2000).

Figura 3. Diagrama que muestra las estructuras de zimogenos para la caspasa iniciadora, caspasa 8, y caspasa efectora, caspasa-3. El prodominio amino-terminal se muestra en verde. Las subunidades grandes se muestran en azul y las pequeñas en verde. El prodominio de la caspasa 8 contiene dos dominios efectores muerte (DED). Otras caspasas iniciadoras pueden tener un dominio de reclutamiento de caspasas (CARD). La enzima heterotetramérica (derecha) es el resultado de una activación proteolítica (Earnshaw et al.,1999).

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Para la activación de las caspasas se han propuesto tres mecanismos generales en respuesta a distintos estímulos que disparan la apoptosis. (Figura 4) (Thornberry y Lazebnik 1998; Hengartner 2000; Fuentes-Prior y Salvesen 2004).

1. Activación de una caspasa cascada arriba, la manera más simple de activar una pro-caspasa es exponerla a otra, previamente activada, esta estrategia es utilizada para activar las pro-caspasas -3, -6 y -7. Sin embargo, este mecanismo no explica como la primera caspasa se activa.

2. Inducción por proximidad ha sido un mecanismo que le da explicación a las caspasas iniciadoras, como la -8, -2 y CED-3. Dicho mecanismo ha sido considerado en la ruta del receptor Fas (CD95/Apo-1) en donde la caspasa-8 es la primera caspasa en activarse. Consiste en que la activación de los dominios muerte del receptor Fas causan reclutamiento de muchas moléculas de pro-caspasa -8 con baja actividad proteasa intrínseca suficiente para que las moléculas se corten y se activen mutuamente.

3. Asociación con una subunidad reguladora, este mecanismo ha sido propuesto para la activación de la pro-caspasa -9 en donde dicha molécula necesita unirse con una proteína cofactora, Apaf-1 (factor activador de apoptosis), y citocromo c

permitiendo así cambios conformacionales que culminan en su

activación.

18

Figura 4. Mecanismos de activación de caspasas. En a) se muestra el mecanismo de activación de caspasas cascada arriba, en b) el modelo de inducción por proximidad, en c) el mecanismo de asociación con una subunidad reguladora. (Hengartner 2000)

La activación de las caspasas resulta en una activación e inactivación de distintas proteínas celulares. En la mayoría de los casos, las caspasas inactivan a la proteína blanco, pero la activación de una proteína se puede dar cortando un dominio regulador negativo o inactivando una subunidad reguladora (Figura 5) (Hengartner 2000). Dentro de las proteínas blanco que se inactivan por acción de las caspasas se encuentran las enzimas reparadoras del ADN, lámina, gelsolina, MDM2 (inhibidor de p53), y proteína cinasa Cδ entre muchas otras. Dentro de proteínas que se activan por acción de las caspasas ya sea directa o indirectamente se encuentran cinasa p21-activada por proteína cinasa 2, CAD (DNasa activada por caspas) entre otras (Strasser et al., 2000).

19

Figura 5. Cortes proteolíticos por caspasas pueden dar una diversidad de resultados, dependiendo de la naturaleza del substrato y la posición exacta de corte en la secuencia primaria de la proteína. a) y b) pérdida de la actividad biológica como la ADP-ribosa polimerasa y lamina. C) y d) ganancia de la actividad biológica como Bcl-2, Bcl-xL (formas dominantes negativas) y remoción de dominios inhibitorios como PAK2, Bid, CAD/ICAD (Hengartner 2000).

Proteínas adaptadoras Las proteínas adaptadoras son las moléculas responsables de las uniones entre los efectores de muerte celular, es decir, las caspasas, y los reguladores de muerte celular, como los receptores muerte y los miembros de la familia Bcl-2 (Strasser et al., 2000). Asociaciones entre proteínas adaptadoras y caspasas o miembros de la familia TNF-R se dan a través de interacciones homotípicas o interacciones intrafamiliares entre los dominios conocidos como dominio muerte (DD), dominio efector muerte (DED) y dominio de reclutamiento de caspasas (CARD), es decir DD/DD, DED/DED y CARD/CARD (Budihardjo, Oliver et al. 1999). Sin embargo, análisis estructurales han mostrado que existe suficiente

20

superficie de área en estos dominios sugiriendo que además de las interacciones homotípicas cabría la posibilidad de interaccionar con otra clase de proteínas y por lo tanto, estos módulos adaptadores podrían también actuar como plataformas de integración uniendo distintas proteínas que pudieran modular la dimerización y potenciar la activación de caspasas (Hengartner, 2000). Dentro de las proteínas adaptadoras se encuentran FADD, RIP, FLIPL, RAIDD, CED-4, Apaf-1 (Figura 6). Por ejemplo, FADD (proteína con dominio muerte asociada a Fas) forma parte del llamado complejo de señalización de inducción de muerte (DISC), es decir, receptor muerte Fas-FADD-caspasa-8 (Lang, Szabo et al. 1999). De esta manera la molécula adaptadora interacciona por un lado, cascada arriba con un regulador de muerte celular, y por otro, cascada abajo con un efector de muerte celular.

Figura 6. Proteínas adaptadoras mostrando dominio muerte (DD), dominio efector muerte (DED) y dominio de reclutamiento de caspasas (CARD). Apaf-1 y Ced-9 tienen dominio conservados ATPasa, y Apaf-1 también tiene repeticiones WD40 en su dominio C-terminal. FLIPL inhibe a FADD quien media la activación de la caspasa.8 (Strasser et al., 2000).

Familia Bcl-2 La familia de proteínas Bcl-2

han sido consideradas como uno de los

principales reguladores en la ruta intrínseca del proceso apoptótico (Danial y Korsmeyer 2004). Inicialmente, Bcl-2 fue identificada como producto del oncogen bcl-2

(Vander Heiden, 1999) siendo uno de los miembros de una familia de

moléculas pro y antiapoptóticas. Debido a la homología compartida entre cuatro regiones conservadas llamadas homologías Bcl-2 (BH) dominios 1-4, la familia de proteínas Bcl-2

han sido divididas en tres grupos; los miembros del grupo I

poseen una actividad antiapoptótica y poseen dominios BH1-4, ejemplo de ellos 21

son Bcl-2, BclxL, Mcl-1, entre otros. Los miembros del grupo II poseen dominios BH1-3, y presentan actividad proapoptótica, a este grupo pertenecen Bax y Bak. Miembros del grupo III también con actividad proapoptótica, contienen un solo dominio BH3, ejemplo de este grupo es Bid (Figura 7) (Hengartener 2000; Danial et al., 2004 y Strasser et al., 2000). Los dominios BH de varios miembros de la familia juegan un papel importante en la habilidad de interactuar entre ellos, de esta manera se ha visto que estas proteínas se encuentran en la célula formando heterodímeros; todos los miembros de esta familia contienen en su dominio Cterminal una región de anclaje a la membrana, lo que permite que estas proteínas puedan anclarse a la membrana externa mitocondrial, membrana del retículo endoplásmico y la membrana que envuelve al núcleo (Bortner et al., 2002).

Figura 7. Comparación estructural entre los miembros de la familia de proteínas Bcl-2. Estas pueden dividirse en dos subgrupos, aquellas que inhiben la apoptosis y aquéllas que la potencian. Regiones numeradas del 1 al 4 indican los dominios homólogos Bcl-2 BH 1-4. Los dominios transmembranales (TM) son indicados en gris. Solo el dominio C-terminal de 200 aminoácidos de Mcl-1 es mostrado (Strasser et al., 2000)

Hasta la fecha se han propuesto varios mecanismos para explicar cómo los miembros de la familia Bcl-2 participan en la regulación de la apoptosis, esencialmente en la liberación del citocromo c y otras proteínas intramembranales inductoras de la apoptosis de la mitocondria. Ninguno de estos mecanismos ha

22

sido probado definitivamente. Existen tres modelos básicos que explican la regulación de los miembros de la familia Bcl-2 durante la apoptosis (Figura 8) (Hengarter, 2000). 1. Los miembros de la familia Bcl-2 forman canales que facilitan el transporte de proteínas. 2. Los miembros de la familia Bcl-2 interactúan con otras proteínas para formar canales. 3. Los miembros de la familia Bcl-2 inducen la ruptura de la membrana externa mitocondrial.

Figura 8. Mecanismos de participación de los miembros de la familia Bcl-2 en apoptosis (ruta intrínseca). De izquierda a derecha: •

Formación de un poro por donde el citocromo c y otras proteínas intramembranales pueden escapar.

•

Heterodimerización entre miembros de la familia pro y antiapoptóticos. La dimerización se logra cuando un

miembro con dominio BH3 se une a otro miembro con dominios BH1, BH2 y BH3, los cuales forman una hendidura hidrofóbica. •

Directa regulación de caspasas vía moléculas adaptadoras.

•

Interacción con otras proteínas mitocondriales, como VDAC (canal aniónico voltaje dependiente), ATN

(transportador del nucleótido de adenosina), ya sea para formar un poro por donde se libere el citocromo c, o para modular la homeostasis mitocondrial (por ejemplo, apertura del poro de permeabilidad de transición PTP). •

Oligomerización para formar un canal iónico débilmente selectivo (Hengarter, 2000)

23

Familia de receptores TNF: Receptores muerte Los receptores muerte pertenecen a la superfamilia de receptores TNF (Factor de Necrosis Tumoral) (Uings, et al., 1999); dichos receptores se caracterizan principalmente por la presencia de múltiples cisteínas en la parte extracelular, pudiendo variar de dos a seis repeticiones, además por la cara citoplasmática contienen una secuencia de

70-80 aminoácidos denominada

dominio muerte, dominio esencial para la inducción de apoptosis, además contienen un dominio transmembranal (Ashkenazi y Dixit 1998).

Los receptores muerte tienen acción pleiotrópica, es decir, dependiendo del tipo celular y otras señales que la célula recibe pueden, iniciar proliferación, diferenciación o muerte celular (Strasser et al., 2000). Estos receptores son activados por un grupo de ligandos estructuralmente similares que pertenecen a la familia de ligandos TNF, la mayoría son sintetizados como trímeros que se anclan a la membrana, en la región extracelular están formados por alrededor de 150 aminoácidos y en la parte intracelular tienen alrededor de 77 aminoácidos (Nagata 1999).

Los receptores muerte mejor caracterizados son CD95 y TNFR1. CD95 es también conocido como Fas o Apo1 y TNFR1 también es llamado p55 o CD120. Otros receptores muerte son, DR3 también llamado Apo3, WSL-1, TRAMP o LARD; el receptor muerte DR4; el receptor muerte DR5 conocido también como Apo2, TRAIL-R2, TRICK 2 o KILLER y el receptor muerte CAR1 (figura 9); sus ligandos respectivamente son CD95L, TNF, infotoxina α, ligando Apo3 (Apo3L, también llamado TWEAK) y ligando Apo2 (Apo2L o TRAIL) para DR4 y DR5, el ligando para CAR1 hasta la fecha no es conocido (Figura 9) (Ashkenazi et al., 1998).

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Figura 9. Comparación estructural entre los receptores muerte. Las regiones extracelulares de unión al ligando son caracterizadas por repeticiones ricas en cisteínas. Además contienen un dominio muerte en la región intracelular esencial para la señalización en la apoptosis Los receptores muerte funcionan como trímeros y como multímeros de trímeros, por simplicidad una única cadena polipeptídica es mostrada. Todas las proteínas mostradas son de mamífero, excepto CAR1, que es de pollo. (Strasser et al., 2000)

¿Y los canales iónicos?... Varios canales iónicos así como transportadores han sido recientemente implicados en la participación de la apoptosis (Gulbins et al., 2000). Como se mencionó anteriormente, la disminución del volumen celular es un cambio morfológico que se lleva a cabo durante la apoptosis. Los canales iónicos así como otros sistemas de transporte forman parte de la regulación del volumen celular por lo tanto el encogimiento celular como ya ha sido establecido, involucra la pérdida de iones y junto con ello el paso del agua del interior hacia el exterior celular. Otra implicación de los canales iónicos en la apoptosis a sido evidenciada en la modulación que éstos tienen para la activación de caspasas y nucleasas (Razik y Cidlowski 2002). El mantenimiento de un ambiente iónico intracelular en condiciones fisiológicas favorece la sobrevivencia de la célula o dicho de otra manera, es un aspecto importante en la represión de la apoptosis. Canales de K+ Un primer grupo de canales iónicos considerados en el proceso de apoptosis son los canales de potasio. La pérdida de K+ y el encogimiento celular han mostrado ser un requerimiento absoluto para la apoptosis. Varios canales de potasio han sido implicados en la disminución del volumen celular apoptótico (apoptotic volume decrease, AVD) y como consecuencia en apoptosis inducida por estimulación ya sea vía ruta extrínseca o vía ruta intrínseca. Entre estos destacan el rectificador tardío neuronal (IK), el 25

receptor a NMDA, canales de potasio dependientes de ATP (KATP), canales de potasio dependientes de Ca+2 (KCa), canales de potasio con dominio de dos poros (K2P), y el Kv1.3 en linfocitos Jurkat (Barros, Castro et al. 2002; Patel y Lazdunski 2004; Remillard y Yuan 2004). Importancia del ion K+ en el proceso apoptótico Intracelularmente, el ión K+ es el que se encuentra en mayor concentración (140 mM), pero durante el proceso apoptogénico dicha concentración disminuye hasta concentraciones de 50mM para timocitos tratados con dexametasona (Hughes, Bortner et al. 1997) y 56mM para células Jurkat tratadas con estimulación del receptor CD95 (Bortner, Hughes et al. 1997).

Figura10. Salida de K+ celular en células apoptóticas es simultáneo con otros eventos. Células Jurkat control (A y D) y tratadas con anti- Fas (50ng/ml: B y E) o Etoposide (50 µM: C y F). La pérdida de K+ intracelular (Círculos negros) inicia entre 1-2 horas después del estímulo apoptótico, al igual la externalización de la fosfatidilserina (cuadros negros), el encogimiento celular (cuadros blancos) y la perdida del potencial de membrana mitocondrial (círculos blancos). Los experimentos también se desarrollan en presencia de z-VAD.fmk (20µM, D-F). El eje de las ordenadas (lado derecho) despliega el cell- pellet [+Rb] como razón del control KR (Thompson et al., 2001)

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Estudios en células Jurkat tratadas con anti-Fas (50 ng/ml) o Etoposide (50 µM) sobre la pérdida de K+ intracelular muestran que dicha pérdida se lleva a cabo después de la primera hora de iniciar la apoptosis (Figura10). Este evento es simultáneo a la externalización de la fosfatidilserina, encogimiento celular y pérdida del potencial de membrana mitocondrial que inicia entre la primera y segunda hora después del estímulo apoptótico, aunado a la dependencia en la activación de caspasas (Thompson, Langlais et al. 2001). Dallaporata et al., (1998) mostraron que la pérdida de K+ citosólico ocurre en la fase de degradación apoptótica en timocitos estimulados con anti-Fas o con dexametasona y que esto ocurre tras la pérdida del potencial de membrana mitocondrial, externalización de la fosfatidilserina y la activación de caspasas, pero antes del encogimiento celular y de que la membrana plasmática se vuelva permeable; Además, la perdida de K+ en fases de degradación,

facilita la

activación de las endonucleasas que degradan la cromatina así como la activación de caspasas (Figura 11 y12)

Figura 11. La actividad de caspasas y nucleasas es restringida en células con bajo K+ intracelular. Timocitos tratados con 1µM de Dexametasona por 2 horas. A) Distribución del tamaño en timocitos en dos distintas subpoblaciones. B) Fluorescencia de PBFI-AM asociada con las subpoblaciones normal y encogida. C) Histograma de DNA que muestra el contenido de DNA de las subpoblaciones de tamaño normal y encogido. D) Actividad de caspasa-3 extraída de timocitos de tamaño normal y encogidos. (Hughes et al., 1997)

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Figura 12. Relación de la salida de K+, actividad de caspasas y nucleasas en apoptosis. En timocitos tratados con dexametasona (1µM) la concentración de K+ intracelular disminuye de manera dependiente del tiempo A), así como también dependiente de la actividad de caspasas B) y la fragmentación del DNA se incrementa C). La disminución de los niveles de K+ intracelular inicia después de las 2 horas de aplicar el estímulo apoptótico así como la activación de caspasas y nucleasas. La medición intracelular de K+ se realizó por citometría de flujo y fluorescencia PBFI sensible a K+ (Hughes et al., 1997).

Canales de ClUn segundo grupo de canales iónicos involucrados en la apoptosis son los canales de cloro. Estos al igual que los canales de potasio han sido implicados en la AVD (Barros et al.,2002; Lang et al., 2000). El canal de cloro de rectificación saliente (ORCC), el cual probablemente este implicado en el pH celular o regulando el potencial de membrana (Lang, Lepple-Wienhues et al. 1998; Gulbins, Jekle et al. 2000; Yu y Choi 2000) de manera similar como lo hace el regulador de conductancia en fibrosis cística (CFTR) quien parece tener una participación en la acidificación celular, lo cual se ha sugerido que es importante en la cascada de señalización apoptótica (Gulbins et al., 2000).

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Canales de Ca+2 Además de los canales de potasio y de cloro, los canales de calcio tienen un rol importante en apoptosis que al parecer, depende del tipo celular y del estímulo. Así, se ha observado que la inducción de la apoptosis en linfocitos estimulados con Fas-L, es calcio-independiente, al menos durante los primeros 60 minutos donde se demostró que no aumenta el Ca+2 citosólico y que además se inhiben los canales ICRAC (calcium release-activated channels) (Lepple-Wienhues, Belka et al. 1999); mientras que Lee et al., (1999) reportaron que en neuronas, la apoptosis inducida por privación de factores de crecimiento es calcio-dependiente (Barros et al., 2002). El Ca+2 puede entrar a la célula a través de canales específicos de calcio; por ejemplo como los CRAC, o los canales catiónicos inespecíficos como receptores a glutamato (Lang et al., 1998). Los mecanismos propuestos para la participación del calcio en la apoptosis son Ca+2-calcineurina dependiente de desfosforilación y activación de la proteína proapoptótica Bad (Wang, Xu et al. 1999).

Defectos en al almacenamiento de calcio puede también inducir la

apoptosis por la activación específica de la caspasa 12 (Barros et al., 2002). Canales intracelulares de Ca+2 como el IP3R, también se han relacionado con el proceso de apoptosis (Jayaraman and Marks 1997). La modulación fina del Ca+2 intracelular que se libera vía IP3R se logra por la habilidad que tiene este receptor en integrar las señales de numerosas moléculas como nucleótidos, cinasas, fosfatasas, proteínas no enzimáticas así como el propio Ca+2 (Patterson, Boehning et al. 2004). Dicha modulación puede ser alterada durante el proceso de apoptosis por moléculas como el citocromo c, miembros de la familia Bcl-2 así como la caspasa 3 (Hirota, Furuichi et al. 1999; Boehning, Patterson et al. 2003; Thomenius y Distelhorst 2003; Boehning, van Rossum et al. 2005; Oakes, Bell et al. 2005).

Mitocondria y apoptosis

Los procesos metabólicos fundamentales ocurren en la mitocondria, oraganelo esencial para la sobrevivencia de todas las células eucarióticas. Sin embargo, la apoptosis es controlada también en estos organelos (Mayer y Oberbauer 2003).

Ejemplo de funciones de sobrevivencia son la fosforilación 29

oxidativa, el transporte de electrones en la cadena respiratoria, la β-oxidación de los ácidos grasos, así como el ciclo de Krebs (ciclo de los ácidos tricarboxílicos). La regulación de la apoptosis incluye la activación de ciertos canales membranales y la liberación de proteínas pro-apoptóticas de la mitocondria hacia el citosol, dichas proteínas activan a ciertas caspasas dando como resultado cambios morfológicos característicos durante la apoptosis (Vander Heiden y Thompson 1999; Hengartner 2000; Szewczyk y Wojtczak 2002), adicionalmente a esto, varias proteínas han sido identificadas en la prevención de la apoptosis a nivel de la mitocondria (Bortner y Cidlowski 2002). Mitocondria, ER y Ca+2

La mitocondria y el retículo endoplásmico (ER) son dos organelos físicamente y fisiológicamente acoplados, quizá el mejor ejemplo es la comunicación que existe entre ambos en el proceso de señalización por Ca+2. En las uniones estrechas entre el reticulo endoplásmico y la mitocondria se generan altos niveles de Ca+2 (estimados en un rango de 50-100 µm) después de la liberación de Ca+2 mediada por IP3R, lo que activa al uniportador de baja afinidad mitocondrial esto da como resultado la recaptura de Ca+2 por la mitocondria (Oakes et al., 2005). La recaptura de Ca+2 mitocondrial regula la forma y la amplitud de los transientes de Ca+2 citosólico y también la modulación de las enzimas del ciclo de Krebs dependientes de Ca+2 (Oakes, Bell et al. 2005) así como al poro de transición de permeabilidad (PTP) bajo un estímulo apoptótico intrínseco (Szalai, Krishnamurthy et al. 1999).

Regulación de la apoptosis vía mitocondrial

La regulación mitocondrial de la apotosis es usualmente activada por estímulos internos celulares; cambios en la función mitocondrial pueden ser responsables de los niveles incrementados de especies de oxígeno reactivas (ROS), así como la acidificación celular (Mayer et al. 2003; Vander Heiden et al., 1999). Otro insulto celular es el daño en el ADN que al igual que los niveles incrementados de (ROS) y la acidificación celular, activan la apoptosis vía mitocondria (ruta intrínseca) (Hengartener 2000). 30

Los reguladores en la apoptosis vía mitocondria pueden ser categorizados de acuerdo a su localización. Proteínas relevantes para la apoptosis en la membrana externa mitocondrial (OMM) son VDAC y miembros de la familia Bcl-2. Además un canal de alta conductancia en la membrana mitocondrial ligado a la apoptosis (MAC) ha sido caracterizado y postulado para permitir la difusión hacia el citoplasma de proteínas tan grandes como, o más grandes que el citocromo c (Pavlov, Priault et al. 2001). El translocador del nucleósido de adenina (ATN) se encuentra situado en la membrana interna mitocondrial (IMM). La creatina cinasa mitocondrial (mtCK) reside entre VDAC y el ATN en el espacio intramembranal. La mayoría de las proteínas pro-apoptóticas son almacenadas en el espacio intercrestal (invaginaciones de IMM), además la ciclofilina D y la cardiolipina que se asocian con el poro de transición de permeabilidad (PTP), están localizados en la matriz mitocondrial (Figura13) (Mayer et al., 2003).

Figura 13. Regulación mitocondrial en la muerte celular apoptótica. Los principales componentes del PTP son VDAC y ATN, que están de manera adyacente en la OMM y la IMM, respectivamente. Además de estas proteínas, el receptor a benzodiazepinas (PBR) y Bax/Bcl-2 en la OMM y ciclofilina D y cardiolifina en la IMM completan el complejo PTP. Bajo condiciones normales el PTP sirve como un sensor del pH en la matriz mitocondrial, Ca+2 en la matriz, potencial eléctrico, estado redox, y otros. El VDAC en condiciones no apotóticas es permeable a solutos de hasta 5kDa y funciona con la ayuda de mtCK como un puente para los sustratos de la cadena respiratoria como el ATP del espacio intramembranal mitocondrial hacia el citoplasma. Por otro lado el ATN, es impermeable, su función es generar un potencial electroquímico para la fosforilación oxidativa. Las proteínas apoptogénicas como citocromo c, smac/Diablo, AIF y otras son almacenadas en vesículas creadas por las invaginaciones en la IMM. Durante la inducción de la apoptosis, la conductancia y la permeabilidad de ATN se incrementan a 700pS y 1.5kDa, respectivamente. Esto permite un hinchamiento en la matriz mitocondrial por un influjo de agua causado por una compresión en el espacio intercristal. Las proteínas pro-apoptóticas

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son liberadas del espacio intercristal hacia el espacio intramembranal. Algunos autores, reportan que la liberación del citocromo c se da en ausencia de una despolarización en la IMM. El citocromo c expulsado hacia el citoplasma se puede lograr por la ruptura de la OMM o a través de canales formados por multímeros Bax con o sin VDAC. Hasta la fecha no existen datos claros de si las caspasas (2, 3 y 9) están realmente localizadas dentro de la mitocondria. El citocromo c, caspasas, ATP y Apaf-1 se asocian en el citosol para formar el apoptosoma (700kDa), complejo que activa la caspasa-9 (Mayer et al.,2003).

Entre las proteínas pro-apoptóticas

destacan el citocromo c, cuya función

fisiológica es la de acarreador de electrones en la cadena respiratoria, su función en la apoptosis es la activación de caspasa-9 cuando es liberado hacia el citoplasma. AIF, una flavoproteína, participa en el sistema de oxido-reducción a través de sus dominios NADH y FAD; en apoptosis, cuando se libera al citoplasma, ésta es transportada hacia el núcleo donde provoca condensación de la cromatina independiente de caspasa. Otra proteína con actividad nucleasa es la endonucleasa G. Otras proteínas apoptogénicas son las proteínas de shock térmico; smac/diablo (second mitochondria-derived activator of caspases/direct inhibitor of apoptosis binding-protein with low pI);

Apaf-1 (apoptosis protease

activiting factor-1); caspasas -2, -3 y -9; y HtrA2 (Mayer et al., 2003; Szewczyk et al., 2002; Hengarter 2000).

Existen

diferentes teorías de cómo es inducida y regulada la apotosis

mitocondrial. En la figura 13 se esquematiza a la mitocondria y sus elementos para dar explicación a este proceso (Mayer et al., 2003; Szewczyk et al., 2002; Hengarter 2000). •

Rutas dependientes del PTP

BAX/BAK Y VDAC FORMAN MEGACANALES. El excesivo influjo de Ca+2 hacia la mitocondria debido a algún estímulo interno incrementa la conductividad del ATN, esto es seguido por un influjo de protones y de iones a través del ATN que causan un hinchamiento mitocondrial. Como consecuencia, se liberan las proteínas pro-apoptóticas del espacio intercristal y escapan hacia el citoplasma por la formación de megacanales o ruptura de la OMM. BCL-XL PUEDE SER NECESARIO PARA EL TRANSPORTE FISIOLÓGICO DEL ATP POR VDAC. La apoptosis puede ser inducida por el bloqueo de la función normal del VDAC debido a miembros pro-apoptóticos de la familia de proteínas Bcl-2. De esta manera Bcl-xL estabilizaría a VDAC para mantenerlo abierto y éste 32

último ejercer su función, que es la de transportar el ATP a el citoplasma. El cierre de VDAC por Bax o Bak pudiera permitir una acumulación de ATP, mal funcionamiento del ATN y con ello un hinchamiento de la mitocondria para finalmente iniciar la apotosis. •

Rutas independientes del PTP

LIBERACIÓN DEL CITOCROMO C SIN LA DESPOLARIZACIÓN DE LA IMM. Péptidos con dominio BH-3 son capaces de oligomerizar Bax en la OMM, los poros de los oligómeros en la OMM son los suficientemente grandes como para pasar moléculas de hasta 1.2mDa, tamaño apto para liberar a las proteínas apoptogénicas. Este proceso puede ser bloqueado por proteínas anti-apoptóticas como Bcl-xL. CAMBIOS EN EL pH QUE CRUZAN LA IMM INDUCEN APOTOSIS. Bajo algunas circunstancias, cambios en el pH pudieron ser observados antes de la liberación del citocromo c y la activación de caspasas. El pH influencia la habilidad de los miembros de la familia Bcl-2 en formar homo y heterodímeros; además la inserción de los miembros Bcl-2 en la OMM es pH dependiente.

Mecanismos celulares en la inhibición de la apoptosis

Los mecanismos responsables de la represión en el proceso apoptogénico pueden actuar a tres niveles: a nivel de caspasas, a nivel de mitocondria y a nivel de membrana plasmática (Bortner et al., 2002).

En las figuras 14, 15 y 16 se esquematizan los mecanismos implicados en la inhibición.

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Figura 14. Inhibición de la apoptosis a nivel de caspasas. IAPs (proteínas inhibidoras de apoptosis) inhiben caspasas iniciadoras y efectoras, pero no aquellas asociadas con receptores muerte, como la -8. CrmA es un inhibidor de caspasa del virus cowpox, este inhibidor ha mostrado ser efectivo con caspasas asociadas con los receptores muerte y no con las caspasas cadena abajo. Un inhibidor específico de la caspasa -8 conocido como FLIP previene la apoptosis uniéndose a DISC. p35 aislado del bacuolovirus inhibe de manera amplia a las caspasas ya sea iniciadoras o efectoras casi con la misma eficiencia (Modificado de Bortner et al., 2002).

Figura 15. Inhibición de la apoptosis a nivel de mitocondria. Los miembros ani-apoptóticos de la familia Bcl-2 inhiben la apoptosis a nivel de mitocondria manteniendo una función fisiológica normal en este organelo y previniendo la liberación de factores apoptogénicos. Interacciones directas entre pro y miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2 pueden arrebatar la protección provista por los miembros anti-apoptóticos Bcl-2. (Modificado de Bortner et al., 2002).

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Figura 16. Inhibición de la apoptosis a nivel de membrana plasmática. Concentraciones fisiológicas normales de potasio intracelular han mostrado prevenir la actividad nucleasa durante la apoptosis así como la activación de las caspas efectoras sugiriendo que el ambiente iónico celular es una determinante para la regulación de la apoptosis a nivel de membrana plasmática (Modificado de Bortner et al., 2002).

Señalización en apoptosis Como ya se mencionó anteriormente, los cambios bioquímicos inherentes al proceso de apoptosis se deben a la acción de las caspasas activadas mediante una serie de estímulos apoptóticos. Dichos estímulos se pueden dar a través de dos caminos. La vía extrínseca o ruta de receptores muerte; y la vía intrínseca o ruta de muerte mitocondrial (Remillard et al., 2004). En el apartado de mitocondria y apoptosis se mencionó que este último camino apoptótico se debe a una disrupción en la membrana mitocondrial que conlleva a la liberación de proteínas apoptogénicas como el citoromo c y Apaf-1 hacia el espacio citoplasmático que activan a la procaspasa-9 mediante el complejo heptamérico Apaf-1 - citocromo cATP denominado apoptosoma (Mayer et al., 2003). El apoptosoma activa la procaspasa-9 que en turno activa las caspasas efectoras -3/-6/-7 en el citoplasma para finalmente culminar en apoptosis. Otras proteínas mitocondriales liberadas

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como Smac/Diablo, AIF, HtrA2 antagonizan las acciones de los inhibidores de las caspasas (Hengarter 2000). La ruta extrínseca es iniciada por la activación de receptores muerte transmembranales, uno de ellos el receptor CD95 se une a su ligando CD95L. El modelo actual del receptor CD95 en la señalización de apoptosis predice que bajo trimerización u oligomerización del receptor, FADD se une al dominio muerte del receptor, y esta molécula adaptadora en turno, se une a la caspasa -8 quien a su vez activa bajo dos distintas circunstancias tanto a Bid, como a la caspasa efectora -3 (Gulbins, Jekle et al. 2000). La apoptosis puede dividirse en tres fases. La fase inicial, la fase efectora y la fase de degradación. La fase inicial de señalización del receptor CD95 se puede dividir a su vez en 5 pasos: (I) Pre-asociación del receptor independiente de ligando a través de un dominio PLAD en N-terminal. (II) Formación de microagregados del receptor. (III) Formación del DISC (complejo de señalización de inducción de muerte), el cual es dependiente de filamentos de actina. (IV) Agregados de receptor CD95 dependiente de la activación de la caspasa-8. (V) Internalización del DISC (Algeciras-Schimnich, Shen et al. 2002). La fase efectora se caracteriza por una despolarización en el potencial de membrana mitocondrial (∆ψm), liberación del citocromo c y/o activación de caspasas citoplasmáticas. Por último, la fase de degradación con cambio estructural del ADN donde las caspasas efectoras escinden láminas e ICAD (Remillard y Yuan 2004). La ruta de señalización apoptótica mitocondrial es exclusiva de algunos tipo celulares como los hepatocitos, donde independientemente de niveles de expresión normal de DC95 en la superficie celular así como de moléculas de señalización, la formación del DISC es ineficiente para activar suficiente caspasa 8 la cual activaría subsecuentemente a las caspasas -3/-6/-7, caspasas efectoras responsables de las características particulares en apoptosis. En cambio, esa pequeña cantidad de caspasa -8 activada es suficiente para escindir a Bid, miembro de la familia Bcl-2, que en turno es translocada hacia la mitocondria resultando en la activación de la ruta intrínseca para la apoptosis previamente descrita. Por el contrario, células, como los timocitos y las células T periféricas, requieren la suficiente activación de la caspasa-8 para que ésta active directamente la caspasa -3 (Scaffidi, Fulda et al. 1998).

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Adicionalmente a estas moléculas señalizadoras, las esfingomielinasas han manifestado tener una función importante en la apoptosis (Kolesnick y Kronke 1998; Gulbins, Jekle et al. 2000; Szabo, Adams et al. 2004). Al menos tres diferentes esfingomielinasas han sido clasificadas de acuerdo a su pH óptimo. Esfingomielinasas ácida, neutra y alcalina; en particular las esfingomielinasas ácida y neutra han sido implicadas en el proceso de apoptosis. La función de la esfingomielinasa ácida en la señalización vía receptor muerte sugiere que la enzima modifica la fluidez de la membrana por la formación de microdominios de ceramida, de esta manera, esta molécula no funcionaría como molécula señalizadora per se, sino que proporcionaría un ambiente adecuado para que el receptor inicie la señal de transducción intracelular por interacción con otras moléculas señalizadoras presentes en los microdominios ricos en ceramida o simplemente aproximando una alta densidad de receptores y proteínas que se les asocian intracelularmente. Lo mismo sucede con la esfingomielinasa neutra que al ser activada por receptores como TNF-α o CD95 produce ceramida. En particular la ceramida ha mostrado interactuar con KSR (cinasa supresora de Ras), proteína cinasa Cξ (PKCξ), proteína fosfatasa activada por ceramida y cinasa Raf-1. KSR está implicada en la regulación de Bad. PKCξ es considerada como una proteína anti-apoptótica; esta cinasa activa la ruta de las MAP cinasas resultando en la activación de un factor nuclear κB y a su vez inactivar el inhibidor de κB, por lo tanto promoviendo la mitogénesis. Además la actividad basal de PKCξ es incrementada por Bcl-2 y no es afectada por los inhibidores de caspasas (Wright y McMaster 2002). Otras moléculas activadas por ceramida son p56Lck, así como algunos canales iónicos implicados en la apoptosis (Gulbins et al., 2000 y Kolesninck et al., 1998). En la figura 17 se resume el proceso de señalización durante el proceso de apoptosis.

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Figura 17. Las dos rutas apoptóticas que involucran la estimulación de receptores muerte (camino extrínseco) y/o disrupción mitocondrial (camino intrínseco). Las principales proteínas que participan en la apoptosis se muestran en el esquema, así como los sitios moduladores para las proteínas reguladoras selectas. AIF, factor inductor de apoptosis; AKT, proteína cinasa B; Apaf-1, factor apoptótico activador de proteasa-1; ARC, represor de apoptosis con dominio de reclutamiento de caspasa; tBid, Bid cortado; cyt c, citocromo c; DIABLO, proteína de unión directa a IAPs con bajo pI; FADD, proteína con dominio muerte asociada a Fas; c-Flip, proteína inhibidora de caspasa -8; IAPs, inhibidores de apoptosis; ROS, especies de oxígeno reactivas; Smac, segundo activador derivado de mitocondria de caspasa; ∆ψm, potencial de membrana mitocondrial. (Modificado de Remillard et al., 2004).

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Capítulo II

Modulación del receptor a IP3 durante la apoptosis Las señales de calcio citosólicas son producidas por un incremento repentino en la concentración de iones libres de Ca+2 (Miyakawa, Mizushima et al. 2001). Procesos como la contracción muscular, proliferación celular, transmisión sináptica, fertilización, activación en células T antígeno-específica así como la muerte celular programada, son controlados por señales de calcio (Jayaraman y Marks 1997; Leyton y Quest 2004). Dichas señales pueden ocurrir por la apertura de canales permeables a Ca+2 localizados ya sea en la superficie de la membrana celular o en las membranas de los organelos intracelulares que contienen altas concentraciones de Ca+2. El receptor a trifosfato de inositol (IP3R) es una canal permeable a Ca+2 localizado en la membrana del retículo endoplásmico (ER) al cual se le atribuyen importantes funciones celulares, entre ellas, el fenómeno de apoptosis. Para su activación se requiere IP3 y Ca+2 y éste juega un papel muy importante en la generación de patrones espacio-temporales de señales de Ca+2, como ondas y oscilaciones de Ca+2 (Miyakawa, Mizushima et al. 2001). En este capítulo se revisarán su distribución, estructura, función, modulación, así como su participación y regulación en el proceso de apoptosis.

Distribución, localización celular e isoformas del IP3R El IP3R es ampliamente distribuido en sistemas vivos; su distribución va desde los humanos hasta organismos como Caernorhabsitis elegans (Bosanac, Alattia et al. 2002). Funcionalmente, el IP3R es una estructura tetramérica conformada por cuatro subunidades de ∼300kDa codificadas por un mRNA de ∼10kb, la estructura tetramérica puede ser homo o heterotetrámera (Harnick, Jayaraman et al. 1995; Jiang, Thrower et al. 2002) dicha estrucutra ha sido demostrada

por medio de experimentos con microscopía electrónica y

centrifugación con gradientes de azúcar (Sugawara, Kurosaki et al. 1997).

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En mamíferos, tres isoformas distintas son expresadas (IR3R1, IR3R2 e IR3R3) y cada una es codificada por un gen distinto, dichas isoformas son homólogas y comparten un ∼70% de identidad (Serysheva, Bare et al. 2003). Adicionalmente a esto, estudios de clonación molecular han revelado tres exones (SI, SII y SIII) para splicing alternativo (Harnick, Jayaraman et al. 1995; Jiang, Thrower et al. 2002), de lo que resultan diversas variantes de IP3Rs. Por medio de estudios inmunohistoquímcios, se han encontrado que los IP3Rs se encuentran en diferentes tejidos; así por ejemplo se han encontrado receptores en músculo liso, miocitos cardiacos, células endoteliales, neuronas, hepatocitos, linfocitos B y T (Jiang et al., 2002; Harnick et al., 1995).

A pesar del alto grado de homología que se presenta entre las distintas isoformas de IP3Rs, existen diferencias en los patrones de señalización por Ca+2 debida en parte a la expresión de los distintos subtipos que conforman el tetrámero en determinado tipo celular así como a la dependencia de Ca+2, ATP y sensibilidad al IP3. Un estudio en linfocitos B genéticamente manipulados (células DT40) que expresan funcionalmente un solo subtipo o la combinación de dos subtipos (1/2, 1/3, 2/3) (Miyakawa, Maeda et al. 1999) mostró, que la señalización por Ca+2 que se produce tras la estimulación de los receptores BCR en células que expresan únicamente un solo subtipo de receptor es diversa; así cuando se expresa únicamente la isoforma 2 se producen oscilaciones de Ca+2 (incrementos periódicos del Ca+2 intracelular) de forma regular (figura 18 C); en cambio en células mutantes que expresan ya sea la isoforma 1 o la 3 se observan oscilaciones de Ca+2 de manera menos regular y transientes de Ca+2 monofásicos, respectivamente (figura 18 B y D). De esta manera, la combinación específica de isoformas de IP3R expresadas puede conducir a la célula hacia patrones particulares de señalización por Ca+2.

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Figura 18. Señalización por Ca+2 en células DT40 que expresan un solo subtipo de receptor tras la estimulación del receptor BCR. (A-D) Respuesta del Ca+2 en células individuales tras la estimulación de BCR con anti-BCR (1µg/ml). Células silvestres (A) y células mutantes que expresan la isoforma 1(B), 2 (C) o 3 (D) a la concentración usada de anticuerpo. 95% de las células por lo menos exhibieron un transiente de Ca+2 en un lapso de 220s en todos los tipos celulares. Los gráficos de arriba y de abajo muestran trazos representativos de respuestas tempranas y tardías, respectivamente. El anticuerpo fue aplicado como se muestra en la barra horizontal debajo de los trazos. (E) Histograma del número de oscilaciones de Ca+2 dentro del lapso de 220s tras la estimulación de BCR. (Modificado de Miyakawa et al., 1999).

En linfocitos, existe evidencia genética que confirma la expresión de estas tres isoformas (Khan, Steiner et al. 1992; Harnick, Jayaraman et al. 1995; Sugawara, Kurosaki et al. 1997) aunque los niveles de expresión son distintos dependiendo de la respuesta celular. Por ejemplo, durante la apoptosis por medio de estudios inmunohistoquímcios así como hibridación in situ se ha revelado que la población de IP3R3 aumenta (Khan, Soloski et al. 1996; Semenova, Kiselev et al. 1998; Blackshaw, Sawa et al. 2000). Estudios con microscopía confocal han revelado que la isoforma 1 en linfocitos (aunque no excluyen la posibilidad de que sea una combinación de las tres isoformas) se encuentra localizada intracelularmente ya sea en el retículo endoplásmcico (ER) adyacente a la superficie interna de la membrana plasmática o en la región perinuclear (figura 19) (Harnick et al., 1995). Sin embargo, estudios realizados por Khan y colaboradores (1992 y 1996) (Khan, Steiner et al. 1992; Khan, Soloski et al. 1996) con técnicas de cromatografía de alta afinidad para la detección de azúcares que se unen a proteínas membranales (manosa para la membrana de RE, y ácido siálico y N-acetilglucosamina para la membrana plasmática) y técnicas inmunohistoquímicas así como “patch clamp” (Semenova, Kiselev et al. 1998),

han reportado la presencia de receptores a IP3 en la

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membrana plasmática de linfocitos y macrófagos respectivamente, aunque su función y/o presencia no es del todo clara.

Sin embargo, algunos estudios

sugieren que puede funcionar como proteína de andamiaje por sus numerosas uniones a proteínas como ankirina, 4.1N, miosina, homer, entre otras (Patterson, Boehning et al. 2004).

Figura 19. Inmunocitoquímica de IP3R en linfocitos humanos T (Jurkat). Células permeabilizadas con 100% metanol por 5 minutos y teñidas con anti-IP3R y un conjugado de rodamina como anticuerpo secundario. Se muestran secciones seriadas de linfocitos T representativos a intervalos de 10°A. IP3R es detectado dentro de la célula y en el RE adyacente a la superficie interna de la membrana plasmática. Tinción de la membrana perinuclear se observa en los paneles c y d (columnas de la izquierda). Para co-localizar al ER se usó una anti-proteína disulfuro isomerasa b y d (columnas de la derecha) (Modificado de Harnick et al. 1995).

Estructura de IP3R La morfología de los receptores a IP3 (IP3R) es un tópico que a la fecha ha sido esclarecido en gran medida. Entender la estructura de los receptores espacialmente es relevante ya que de esta manera es posible entender la activación, modulación y selectividad iónica, todas ellas, propiedades inherentes al funcionamiento de este canal.

42

Topológicamente, el IP3R está constituido por tres dominios o regiones: 1) una región grande citoplasmática con un sitio de unión al IP3 cercano al Nterminal, 2) una región transmembranal próxima al C-terminal y 3) una cola corta C-terminal (Hamada, Terauchi et al. 2003)

Cada subunidad que conforma al receptor tiene alrededor de 2,749 residuos de

aminoácidos

(Serysheva,

Bare

et

al. 2003). Estudios

de

hidrofobicidad, de biología molecular, bioquímicos, y electrofisiológicos ponen de manifiesto que el dominio N-terminal (residuos 1-2275) y C-terminal (residuos 2590-2749) se encuentran dando la cara hacia la región del citoplasma. Además del sito de unión al IP3 localizado en la región N-terminal (residuos 226-578), se encuentran también otros sitios de unión alostéricos para distintas moléculas efectoras intracelulares (Ca+2, calmodulina y ATP) y sitios de fosforilación por proteínas cinasas (proteína cinasa dependiente de AMPc, proteína cinasa G, proteína cinasa dependiente de Ca+2/Calmodulina y tirosina cinasa) (Hamada, Miyata et al. 2002);esta región para dichos sitios también es conocida como dominio central modulador (Bosanac, Alattia et al. 2002) . La región transmembranal (residuos 2276-2549) la forman seis hélices y además existe una asa grande de 106 aminoácidos que incluye dos secuencias cortas hidrofóbicas y dos sitios para N-glicosilación; entre el quinto y sexto segmento transmembranal se encuentra esta asa que da al lado luminal del ER. Se ha sugerido que una secuencia corta de esta asa grande forma el asa de poro o asa P (Jiang, Thrower et al. 2002)

Las hélices median la oligomerización del receptor y contribuyen con la estructura del poro, las hélices 5 y 6 juntas con el asa de poro forman el poro mismo (Da Fonseca et al., 2003).

El canal del poro comparte similitud en

+

estructura con los canales de K voltaje-dependientes y con los canales de calcio. El filtro de selectividad lo comprende una secuencia de aminoácidos GVGD (2747-2550, secuencia en rata) con la selectividad al Ca+2 mediada por Asp 2550, determinada por mutagénesis sitio dirigida (Patterson et al., 2004). La figura 20 muestra las regiones anteriormente descritas.

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Figura 20. Representación esquemática para la estructura primaria del receptor a IP3. A)IP3R se divide estructuralmente en tres segmentos: un dominio citoplasmático N-terminal grande (∼80% de la masa total proteica) que contiene un sitio de unión para IP3 y la región reguladora; un dominio que forma al canal (∼10%) compuesto por seis hélices transmembranales; y una cola corta C-terminal. La mayoría de los sitios de unión para ligandos como Ca+2, calmodulina y ATP están localizados en el dominio citoplasmático. B) Vista ampliada de la región reguladora mostrando los sitios de unión para Ca+2, Calmodulina, ATP, Caspasa-3, ATP, PKA y PKG y otras proteínas reguladoras. C) Vista ampliada de la región del canal con el residuo Asp-2550, residuo crítico para la selectividad al Ca+2 (Modificado de Patterson et al., 2004)

La estructura tridimensional del IP3R en estado cerrado ha sido dilucidada a través de estudios con microscopía electrónica y técnicas de reconstrucción individual. Varios autores, entre ellos Jiang et al. (2002) Da Fonseca et al. (2003) y Serysheva et al., (2003) proponen un modelo tridimensional para IP3R de tipo 1 purificado de cerebelo de ratón y de bovino. Un primer reporte para la estructura tridimensional del IP3R1 fue hecho por Jiang et al. (2002); en este modelo el receptor adquiere la forma de una estructura primariamente globular con pequeñas proyecciones en uno de sus extremos (parecido

a

una

“pesa

de

ejercicio

asimétrica”

con

una

terminación

significativamente más grande que la otra), dicha estructura fue obtenida a 24°A de resolución; Da Fonseca et al., (2003) reportan que el IP3R presenta una estructura similar a una flor que esta hecha por tres distintos dominios conectados por uniones delgadas. El receptor comprende un dominio grande representado por los pétalos y estigma de la flor y un dominio pequeño representado por el tallo. Considerando la secuencia primaria del receptor los dominios grande y

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pequeño corresponden al dominio citoplasmático y dominio

del canal,

respectivamente. Un tercer modelo para el IP3R1 en estado cerrado fue reportado por, Serysheva et al (2003), ellos proponen que el IP3R1 comprende morfológicamente dos regiones distintas: una estructura parecida a una “molino de viento” que tiene cuatro barras en forma radial. Cada barra radial se conecta a una región central a través de un puente. La región central tiene forma de corona en una terminación y en la terminación opuesta tiene forma de embudo. La segunda región corresponde a una estructura con forma cuadrada localizada en el lado opuesto a la estructura de la girándula; dicha estructura tiene una depresión en la parte central. Ambas regiones están conectadas por una columna. La girándula corresponde al dominio citoplásmico, mientras que la estructura cuadrada corresponde al dominio transmembranal. El dominio de unión a IP3 se encuentra en las barras radiales. Interesantemente Boehning et al. (2000) encontraron que el dominio N-terminal del canal se une directamente al dominio C-terminal de la subunidad adyacente del tetrámero y lo activa (Patterson, Boehning et al. 2004). Ver figura 21.

Figura 21. Representación de superficie de la reconstrucción tridimensional del IP3R. La reconstrucción 3D se muestra en tres diferentes vistas. A, Dominio citoplasmático visto desde el citoplasma; B, vista del lado del dominio citoplasmático (arriba) y dominio transmembranal (abajo); C, Dominio transmembranal visto desde el lumen del RE; Terminaciones opuestas de la región central, el subdominio con forma de corona y la cavidad en forma de embudo, indicados con una punto azul y un punto rojo, respectivamente. Subdominios A, B, C, D y TM corresponden: A y B representan las barras radiales del molino de viento; C puente que une hacia la región central; D columna que conecta al dominio C; TM dominio transmembranal. (Modificado de Serysheva et al., 2003).

En general, la descripción de estos tres modelos es similar en cuanto a la representación general del receptor a IP3, todos ellos coinciden en que el dominio citoplasmático es mucho más grande (∼75% del volumen total) que el domino transmembranal con formas bien caracterizadas, unidos por puentes delgados;

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además en el dominio citoplásmico hay cuatro dominios radiales globulares conectados por uniones delgadas que podrían representar los sitios de unión al IP3 así como a otros sitios moduladores. Estos estudios dieron la pauta para que publicaciones posteriores mostraran la relación entre los cambios estructurales que presenta este receptor y la función que realiza, es decir, su activación y por lo tanto el eflujo de Ca+2 hacia el citoplasma. En el siguiente apartado se describe la relación estructura-función para este canal activado por ligando.

Relación estructura-función del IP3R El conocimiento de las interrelaciones espaciales y los re-arreglos entre el dominio de unión al ligando y el dominio del canal es central para el entendimiento de cómo el IP3R lleva a cabo la apertura del canal debido a un acoplamiento estructural. Dicha apertura es controlada por el IP3 y Ca+2 (Hamada, Miyata et al. 2002; Hamada, Terauchi et al. 2003) En años recientes se han reportado dos estados conformacionales para el IP3R regulados por calcio y de esta manera una posible explicación al mecanismo de activación de este receptor. Estudios con microscopía electrónica con una resolución de 4.3nm y proteólisis limitada del IP3R1 purificado de cerebelo de ratón, muestran que la unión alostérica del Ca+2 (concentración efectiva < 10-7 M) al receptor IP3R1 controla su activación modificando sus estados conformacionales, y además muestran que el IP3 apenas afecta dichos estados ya que el IP3R tripsinizado retiene la habilidad de liberarar Ca+2 (Patterson et al., 2004), indicando que cambios sutiles en conformación permiten la activación del canal (figura 22) (Hamada et al., 2003). Análisis estructurales del receptor en presencia de Ca+2 y sin Ca+2 revelaron dos distribuciones. La estructura del IP3R sin Ca+2 tiene una apariencia de “champiñón” la cual consiste en una cabeza cuadrada grande (dominio de unión al IP3 y dominio central modulador) y un dominio pequeño (domino de canal) unidos por cuatro puentes delgados. La estructura del IP3R con Ca+2 tiene una apariencia de “molino de viento” y también tiene los cuatro puentes que conectan al dominio de unión al IP3 hacia el dominio del canal.

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Figura 22. Efectos del Ca+2 en la proteólisis parcial del IP3R nativo. A, fragmentos proteolíticos del IP3R nativo purificado de cerebelo. IP3R fue digerido con Lys-C (0-5µg/ml) en presencia de 1mM de EGTA (izquierda) o 1mM de CaCa2 (derecha). Los productos de la lisis total fueron separados con un gel al 5% (arriba)

y doblemente marcados con +2

anticuerpos 4C11 y 18A10, se observan fragmentos de 100-105kDa en presencia de Ca . Una banda característica de 38kDa fue separada con un gel al 10% y marcada solo con el anticuerpo 4C11 (abajo), dicha banda fue predominantemente observada en la presencia de Ca+2. B, representación esquemática de la localización de los epítopes 4C11 y 18A10. C, Concentración efectiva de Ca+2 libre después de la unión o no unión del IP3 al receptor (10µM IP3) (Modificada de Hamada et al., 2003)

Estos dos cambios conformacionales denominados estado-S (Square, sin calcio) y estado-W (windmill, con calcio) sugieren una transición estructural causada por la re-localización de dominios funcionales donde el dominio puente juega un papel importante (figura 23).

Figura 23. Modelo global tridimensional para la re-localización a gran escala del dominio de unión al IP3 que permite la transición entre el estado-S y el estado-W. Posible región de unión para el IP3 (azul) con su ligando (rojo), fragmento de 38kDa (verde) y dominio canal (café) (Modificado de Hamada et al., 2003)

¿Cuál es el papel biológico de la transición S/W en el IP3R? Hamada et al., (2002) proponen dos modelos estructurales para las implicaciones funcionales de los cambios globales conformacionales. En el primer modelo llamado “modelo de largo alcance”, proponen que el Ca+2 como co-agonista, primero se une al IP3R 47

para provocar los dos estados conformacionales (estado-S y estado-W). El IP3 en turno, se une después a ambos estados a pesar de la presencia del Ca+2. El IP3 unido al estado-W abre el poro del canal (estado W’). En este modelo ellos postulan que el Ca+2 unido a este estado eficientemente transmite la señal de largo alcance, desde la región de unión del IP3, hasta el poro del canal. El segundo modelo propuesto lo llaman “modelo de dos pasos”. En este modelo el IP3

se

une

primero

al

estado-S

en

reposo

para

provocar

cambios

conformacionales finamente (no visto por microscopía electrónica hasta la fecha) desde la región de unión del IP3, hasta el domino del canal, resultando en un estado-S activado. Posteriormente el Ca+2 se une para disparar los cambios globales conformacionales que activen al estado-W y luego el canal se abra. En este caso, no puede haber eflujo de Ca+2 en el estado-W sin una pre-unión del IP3. Regulación del IP3R La complejidad y sofisticación en la regulación del IP3R es ejemplificado por su modulación a través de varias moléculas pequeñas. Fosforilación, nucleótidos y regulación por calcio, todos estos moduladores trabajan de una manera concertada para tener un control preciso sobre la función del IP3R (Patterson et al., 2004). Regulación por Ca+2 La actividad del IP3R es bifásicamente regulada por los niveles de [Ca+2] citoplasmático; en reposo, [Ca+2] citoplasmático es de ∼100 nM, incrementos en dichas concentraciones inducen liberación de Ca+2 inducida por IP3. En contraste, [Ca+2] citoplasmático mayores a 5 µM disminuyen la habilidad del IP3 de liberar Ca+2, posiblemente como un mecanismo de retroalimentación negativa que evita un exceso de [Ca+2] citoplasmático (Boehning, Patterson et al. 2003). Estudios con IP3R reconstituido revelan múltiples sitios de unión directa para el Ca+2, con una afinidad de ∼800 nM (Patterson et al., 2004) (Figura20), aunque hasta la fecha no ha sido determinado un papel funcional para estos sitios de unión; sin embargo, un residuo importante en la fisiología del receptor a IP3R es la asparagina en la posición 2100, dicho residuo es importante en la señalización del

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calcio intracelular realizada por este receptor. La mutación puntual de este residuo resulta en un decremento de 10 veces en la sensibilidad al Ca+2 por parte del receptor sin cambios en otras propiedades del canal, incluyendo la sensibilidad al IP3, de esta manera, se pone de manifiesto la importancia del ión Ca+2 como coagonista para el funcionamiento de este receptor intracelular (Miyakawa, Mizushima et al. 2001). El mecanismo exacto de la regulación por Ca+2 es aún controversial; sin embargo, se acepta generalmente que el Ca+2 inicialmente liberado por IP3R retroalimenta de forma positiva y de manera cooperativa para liberar más Ca+2 (Patterson et al., 2004).

Regulación por Nucleótidos El ATP influencia la función del IP3R independientemente de la fosforilación o energía dependiente del proceso (Miyakawa, Maeda et al. 1999; Patterson, Boehning et al. 2004). Por un lado, la sensibilidad al ATP para evaluar el Ca+2 liberado en células que expresan un solo subtipo es distinta; la isoforma 1 es altamente sensible a ATP; mientras que las isoformas 2 y 3 son menos sensibles (Miyakawa, Maeda et al. 1999). Adicionalmente a esto, cuando se evalúa la interacción funcional entre las distintas isoformas de IP3Rs, resulta, que la coexpresión de múltiples subtipos con respecto a la sensibilidad al ATP depende del subtipo dominante para dicho agonista (Miyakawa, Maeda et al. 1999). Este estudio por lo tanto demuestra que los patrones de señalización por Ca+2 intracelular dependen del tipo de isoforma implicada así como del agonista utilizado; además, existe una interacción entre los distintos subtipos que conforman al tetrámero. Estudios en vesículas reconstituidas que contienen IP3R purificado revelaron que el ATP maximiza el flujo de Ca+2, inducido por IP3 (∼100 µM ATP), además de que sugieren sitios específicos de unión para el ATP (figura 20) (Patterson et al., 2004). Los niveles de ATP en las células en reposo son ∼1 mM (Patterson et al., 2004). Por lo tanto la activación fisiológica del IP3R pude ocurrir cuando los niveles de ATP son depletados en un microambiente para el IP3R, como por ejemplo, cuando se activa la bomba de Ca+2 del retículo endoplásmico (SERCA) ya que este proceso requiere de la depleción del ATP. Además, debido a que el ER se encuentra cerca a la mitocondria, alteraciones en el ATP mitocondrial pueden regular al IP3R (Patterson et al., 2004). 49

Regulación del IP3R por fosforilación IP3R es fosforilado por múltiples cinasas (Figura20). Entre las cinasas que fosforilan al canal en residuos serina/treonina se encuentran: proteína cinasa dependiente de AMP cíclico (PKA), proteína cinasa dependiente de GMP cíclico (PKG) y PKC en las posiciones 1589 y 1755 para las primeras dos cinasas y para la tercera en otro sitio distinto (Patterson et al., 2004) (Figura20), Adicionalmente a estos residuos, las fosforilaciones de las tirosinas en la posición 353 y 482 (Harnick et al., 1995) (localizadas en región de unión al IP3) así como la tirosina 2617 (Harnick et al., 1995) (cercana a la región del poro del canal) han sido implicadas en la modulación de IP3R. La tirosina en la posición 353 del IP3R es fosforilada por Fyn, miembro de las proteínas cinasas pertenecientes a la Familia Src, in vivo e in vitro, receptor

(concentración

dicha fosforilación aumenta la afinidad del IP3 por su Rb (0.77) > NH4 (0.1) > Cs (0.02) > Na ( bulbo olfatorio, puente/médula >mescencéfalo, culículo superior, cuerpo estriado, hipocampo, corteza cerebral), pulmones, islotes, timo, bazo, nódulos linfáticos, fibroblastos, linfocitos B, linfocitos T, células pre-B, amígdala, macrófagos, microglia, oligodendrocitos, osteoclastos, plaquetas, testículo Regulación del potencial de membrana, volumen celular y señalización por calcio para la secreción de Interleucina-2 y proliferación celular en linfocitos. No establecidas

Blanco terapéutico para inmunosupresores; inhibidores de Kv1.3 suprimen la activación en células T in vitro y retardan un tipo de hipersensibilidad in vivo y ha sido efectivo en esclerosis múltiples; la expresión de Kv1.3 se incrementa dramáticamente y exclusivamente en células T efectoras de memoria Comentarios Co-ensambla con otros miembros de la familia Kv1 en heteromultímeros, pero no con miembros de otras familia de canales Kv. a 4-AP, 4-aminopiridina; TEA, tetraetilamonio; CTX, carybdotoxina; NTX, Noxiustoxina; KTX, Kaliotoxina; Shk-Dap, Toxina Stichodactyla helianthus-Acido diaminopropiónico;

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A continuación se presentan unos registros originales obtenidos en nuestro laboratorio para el Kv1.3 en células Jurkat. En ellos se muestran la activación, inactivación y recuperación de la inactivación del canal. (Figuras 34, 35 y 36).

Figura 34. Activación del canal Kv1.3 en linfocitos Jurkat. En la parte superior se muestra el protocolo de voltaje usado para activar corrientes de potasio en células Jurkat. Las corrientes fueron evocadas desde potencial de mantenimiento de 100mV a un rango de pulsos de -100 hasta +50mV por 35 ms, seguido de un pulso a –50 mV, provocando corrientes de cola (cierre de canales Kv1.3). En la parte inferior se muestra la gráfica para la corriente de cola relativa a -50mV en función de potencial inmediato anterior, lo que sirvió como medida de la probabilidad de activación dependiente de voltaje. Los puntos han sido ajustados con una curva de Boltzmann, con los parámetros dados en el grafico.

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Figura 35. Inactivación del canal Kv1.3 en linfocitos Jurkat. En la parte superior se muestra el protocolo de voltaje usado para provocar corrientes de potasio en células Jurkat observando su inactivación. Las corrientes (parte media) fueron evocadas para un rango de potenciales de prueba desde -70 hasta +50mV con una duración de 5s, seguido de un pulso a +50mV para medir la fracción de canales no inactivados durante el pulso despolarizante. La pause entre los pulsos fue de 35 s. La corriente fuga se midió entre -100mV y –70mV, donde canal permanece cerrado, y fue extrapolada como función lineal para potencial de prueba +50mV. Se muestran los registros representativos del Kv1.3. En la parte inferior se muestra la gráfica para la fracción de canales no inactivados medidos a +50mV, en función de voltaje inmediato anterior. Los puntos han sido ajustados con una curva de Boltzmann modificada, considerando que el canal no se inactiva a 100 % a ningún potencial.

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Figura36. Recuperación de la inactivación del canal Kv1.3 en linfocitos Jurkat. En la parte superior se muestra el protocolo de doble pulso. Las corrientes fueron evocadas desde –70 mV a +40mV con duración de 2.5 s, seguido de un pulso a +40 mV mas corto (cada 50 ms). El intervalo entre pulsos desde el valor inicial de 1 se aumentó cada vez por 4 s. La fracción de la corriente recuperada durante la pausa entre pulsos fue calculada como A2/A1, donde A1 es la amplitud de la corriente inactivada al primer pulso, y A2 es la amplitud de corriente de pico menos la corriente de base para el 1er pulso. En la parte inferior la cinética de salida desde el estado inactivado, A2/A1 en función del tiempo entre los pulsos. Los puntos han sido ajustados por una exponencial, con el tiempo característico de 10.8 s.

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Regulación de Kv1.3

El canal Kv1.3 es regulado por el potencial de membrana, de esta manera, a voltajes despolarizantes el canal se activa y permite fluir iones potasio hacia el lado extracelular. El potencial medio para activación del canal Kv1.3 en una célula Jurkat mostrada en la figura 34 es de -29.3 mV comparado con el potencial de reposo en linfocitos entre -35 a -70mV (Verheugen, Vijverberg et al. 1995). La dependencia de voltaje es una forma de regulación inherente de este canal por pertenecer a la familia Kv, pero además, existen otros factores de regulación que permiten que el canal dadas ciertas condiciones deje o no pasar el flujo iónico a través del poro.

Entre las formas de modulación del Kv1.3 se encuentra la

fosforilación de residuos tirosina, regulación indirecta por ceramida, regulación por lipid ratfs así como regulación por Bcl-2 en corrientes IKv de células vasculares de epitelio pulmonar (PASMC). Modulación de Kv1.3 por p56lck La fosforilación de proteínas

es una modificación post-transduccional

empleada en diversas vías de señalización intracelular

como mecanismo de

regulación en la actividad de las mismas (Bock, Szabo et al. 2003). Los canales iónicos son blanco de estos procesos y de esta manera se puede modificar la actividad del canal alterando sus propiedades electrofisiológicas tanto en células excitables como en células no excitables (Davis, Wu et al. 2001) El canal Kv1.3 ha mostrado ser fosforilado en residuos tirosina. En linfocitos T Jurkat, el canal Kv1.3 también es fosforilado en residuos tirosina tras la estimulación con Fas o ceramida, lo que conduce a la apoptosis. Dicha fosforilación inhibe la corriente de Kv1.3, que al parecer está mediada por la tirosina cinasa p56lck ya que una deficiencia en esa cinasa anula la inhibición de la corriente producida por Fas o ceramida, mientras que la reconstitución de p56lck vuelve a establecer el efecto (Figura 37) (Szabo, Gulbins et al. 1996; Gulbins, Szabo et al. 1997).

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Figura 37. Kv1.3 es tirosina-fosforilado tras un tratamiento con Fas. A): Fosforilación de tirosina del Kv1.3 (65KDa) bajo estimulación con anti-Fas a diferentes tiempos en células Jurkat; B) fosforilación del canal en células Jurkat, células tratadas con Herbamicina A (HA, inhibidor de Src) (10µM), JCaM 1.6 (Celulas Jurkat deficientes en p56lck) y JCam reconstituidas con lck (JCam + lck) tras la incubación con Fas-L en los tiempos indicados. (modificado de Szabo et al., 1996)

Los mecanismos moleculares por los que la fosforilación en residuos tirosina induce la inhibición del Kv1.3 no son del todo conocidos. Sin embargo, un estudio reciente realizado en células HEK 293 (Cook and Fadool 2002) muestra que dos proteínas adaptadoras expresadas en el bulbo olfatorio (región en donde se expresa Kv1.3) (ver tabla1), la proteína homóloga al colágeno neuronal (n-Shc) y la proteína de unión al receptor del factor de crecimiento 10 (Grb10) modulan diferencialmente: 1) el grado de fosforilación a residuos tirosina en el Kv1.3, 2) las propiedades biofísicas del canal y 3) los complejos físicos asociados con el Kv1.3 en presencia de cinasas Src. Por otro lado, otra cinasa, en particular p70zap, ha mostrado funcionar cascada abajo de las cinasas Src, quien pudiera mediar la fosforilación del canal (Gulbins, Szabo et al. 1997). Bajo un análisis mutacional, la regulación del Kv1.3 por Src está determinada por múltiples sitios de fosforilación, incluyendo Tyr137 en la región N-terminal del Kv1.3 (Davis et al., 2001) y Tyr449 en la región C-terminal (Holmes, Fadool et al. 1996); además la inhibición de Kv1.3 por EGFR (receptor a factor de crecimiento de epidermis) es mediada en un sitio distinto, Tyr479 (Davis et al., 2001). Cuando Kv1.3 es co-expresado en células HEK 293 con cinasas v-src o receptores a cinasas tirosina (como EGFR), el canal se fosforila y la corriente se suprime en un 95% (Holmes et al., 1996). Funcionalmente, el efecto de la fosforilación del Kv1.3, es decir la inhibición de la corriente, parece estar

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modulada por la activación del canal o la modulación en la cinética de activación (Holmes et al., 1996). La fosforilación en residuos tirosina del Kv1.3 fue medida usando co-inmunoprecipitación seguida de un análisis por Western blot, usando anticuerpos que reconocen específicamente al canal Kv1.3 y a diversas cinasas de tirosina; para determinar la correlación directa entre fosforilación del canal e inhibición de la corriente (estudios funcionales), se usó la técnica de patch-clamp en distintas modalidades.

Modulación de Kv1.3 por ceramida y lipid rafts Recientemente, se ha demostrado que los canales Kv1.3 co-localizan con los microdominios de membrana (Bock, Szabo et al. 2003; Martens, O'Connell et al. 2004). Estas pequeñas regiones de la membrana celular presentan características singulares diferentes del resto de la membrana, y en los últimos años han sido objeto de intenso estudio, pues se ha demostrado que en ellos se encuentran concentrados componentes de señalización que de cierta manera contribuyen a fortalecer

las vías para determinada respuesta celular. La

modulación de Kv1.3 por lipid rafts o microdominios de membrana ha sido recientemente revelada (Bock et al., 2003). Evidencia acumulada en años recientes, ha mostrado que la membrana plasmática no es una bicapa lipídica homogénea, pues en ciertas regiones contiene abundancia de esfingolípidos y colesterol, lo que le confiere una fase líquido-ordenada

con propiedades

biofísicas distintas del resto de la membrana celular (Martens, O'Connell et al. 2004, Dykstra, Cherukuri et al. 2003). Así los microdominios de membrana relativamente ordenados flotan en una bicapa desordenada de glicerofosfolípidos. Dichas regiones son denominadas lipids rafts (Dykstra, Cherukuri et al. 2003). Una característica importante de los lipid rafts es que permiten la segregación lateral de proteínas en la membrana plasmática, dicha capacidad provee un mecanismo para la compartamentalización de distintos componentes de señalización dentro de la membrana, concentrando a ciertos de ellos en los lipid rafts y excluyendo a otros (Dykstra, Cherukuri et al. 2003). El estudio de los canales iónicos asociados a los lipid rafts así como moléculas de señalización asociadas a los microdominios, es un tema que el los últimos años ha ido

73

incrementándose. Para una mejor comprensión del tema revisar Dykstra et al. (2003) y Martens et al. (2004) Un estudio realizado por Bock

y colaboradores (2003) muestra que el

canal Kv1.3 se localiza en lipid rafts (figura 38).

Figura 38. Localización de Kv1.3 en lipid rafts después de la estimulación de CD95.

A) Asilamiento bioquímico de

fracciones de membrana insensibles a detergente revelan la presencia de Kv1.3 en lipid rafts. Lipid rafts fueron aislados por ultracentrifugación de extractos solubilizados con Triton X-100 al 1% usando un gradiente de sucrosa. Los gradientes fueron separados con SDS-PAGE al 10% y analizados con Western Blot usando el anticuerpo policlonal anti-Kv1.3. La fracción no. 3 contiene el raft y la no. 10 contiene la fracción soluble. La presencia de lck y la ausencia simultánea de CD95 en la fracción raft confirman la pureza del lipid raft. B) Inmunotinción de linfocitos periféricos revela la presencia de Kv1.3 en rafts positivos a toxina de cólera. Entrecruzamiento artificial de Kv1.3 de anticuerpos antiKv1.3 acoplados a proteína G resultan en agregados de toxina de cólera positivos a rafts que contienen al canal, lo que indica una asociación constitutiva de Kv1.3 con rafts. Rafts fueron visualizados por tinción con FITC acoplado a toxina de cólera y Kv1.3 con Cy3antiKv1.3 (modificado de Bock et al., 2003)

Además, esos microdominios se transforman en plataformas de membrana enriquecidas con ceramida tras la estimulación de esfingomielinasa acida (ASM) endógena, adición de esfingomielinasa exógena o adición de ceramida C16. Los mecanismos por los que ASM se trasloca en la superficie de la membrana son desconocidos, pero se sabe que ASM media la hidrólisis de la esfingomielina y la liberación de ceramida en los rafts. La ceramida tiene la propiedad de cambiar y fusionar pequeños rafts en grandes plataformas de señalización pues muestra

74

propiedades únicas al asociarse espontáneamente y dirigir la coalescencia de los ratfs

en

membranas

fusionables

(Szabo,

Adams

et

al.

2004).

Dicha

transformación de los rafts a membranas enriquecidas con ceramida resulta en un agrupamiento del Kv1.3 en esos dominios y una inhibición en la actividad del canal (Bock et al., 2003) (figura39), dicho de otra manera, la disrupción de los lipid rafts inhibe la actividad del Kv1.3 (ya sea de la manera anteriormente mencionada o usando β-ciclodextrina que es un depletor de colesterol), sugiriendo por lo tanto una novedosa forma de regulación para el Kv1.3 debida a la composición de la membrana.

Figura 39. Transformación de los rafts en membranas ricas en ceramida bajo estímulo con anti-CD95, Ceramida C16 o Esfingomielinasa inhiben la actividad de Kv1.3. A) incubación de linfocitos periféricos con los estímulos mencionados anteriormente resultan en una rápida formación de plataformas enriquecidas con ceramida en la membrana celular. B) y C) Ceramida bloquea la actividad de Kv1.3 (B) mientras que el vehículo de ceramida (etanol 0.02%) no bloquea la actividad del canal, Se muestran los registros en célula completa en células Jurkat (control) antes y 15 min después de la aplicación de 1µM de ceramida o el vehículo. Las corrientes fueron inducidas durante 200ms mediante un pulso cuadrado de voltaje desde un potencial de sujeción de -70mV hasta +120mV. D) El curso temporal revela que la inhibición del Kv1.3 por ceramida se da en pocos minutos. Las corrientes fueron registradas como en B. Los triángulos presentan el promedio de corrientes registradas en células prefundidas con ceramida (1µM, n = 5). Los círculos presentan las corrientes promedio de las células prefundidas con vehículo (0.02% etanol, n = 5). Las flechas indican la adición de ceramida o vehículo a la solución del baño, (modificado de Bock et al., 2003).

¿Cómo es que un microdomino de membrana está asociado con el canal? Existen diversas hipótesis para contestar a esta pregunta. Una de ellas es que un arreglo de lípidos, como una concha, rodea a los canales, dirigiendo de esta

75

manera su asociación a los rafts. Otra sugiere que el canal o proteínas

en

general por sí mismas pueden organizar a los lípidos de la membrana y quizá estabilizar de manera transiente los rafts, es decir, las proteínas pudieran funcionar como centros de nucleación para los rafts. Una tercera hipótesis sugiere que ligeras diferencias en el grosor de los dominios transmembranales de los canales

incrementa

o

decrementa

su

afinidad

por

los

microdominios.

Alternativamente, la asociación de los canales a los ratfs podría no ocurrir a través de la interacción proteína-lípido, sino a través de interacciones proteína-proteína, esto es el canal unirse a otra proteína y ésta a su vez asociarse al microdomino (Martes et al., 2004). ¿Cómo los lipid rafts pueden regular al canal Kv1.3? Viendo como un canal puede asociarse a un raft, es posible suponer que la regulación puede ser directa, asumiendo que el microambiente específico de los lipid ratfs es requerido para la actividad del canal. Podría ser posible que la integridad de los rafts se requiere para el correcto ensamble del canal o la asociación directa del Kv1.3 con proteínas/factores que promueven la actividad del canal (Bock et al., 2003). En particular, se ha mostrado que p56lck está presente en plataformas de membrana y que la fusión de los rafts en células estimuladas puede resultar en una aproximación muy cercana o asociación de Kv1.3 con cinasas de tirosina Src (Bock et al., 2003). De esta manera, el reclutamiento de Kv1.3 en microdominios enriquecidos con ceramida puede ser un pre-requisito para la regulación del Kv1.3 por cinasas de tirosina. Contrariamente, la separación de p56lck y Kv1.3 en distintos compartimentos en células no estimuladas puede prevenir la fosforilación de tirosina del canal y permitir entonces que éste se active. Nosotros en el laboratorio estudiamos las características del canal KV1.3 en células Jurkat tratadas con 1mM metil-β-ciclodextrina que depleta colesterol de la membrana y de tal manera interrumpe los microdominios de la membrana. Aplicando el protocolo con una serie de rampas de voltaje de –100 a +200 mV en configuración “cell- attached“ con concentración de potasio alta en la pipeta (140 mM) podemos observar los cambios rápidos del umbral de activación del canal (Figura 40). Pensamos, que en tiempos muy cortos del protocolo, la reestructuración del canal es poco probable, y dichos cambios finos y muy rápidos pueden ser el resultado de los procesos de fosforilación/ desfosforilación, aunque el mecanismo exacto requiere más estudios. 76

Figura 40. Corrientes de K+ inducidas por rampas de voltaje en células Jurkat tratadas con 1mM de β-ciclodextrina en configuración “cell-attached”. Desde el potencial de mantenimiento de –60 mV (más el potencial de reposo de la célula), el potencial comando ha sido cambiado a –100 mV y luego se varía de manera lineal a una velocidad de 0.6 mV / ms hasta 200 mV. La activación de los canales Kv1.3 en estas condiciones iónicas se presenta como un desplazamiento negativo de la corriente desde la línea de base (corriente de fuga), con un umbral de activación variable. Adicionalmente, la corriente negativa mediada por canales KV1.3 se disminuye hasta cero y cambia su dirección, de entrante a saliente (corriente positiva). En el punto de inversión de la corriente, el potencial comando cancela el potencial de la membrana, i.e. el potencial asumido es equivalente a cero (ya que la concentración de K+ en la pipeta y dentro de la célula es igual; el potencial de inversión de cualquier canal catiónico, no solo selectivo a K+, debe ser cero). Entonces, el potencial comando en este punto de reversión, tomado con el signo opuesto es el potencial de la membrana. El punto de inversión no cambia su posición en diferentes trazos, entonces, el potencial de reposo es constante. Con la base de su valor, agregando potenciales de comando, que corresponden al inicio de la activación de canales KV1.3, se pueden calcular potenciales absolutos para los umbrales de activación. La actividad de otro tipo de canal catiónico de 60 pS, independiente de voltaje, se puede ver en los trazos de la parte inferior.

77

Modulación del canales de K+ por BcL-2 BcL-2 es una proteína antiapoptótica cuyas acciones durante la apoptosis han sido descritas en el capítulo inicial. Recientemente, ha sido descrito que esta proteína ejerce su acción inhibidora, actuando en parte, sobre los canales de K+ en la membrana plasmática de células vasculares de músculo liso (PASMC). En este tipo celular obtenido de rata, la sobre-expresión del gen humano bcl-2 usando un vector adenoviral: 1) incrementa marcadamente la expresión de BcL2, 2) disminuye la densidad de corriente de canales Kv sensibles a 4aminopiridina (4-AP), 3) regula a la baja la expresión de Kv1.1, Kv1.5 y Kv2.1 así como sus corrientes representativas Kv y 4) inhibe la apoptosis mediada por estaurosporina (ST) (Remillard et al., 2004). Estos resultados sugieren que la inhibición de la actividad de los canales Kv puede servir como un mecanismo adicional en el que BcL-2 ejerce su efecto antiapoptótico en PASMC. Los mecanismos precisos por los que esta proteína antiapoptótica regula a la baja la expresión de los canales Kv e inhibe su actividad en PASMC son desconocidos. Sin embargo, la apoptosis inducida en linfocitos debida al estímulo del receptor CD95 no se contrarresta por la acción de BcL-2.

Expresión, distribución celular, y funciones de Kv1.3 en linfocitos

Mediante registros electrofisiológicos en una variedad de timocitos así como células T ha sido posible identificar y caracterizar una variedad de canales iónicos. Los linfocitos expresan tres tipos de canales de potasio dependientes de voltaje. El canal tipo n (normal) o también llamado Kv1.3, el canal tipo n’ (casi normal) y el canal l (larga conductancia) también nombrado

Kv3.1 (Tabla 2)

(Cahalan, Wulff et al. 2001; George Chandy, Wulff et al. 2004).

78

Tabla 2 Canales de K+ en linfocitos GRUPO/ TIPO DE CANAL

SELECTIVID AD

De K+ (Kv) tipo: n (Kv1.3)

Mostrado en Tabla 1 *

ACTIVACI ÓN

FARMACOLOGÍ A

A

*

*

DISTRIBUCI

PAPEL

ÓN

FISIOLÓGICO

*

*

n’ (17pS)

Igual que n

Umbral de activación 8 -40mV

CTX (∼ 5nM) 8 TEA (100mM)

Linfocito 6 ratón

T

Igual que n

l (Kv3.1) (21-27pS)

Igual que n

Umbral de activación 8 -10mV

TEA 8 (0.05.0.1mM)

Linfocito 6,8 ratón

T

Igual que n

De K+ (KCa) tipo: KCa1 (11pS)

K > + Rb > NH4 >> +4 Cs

Kd = 400nM +2 1,5 [Ca ]I

CTX (3-4nM) 2 CTX-Glu, (33nM) 2,4 TRAM-34 (20nM) 5 TEA (40mM)

+

SKCa (5pS)

Kd 400nM +2 3 [Ca ]i

De K+ (K2P) tipo : 9,11,12 TWIK-2 (Baja conductancia)

+

K

10

TRESK-2 (13pS, +60mN 16pS, -60mV)

a

8

5,7

=

3

Apamina (1nM) 4 UCL1648 (200pM)

+2

Linfocitos T y 1,5 B humanos

Linfocito 3 Jurkat

T

Activador de PKC [H+]i

Ba Quinidina Quinina

Timo y Bazo humano

Activación Vh=-100 hasta Vh = +100

Quinidina (100µM) Araquidonato (20µM) Bupivacaina (100µM) +2 Ba (3mM)

Timo y Bazo de humano y ratón

Regulación del potencial de membrana y volumen celular, modulación de la señal de calcio y proliferación celular.

+

Canales de K background o de fuga que sirven para mantener el potencial de la membrana en reposo.

TEA, tetraetilamonio; CTX, caribdotoxina; 4-AP, 4-aminopiridina; NTX, Noxiustoxina;

Referencias de la tabla 2: 1. (Verheugen et al., 1995).

2. (Wulff, Miller et al. 2000).

3. (Grissmer et al., 1992).

4. (Cahalan et al., 2001).

5. (Grissmer et al., 1993).

6. (Lewis and Cahalan 1988)

7. (Rader, Kahn et al. 1996).

8. (Decoursey, Chandy et al. 1987).

9. (Patel, Maingret et al. 2000).

10. (Kang, Mariash et al. 2004).

11. (Lesage and Lazdunski 2000)

12. (Patel et al., 2004).

79

Los niveles de expresión de los canales iónicos varían substancialmente a medida que el linfocito progresa hacia su división tras una estimulación mitógena (George Chandy et al., 2004). En la figura 41 se muestra la expresión del Kv1.3 así como el KCa1 en linfocitos en estado de reposo así como en estado activado, lo que sugiere una regulación en la respuesta inmune.

Figura 41. Esquema que muestra el número promedio de canales Kv1.3 y canales KCa1 en células en estado de reposo, células memoria central (TCM) y células efectoras (TEM). Células en reposo y TCM incrementan la expresión del canal KCa1 cuando se activan, mientras que células (TEM) incrementan la expresión del canal Kv1.3. TCR = receptor en célula T (Modificado de Goerge Chandy et al., 2004)

Por otro lado, los canales Kv1.3 en células Jurkat se encuentran distribuidos de manera no aleatoria en la membrana plasmática y mostrando además una proximidad con moléculas de CD3; estos hallazgos fueron determinados mediante el uso de microscopía electrónica confocal

así como

FRET (fluorescence resonance energy transfer) (Panyi, Bagdany et al. 2003). Particularmente, dichos canales son encontrados en las sinapsis inmunológicas, esto es, en las regiones de la membrana celular que determinan el encuentro y la interacción entre una célula que presenta al antígeno (como un macrófago) y un linfocito T (Panyi, Vamosi et al. 2004). El canal Kv1.3 juega un papel muy importante en la regulación de distintos procesos celulares en linfocitos, entre ellos; el mantenimiento del potencial de membrana, la regulación del volumen celular, el influjo de calcio que contribuye a la diferenciación celular y a la producción de interleucina-2, motilidad (quimotaxis

80

y adhesión) así como la apoptosis (Liu, Fleischmann et al. 2002). Este último proceso será abordado de manera amplia en el apartado de Apoptosis y Kv1.3. El mantenimiento del potencial de membrana (∆ψ) está determinado principalmente por la combinación interactiva de la ATPasa de Na+/K+ y los canales de K+. En linfocitos en estado de reposo, el Kv1.3 es el canal de potasio que predomina (Cahalan et al., 2001). La permeabilidad de la membrana celular a los iones K+ es mucho mayor que la permeabilidad de otros iones, por lo que la actividad de este canal es importante en el potencial de reposo (Gulbins et al., 2000). Por su dependencia al voltaje, el Kv1.3 sirve para proteger a la célula cuando se presenta una despolarización en la membrana celular (Cahalan., et al., 2001). La regulación del volumen celular, esto es, el paso de iones a través de la membrana celular que permite mantener a la célula en un rango normal de tamaño en presencia de condiciones adversas (Bortner et al., 2002) está determinado por RVD (regulation volume decrease) el cual involucra el eflujo de iones Cl- y K+ (por dos distintas rutas iónicas) junto con osmolitos orgánicos, además de la salida de agua (Liu et al., 2002; Lang et al., 2000). En linfocitos maduros, la apertura del canal de Cl- activado por hinchamiento celular (Cl-swell) permite la salida de iones de Cl- y la despolarización de la membrana celular, que indirectamente, activa a los canales Kv mediando el eflujo de potasio. (Cahalan, et al., 2001). (Figura 42).

Figura 42. Representación esquemática de la regulación del volumen celular por Kv1.3. Ver explicación en el texto. (Modificado de Cahalan et al., 2001)

81

La proliferación y producción de citocinas está determinada en parte por la participación del Kv1.3 a través de el control en el mantenimiento del potencial de membrana en reposo (Levy et al., 1996), lo que a su vez modula las señales de calcio intracelular (Bronstein-Sitton, 2004), ya que hiperpolarizando la membrana celular aumenta la fuerza de conducción para el ión Ca+2 (Lewis., 2001). El bloqueo selectivo de los canales Kv1.3 por las toxinas carybdotoxina (CTX) y margatoxina (MgTx) despolarizan la membrana plasmática y por lo tanto inhiben el influjo de calcio mediado por TCR, producción de interleucina-2 y proliferación celular (Cahalan et al., 2001; Liu et al., 2002). Finalmente, el Kv1.3 en linfocitos no activados regula la activación de βintegrinas, quienes participan en la migración y adhesión celular (Liu et al., 2002). Además, Kv1.3 y β-integrinas se han encontrado co-inmunoprecipitados sugiriendo no solo un acople funcional, sino físico (Cahalan et al., 2001). Kv1.3 y Apoptosis Actividad del Kv1.3 durante la apoptosis Estudios iniciales

del papel Kv1.3 en apoptosis describen una rápida

inhibición tras un tratamiento con anticuerpo anti-Fas (200ng/ml) o con ceramida (10µM) durante 15-25 minutos de estimulación (Szabo et al., 1996; Gulbins et al., 1997). La aplicación de ambos estímulos resulta en un ∼50% de inhibición de la corriente para todos los voltajes ≥10mV, estos autores proponen que la supresión en la corriente no se debe a los cambios en las propiedades del gaiting del canal ya que la sensibilidad al voltaje, intrínseca del canal, no se ve alterada (Figura 43). Dicha inhibición está correlacionada con una marcada fosforilación del canal debido a p56lkc. (Figura. 37)

82

Figura43. La estimulación del receptor Fas inhibe el canal Kv1.3 en linfocitos T Jurkat.

A) Corriente saliente en célula

completa provocada por pulsos de voltaje con una duración de 300ms a intervalos de 60s desde un potencial de sujeción de -70mV. La corriente fue medida en el rango de -110 a 70mV variando el voltaje en incrementos de 20mV. En el panel superior se muestra la corriente control, en el panel interior se muestra la corriente a los 23min tras la perfusión con 200ng/ml de anti-Fas. B) relación corriente-voltaje en corrientes de célula completa. Todas las corrientes son expresadas en porcentaje del pico de corriente a +70mV bajo la condición control al tiempo cero. Círculos negros representan la corriente control. Triángulos negros representan la corriente medida a los 10 minutos después del estímulo con anti-Fas. La diferencia entre la corriente control y la corriente con estímulo anti-Fas es significativa. C) curso temporal de la inhibición del canal. Círculos negros representan a la corriente sin el estímulo (control), triángulos negros representan la corriente tras la incubación con anti-Fas humano. Todas las corrientes son expresadas como porcentaje de la corriente pico a +70mV bajo condición control al tiempo cero. (Modificado de Szabo, et al., 1996)

La unión de Fas-L a su receptor a mostrado inducir síntesis de ceramida a través de la activación de esfingomielinasas ácida y neutra (Gulbins et al., 1997) por lo que se puede proponer una cascada de señalización en donde la estimulación del receptor CD95 activa las esfingomielinasas quienes a su vez producen ceramida que al interactuar con los lipid rafts producen inhibición del Kv1.3 (Figura44).

83

Figura44. Esquema propuesto para la cascada de señalización por rafts bajo el estímulo al receptor CD95. Fas-L estimula a CD95 lo cual dispara la externalización de ASM a la cara externa de la membrana, por un lado la fusión de rafts en plataformas ricas en ceramida provoca al agrupamiento de varios receptores para posteriormente seguir cadena abajo en la cascada de señalización. Por otro lado, los rafts también pueden modular canales iónicos; así al fusionarse y formar plataformas de membrana enriquecidas con ceramida, el canal Kv1.3 puede modularse ya sea debido al microambiente que se genera, o a que se compartamentaliza con otras moléculas reguladoras como p56lck

Estudios adicionales

muestran que el Kv1.3 presenta inhibición de la

corriente bajo dos estímulos adicionales a Fas-L y ceramida en linfocitos T y ovocitos de Xenopus; estos estímulos son: H2O2 (agente oxidante) (Szabo, Nilius et al. 1997) y

dos proteínas pro-apoptóticas de Drosophila, Reaper y Grim

(Avdonin, Kasuya et al. 1998). La inhibición de la corriente de Kv1.3 por agentes oxidantes (∼46%) puede ser significativa durante la apoptosis al igual que la estimulación con Fas-L o ceramida; así, ROS pudiera inducir una marcada despolarización en el potencial de las células, siendo éste un factor importante en la apoptosis. En Drosophila, Reaper y Grim disparan la apoptosis de una manera dependiente de caspasa. Estas proteínas tienen unas secuencias conservadas en sus dominios N-terminal parecidas a secuencias en N-terminal en canales de potasio Kv que participan en la inactivación del canal. Por otro lado, en células de mamífero, el dominio citoplasmático de CD95 comparte homología con Reaper de lo que se podría inferir que dicho receptor podría funcionar como proteína de fusión pro-apoptótica y como proteína inhibidora de Kv1.3 (Szabó et al., 2004). Péptidos sintéticos de la región N-terminal inducen una rápida inactivación en Kv1.3 cuando se aplican por el lado citoplásmico del canal. Además, mutaciones que reducen la actividad apoptótica de Reaper, también reducen la habilidad del péptido sintético de inducir inactivación, indicando que la inactivación del canal correlaciona con la actividad apoptótica. Adicionalmente, la co-expresión del RNA de Reaper o inyección directa de la proteína completa causa un bloqueo

84

irreversible del Kv1.3. Dichos resultados sugieren que esas proteínas pueden causar el inicio de la apoptosis por un bloqueo estable en los canales Kv1.3. La despolarización de la membrana puede resultar de un influjo incrementado de Na+, un decremento en el eflujo de K+, así como una inhibición en la recaptura de K+ y eflujo de Na+ por acción de la ATPasa de Na+/K+; dicho fenómeno está asociado con una actividad pro-apoptótica

en muchos tipos

celulares así como estímulos apoptóticos (Avdonin, Kasuya et al. 1998; Bortner, Gomez-Angelats et al. 2001). Los canales Kv1.3 podrían tener esta función al inhibirse tempranamente durante el estímulo provocado por Fas o ceramida; (Bortner, Gomez-Angelats et al. 2001; Bortner y Cidlowski 2003) demostraron que durante la apoptosis inducida por anti-Fas en células Jurkat hay una despolarización temprana de la membrana plasmática que se observa con citometría de flujo y con el uso del indicador DIBAC4(3), adicionalmente se presenta la inactivación de la ATPasa Na+/K+ (Figura 45) y un incremento de Na+ intracelular que aumentan la despolarización. Así, una despolarización crónica puede estar unida cercanamente a las fases iniciales de la apoptosis. Severas y prolongadas despolarizaciones pueden ser suficientes para desequilibrar el delicado balance entre las fuerzas pro y anti- apoptóticas a favor de la iniciación de la apoptosis.

Figura 45. Análisis de Western Blot de las subunidades α y β de la ATPasa Na+/K+ en apoptosis. En A) se muestran células Jurkat tratadas en presencia y ausencia de 50ng/ml de anti-Fas en diferentes tiempos. Los extractos de proteína fueron preparados y examinados en electroforesis de gel de poliacrilamida. Los geles fueron transferidos a membranas de nitrocelulosa y examinados por la expresión de las subunidades α y β de la ATPasa Na+/K+. Se observa una temprana disminución de la subunidad α con el corte específico de la subunidad β. B) Examen de células individuales despolarizadas y no despolarizadas que revelan la disminución de la subunidad α de la ATPasa de Na+/K+ en las poblaciones de células despolarizadas (Bortner et al., 2001)

85

Adicionalmente,

un

estudio

realizado

en

células

electrofisiología y mediciones ópticas con fluorescencia

Jurkat

mediante

del efecto de la

dexametasona (1 µM y 2-3 horas de estimulación) sobre el canal Kv1.3 muestra que dicho estímulo produce inhibición del canal lo que a su vez inhibe a los canales CRAC (Lampert, Muller et al. 2003); en células Jurkat estimuladas con Fas-L se observa el mismo efecto de inhibición del Kv1.3 (Szabo et al., 1996) así como el bloqueo de la entrada de Ca+2 a través de los canales CRAC. El estímulo en células Jurkat activa ASM y la subsecuente liberación de ceramida (LeppleWienhues, Belka et al. 1999). Interesantemente el estímulo con dexametasona no produce apoptosis en células Jurkat (Lampert et al., 2003); además, existe evidencia que muestra que los receptores para glucocorticoides en linfocitos Jurkat presentan una mutación que disminuye la afinidad por el estímulo y por lo tanto la señal de muerte transmitida hacia el interior celular es débil (Kofler, Schmidt et al. 2003), así, se podría sugerir que dexametasona tienen un efecto de sobrevivencia claramente diferente al estímulo del receptor CD95 por lo que la inhibición del Kv1.3 pudiera no ser necesariamente un fenómeno acoplado a la apoptosis. Por otro lado, existe marcada evidencia que apunta para proponer que la activación de los canales de potasio dependientes de voltaje juega un papel importante durante el desarrollo de la apoptosis en distintos modelos celulares. (Bortner, Hughes et al. 1997) muestran una correlación entre el decremento en [K+] citoplasmático y el número de células encogidas cuando los linfocitos son estimulados con Fas-L, dexametasona y ST para inducir apoptosis. En PASMC (células de músculo liso de arteria pulmonar), cuando son tratadas con STS, corrientes IKV se incrementan dentro de 30 min seguido inmediatamente de la reducción en tamaño celular y además, adicionando citocromo c recombinante a la pipeta, se potencian corrientes IKV sensibles a 4-aminopiridina (4-AP) independiente de la activación de caspasa-9 (Platoshyn, Zhang et al. 2002), sugiriendo que citocromo c media apertura de canales de K+, situación que precede la activación de la caspasa-9. En células de hígado de rata la apoptosis inducida por Factor de Necrosis Tumoral α activa entre los 5-10 min canales de K+ y de Cl- (Nietsch, Roe et al. 2000) y en células epiteliales de córnea la apoptosis inducida por radiación UV también activa canales de potasio sensibles a 4-AP (Wang, Li et al. 2003). 86

De esta manera, incrementar el eflujo de potasio contribuye a reducir la fuerza iónica citoplasmática, que ha mostrado ser esencial para el encogimiento celular, evento importante durante el desarrollo de la apotosis así como también favorece la activación de caspasas y nucleasas. Un estudio realizado recientemente en linfocitos Jurkat

mediante la

estimulación de receptores muerte (CD95) con Fas-L (2 µg/ml) muestra activación del canal Kv1.3 a partir de los 30 minutos de estimulación (Storey, GomezAngelats et al. 2003). La figura 46 muestra corrientes representativas de células control B) y células tratadas con L-Fas C). La densidad de corriente de potasio de las células tratadas con L-Fas fue dos veces mayor en promedio, comparada con las células control para todos los potenciales de prueba.

Figura 46. Efecto del ligando Fas (L-Fas) sobre la corriente de potasio en células Jurkat. A) Protocolo de voltaje usado para provocar corrientes de potasio en células Jurkat. Las corrientes fueron evocadas para un rango de potenciales de prueba desde -60 hasta +80mV por 100 ms, con un potencial de sujeción de -80mV. B) corrientes representativas de células control. C) Corrientes representativas de células estimuladas con L-Fas (2µg/l) por 30 min (Modificado de Storey et al., 2003).

Además

ellos

determinaron

mediante

herramientas

genéticas

y

farmacológicas, que los incrementos en la corriente debido a la activación del Kv1.3 requiere de la activación del receptor CD95 y no requieren síntesis de proteína de novo. Adicionalmente, Storey y colaboradores (2003) encontraron que

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el reclutamiento de FADD (proteína adaptadora) así como la activación de la caspasa-8 sin requerir la activación de la caspasa-3 son eventos necesarios para el incremento en la corrientes producidas por Kv1.3 y por el contrario PKC previene la inducción de la corriente inducida por Fas-L. Posteriormente ellos encontraron que el potencial de membrana en células Jurkat se encuentra despolarizado tras el estímulo apoptótico (Figura 47A), y que además L-Fas (2µg/ml) induce mayor corriente (∼2 veces más en todos los voltajes evaluados) en estado estable en células Jurkat (Figura 47B)

Figura 47. Efecto de Fas-L en las propiedades iónicas de células Jurkat. A) Efecto del ligando Fas sobre el potencial de membrana de las Células Jurkat. Histogramas de frecuencia representativos para poblaciones celulares control y tratadas con Fas-L. La barra sólida representa la fluorescencia media de la muestra control y la despolarización celular fue observada por un incremento en la fluorescencia celular y se representa en cada histograma comparado con el valor en la muestra control. Las células fueron tratadas con Fas-L (2µg/ml) por 30 min e incubadas con el indicador de potencial de membrana DiBAC4 (150ng/ml) que se analizaron por citometría de flujo. B) Efecto de la estimulación con Fas-L sobre las corrientes sostenidas de potasio en células Jurkat. Se evocaron una familia de corrientes bajo el siguiente protocolo. Despolarizaciones entre -50 y +30mV con incrementos de 9.8s. La corriente fue medida tras 8 s de registro. Se graficó la corriente promedio contra el voltaje que se muestra inserto en B), círculo negros, células Jurkat tratadas, cuadros negros, células control (Storey et al., 2003).

De esta manera, dichos autores proponen que la activación del receptor Fas y su correspondiente cascada de señalización hasta antes de la activación de la caspasa-3, incrementa los picos de corriente medidos a los 100 ms (protocolo de activación, figura 46) y también en corrientes sostenidas medidas a los 8 s de registro (protocolo de inactivación, figura 47) por lo que estas dos propiedades de activación e inactivación del canal se intersectan en algún momento dado para dar una ventana (margen, rango) en el potencial de membrana en donde los

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canales están activados pero no completamente inactivados. Así, un eflujo de potasio estable podría requerir de tres eventos coincidentes para que se vuelva significativo: estimulación del Kv1.3, inhibición de la ATPasa de Na+/K+ y despolarización en la membrana. Cabe señalar sin embargo que el reclutamiento de FADD y la activación de la caspasa-8 se dan en cuestión de segundos a minutos (Scafiddi et al., 1998) por lo que en este estudio en donde se reporta que la activación del Kv1.3 se presenta a los 30 minutos de estimulación ya no sería tan probable. Interesantemente, Storey y colaboradores (2003) observaron que en células tratadas con L-Fas por lo menos 20 minutos, la amplitud de la corriente observada es en promedio parecida a las células control, es decir, ellos no observaron ninguna inhibición en la amplitud de la corriente provocada por Kv1.3, como lo observaron Szabo y colaboradores (1996) bajo el mismo estímulo, en el mismo tipo celular. Sin embargo cabe mencionar que existen diferencias en la concentración del estímulo (Fas-L), control en la temperatura, así como en los protocolos utilizados, por lo que de esta manera, estas diferencias en los diseños experimentales estarían dando una respuesta distinta al comportamiento de la canal, dada una aparente condición similar. Los protocolos utilizados para observar la amplitud de la corriente provocada por Kv1.3 son distintos en ambos estudios. El protocolo de Szabo y col. (1996) tiene una duración de 300ms mientras que el de Storey y col. (2003) es de 100ms, este último tiempo de duración del protocolo solo puede registrar corrientes activadas sin ver inactivación del canal. Además, el voltaje de sujeción es distinto así como los potenciales de prueba. Las concentraciones de Fas-L en el experimento de Szabo son de 200ng/ml y en el de Storey son de 2µg/ml, es decir 10 veces más concentrado en este último experimento; la razón que ellos dan para utilizar esa elevada cantidad es que debido a que la apoptosis ocurre estocásticamente en respuesta a estímulos muerte, aumentar la concentración de Fas-L acelera el proceso de iniciación y progreso de la apoptosis. Finalmente la temperatura en el experimento de Szabo es de 30°C y en el de Storey es de 2024°C, se ha visto que la actividad del canal así como algunos factores intracelulares que pudieran modular al canal son dependientes de temperatura,

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siendo 30°C, la temperatura de mejor actividad para el canal Kv1.3 (Szabo et al., 1996) ¿Como conciliar que el canal Kv1.3 durante la apoptosis por un lado se inactiva y por otro lado se activa? Pudiera ser que la inhibición de la corriente observada durante los primeros minutos tras el estímulo apoptótico con Fas-L fuera solo una fase pre-inicial, en donde el canal Kv1.3 junto con sus moléculas moduladoras, localizadas en un microambiente especial, responde a una inestabilidad por la acción de señales externas. Trascurrido el tiempo (mayor a 30 min tras el estímulo) se presentaría la activación del canal Kv1.3 que, partiendo de que la membrana se encuentra despolarizada estaría provocando el eflujo de potasio, que junto con la salida de otros iones como el Cl- así como osmolitos orgánicos (taurina) y agua, contribuyen con el encogimiento celular observado durante la apoptosis, así como la activación de caspasas y nucleasas, indispensables para el desarrollo orquestado de la muerte celular programada. Finalmente, es importante señalar que, debido a que el canal Kv1.3 no es el único canal de potasio en linfocitos Jurkat (Tabla 2), es elemental considerar que este canal de potasio no es el único canal que pudiera estar participando en la apoptosis como parte del la AVD o en la actividad de caspasas y nucleasas, como se ha venido mencionando anteriormente. También hay expresión de otros canales de potasio de tipo Kv, canales de potasio activados por Ca+2 (KCa) y canales de K+ con dominio de dos poros (K2P). Dentro de los canales Kv se encuentran el canal n’ (casi normal) y el l (de gran conductancia y con distinto umbral de activación). El canal Kv tipo n’ no presenta inactivación y el tipo l se recuperan de la inactivación rápidamente (Cahalan et al., 2001). El otro grupo de canales de K+ activados por Ca+2 (KCa) son: de conductancia intermedia (IKCa) y de conductancia pequeña (SKCa), ambos son activados por Ca+2 a un nivel submicromolar (400nM y están cerrados a 100nM Ca+2), tienen diferente sensibilidad farmacológica y SKCa se expresa en linfocitos Jurkat (Verheugen et al., 1995). Finalmente los canales de K+ de dos poros (K2P) de los cuales, el TWIK-2 y el TRESK-2 son expresados en bazo y timo de humano y ratón, dichos canales son conocidos como canales fuga o canales “Background” por estar activados en un amplio rango de potenciales de la membrana y se activan y desactivan rápidamente con poca o nada de inactivación con cambios de voltaje, estas características pueden contribuir con la regulación del potencial 90

de la membrana en reposo lo cual pudiera contribuir con la regulación de las señales de Ca+2 citosólicas así como otras funciones que desempeñan normalmente los canales de K+ (como sus análogos, los canales Kv o los KCa en linfocitos) (Patel, Maingret et al. 2000; Kang, Mariash et al. 2004). Así un estudio en eritrocitos humanos ha mostrado la participación de canales de K+ activados por Ca+2

como importantes reguladores durante la

muerte celular programada al intervenir en la disminución del volumen celular así como en la externalización de la fosfatidilserina hacia la parte externa de la membrana celular (Lang, Kaiser et al. 2003). El canal de K+ de dos poros, particularmente el TASK-3 (TWIK related acid sensitive-3) es responsable del proceso de apoptosis dependiente de K+ en neuronas de cerebelo. La muerte celular neuronal puede ser prevenida por condiciones que específicamente reducen el eflujo de K+ a través de los canales TASK-3. Además, la transferencia génica de TASK-3 en neuronas de hipocampo que carecen de este canal, induce apoptosis (Patel et al., 2004). Más aún, estudios en timocitos deficientes en el canal Kv1.3 (extraídos de animales Kv1.3-/-) muestran que no existe algún defecto en apotosis de timocitos, y que esto es debido a que existe conductancia de cloro incrementada marcadamente (hasta 50 veces más comparadas con el control) que está compensado esta aparente falta de funcionalidad en el sistema inmune en ratones Kv1.3-/- (Koni, Khanna et al. 2003). En nuestro laboratorio, mediante el uso de rampas de voltaje para Kv1.3 con estímulos de -100 hasta +200mV, se ha visto que existen otras corrientes hasta la fecha no identificadas, estimuladas mediante succión (Figura 48). Por lo tanto cabe especular que el Kv1.3 no es el único canal de potasio con una participación durante la muerte celular programada, si no que otros canales permeables a K+ pudieran estar modulando este complejo y la vez fascinante evento celular: la muerte celular programada.

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Figura 48. Estimulación de corrientes de K+ no identificadas, mediante succión en parches “cell-attached”. Testigo (dos trazos arriba, sin succión) muestran registros típico de la corriente mediada por canales KV1.3 (hasta 4 canales unitarios abiertos simultáneamente) en función de voltaje; con base al potencial de inversión de la corriente KV1.3 se puede evaluar el potencial de la membrana de la célula y valores absolutos del umbral de activación de KV1.3 (ver Fig. 40 para los detalles). El momento de la aplicación de la succión se muestra con el cambio del color, de trazo color negro al trazo color azul. La succión provoca la activación de múltiples canales no identificados con una rectificación entrante. En base a que la inversión de la corriente, inducida por la succión, coincide con la inversión de canales KV1.3 se puede concluir, que los canales son selectivos para cationes (no necesariamente para K+).

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De esta manera, se pude proponer el siguiente esquema del desarrollo de la apoptosis por la interacción del ligando Fas con su receptor en células linfoides en donde se muestran los cambios en las modulaciones de los canales Kv1.3 así como el IP3R así como la participación de otros canales de potasio distintos al Kv1.3 (Figura 49).

Figura 49. Esquema propuesto para la modulación de Kv1.3 e IP3R durante la apoptosis vía Fas-L. Fas-L estimula a CD95 lo cual dispara la externalización de ASM a la cara externa de la membrana, la fusión de rafts en plataformas ricas en ceramida provoca al agrupamiento de varios receptores para posteriormente seguir cadena abajo

la cascada de

señalización que produce la apoptosis bajo la activación de las caspasas iniciadoras y efectoras. Una Fase Pre-Inicial en el proceso de apoptosis desestabilizaría la membrana plasmática mediante la inactivación de el Kv1.3 bajo la modulación por rafts; así al fusionarse los rafts y formar plataformas de membrana enriquecidas con ceramida, el canal Kv1.3 puede modularse ya sea debido al microambiente que se genera, o a que se compartamentaliza con otras moléculas reguladoras como p56lck. En una fase tardía, el canal Kv1.3 se activa para disminuir su concentración intracelular junto con la activación de canales de Cl- presentes también en las membranas plasmática de los linfocitos como parte de la disminución del volumen apoptótico (AVD). La activación tardía de Kv1.3 es dependiente de caspasa-8 y proteína cinasa C. Por otro lado, Fas-L inicialmente activaría la PLCγ (mecanismo aún desconocido) para así producir IP3, el citocromo c se trasloca de la mitocondria exclusivamente al ER, donde se une al IP3R en fases tempranas de la apoptosis. Este evento sensibiliza al los IP3Rs a liberar Ca+2 de una manera no regulada, causando que el Ca+2 sea recapturado por el uniportador mitocondrial y por tanto aumenten los niveles de Ca+2 en la matriz mitocondrial. Esto permite mayor liberación de citocromo c vía PTP y posteriormente en fases tardías durante la apoptosis, el citocromo C forma en complejo con caspasa-9 y APAF-1 el apoptosoma quien a su vez, activa la caspasa-3. La caspasa-3 escinde al IP3R, resultando en canales no funcionales o canales con fuga de calcio. Ambos mecanismos aumentan los niveles de Ca+2 citosólico en diferentes tiempos durante la apoptosis, resultando en una incrementada señal de muerte celular.

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PERSPECTIVAS •

Investigar qué mecanismo modulador activa al Kv1.3 durante la fase temprana de la apotosis (después de 30min tras la aplicación del estímulo) en linfocitos T Jurkat.

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Investigar los mecanismos finos de modulación que se presentan por la acción de los lipid rafts sobre el Kv1.3 durante el proceso de apoptosis.

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Investigar si alguna corriente de K+ en linfocitos Jurkat es modulada por BcL-2 y citocromo c durante la apoptosis.

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Estudiar la participación de los canales de K+ activados por Ca+2 durante el proceso de apoptosis en linfocitos T Jurkat y hacer una correlación con las señales de calcio amplificadas que se generan durante el proceso de apoptosis.

•

Investigar la posible participación de los canales K2P en la apoptosis en linfocitos T Jurkat.

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Identificar al canal activado por succión observado durante los registros de corriente para el Kv1.3 y su posible participación durante el proceso de apoptosis.

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CONCLUSIONES •

El IP3R es un canal de calcio intracelular cuya función durante el proceso de apoptosis es modulada por miembros de BcL-2, citocromo c y caspasa3.

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La amplificación de la señal de calcio citosólico es un requisito para el avance de la muerte celular programada.

•

El canal Kv1.3 es inhibido por la acción de p56lkc y lipid rafts

•

El canal Kv1.3 se activa durante fases tempranas y tardías en el proceso de apoptosis para participar en AVD así como la regulación de caspasas y nucleasas.

•

Existen otros canales de K+ no estudiados hasta el momento en linfocitos T Jurkat que pueden estar involucrados en el proceso de apoptosis.

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