UNIVERSIDAD DE COLIMA PROGRAMA INTERINSTITUCIONAL EN CIENCIAS PECUARIAS Título de la Tesis

TRANSMISIÓN VERTICAL/HORIZONTAL DE Neospora caninum EN UN HATO INFECTADO NATURALMENTE Para obtener el grado de

DOCTORADO EN CIENCIAS PECUARIAS Presenta

MC. LETICIA ESPERANZA MEDINA ESPARZA Director de Tesis DR. CARLOS R. CRUZ VÁZQUEZ Comité tutorial DR. TEÓDULO QUEZADA TRISTÁN DR. ARTURO VALDIVIA FLORES DR. ALFONSO PESCADOR RUBIO DR. ISIDORO GUAJARDO HERNÁNDEZ

Tecomán, Col., Enero 2008

POSGRADO INTERINSTITUCIONAL EN CIENCIAS PECUARIAS Título de la Tesis

TRANSMISIÓN VERTICAL/HORIZONTAL DE Neospora caninum EN UN HATO INFECTADO NATURALMENTE Para obtener el grado de

DOCTORA EN CIENCIAS PECUARIAS

Presenta

MC. LETICIA ESPERANZA MEDINA ESPARZA

Director de Tesis DR. CARLOS R. CRUZ VÁZQUEZ Comité tutorial DR. TEÓDULO QUEZADA TRISTÁN DR. ARTURO VALDIVIA FLORES DR. ALFONSO PESCADOR RUBIO DR. ISIDORO GUAJARDO HERNÁNDEZ

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Dedicatoria A Dios: Por darme la oportunidad de vivir para lograr cada uno de mis objetivos. A mi Hijo: Gilberto Eduardo, por tu apoyo incondicional, haber sido mi fortaleza y estar conmigo durante todo este proceso, te amo. A mis padres: José†y Margarita†, siempre los recordaré. A mis hermanos: Socorro, Triny, Chepe, Mary, Mely, por su apoyo y confianza en mí.

iii

AGRADECIMIENTOS A la Secretaría de Educación Pública, que a través de la Dirección General de Educación Superior Tecnológica que permitió la realización de mis estudios de Doctorado.

A las autoridades del Instituto Tecnológico El Llano Aguascalientes, por las facilidades necesarias para la realización de mis estudios, así como el uso de sus instalaciones para el desarrollo de este trabajo.

A mi director de Tesis, Dr. Carlos R. Cruz Vázquez por su confianza y apoyo para lograr mis objetivos.

A los Doctores Teódulo Quezada Tristán, Arturo Valdivia Flores, Isidro Guajardo Hernández y Alfonso Pescador Rubio, por todo el apoyo incondicional y orientación que me brindó durante el desarrollo de este trabajo.

Al MVZ. Daniel Quezada Gallardo propietario del Rancho el Tepetatillo, por su apoyo decidido y constante durante la planeación y desarrollo del presente trabajo.

A

Elda y Yolanda, por su apoyo incondicional y el estimularme a lograr mis

objetivos.

iv

INDICE Número

Contenido

Página

INDICE DE FIGURAS

i

INDICE DE CUADROS

ii

RESUMEN

iii

ABSTRAC

iv

INTRODUCCIÓN

1

1.1. JUSTIFICACION

3

1.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

4

ANTECEDENTES

5

2.1. GENERALIDADES DE LA ENFERMEDAD 2.1.1. Ubicación taxonómica y diferenciación con otras coccidias 2.2. CICLO DE VIDA Y RUTAS DE TRANSMISIÓN

5

2.3. SIGNOS CLÍNICOS Y PATOGENESIS

12

2.4. DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD

15

2.5. EPIDEMIOLOGÍA DE LA ENFERMEDA

19

3

HIPOSTESIS

20

4

OBJETIVOS

21

3.1. OBJETIVO GENERAL

21

3.2. Objetivos Particulares

21

METODOLOGIA

22

5.1. UBICACIÓN DEL ESTUDIO

22

5.2 . SELECCIÓN DEL ESTABLO

22

5.3. DISEÑO DEL TRABAJO

23

5.3.1. Seguimiento serológico del grupo de cohorte

24

5.3.2. Seguimiento serológico del las crías nacidas

24

5.3.3. Pruebas diagnosticas

24

5.3.4. Diagnostico serológico en perros 5.3.5 Parámetros reproductivos y productivos de los animales del grupo de cohorte. 5.4. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

26 26

RESULTADOS

28

6.1 Selección del establo

28

1

2

5

6

v

6 8

26

6.2 Evaluaciones serológicas

29

6.3 Evaluaciones serológicas de las crías nacidas 6.4 Porcentaje de abortos del grupo de cohorte (n=40) 6.4.1 Análisis de riesgos

32

6.5 Resultados del PCR en fetos abortados

36

6.6 Pruebas diferenciales en las hembras abortadas

39

6.7 Prueba serológica en perros de la zona

39

6.8 Comportamiento reproductivo

39

6.8.1 Número de días abiertos

38

6.8.2 Servicios por concepción

40

6.8.3 Intervalo entre parto-estro

41

6.8.4 Intervalo parto parto

42

6.9 Comportamiento productivo

43

7

DISCUSIÓN

46

8

CONCLUSIONES

54

9

REFERENCIAS

55

vi

34 35

ÍNDICE DE FIGURAS Número 2.2.1. 2.4.2 5.1.1. 6.2.1. 6.3.1. 6.3.2. 6.3.3. 6.5.1.

6.5.2.

6.5.3.

6.8.1.1. 6.8.2.1. 6.8.3.1.

Nombre Página Propuesta de la transmisión de la Neosporosis (Dubey, Buxton y Wouda, 2006) 9 Diagrama para el diagnostico de abortos asociados a N. caninum (Dubey y Schares 2006) 16 Ubicación geográfica del establo en estudio 22 Incidencia mensual a N. caninum durante los 7 períodos 31 de seguimiento Prevalencia a N caninum en becerras del grupo de 33 animales seronegativos durante la primera gestación Prevalencia a N caninum en becerras del grupo de vacas 33 seronegativas durante la segunda gestación Prevalencia a N. caninum en crías nacidas dentro de los 34 grupos seropositivos y seronegativos Fotografía del gel de agarosa al 2.5%, que muestra las bandas a 146 pares de bases, de los casos positivos a la 37 N. caninum Fotografía de tejido nervioso (cerebro) de un feto abortado a los 5 meses de edad, con lesiones típicas asociadas a la infección con N. caninum, la flecha 37 muestra la necrosis focal e infiltración de células mononucleares. (tinción H-E 10X) Fotografía de tejido nervioso (cerebro) de un feto abortado a los 5 meses de edad, con lesiones típicas asociadas a la infección con N. caninum, la flecha 38 muestra la necrosis focal e infiltración de células mononucleares. (tinción H-E 40X) Promedios de los días abiertos de los grupos de 40 animales seronegativos y seropositivos a la N. caninum Servicios por concepción en los grupos de animales 41 seronegativos y seropositivos a la N. caninum Días intervalo parto-estro de los grupos de animales 42 seronegativos y seropositivos a N. caninum (Media ± DE)

6.8.4.1.

Intervalo parto-parto de los grupos de animales seronegativos y seropositivos a N. caninum (Media ± DE)

43

6.9.1.

Producción media individual de leche ajustada a 305 días de los grupos seronegativos y seropositivos a N. caninum

44

6.9.2.

Producción media de leche total de los grupos de animales seronegativos y seropositivos a N. caninum

44

6.9.3

Producción de leche total de los grupos de animales seronegativos y seropositivos a N. caninum

45

vii

ÍNDICE DE CUADROS No. 6.2.1. 6.3.1. 6.4.1. 6.5.1.

Nombre Página Incidencia mensual a N. caninum al cohorte (n=40) 29 bajo estudio durante un periodo de 32 meses Prevalencia a N. caninum en becerras nacidas en la cohorte (n=40) bajo estudio durante un periodo de 32 32 meses Frecuencia de abortos de los animales seronegativos y 34 seropositivos durante los 32 meses de observación Resultados de las técnicas de histopatología y PCR a 37 los cerebros recuperados de los animales abortados

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RESUMEN Transmisión Vertical/Horizontal de Neospora caninum en un Hato Infectado Naturalmente. Medina Esparza Leticia Esperaza, Cruz Vázquez Carlos Ricardo, Quezada Tristán Teódulo, Valdivia Flores Arturo, Pescador Rubio Alfonso, Guajardo Hernández Isidoro. Neospora caninum es un protozoario perteneciente al phylum Apicomplexa, dicho parásito produce comunmente una infección natural en perros y ganado, actualmente es considerado como la principal causa de aborto en el mundo. El objetivo del estudio fue determinar la transmisión vertical y horizontal de la infección por Neospora caninum en ganado lechero infectado naturalmente en una zona endémica, así como su influencia en la producción de leche y en los parámetros reproductivos, Es un estudio de cohorte longitudinal, se llevó a cabo en un hato productor de leche en la región lechera de Aguascalientes, Mex., para su realización se eligieron 20 animales seronegativos y 20 seropositivos a N. caninum, realizando muestreos mensuales durante dos gestaciones, para observar si existió algún cambio en su seroestatus hasta la ocurrencia del parto o el aborto. Las crías nacidas de las hembras se muestrearon mensualmente. En caso de la ocurrencia del aborto, se recuperó el cerebro del feto abortado para practicarles pruebas de histopatología, PCR y en las hembras abortadas se realizaron pruebas serológicas diferenciales con otras enfermedades reproductivas, como, brucelosis, diarrea viral bovina, rinotraqueitis viral bovina y leptospirosis. A las hembras paridas se registro la producción de leche mensualmente, así como su comportamiento en los parámetros reproductivos. Los resultados obtenidos en el grupo de animales seronegativos a N. caninum presentó cambios en su seroestatus observando una incidencia durante el periodo de estudio fue del 31.25%. La prevalencia observada en las becerras durante los periodos de estudio que fue desde el 6.6% hasta el 80%. En los 19 abortos recuperados el 73.6% de las muestras fueron positivas a N. caninum mediante la prueba de PCR debido a la presencia de ADN mediante la banda característica a 146pb, y con la técnica de histopatología el 36.8% de las muestras presentaron las lesiones características a N. caninum. Los factores de riesgos analizados, con respecto a la asociación del seroestatus positivo y la ocurrencia del aborto el riesgo relativo obtenido fue de 2.2 y el odds ratio fue de 3.7. Los resultados de días abiertos la media obtenida fue de 118.5 días la diferencia entre los dos grupos, servicios por concepción hasta de 4.1 en el grupo seropositivo, intervalos entre parto-estro el promedio fue de 57.4 días, con respecto a la producción de leche se observó una diferencia de 14072 kg entre ambos grupos. Se concluyó que la transmisión vertical o endógena y la transmisión horizontal o exógena contribuyen de manera similar en la permanencia de N. caninum en el hato en estudio. Concluyendo que debido al estado endémico y la alta prevalencia en el hato se explica por la contribución tanto de la transmisión vertical o endógena como de la horizontal o exógena, ambos de similar valor epidemiológico. Aborto, neosporosis bovina, rutas de transmisión.

ix

ABSTRACT Vertical and horizontal transmission of Neospora caninum infection present on natural infected cattle. Medina Esparza Leticia Esperaza, Cruz Vázquez Carlos Ricardo, Quezada Tristán Teódulo, Valdivia Flores Arturo, Pescador Rubio Alfonso, Guajardo Hernández Isidoro. The protozoan Neospora caninum, (Phylum Apicomplexa) which causes abortion on cattle around the world, is found naturally on dogs and other animal species, mainly in cattle. Since this disease is endemic on Aguascalientes State, the goal of this study was to detect both the vertical and the horizontal transmission of Neospora caninum on milking cows naturally infected, as well as its influence on milk production and reproductive parameters. To accomplish this goal, the first study was done on 20 serologically N. caninum-positives and 20 serologically negatives. Sampling was done monthly during two periods of gestation, checking for the changes on serological status until birth or abortion. Newborns were checked monthly. On abortive cases, brains from the fetuses were collected in order to make both histopathological and PCR tests. Abortive cows were also tested for Brucella abortus, Viral bovine diarrhea, Infectious bovine rhinotracheitis and Leptospyra. Cows with newborns were tested for milk production, and reproductive behavior indicators such as: non-copulating period, intercourse times, birth-to-heat period and birth-to-birth period. Originally serological negatives showed a decrease since 31.2% got the infection. Prevalence of this disease on newborns ranged from 6.6 up to 80%. Additionally, from a sample of 19 abortions, 73.6% were N. caninum-positive according to the PCR test checking for a 146 bp DNA band, while histopathological tests showed only a 36.8% from the same total. Relative risk associated to positive serological status was 2.20 and the rate of mummy appearance was 3.7. The noncopulating mean period was 118.5 days, but there was a difference of 4.1 days between the positive and negative groups. The difference between these groups was of 57.4 days for the birth-to-heat period. Milk production differed by 14,072 kg between both groups. The overall conclusion was that both vertical as well horizontal transmission of N. caninum play similar epidemiologic role due to the endemic nature of the disease and the high prevalence on cattle herds from Aguascalientes State. Abortion, bovine neosporosis, transmission pathways

x

xi

1. INTRODUCCIÓN

A pesar de los esfuerzos realizados por los gobiernos federal, estatal y municipal en asociación con los productores del sector lechero para invertir recursos económicos destinados al desarrollo y fortalecimiento de la ganadería bovina lechera en México, se sigue presentando un déficit importante en las necesidades de leche. Lo anterior, aunado a la gran diversidad que existe en los sistemas de producción lechera, además de la presencia de una serie de trastornos en la salud animal que provocan una disminución importante en la producción de leche, entre las cuales se encuentran enfermedades digestivas, metabólicas, respiratorias, endocrinas y reproductivas (SAGARPA, 2005). Las enfermedades reproductivas, ya sean de origen viral, bacteriano, micótico y parasitario, representan gran importancia económica en las unidades de producción lechera, por las severas pérdidas que estas ocasionan, así como por sus efectos sobre el tracto reproductivo de las hembras, lo que ocasiona la interrupción de la gestación, disminución de la producción de leche y el aumento en el número de desechos de los animales afectados. Entre las enfermedades infecciosas de los bovinos, que se manifiestan clínicamente con el aborto, se encuentran la brucelosis, tuberculosis, leptospirosis, diarrea viral bovina y rinotraqueitis viral bovina (Vitela, 1999). Dentro de las enfermedades con etiología parasitaria actualmente la de mayor importancia en los hatos lecheros es la neosporosis. La neosporosis bovina es una enfermedad reproductiva producida por el protozoario Neospora caninum, donde el perro y el coyote se consideran hospedadores definitivos, que a la vez estos juegan un papel muy importante en la epidemiología de la infección. Así mismo, se han considerado como hospedadores intermediarios a otros caninos domésticos y salvajes, felinos, bovinos, ovinos, caprinos, búfalos, ciervos y equinos (Dubey, 1999). La neosporosis actualmente es considerada como cosmopolita, ya que se puede encontrar presente en grandes extensiones ganaderas alrededor del mundo. Los abortos endémicos debido a N. caninum presentan tasas de abortos superiores

1

al 20% a lo largo de varios años, mientras que, los abortos epidémicos, pueden llegar a ocurrir desde el 20% al 30% en dos semanas. La prevalencia por la neosporosis ha sido reportada desde 1% al 58% e inclusive mayores a estos valores (Dubey, 2003). La neosporosis es más frecuente en ganado lechero estabulado, con tendencia estacional hacia el invierno, en vacas de todas las edades, con abortos repetitivos, asociado a la presencia de perros en los establos, como una enfermedad que puede volverse recurrente. Se ha considerado que la existencia de reacciones serológicas positivas a la presencia de anticuerpos a N. caninum significan la existencia del contacto con el parásito. Las vías de infección juegan un papel determinante en la epidemiología; se reporta que la N. caninum puede ser trasmitido al feto a través de la placenta causando una infección congénita en el mismo o bien, después del nacimiento el recién nacido puede adquirir la infección con N. caninum (MacAllister et al., 1998). En México, se han realizado pocos estudios que hagan referencia a la prevalencia de los casos de neosporosis bovina en el ganado lechero en los diferentes sistemas de producción. Estudios epizootiológicos realizados en México en tejidos fetales abortados, reportan una prevalencia del 35%, mientras que la frecuencia de anticuerpos anti-N. caninum alcanza valores del 51.8% en perros de establo, infiriéndose que los perros en los establos están íntimamente ligados a un riesgo alto a la exposición al parásito. Otros estudios realizados sobre la seroprevalencia a N. caninum en hatos lecheros de Aguascalientes han reportado valores mayores o iguales al 50% (Medina et al., 2006).

Por lo anterior, en el presente estudio se planteo como objetivo la determinación de la transmisión vertical y horizontal de la infección por Neospora caninum en ganado lechero infectado naturalmente en una zona endémica, así como su influencia en la producción de leche y en los parámetros reproductivos.

2

1.1. JUSTIFICACIÓN La neosporosis bovina es una enfermedad que tiene actualmente un impacto económico importante dentro de la ganadería lechera del país especialmente por los abortos a diferentes edades de gestación, efectos sobre parámetros reproductivos, los programas de reemplazos y de la producción de leche. A pesar de que la enfermedad ha sido reportada desde 1997, a la fecha, se cuenta con poca información del estado epidemiológico en México en los hatos lecheros del país. El estado de Aguascalientes, ocupa el octavo lugar en la producción a nivel nacional de leche de bovino, con un volumen de 1.14 millones de litros diarios producto de 71501 cabezas de ganado bovino lechero, donde el sistema de producción intensiva (tecnificado) aporta el 76.4% de la producción total. Algunos estudios realizados a la fecha nos indican que la es endémica presencia de esta enfermedad en la cuenca lechera de Aguascalientes, por lo que se considera de gran importancia realizar de estudios orientados a incrementar la información para conocer más sobre los mecanismos de la transmisión vertical y horizontal de la neosporosis; así como, el estudio de algunos de los factores de riesgo que participan en la epidemiología de la neosporosis en los hatos lecheros y el efecto de éstos en la producción de leche y la reproducción de las vacas lecheras afectadas. De igual manera, dado a que uno de los elementos indispensables para el diseño de las estrategias de control, se considera al conocimiento de los mecanismos de transmisión de las enfermedades; para el caso de la neosporosis bovina, no se conoce suficientemente su cadena epidemiológica esto es debido a que aun existen aspectos importantes que aun no han sido debidamente identificados con respecto a este problema. El ampliar el conocimiento de algunos de estos mecanismos de transmisión propuestos, el conocer cual o cuales de éstos factores pudieran presentar un mayor impacto sobre de forma directa e indirecta en la manifestación del problema en las explotaciones de ganado lechero, permitirá establecer estrategias y acciones orientadas a la prevención, control y, de ser posible, a la erradicación del problema, que beneficien de manera integral la producción en las explotaciones

de ganado lechero mediante la mejora de sus parámetros

productivos.

3

1.2 .

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Los estudios realizados actualmente sobre la Neosporosis bovina en México y especialmente en Aguascalientes, han mostrado una alta prevalencia de la presencia del parásito en los hatos lecheros, con la consecuencia de una elevada manifestación de abortos. Sin embargo, en nuestro conocimiento, no se han conducido estudios que se hayan orientado a determinar y evaluar la importancia de las rutas de transmisión tanto vertical como horizontal, así como la influencia que éstas pudieran presentar sobre el comportamiento reproductivo y productivo del ganado lechero que hayan abortado por esta causa. Considerando que, el estado de Aguascalientes es reconocido como una cuenca lechera de importancia en el país, y que se han reportado tasas de prevalencia elevada del problema, además que esta enfermedad provoca grandes pérdidas económicas en la ganadería lechera como consecuencia de los abortos, disminución de la producción de leche e incremento del porcentaje de desechos por esta causa, se tomó la decisión de llevar acabo un estudio para evaluar las rutas de transmisión, con la finalidad de aportar información útil para generar estrategias y acciones viables y económicamente sostenibles en el control de la neosporosis.

4

2.

ANTECEDENTES

2.1. GENERALIDADES DE LA ENFERMEDAD La neosporosis es una enfermedad parasitaria causada por Neospora spp; este parásito se ha encontrado afectando en forma natural a diferentes especies domésticas como la; canina, bovinas, ovina, caprina y equina. El parásito fue identificado por primera vez en perros en Noruega en 1984, aunque estudios retrospectivos demostraron que el parásito ha sido endémico en el lugar por lo menos desde 1957 (Dubey, et al., 2002). Mientras que en el año 1988 el parásito fue identificado en perros de los Estados Unidos de América (EUA), mediante su aislamiento en cultivos de tejidos, dándole la denominación de Neospora caninum (Dubey, 1988). Posteriormente, se confirmó que el perro doméstico (Canis familiaris), es el huésped definitivo del parásito (Lindsay et al., 1999). El primer reporte que se dio al aborto por un protozoario parecido a N. caninum en el ganado lechero se realizó en Nuevo México, EUA, en 1987. Mientras que en California (EUA), la neosporosis, ha sido considerada como la principal causa de aborto en el ganado lechero (Niefteld et al., 1992), la frecuencia del aborto provocada por la neosporosis en este estado fue estimada en un 42.5% (Anderson et al., 1995). De igual manera, la neosporosis bovina ha sido reconocida como la causa de aborto en varios países del mundo, como Holanda, Nueva Zelanda, Israel, Canadá, Gran Bretaña, Suecia, Irlanda, Estados Unidos, Costa Rica, Argentina y México, en rango que va desde un 16% al 40% o más en algunos otros casos (Dubey, 2003). La seroprevalencia observada en Portugal fue del 46% en las vacas lecheras y del 36% en fetos abortados (Canada et al., 2004). La Neospora caninum ha sido descrita y asociada como una importante causa de abortos epidémicos en el ganado bovino lechero; no obstante, fue hasta el año de 1989 cuando se le dio el reconocimiento a esta enfermedad en la especie bovina, así como de diseminación mundial (Dubey, 2003). La enfermedad de neosporosis bovina se ha caracterizado por ser típicamente asintomática y de transmisión congénita o transplacentaria, por lo que las hembras infectadas son consideradas como responsables de la perpetuación del parasitismo de generación en generación 5

en las explotaciones de ganado. En las situaciones donde se han presentado los casos con sintomatología clínica la principal manifestación es el aborto, con las consecuentes pérdidas económicas provocadas por la reducción en la producción de leche, la muerte de los neonatos y el incremento del desecho de los animales adultos (Barr et al., 1995; Lindsay, Dubey y Blagburd, 1996).

EL ciclo de vida de este parásito, incluye al perro como hospedero definitivo, ya que, en las heces de esta especie animal se han encontrado los ooquistes (McAllister et al., 1998). Sin embargo, el perro también puede ser hospedero intermediario, al igual que, otras especies animales domésticas, entre las que se mencionan a la bovina, equina, ovina, caprina y animales silvestres entre los que se encuentran los coyotes, ciervos, zorros, búfalos y camellos. Por otra parte, experimentalmente se puede llegar a infectar a otros animales como los felinos, ratas, ratones, cerdos y monos (Dubey, 1999). En todos estos animales la infección natural de la neosporosis ocurre por el consumo de ooquistes esporulados, procedentes de heces que contaminan los alimentos y el agua de consumo, generando a nivel intracelular las otras dos formas del parásito (taquizoitos y bradizoitos) en el hospedero intermediario que los consume. En cuanto a su distribución tisular, los conocimientos que se tienen hasta la fecha, indican que el protozoario tiene una predilección por los tejidos del sistema nervioso central (SNC), así como a la retina de los animales afectados (Dubey y Lindsay, 1996; Dubey, 1999; Dubey, 2003).

2.1.1. Ubicación taxonómica y diferenciación con otras coccidias

Neospora caninum es un protozoario perteneciente al phylum apicomplexa de la familia Sarcocystidae, morfológicamente es muy similar a Toxoplasma gondii y relacionado con otros parásitos que forman quistes como Hammondia o Besnoitia (Moore, Odeón y Campero, 2001). Hasta hace algunos años a Neospora caninum se le consideraba una especie única, recientemente también se ha descrito a Neospora hughesi como causante de una meningoencefalitis en equinos (Marsh et al., 1996). Dada la similitud con los parásitos mencionado anteriormente, hubo una discusión referente a que sí Neospora caninum era una especie más del género Hammondia o Isospora, esto basado a su similitud entre los oocistos de ellos (Melhorn y Heydorn, 6

2000). En el año 2002, Dubey et al., realizaron una redescripción en base a algunos aspectos moleculares, morfológicos y antigénicos de los parásitos; recurriendo a los especimenes encontrados por Dubey et al., (1988) al identificar el parásito, así como a los resultados reportados por Bjerkas encontrados en 1984, observando principalmente las siguientes diferencias:

a) Molecularmente, Neospora caninum es un género y especie distinta de Hammondia e Isospora. Basado en los espaciadores transcritos internos (ITS por sus siglas en inglés), los cuales son secuencias nucleotídicas que se conservan en cada una de las especies. b) Morfológicamente, encontraron diferencias estructurales entre Neospora caninum y Toxoplasma gondii, como la estructura de los oocistos, los de este último presentaron un menor grosor en la pared del quiste, además de que su hospedero definitivo es el gato y la causa principal de los abortos en las ovejas, mientras que Neospora caninum es un huésped definitivo de los caninos y su hospedero alternativo es generalmente el ganado bovino. c) El ciclo de vida correspondiente a los oocistos de Neospora caninum y de Isospora bigemia no pueden ser comparados, pues en ciclo de primera especie no se han demostrado los esquizontes ni los gametos. d) El ciclo de vida de la Neospora caninum es diferente al de la Hammondia heydorni, pues este último requiere de dos hospederos para cerrar el ciclo. Por otra parte, Neospora caninum para reproducirse puede permanecer indefinidamente en cultivo, roedores o el ganado. e)

Antigénicamente Neospora caninum y Toxoplasma gondii son distintos y no se ha observado una reacción cruzada en ensayos inmunológicos. Los aminoglúcosidos de membrana son distintos en cada uno y sus anticuerpos son específicos (monoclonales).

7

2.2. CICLO DE VIDA Y RUTAS DE TRANSMISIÓN El ciclo de vida completo de este parásito no se conoce por completo. Sin embargo, como todas las coccidias, debe tener un ciclo de vida heterogéneo con dos hospederos; se ha postulado y confirmado experimentalmente que los perros son hospederos definitivos e intermediarios, mientras que los herbívoros son los hospederos intermediarios (MacAllister et al., 1998; Linsday y Dubey, 1990; Lindsay, Dubey y Duncan, 1999; Bartels et al., 1999; Lindsay, Ritter y Brake, 2001; Basso et al., 2001, Dubey et al., 2002; Dubey, 2003). Aunque el hombre no ha sido involucrado dentro del ciclo de Neospora caninum, se ha logrado infectar experimentalmente primates no humanos por lo que podría ser una zoonosis potencial (MacAllister et al., 1998; Lindsay, Dubey y Blagburd, 1996). En el ciclo de vida de Neospora caninum se han identificado tres estados infecciosos, los taquizoitos, los quistes tisulares que contienen a los bradizoitos y los ooquistes del parásito (Dubey et al., 2002). Los estados patógenos corresponden a los taquizoitos que se replican por endodiogenia con estadios intracelulares en diferentes tejidos, igual a lo que sucede con Toxoplasma gondii (Lindsay, Dubey y Blagburd, 1996). En la figura No. 2.2.1, se muestra el ciclo de vida de Neospora caninum propuesto por Dubey (2006).

Figura No. 2.2.1. Propuesta de la transmisión de la Neosporosis (Dubey, Buxton y Wouda, 2006)

8

La etapa de reproducción sexual se realiza en el huésped definitivo (perro). El parásito ingresa al hospedero por vía oral como oocisto esporulado, excretado en las heces por otro perro infectado, los esporozoitos se liberan en el tubo digestivo y se estable en el epitelio intestinal, donde desarrollan al menos una esquizogonia, antes de generar la gametogonia para la producción de una nueva generación y excretarse al medio ambiente como oocistos. El perro puede también infectarse al ingerir tejidos infectados por quistes de bradizoitos o taquizoitos, que liberan esporozoitos en el intestino (MacAllister et al., 1998; Linsday, Linsday y Dubey, 1990; Lindsay, Dubey y Duncan, 1999; Dijkstra et al., 2001; Schares et al., 2001; Gondim, Gao y McAllister, 2002; Dubey et al., 2002). Para completarse el ciclo, el hospedero definitivo elimina los ooquistes del protozoario en sus heces contaminando el agua y el alimento de los

hospederos

intermediarios.

Actualmente,

se

desconoce

el

tiempo

de

supervivencia de los oocistos en el medio ambiente y si otros cánidos son hospederos definitivos para N. caninum (Dubey, 2003).

Se conoce poco sobre el modo de diseminación y distribución de tejido contaminado con N. caninum; usando las rutas de transmisión natural, el parásito puede ser transmitido de forma transplacentaria en algunos hospederos, pero la ruta transmisión vertical (de la madre al feto) es el mecanismo de transmisión mayor en los bovinos, ovinos, caprinos, ratones, perros, gatos, monos y cerdos (Dubey, 1999; Dubey 2003). El mecanismo de transmisión horizontal es la causa por la cual se adquiere la parasitosis en los animales susceptibles por en cualquier momento de su vida. Sin embargo, no ha sido determinado si esta ruta de transmisión puede establecer una infección crónica (McAllister et al., 1998; Hemphill, 1999; Sánchez et al., 2002; Trees et al., 2002). Por otro lado, se ha demostrado que las vacas crónicamente infectadas transmiten el parásito a sus fetos en varias generaciones y pueden sufrir uno o más abortos a lo largo de su vida (Anderson et al., 1995). Sin embargo, la transmisión de vaca a vaca no ha sido comprobada. Anderson et al., (1997) realizaron un estudio para evaluar en la descendencia en vacas seronegativas y seropositivas al momento de su nacimiento, los resultados obtenidos fueron que dentro del grupo de animales 9

seronegativos los recién nacidos no adquirieron la infección por N. caninum. Mientras que, en el grupo de animales seropositivos los becerros nacieron clínicamente normales pero congénitamente infectados. Los estudios realizados por Davison, Otter y Trees (1999), establecieron que la transmisión vertical es muy alta, pues el 95.2% de las vacas seropositivas dan origen a crías seropositivas previo al consumo de calostro; además, encontraron que el riesgo de que ocurra el aborto en los animales infectados es de tres a siete veces mayor que en animales no infectados. Igualmente, las crías que no fueron abortadas pueden nacer con la infección, aunque estos animales pueden no desarrollar la infección crónica y abortar una vez que alcanzan la madurez reproductiva. El mecanismo de transmisión vertical resulta ser muy eficiente y sin duda se le ha implicado como el principal responsable de la infección crónica a nivel de los animales que conforman un hato, ésto se ha inferido debido a que los animales permanecen infectados de por vida y muestran la capacidad de poder transmitir la infección a su descendencia, abuela-madre-hija (Cebrián, Barberán y Ferrer, 2000; Anderson, Andrianarivo, Conrad, 2000; Bergeron et al., 2000). Sin embargo, la seroconversión es un evento relativamente raro, menos de un 4% de casos en vaquillas y un número no determinado en vacas adultas que sufren desafíos nuevos, lo cual, dificulta comprender la presencia de infecciones post-natales en establos sin la presencia de perros y el eventual aborto; muchos de estos vacíos de conocimiento deben de ser enfrentados para comprender mejor los mecanismos de transmisión y perpetuación de la infección crónica a nivel de hato (Dijkstra et al., 2002). Por otra parte, la transmisión horizontal de la neosporosis ha sido estudiada por Bergeron et al., (2000) basado en la genealogía de las vaquillas y pruebas serológicas, demostraron que madres que resultaron seronegativas y las crías que mostraron ser seropositivas, infieren que la infección ocurrió por el mecanismo de transmisión horizontal. Entre los factores de riesgo asociados para que se lleve a cabo la transmisión horizontal en una explotación lechera se encuentran la presencia de perros, la población total de animales en el hato, la estación del año, el agua y los alimentos contaminados con heces de perros infectados, los fetos y las placentas que no son retirados del establo.

10

Por lo que la epidemiología de la enfermedad resulta ser muy compleja (LópezGatius, Pabón y Almería, 2004; Schares et al., 2003; 2004). El estudio realizado por López-Gatius, Pabón y Almería (2004), evaluaron a través de pruebas serológicas, la relación de la infección de N. caninum antes de la gestación y el subsiguiente aborto, observando que el porcentaje de los abortos ocurridos durante el primer trimestre de la gestación fue del 6.6%, que después de los 90 días fue del 5.3% y en el tercer trimestre de un 20%. Mientras que de los 105 animales seropositivos, las variables estudiadas como estación del año, parto y manejo de los animales en relación al aborto provocado por la N. caninum no fueron significativos. Estudios de seroprevalencia obtenidos por Guimaräes et al., (2004), fueron del 15.1% en un muestreo de 558 vacas lecheras, del 7.7% en animales de razas especializadas en la producción de carne. Mientras que la seroprevalencia que obtuvieron en un total de 134 perros muestreados fue del 21.6%, concluyendo con estos resultados que la presencia de perros en los establos esta directamente asociada con la presencia de N. caninum en el ganado. Por otro lado, el estudio realizado por Hall, Reichel y Ellis (2005), mostraron un alto grado de asociación entre la infección por N. caninum y la presencia de abortos, estableciendo con estos resultados que el principal mecanismo de transmisión es el vertical. Generando una propuesta como medida de control de la infección a través de la eliminación de los animales seropositivos, considerando que esta medida es suficiente para reducir el nivel de la infección y por consecuencia el número de abortos. Por otra parte, los estudios realizados por Baillargeon et al., (2001) y Landamann et al., (2002), demostraron que la ocurrencia de la neosporosis por el mecanismos de la transmisión venérea o por la transferencia de embriones en bovinos es improbable, proponiéndolo este resultado como un método de prevención y control de la transmisión vertical.

11

2.3. PATOGENESIS Y SIGNOS CLÍNICOS

Recientemente se han realizado estudios de la patogénesis de la neosporosis en vacas que han sido inoculadas con taquizoitos de Neospora caninum a los 70 días (gestación temprana) y a los 140 días de gestación (gestación media). En ambos estudios se lograron encontrar lesiones y parásitos en el útero, la placenta y en los fetos, en cuales el cerebro fue el órgano más afectado. Estos estudios demuestran el papel central que juega la placenta en la patogénesis y epidemiología de la infección. (Maley et al., 2003; Macaldowie et al., 2004). Sin embargo, todavía se desconoce el mecanismo mediante el cual los taquizoitos penetran y se multiplican en las células de los órganos afectados in vivo, no obstante, en estudios realizados in vitro utilizando células endoteliales de aorta de bovino (BAE), se ha observado por medio del microscopio electrónico que la interacción física entre los taquizoitos de Neospora caninum y estas células es similar a la llevada a cabo en otros parásitos del grupo apicomplexa. El proceso de invasión celular se puede dividir en tres pasos sucesivos, llamados reconocimiento de la membrana celular y adhesión del taquizoito a los receptores de la célula huésped, invasión activa de la célula y desarrollo intracelular del parásito. Antes de la invasión celular, los micronemas liberan por exocitosis moléculas involucradas en el reconocimiento y unión con la célula huésped sobre la superficie del parásito. Una vez adheridos, los taquizoitos extruyen el conoide modificando la forma de la célula con la aparente secreción del contenido de las roptrías desde el inicio de la invasión. Tanto la adhesión como la invasión, se llevan a cabo en cinco minutos aproximadamente. Después de 45 a 60 minutos, gran número de taquizoitos han invadido las células, aunque algunos no lo pueden hacer. Durante la internalización, las membranas de los parásitos se fusionan con las de las células y una vez dentro, los parásitos se alojan en la Vacuola Parasitófora (VP) y se mueven hacia el interior de las células principalmente hacia el núcleo, rodeándose rápidamente de las mitocondrias de las células. Posteriormente se lleva a cabo una secreción masiva dentro de la VP, indicando que el parásito modifica la vacuola y su membrana de acuerdo a sus necesidades. La endodiogenia ocurre alrededor de las seis horas post-infección y culmina hasta que un pseudoquiste se ha desarrollado entre 72 y 80 horas el cual contiene múltiples nuevos taquizoitos, finalmente ocurre la lisis celular y la liberación de los taquizoitos 12

que infectan a células vecinas, (Buxton et al., 2002; Hemphill et al., 1996; Hemphill, 1999).

Se sabe que Neospora caninum es uno de los parásitos que se transmiten más eficientemente a través de la placenta, lo que ha generado controversia acerca de que si es patógeno primario capaz de provocar por si solo el aborto o lo provoca en asociación con otros agentes, especialmente los virus. Las evidencias parecen indicar que sí es un patógeno primario, ya que en la mayoría de los tejidos de los fetos abortados por neosporosis se encuentran lesiones características y con parásitos en el interior de las lesiones, especialmente en el cerebro. Estas lesiones se manifiestan principalmente como focos de necrosis rodeados por células inflamatorias

y

gliales

localizados

especialmente

en

la

corteza

cerebral.

Dependiendo de la edad del feto, se puede detectar encefalitis y meningitis linfoplasmocitaria. Otras lesiones características son miocarditis linfoplasmocitaria con tendencia a ser difusa y hepatitis linfoplasmocitaria con tendencia periportal. En ocasiones raras se encuentran lesiones que pudieran asociarse a virus o bacterias que se encuentran en los mismos tejidos. (Dubey 2003a; Dubey 2003b).

El único signo clínico de neosporosis observado en la vaca adulta de cualquier edad es el aborto, ya sea esporádico, endémico o epidémico, pudiendo presentarse desde los tres meses de gestación hasta su término. Sin embargo, los estudios de Anderson et al., 1994 y Dubey, 1999 reportan que estos ocurren mayormente alrededor de los 5 a 6 meses de gestación. Con respecto a los fetos, éstos pueden morir dentro del útero, ser reabsorbidos, momificados, autolizados, nacer muertos, nacer vivos y morir inmediatamente, o nacer clínicamente normales, pero de forma invariable se encuentran infectados crónicamente (Anderson et al., 1994; Otter et al., 1995; Barr et al., 1997; Dubey, 1999; Dubey 2003b). Algunos estudios epidemiológicos han indicado que el aborto puede suceder en cualquier época del año, ya que en California, E.E.U.U., la mayoría de los abortos se han detectado en el invierno mientras que en Holanda, la mayoría de éstos se han informado en verano y otoño (Thurmond et al., 1995; Moen et al., 1998). Muchos abortos pueden ocurrir en un período relativamente corto y las hembras que han abortado por causa de

13

Neospora caninum pueden tener la capacidad de gestar un ternero infectado de forma congénita en el siguiente parto o realizar el aborto nuevamente (Dubey, 1999; 2003a). Igualmente se ha demostrado que generalmente la edad de las vacas, el número de lactaciones y la historia de sus abortos no afectan el porcentaje de infecciones congénitas, por lo que permite mantener la eficiencia de la transmisión vertical tanto en las vacas jóvenes como en las adultas (Dubey, 2003b; Zabala et al., 2004). Histopatológicamente, en el feto abortado se puede observar encéfalomielitis multifocal, que puede estar ubicada en la materia gris del cordón espinal; encefalitis focal caracterizada por necrosis e inflamación no supurativa; una miocarditis no supurativa y hepatitis, esta última se observa más comúnmente en los abortos epidémicos que en los esporádicos (Anderson et al., 1994; Dubey, 1999). En los terneros nacidos vivos e infectados, los signos clínicos frecuentemente encontrados son: peso bajo, signos neurológicos de ataxia, disminución del reflejo patelar y pérdida de la propiocepción hasta parálisis completa, también puede observarse una exoftalmia y asimetría de los ojos (Bryan et al., 1994; Lindsay, Dubey y Blagburd, 1996; Otter et al., 1997; Dubey, 1999).

2.4. DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD

En base a los estudios realizados sobre la relación causa-efecto entre N. caninum y el aborto, se a considerado que N. caninum es la primer causa de aborto en el ganado productor de leche en el estado de California en Estados Unidos de América (Dubey 2003a; Dubey y Schares, 2006). Las lesiones asociadas a N. caninum en el cerebro y corazón de los fetos abortados pueden ser tan severas como para causar su muerte. Además, existe una evidencia reciente de que una infección de N. caninum acciona una respuesta inflamatoria en base a la producción de citoquinias y una respuesta inmune Tipo Th1 lo cual puede afectar la gestación (Innes et al., 2005). Debido a que la seroprevalencia de N. caninum en los hatos lecheros es alta hasta el 100% en ciertos hatos y considerando que el parásito se transmite muy eficientemente de la vaca infectada al feto, estos hechos hacen difícil establecer que la causa de aborto sea por N. caninum pues la ocurrencia del aborto es mucho menor. Para establecer una relación causa-efecto es importante utilizar métodos 14

serológicos, inmunohistoquímicos y PCR (Dubey y Schares 2006); para alcanzar este objetivo, es importante demostrar que el taquizoito de N. caninum en lesiones y excluir otras causas de aborto (Anderson et al., 1991; Wouda et al., 1997).

El diagnóstico de la neosporosis bovina es difícil debido a la inexistencia de manifestaciones clínicas en los animales infectados crónicamente y al escaso número de parásitos en los fetos abortados (Jenkins et al., 2002). Por ello, la confirmación de la infección requiere la asistencia de un laboratorio de diagnóstico veterinario. El diagnóstico de la neosporosis bovina se basa en la detección de anticuerpos específicos frente al parásito en los bovinos adultos (Björkman et al., 2005) y la observación de lesiones compatibles en el cerebro, corazón e hígado de fetos abortados, combinado con el examen inmunohistoquímico (Barr et al., 1990; Anderson et al., 1991; Morales et al., 2001) y la detección de ADN de Neospora caninum mediante la reacción en cadena de la polimerasa (Gottstein et al., 1998; Baszler et et al., 1999; Sager et al., 2001; Pitel et al., 2002; Pereira-Bueno et al., 2003, Medina et al., 2006) en tejidos fetales; y la serología fetal (Barr et al., 1995; Buxton et al., 1997; Wouda et al., 1997). No existe un método estándar de diagnóstico ante mortem para la infección en bovinos adultos. Se han ensayado una serie de técnicas, fundamentalmente dirigidas a revelar la presencia de anticuerpos séricos en vacas lecheras que han abortado. Entre estas pruebas inmunodiagnósticas que se han estudiado y que pueden

encontrarse

disponibles

de

manera

comercial

son:

ELISA,

inmunofluorescencia indirecta y aglutinación directa, (Obbendorf et al., 1995; Dubey et al., 1996; Dubey 2003b). Aunque la presencia de los anticuerpos sólo indica que los animales fueron expuestos a N. caninum ya que para obtener un diagnóstico definitivo se requiere aislar el protozoario. Por otra parte, el diagnóstico del aborto de manera congénita se lleva a cabo con histopatología de tejidos fetales, la identificación y confirmación de la presencia del parásito, empleando pruebas de laboratorio como la inmunohistoquímica (Barr, et al., 1995; MacAllister et al., 1998). Por otro lado, para poder realizar el diagnostico de los fetos abortados se debe de enviar al laboratorio el feto abortado completo, cerebro, corazón, hígado y placenta, los que deben ser examinados mediante histopatología. También se recomienda tomar muestras de fluidos corporales y suero sanguíneo para su evaluación serológica (Barr, et al., 1995; MacAllister et al., 1998; Dubey 2003b), de no ser 15

posible es conveniente enviar solamente la cabeza. Es importante recordar, que la presencia de anticuerpos anti-N. caninum en el suero fetal e incluso el suero precalostral del ternero, indicarán infección, en tanto que la ausencia de ellos no necesariamente indicaría que el animal no esta infectado, ya que la síntesis de anticuerpos en el feto y el ternero recién nacido, dependerá del estado de gestación (madurez del sistema inmune), del nivel de exposición y el tiempo transcurrido entre la infección y el aborto. Lamentablemente el aislamiento de N. caninum no siempre es posible hacerlo, debido al estado de autolisis que presentan los fetos abortados (Otter et al., 1997). Otra de las pruebas utilizadas para el diagnóstico de la Neosporosis bovina es la de inmunofluorescencia indirecta que se ha considerado como de amplio valor diagnóstico, aunque un resultado positivo no es indicativo de la presencia del parásito en el animal, sino que el animal tuvo un contacto con el parásito en algún momento de su vida (Barr et al., 1995; Dubey 2003b). La Figura 2.4.2, muestra la secuencia para llevar a cabo el diagnostico en base a sueros maternos, de fluidos corporales fetales o de tejidos finos fetales, los cuales se utilizan para establecer un diagnostico positivo a N. caninum serología y PCR, es importante eliminar otras posibles causas de aborto en base al historial de abortos y fecundación de las hembras (Dubey y Schares 2006). Por otro lado, el parásito puede ser aislado inoculando extractos de tejidos en cultivo celular o en animales de laboratorio. Sin embargo estos métodos son costosos, debido al tiempo prolongado que se requiere para su aislamiento (Lindsay, Dubey y Blagburd, 1996).

16

Bovinos con problemas de aborto

Envío de fetos abortados y placentas al laboratorio

Envío de suero de vacas abortadas al laboratorio

NO

Suero Positivo (Ac.)?

Otras causas de aborto

NO PCR +? Lesiones microscópicas características? Ac. en fluido fetal

SI Paso 1 Diagnóstico: Identificación de las posibles causas de aborto (N. caninum u otras causas).

Recolección de datos de abortos y fecundidad en el hato

Serie de abortos iniciados entre las 8 y 10 semanas

SI

SI

NO Problema de aborto endémico

Problema de aborto epidémico

Definir vacas en riesgo: Envío de los sueros de vacas colectados para el examen serológico

Las lesiones de N. caninum son compatibles o no con la vida

NO

SI

Asociación estadística significativa a N. caninum entre la respuesta positiva a Ac. y el aborto? Paso II Diagnóstico: Alta probabilidad de que N. caninum sea la causa de aborto

NO

Otras causas de aborto?

SI

Figura 2.4.2. Diagrama para el diagnostico de abortos asociados a N. caninum (Dubey y Schares 2006) Se han sintetizado tres proteínas recombinantes de N. caninum que han sido usadas en el diagnóstico de la neosporosis bovina, también se han elaborado anticuerpos monoclonales

contra

taquizoitos

de

N.

caninum

para

ser

usados

en

inmunohistoquímica (Cole et al., 1994). Así mismo, se han establecido varios métodos para el diagnóstico mediante la Técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (Payne y Ellis, 1996; Pichard, 1997; Ellis y McMillan y Ryce, 1999).

17

2.5. EPIDEMIOLOGIA DE LA ENFERMEDAD La forma de infección de los perros en la naturaleza se desconoce, se ha considerado que es debido a la caza y consumo de pequeños animales que no han sido identificados como huéspedes naturales de N. caninum. El consumo de membranas placentarias y fetos bovinos abortados, parece ser una fuente importante de infección en perros y poco se conoce sobre la frecuencia de eliminación y la resistencia de los ooquistes por caninos en la naturaleza. (Dijkstra et al., 2001; Bergeron, et al., 2001a; Dijkstra et al., 2002). Sin embargo Gondim et al., 2002 realizaron un experimento donde 9 perros fueron alimentados con tejidos de terneras infectadas con Neospora y la producción de ooquistes fue de 160,700 en promedio mientras que 6 perros que fueron alimentados con cuerpos de ratones también positivos, produjeron 5,400 ooquistes. Varios estudios sugieren que la cohabitación de perros y vacas es un factor de riesgo para la infección de N. caninum (Cabassi et al., 2001ab; Sánchez et al., 2002; Dubey, 2003). Para establecer la importancia de los posibles factores de riesgo es necesario conocer la incidencia de la enfermedad asociada con el factor de riesgo en estudio, así como, la razón de probabilidades de que ocurra la infección a N. caninum a que no ocurra, indicando el número de veces más de que pueda adquirir la infección a N. caninum en un grupo de animales expuestos en relación a los no expuestos a el parásito. Al conocer la diferencia entre la incidencia de la infección a N. caninum en la población total y la incidencia de la infección en el grupo no expuesto, cuya proporción indicaría la cantidad de infección en la población total atribuible al factor de riesgo, así como, el comportamiento de la infección al aumentar el factor de riesgo (Thrusfield 1995; Hird et al., 2001).

18

3. HIPÓTESIS

La perpetuación de la neosporosis a través de generaciones sucesivas depende principalmente de la transmisión vertical, repercutiendo en el nivel productivo y reproductivo de los animales.

19

4. OBJETIVOS

4.1. OBJETIVO GENERAL •

Demostrar y comprobar la transmisión vertical y transmisión horizontal de la infección por Neospora caninum en ganado lechero infectado naturalmente en una zona endémica, así como su influencia en la producción de leche y en los parámetros reproductivos.

4.2. OBJETIVOS PARTICULARES •

Determinar la transmisión vertical y horizontal de la infección por Neospora caninum en ganado bovino lechero infectado naturalmente en una zona endémica.

•

Estimar la eficiencia y el riesgo de transmisión vertical de N. caninum a las crías en vacas infectadas naturalmente.

•

Estimar el riesgo de la transmisión horizontal en vacas, becerras y vaquillas, evidenciado por la seroconversión y el aborto.

•

Estimar el efecto sobre la producción de leche, días abiertos y servicios por concepción en vacas infectadas con por N. caninum, así como del grupo de animales que abortaron a consecuencia de la infección.

20

5.

METODOLOGÍA

5.1. UBICACIÓN DEL ESTUDIO El presente trabajo de investigación se desarrolló en un establo ubicado en la región lechera del estado de Aguascalientes, localizado en la región Centro-Norte de la República Mexicana, a una altitud de 2,217 msnm, con una temperatura promedio de 16.9°C y una precipitación pluvial promedio de 475 mm al año, la cual, fue estacional presentándose únicamente en el verano. El clima de acuerdo a la clasificación de Koeppen modificada por García, 1973, es BsKw (w) (e) (Figura 5.1.1). Los análisis instrumentales se realizaron en el Laboratorio de Sanidad Fitopecuaria del Instituto Tecnológico El Llano Aguascalientes, localizado en el Km. 18 de la carretera Ags.-SLP.

Figura 5.1. 1. Ubicación geográfica del establo en estudio

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5.2. SELECCIÓN DEL ESTABLO La selección del establo se realizó por el método de conveniencia (Thrusfield, 1995), en base a los siguientes criterios de inclusión: a) Que se ubicara en la región lechera de Aguascalientes. b) Que se mantuviera al ganado alojado en el sistema de estabulación libre, característica de la zona. c) Que se brindaran las facilidades necesarias para seguir a los animales durante dos y medio años. d) Que el propietario se comprometiera no vender o desechar a los animales incluidos en el estudio. e) Que el establo contara con historia clínica previa, y con antecedentes de animales seropositivos a N. caninum. Se aplicó una encuesta al propietario del establo, para conocer las características generales y manejo del ganado, en relación al tipo de explotación, parámetros reproductivos y productivos, principales enfermedades, tipo de alimentación, sanidad e higiene, así como la presencia de perros o no en el rancho. 5.3. DISEÑO DEL TRABAJO Se realizó un estudio de cohorte longitudinal prospectivo por dos generaciones en un grupo de terneras. En base al total de animales de reemplazo existentes en el establo seleccionado, se eligieron de manera aleatoria 75 terneras de 13 a 14 meses de edad, se les tomaron muestras de sangre y se recolectó el suero de las mismas. Las muestras de sueros obtenidas fueron sometidas a la prueba de aglutinación en tarjeta con el antígeno de Rosa de Bengala al 2% (NOM – 041- ZOO-1995), y a la prueba de ELISA utilizando el paquete comercial Herd Check anti-N. caninum IgG (IDDEX Laboratories, Inc. Westbrook, Maine, USA) utilizando una sola dilución (1:100) para detectar positivos a un punto de corte de 0.50, para determinar su seroestatus a Brucelosis y a Neosporosis bovina, respectivamente. Con los resultados del estatus serológico de los animales muestreados se realizó un diagnóstico preliminar, seleccionando 40 animales seronegativos a la enfermedad de Brucelosis, los cuales fueron divididos en dos grupos de 20 animales cada uno, el primer grupo de terneras seropositivas y el segundo de seronegativas a N .caninum.

22

5.3.1.

Seguimiento serológico del grupo de cohorte

Se realizó el seguimiento serológico mensualmente mediante la prueba de ELISA al grupo positivo a N. caninum y al grupo negativo a N. caninum hasta su correspondiente inseminación, diagnóstico de gestación y su primer parto, las hembras permanecieron alojadas durante este tiempo en el área de recría. El tipo de alimentación y cuidados de ambos grupos fueron similares. Posteriormente, se continúo con el seguimiento mensual desde el desarrollo de su segunda gestación hasta el parto. En caso de la presentación del aborto se llevó a cabo un diagnosticó integral para determinar la posible causa mediante el uso de pruebas serológicas en la madre, mientras que en los fetos abortados se llevaron a cabo un diagnóstico para N. caninum mediante histopatología (HP) y pruebas de Reacción en Cadena de la Polimerasa (por sus siglas en Inglés, PCR). 5.3.2. Seguimiento serológico de las crías nacidas

A todas las crías hembras y machos nacidas de las dos primeras gestaciones, se les aplicó la técnica serológica de ELISA, para verificar su seroestatus a N. caninum, el primer

muestreo

Posteriormente,

se

realizó

antes

de

suministrar

calostro

los

beceros.

a las becerras que permanecieron en el establo se les dio

seguimiento serológico mensual, tanto a las del primer parto (por 18 a 20 meses), como a las del segundo parto (por 6 meses).

5.3.3. Pruebas diagnósticas

Se realizó un seguimiento serológico mensual mediante la técnica de ELISA utilizando el paquete comercial Herd Check para la identificación de anticuerpos IgG específicos anti-N. caninum (IDDEX Laboratories, Inc. Westbrook, Maine, USA), con sensibilidad de 98.6% y especificidad de 98.8% de acuerdo al fabricante, siguiendo el procedimiento recomendado por el mismo. La prueba se realizó en una sola dilución (1:100) para detectar positivos y negativos; los sueros se procesaron

23

pareados y el punto de corte fue de 0.50, dándose como positivos a los que tuvieran lecturas medias > 0.50

En caso de la presentación del aborto, se siguió la siguiente metodología: Se asistió a la mayor brevedad, en un tiempo promedio de 3 horas, posible al establo para realizar la extracción de los cerebros de los fetos abortados. Se elaboraron hojas clínicas de cada uno de los eventos; se identificaron los fetos abortados; se obtuvieron muestras de los cerebros, las cuales fueron colocadas en frascos conteniendo formalina neutra bufferada al 10% para su conservación y fijación de los tejidos. Posteriormente fueron llevadas al laboratorio, para ser procesadas a la técnica convencional de HP. Las muestras fueron embebidas en parafina, se les realizaron cinco cortes en diferentes regiones del cerebro y se tiñeron con la técnica hematoxilina y eosina (HE) para la identificación de las lesiones provocadas por la N. caninum (Medina, et al., 2006).

Las muestras de cerebros de los fetos, se sometieron a la prueba de PCR anidado en un solo tubo para identificar la presencia de ADN de N. caninum, de acuerdo a la técnica descrita por Ellis, McMillan y Ryce (1999) modificada por Medina et al., (2006), las secuencias utilizadas fueron: NF1 (5’-GCGTGATATACTACTCCCTGT); NS2 (5’-CATGTGGATATTTTGCA); NR1 (5’-AAATCCTGGAAGTTAAAG) y SR1 (5’AAATAACGGTGTGGGAAAA).

Las vacas que presentaron abortos fueron identificadas, para posteriormente realizar un análisis serológico a los 10 días después de la presentación del evento. Se obtuvieron los sueros de las muestras de sangre para que posteriormente fueran sometidas a la pruebas serológicas para descartar las enfermedades siguientes: Brucelosis, Leptospirosis, Rinotraquitis Infecciosa Bovina y Diarrea Viral Bovina (diagnóstico serológico realizado por el Centro Nacional de Servicios de Diagnóstico en Salud Animal del Centro Nacional de Sanidad Animal, localizado en Tecamac, Edo. México), así como las pruebas de ELISA para el diagnóstico de la neosporosis bovina (esta prueba realizada en nuestro laboratorio). Los resultados de estas 24

pruebas permitieron hacer un diagnóstico diferencial entre las cuatro principales enfermedades que se mencionaron anteriormente, igualmente nos permitió conocer cual era el seroestatus para la enfermedad de la neosporosis bovina. 5.3.4. Diagnóstico serológico en perros Se tomaron muestras de sangre a los 26 perros que habitan normalmente en el rancho, se obtuvieron los sueros y se sometieron a la prueba de ELISA para determinar el seroestatus a N. caninum; en este caso se utilizó el mismo paquete que en los bovinos sustituyendo únicamente el proceso el segundo anticuerpo marcado con peroxidasa por una IgG de perro.

5.3.5.

Parámetros reproductivos y productivos de los animales del grupo de

cohorte Se llevo a cabo el registro de los eventos reproductivos de cada uno de los animales de ambos grupos después de haber ocurrido el parto, consultando la base de datos que al respecto se mantiene en el establo, datos tales como: fecha de parto o la ocurrencia de aborto, servicios por concepción, días abiertos, intervalo parto-estro e intervalo parto-parto. Igualmente se registró mensualmente la producción de leche durante la primera lactación en ambos grupos bajo estudio.

5.4. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS Se estimó el riesgo de sufrir aborto con relación al seroestatus a N. caninum en la cohorte bajo estudio, para este fin los datos epidemiológicos se organizaron en una tabla de contingencia 2X2 y fueron analizados con el apoyo del paquete estadístico Epiinfo (2000) y la metodología propuesta al respecto por Thrusfield (1995) y por Hird et al., (2001). Se calculó el Riesgo Relativo (RR), la razón de probabilidades o razón de momios (OR), el Riesgo Atribuible (RA), la Fracción Atribuible (FA), el Riesgo Atribuible Poblacional (RAP), el Factor Atribuible Poblacional (FAP) y la Razón de Probabilidades de Prevalencia (ORP), todos los análisis fueron realizados con un intervalo de confianza (IC) del 95% de Cornfield.

Para poder determinar el efecto provocado sobre el comportamiento reproductivo y productivo en los grupos de animales seronegativos y seropositivos a N. caninum, fueron evaluadas las siguientes variables respuesta; días abiertos, servicios por concepción, intervalo del parto al estro, intervalo parto a parto y la producción de 25

leche. Los datos obtenidos fueron ordenados y sistematizados para posteriormente ser sometidos a un análisis estadístico con el Modelo General Lineal (GLM) y prueba de comparación de medias de Tukey (p0.05). La producción media individual ajustada a 305 días para el grupo de animales seronegativos fue de 29.5 kg/día, con un error estándar (EE) de la media de 1.3, mientras que el grupo de animales seropositivos fue de 27.3 kg/día con un EE de 1.7. En la figura 6.9.2. muestra la produccion promedio de leche a 305 días de los grupos de animales seropositivos y seronegativos con 9022 kg y 8351 kg de leche, respectivamente, con un EE de la media de 395 kg para el grupo de animales seronegativos y un EE de la media de 520.4 kg para el grupo de animales seropositivos. Mientras que la producción de leche total a los 305 días para el grupo de animales seronegativos fue de 179,651 kg y para el grupo de animales seropositivos fue de 165,780 kg. Estos datos permiten estimar una diferencia de 14071.5 kg entre ambos grupos (figura 6.9.3).

42

Producción (kg)

35 30

a

a

25 20 15 10 5 0 Negativo

Positivo Grupo

Figura 6.9.1. Producción media individual de leche ajustada a 305 días de los grupos de animales seronegativos y seropositivos a N. caninum

Producción (kg)

10000

a

a

Negativo

Positivo

8000 6000 4000 2000

G rupo

Figura 6.9.2. Producción media de leche total de los grupos de animales seronegativos y seropositivos a N. caninum Aunque estadísticamente no se obtuvieron diferencias significativas en los parámetros de producción, la

relación existente entre el comportamiento

reproductivo y productivo es muy importante. Siendo el grupo de animales seronegativos el que presentó los mejores resultados durante el seguimiento del estudio.

43

Producción (kg)

190000 179,851

180000 170000

165,780

160000 150000 Seropositivo

Seronegativo

Grupo

Figura 6.9.3. Producción de leche total de los grupos de animales seronegativos y seropositivos a N. caninum

44

7. DISCUSIÓN

Se ha documentado que la transmisión vertical de Neospora caninum es muy eficiente por lo cual se le ha implicado como la ruta principal de la infección crónica a nivel de hato, debido a que los animales permanecen infectados de por vida y pueden transmitir la infección a su descendencia, abuela-madre-hija (Cebrián, Barberán y Ferrer, 2000; Anderson, Andrianarivo, Conrad, 2000; Dubey y Schares, 2006). El presente estudio, confirma que el grupo de animales positivos a N. caninum fueron infectados por transmisión vertical manteniéndose el 100% de la prevalencia en este grupo, ya que se registró el mismo seroestatus hasta el último de los muestreos realizados y todas las crías nacidas de ellos conservaron también seroestatus positivo a N. caninum (cuadro 6.2.1 y 6.3.1). Por otra parte estudios realizados por Bergeron et al., (2000) demostraron una tasa menor de transmisión vertical del 44.4%. Sin embargo los estudios realizados por Paré, Thurmond e Hietala (1996) y Schares et al., (2002) reportaron en hatos de vacas productoras de leche una prevalencia en la transmisión vertical del 85%, siendo esta también menor a la observada en el presente estudio. Otros estudios llevados a cabo por Stenlund et al., (2003) y Peregrine et al., (2004) encontraron resultados similares en cuanto al índice referido, así como, una tendencia al incremento progresivo a través de los años en hatos con un elevado número de vacas seropositivas. Estas diferencias pueden ser debidas a dos razones; primera a que el grupo de animales estudiados de los anteriores investigadores no se les dio un seguimiento permanente como el realizado en esté estudio y la segunda a que el tamaño del hato pudo haber sido un factor importante en los resultados obtenidos dado a que es más fácil dar seguimiento a un hato pequeño que a un hato grande.

En el grupo de animales seronegativos a N. caninum presentó cambios en su seroestatus en el tercer periodo de muestreo (después de su primer parto), atribuible a una transmisión horizontal, registrándose una incidencia del 5.3% habiendo un incremento posterior a este periodo hasta del 36.4%, es decir, que los casos de seroconversión (casos nuevos) se incrementaron con el paso del tiempo; donde la tasa de incidencia acumulada observada en el estudio fue del 31.2% (cuadro 6.2.1). Por otro lado, en el grupo de animales seronegativos, la seroconversión observada 45

durante la primera gestación fue del 5.0% y en la segunda gestación del 47.4%. De igual manera, la seroconversión observada para la totalidad de la cohorte fue del 50%, el cambio del seroestatus de este grupo incidió en el aumento de la prevalencia de la población en estudio ubicándola en un 75%. Existen pocos estudios que expliquen ampliamente esta forma de transmisión horizontal por lo difícil de poder identificar los factores riesgo o fuentes de la infección. Dijkstra et al., (2002) observaron una seroconversión del 70% en 95 animales seronegativos que tenían una edad de ocho meses a dos años y medio, los cuales experimentaron seroconversión en un periodo de seis meses, situación similar al del presente estudio. Otro estudio, realizado por Thurmond e Hietala (1997b) reportaron que becerras seronegativas se seroconvirtieron a partir de los seis meses de edad, cuando los animales comenzaron a consumir raciones mezcladas. Igualmente, los estudios de Häsler et al., (2006) demostraron cambios de seroestatus durante la gestación realizando de tres a cinco muestreos, donde el 26.5% (30/113) iniciaron como seropositivas y el 73.5% (83/113) iniciaron como seronegativas, de las 83 seronegativas soló una mostró seroconversión a positiva durante la gestación, por lo que consideraron que la transmisión horizontal fue responsable de la seroconversión aunque su importancia fue baja. En el presente estudio la seroconversión tendió al crecimiento y fue posterior al momento en que los animales fueron trasladados de la unidad de recría al establo de producción, tres días post parto, lo cual puede sugerir que la transmisión horizontal estuvo relacionada con la ingestión de oocistos presentes en el ambiente de su nuevo alojamiento, depositados y/o diseminados por la presencia de los perros tanto los propios como los que llegan de paso, de coyotes o de algún otro animal silvestre, hipotéticamente implicado en el ciclo biológico, que de alguna forma contaminan el agua, los alimentos, los forrajes o el ensilaje. Por otra parte, la seroconversión de las crías nacidas de hembras seronegativas sucedió también posterior al cambio de los animales a las instalaciones de producción, caracterizándose por presentar una seroprevalencia general del 45.8%.

Los trabajos realizados por Romero et al., (2003) encontraron que en un total de 3002 hembras la seroprevalencia de N. caninum fue de 39.7% y que la seroprevalencia

aparente

en

hijas

y

madres

fue

del

33.3%

y

38.2%,

respectivamente. La asociación entre el seroestatus de las hijas y las madres en 747 pruebas realizadas mostraron que el riesgo de ser seropositivas fue de 2.8 cuando la madre era seropositiva, mientras que la probabilidad de la transmisión horizontal fue 46

de 0.22. En crías seropositivas nacidas de madres seropositivas, el 63.7% correspondió a la probabilidad de que las descendientes fueran seropositivas. Por otra parte, la probabilidad del incremento de la transmisión horizontal aumenta a 3.4 cuando la transmisión vertical disminuye.

La mayoría de los estudios realizados con respecto a la transmisión vertical coinciden en atribuir una gran importancia que tiene dentro de los hatos. Sin embargo, en nuestro estudio se observó que la transmisión horizontal tuvo un papel muy importante, debido al alto porcentaje de seroconversión que tuvo el grupo seronegativo durante el periodo analizado. Es claro que existe la necesidad de comprender de manera integral la relación entre la dinámica de la transmisión vertical y la transmisión horizontal, por lo tanto deben de realizarse estudios enfocados a conocer los factores que predisponen a los animales seronegativo a N. caninum para contraer esta parasitosis bajo diferentes condiciones geográficas y de manejo de las explotaciones de ganado lechero en el estado de Aguascalientes.

Al analizar la asociación entre el seroestatus y la presentación de abortos en el grupo de animales seropositivos a N. caninum se observó que el RR fue de 1.25 y el OR de 1.3 para la primera gestación (P