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UNIVERSIDAD DE COLIMA MAESTRÍA EN CIENCIAS, ÁREA: BIOTECNOLOGÍA
INDUCCIÓN DE EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DE TEJIDO NUCELAR DE TRES VARIEDADES DE MANGO (Mangifera indica L.).
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS, ÁREA: BIOTECNOLOGÍA
PRESENTA
MIGUEL ANGEL MANZANILLA RAMÍREZ
ASESORES M.C. SALVADOR GUZMÁN GONZÁLEZ M.C. M. MANUEL ROBLES GONZÁLEZ
Tecomán, Col. Febrero de 2004
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad de Colima, por el apoyo, así como por permitirme ingresar al posgrado de la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias.
AL Dr. Richard Litz, por la capacitación y apoyo durante la elaboración de este trabajo.
Al M.C. Víctor Manuel Medina Urrutia, por todo el apoyo recibido durante toda mi formación.
Al M.C. M. Manuel Robles González, por sus sabios consejos y apoyo.
Al M.C. Salvador Guzmán González, por su incondicional apoyo durante toda mi formación.
A mi amigo el Ing. Gerardo A. Sánchez de la Torres, por su incondicional amistad y apoyo.
A todos los profesores e Autoridades de la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Colima.
A mis compañeros del Laboratorio de Biotecnología Campus Tecomán.
A mis amigos investigadores del INIFAP Campo Experimental por su amistad y apoyo.
A mis amigos del laboratorio de cultivo de Tejidos del Campo Experimental Tecomán por su apoyo incondicional.
Al personal de campo del M.C. Víctor Medina Urrutia, (Carlos, Lalo, Gerardo, Chava (q.e.p.d.) en especial a Armando Rivera Zamora) por su apoyo y consejos.
A mis compañeros del COELIM-Col por su compresión.
A TODOS MUCHAS GRACIAS
DEDICATORIA
Con todo mi respeto y amor a mis padres Miguel A. Manzanilla López y Martha Esther Ramírez Beutelspacher. Por sus constantes apoyos y consejos que nunca me han faltado.
A mi esposa Laura y mi hijo Miguel Emiliano, por su paciencia, amor, apoyo, motivación y dulce compañía que me dan a diario.
A mis hermanas Tita y Azu, por su amor, respaldo y apoyo incondicional.
A mis tíos Manuel Cantu y Marielena Ramírez, por su apoyo y cariño constante durante toda mi vida.
A mis abuelitas Alicia López (q.e.p.d.) y Esther Beutelspacher (q.e.p.d.), por su gran ejemplo y su apoyo que me siguen brindando donde se encuentren.
A toda mi familias Ramírez y Manzanilla por su cariño y respaldo.
A todos mis amigos en especial a Toño y Bri, por su apoyo y cariño.
ÍNDICE Páginas. LISTA DE CUADROS……………………………………………………………….…..
1
LISTA DE FIGURAS……………………………………………………………............
3
RESUMEN………………………………………………………………………………..
5
ABSTRACT……………………………………………………………………………….
6
I. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………
7
II. REVISIÓN DE LITERATURA……………………………………………………….. 10 2.1. Biotecnología……………………………………………………………………... 10 2.2. Cultivo de Tejidos………………………………………………………………… 10 2.2.1. Cultivo de embriones………………………………………………………... 11 2.2.2. Cultivo de meristemos………………………………………………………. 12 2.2.3. Micropropagación……………………………………………………............ 12 2.2.4. Variación somaclonal………………………………………………………..
13
2.2.5. Selección in vitro……………………………………………………………..
13
2.2.6. Producción de haploides……………………………………………...........
13
2.2.7. Cultivo de protoplastos……………………………………………………… 13 2.3. Embriogénesis Somática...……………………………………………………… 14 2.3.1. Conceptos de embriogénesis somática......………………………………. 15 2.3.2. Morfología de la embriogénesis somática………………………………… 15 2.3.3. Embriones somáticos………………………………………………………..
16
2.3.4. Epigenética…………………………………………………………………… 17 2.3.5. Potencial embriogénico……………………………………………………..
18
2.3.6. Embriogénesis somática directa…………………………………………… 18 2.3.7. Embriogénesis somática secundaria………….…………………………... 19 2.3.8. Desarrollo anormal de embriones somáticos……………………………..
19
2.3.9. Hiperhidricidad……………………………………………………………….. 19 2.4. Fases de la Embriogénesis Somática………………………………………….
20
2.4.1. Inducción de embriogénesis somática…………………………………….
20
2.4.1.1. Tipo de explantes………………………………………………………… 20 2.4.1.2. Nucela……….....................................................................................
21
2.4.1.3. Factores que influyen en la adquisición de capacidad embriogénica …………………………………………………………….. 21
2.4.1.3.1. Hormonas………………..…………………………………………...
21
2.4.1.3.2. Genotipo y tipo de tejido…...………..……………………………...
22
2.4.1.3.3. Enzimas y genes…………………..………………………………...
23
2.4.1.3.4. Otros factores.……………..………………………………………...
24
2.4.2. Proliferación y mantenimiento de cultivos embriogénicos………...........
26
2.4.2.1. Eventos tempranos en presencia de auxinas……………..…………. 26 2.4.2.2. Células proembriogénicas……………………………………………… 27 2.4.3. Maduración de embriones somáticos………..……………………………. 27 2.4.3.1. Obtención de embriones somáticos…………..………………………. 27 2.4.3.2. Factores que inhiben en la producción de embriones somáticos………………………………………………………………… 29 2.4.3.3. Polaridad de embriones somáticos……………………………………. 30 2.4.3.4. Factores que intervienen en la maduración de embriones somáticos……….……………………………………………………….. 2.4.3.4.1. Acumulación de Proteínas………………………………….……...
31 31
2.4.3.4.2. Sacarosa……………….…...………..……………………………...
31
2.4.3.4.3. Densidad del explante...…………..…..…………………………...
32
2.4.3.4.4. Glutamina………………………………...………………………….. 32 2.4.3.4.5. Ácido absisico……………………………………………………….. 33 2.4.4. Germinación de embriones somáticos…………………………………….
34
2.4.5. Recuperación y aclimatización de plántulas…..………………………….
35
2.5. Aplicaciones de la Embriogénesis Somática...………………………………..
36
2.6. Organogénesis en Mango……………………………………………………….
37
2.7. Embriogénesis Somática en Mango……….………………………….............
38
2.8. Usos de la Embriogénesis Somática en Mango………………………………
44
III. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………………..
48
3.1. Materiales…………..……………………………………………………………..
48
3.1.1. Material biológico…………………………………………………………….
48
3.1.2. Lugar experimental…………………………………………………………..
48
3.1.3. Medios de cultivo…………………………………………………………….. 49 3.2. Métodos…………………………………………………………………………… 50 3.2.1. Determinación del estado de desarrollo……………...…………………… 50 3.2.2. Tamaño de fruto y óvulo……………...………………………..…………… 51
3.2.3. Inducción de embriogénesis somática..…………………………………… 52 3.2.4. Proliferación de tejido embriogénico….…………………………………… 53 3.2.5. Recuperación de embriones somáticos…………………………………… 54 3.2.6. Maduración de embriones somáticos...…………………………………… 54 3.2.7. Germinación de embriones somáticos….…………………………………
56
3.2.8. Análisis estadísticos…………………….…………………………………… 57 IV. RESULTADOS……………………………………………………………………….
58
4.1. Estado de Desarrollo de la Semilla…..………………………………………… 58 4.2. Inducción de Cultivos Embriogénicos………...……..…………………………
60
4.3. Proliferación de Cultivos Embriogénicos……………..………………………..
64
4.3.1. Incremento en peso…………………….……………………………………
64
4.3.2. Número de embriones en estado temprano………………………………
68
4.4. Recuperación de Embriones Somáticos……………………...……………….. 70 4.4.1. Incremento en peso…………………….……………………………………
70
4.4.2. Embriones somáticos desarrollados……….………………………………
72
4.4.3. Embriones somáticos hiperhidricos……………………………………..…
73
4.5. Maduración de Embriones Somáticos…………………………………..……..
75
4.5.1. Sobrevivencia de embriones somáticos…...……………………………… 77 4.5.2. Germinación precoz de embriones somáticos……………………………
78
4.5.3. Embriogénesis secundaria………...……………………………………..… 78 4.6. Germinación de Embriones Somáticos….....………………………………….
82
4.6.1. Sobrevivencia de embriones somáticos…...……………………………… 83 4.6.2. Emergencia de brotes……………………….………………………………
83
4.6.3. Emergencia de raíces……………………………………………………..… 83 V. DISCUSIÓN…………………………………………………………………………... 86 5.1. Estado de Desarrollo de la Semilla…..………………………………………… 86 5.2. Inducción de Cultivos Embriogénicos………...……..…………………………
86
5.3. Proliferación de Cultivos Embriogénicos……………..………………………..
88
5.4. Recuperación de Embriones Somáticos……………………...……………….. 89 5.5. Maduración de Embriones Somáticos…………………………………..……..
90
4.6. Germinación de Embriones Somáticos….....………………………………….
91
VI. CONCLUSIONES……………………………………………………………………
92
VII. REFERENCIAS……………………………………………………………………... 93
LISTA DE CUADROS Página Cuadro 1.
Sales menores y compuestos orgánicos del medio de cultivos de Murashige y Skoog (1962)……………………………………………….
49
Cuadro 2.
Sales mayores del medio de cultivo de Gamborg et al. (1968)……..
50
Cuadro 3.
Análisis de varianza del efecto de tres variedades y la relación del embrión/óvulo sobre el tamaño del óvulo y del fruto………………….
58
Comportamiento de la longitud de fruto de tres variedades de mango con semillas de tres relaciones en tamaño del embrión/óvulo……………………………………………………………...
59
Comportamiento de la longitud del óvulo de la semilla de tres variedades de mango con semillas de tres relaciones en tamaño del embrión/óvulo……………………………………………………………...
60
Análisis de varianza del efecto de la variedad y la relación embrión/óvulo sobre la respuesta embriogénica en medio de cultivo de inducción………………………………………………………………..
63
Potencial embriogénico de tejido nucelar de tres estados de relación en tamaño del embrión/óvulo de tres variedades de mango después de nueve semanas en medio de cultivo de inducción……...
64
Análisis de varianza del efecto de la variedad y el estado físico del medio de cultivo sobre el incremento en peso y el número de embriones desarrollados en medio de mantenimiento………………..
65
Efecto variedad-estado físico del medio de cultivo sobre el incremento en peso de 100 mg de tejido embriogénico de mango después de cuatros semanas en medio de cultivo de mantenimiento……………………………………………………………..
68
Cuadro 10. Número de embriones somáticos desarrollados a partir de 100 mg de tejido embriogénico en dos estados físicos del medio de cultivo de mantenimiento en tres variedades de mango después de cuatros semanas en medio de cultivo de mantenimiento…………….
69
Cuadro 11. Análisis de varianza del efecto de la variedad y el estado físico del medio de cultivo sobre el incremento en peso y el número de embriones desarrollados en medio de recuperación………………….
71
Cuadro 4.
Cuadro 5.
Cuadro 6.
Cuadro 7.
Cuadro 8.
Cuadro 9.
1
Cuadro 12. Incremento en peso de 100 mg de masas proembriogénicas en dos estados físicos del medio de cultivo en dos variedades de mango después de 30 días en medio de cultivo de recuperación…..
72
Cuadro 13. Efecto variedad-estado de desarrollo sobre el número embriones en estado temprano (3-5 mm) desarrollados a partir de 100 mg de masas proembriogénicas de mango después de 30 días en medio de cultivo de recuperación……………………………...
73
Cuadro 14. Número de embriones somáticos hiperhídricos en estado temprano (3-5mm) desarrollados en 100 mg de masas proembriogénicas en dos estados físicos del medio de cultivo en dos variedad de mango después de 30 días en medio de cultivo de recuperación……………………………………………………………….
74
Cuadro 15. Análisis de varianza del efecto de la variedad y la formulación del medio de cultivo sobre la sobrevivencia, incremento en longitud, germinación precoz y embriogénesis secundaria de embriones somáticos en medio de maduración…………………………………….
77
Cuadro 16. Porciento de sobrevivencia de embriones somáticos en estado temprano (3-5 mm) de tres variedad de mango en cinco formulaciones del medio de cultivo después de 30 días en medio de maduración…………………………………………………………….
79
Cuadro 17. Efecto variedad-formulaciones del medio de cultivo sobre el porcentaje de embriones somáticos en estado temprano (3-5 mm) con germinación precoz después de 30 días en medio de maduración………………………………………………………………...
80
Cuadro 18. Efecto variedad-formulaciones del medio de cultivo sobre el porcentaje de embriones somáticos en estado temprano (3-5 mm) con embriogénesis secundaria después de 30 días en medio de maduración………………………………………………………………...
81
Cuadro 19. Análisis de varianza del efecto de la variedad sobre la sobrevivencia y la emergencia de brotes y raíz en embriones somáticos en medio de germinación…………………………………....
82
Cuadro 20. Germinación y sobrevivencia de embriones somáticos de tres variedades de mango, después de 30 días en medio de germinación………………………………………………………………..
83
2
LISTA DE FIGURAS Página Figura 1.
Frutos inmaduros de tres variedades de mango 40 días después de la antesis……………………………………………………...…………...
48
Figura 2.
Extracción de nucela de óvulo inmaduro de mango…………….…….
51
Figura 3.
Etapas de desarrollo de la nucela en base a las relaciones embrión/óvulo (1/3, ½ y 2/3 ) evaluadas……………………………….
51
Nucela de mango al momento de ser explantada en medio de inducción…………………………………………………………………...
52
Tejido embriogénico (masas proembriogénicas) de la variedad Ataulfo desarrollas a partir de nucelas después de nueve semanas en medio de inducción………………………………………..………..
53
Embriones somáticos de la variedad Tommy Atkins en estado temprano (3-5 mm) subcultivados en medio de maduración…………
55
Embriones somáticos en estado dicotiledonal (10 a 20 mm. de longitud) en medio de germinación…………………………………….
57
Desarrollo de embriones somáticos a partir de callo nucelar característico de los variedad monoembriónicos Haden y Tommy Atkins……………………………………………………………………….
61
Desarrollo de masas proembriogénicas a partir de tejido nucelar después de 9 semanas en medio de inducción………………………..
61
Embriogénesis directa a partir del tejido nucelar, característico de la variedad poliembriónica Ataulfo………………………………………..
62
Figura 11.
Embriogénesis secundaria en la variedad Haden……………………..
66
Figura 12.
Masas proembriogénicas en medio sólido de mantenimiento……….
66
Figura 13.
Masas proembriogénicas en medio líquido de mantenimiento………
67
Figura 14.
Embriones en estado de corazón creciendo a partir de masas proembriogénicas después de treinta días en medio de recuperación……………………………………………………………….
67
Figura 4. Figura 5.
Figura 6. Figura 7. Figura 8.
Figura 9. Figura 10.
3
Figura 15. Figura 16. Figura 17. Figura 18. Figura 19. Figura 20. Figura 21.
Embriones somáticos hiperhídricos desarrollados en medio de cultivo de recuperación sólido y líquido después de 30 días. ………
70
Embrión somático de la variedad Tommy Atkins con germinación precoz después de 3 semanas en medio de maduración………….
75
Embrión somático de la variedad Ataulfo con Embriogénesis secundaria después de 2 semanas en medio de maduración……....
76
Embriones somáticos aberrantes de las variedades Ataulfo y Tommy Atkins después de 4 semanas en medio de maduración…...
76
Embriones somáticos necrosados de la variedad Haden después de cuatro semanas en medio de germinación………………………...
84
Embriones somáticos de la variedad Ataulfo con desarrollo del meristemo de raíz después de 30 días en medio de germinación…..
84
Germinación de embriones somáticos de mango después de 60 días en medio de cultivo de germinación………………………………
85
4
RESUMEN Las variedades comerciales de mango Ataulfo, Haden y Tommy Atkins son afectadas por la antracnosis y la pudrición interna del fruto, que hasta hoy no han sido resueltas a través de métodos de mejoramiento convencionales. La manipulación genética de este grupo de plantas es una alternativa para tratar de resolver los problemas mencionados. Sin embargo para ellos se requiere un sistema eficiente de regeneración de plantas vía embriogénesis somática, el cual no a sido establecido para dos de las variedades de objeto de estudio. Por ello se planteo el objetivo de evaluar la respuesta al proceso de embriogénesis somática de las variedades Ataulfo, Haden, y Tommy Atkins. Para esto, nucelas de semillas inmaduras fueron cultivadas en medio nutritivo conteniendo sales mayores de B5, sales menores y complementos orgánicos de MS complementado con 400 mg/L de glutamina, 4.5 mM de 2,4 – D (ácido diclorofenoxiacético), 60 g/L de sacarosa y 8 g/L de agar. El potencial embriogénico de la variedad Ataulfo resultó ser intermedio (12.38 %), mientras que el potencial de Haden (2.86 %) fue bajo. El estado de desarrollo óptimo de las nucelas para la inducción de embriogénesis somática resulto la relación embrión/óvulo de 1/3. Las variedad Ataulfo y Tommy Atkins formaron masas proembriogénicas mientras que la variedad Haden, solo desarrollo embriogénesis secundaria. El agua de coco y el carbón activado no tuvieron efecto en la maduración de embriones somáticos de las variedades estudiadas. Se logro la germinación completa de embriones somáticos de la variedad Ataulfo, los cuales posteriormente se transfirieron a suelo. Palabras clave: mango, embriogénesis somática, variedades.
5
ABSTRACT The commercial varieties of mango, such as Ataulfo, Haden and Tommy Atkins are affected by the anthracnose and internal breakdown of the fruit mango and have not been solved yet by conventional breeding methods. The genetic manipulation of this group of plants is an alternative to solve the mentioned problems. Nevertheless, before an efficient system of regeneration of plants via somatic embryogenesis is required, which has not established yet for Ataulfo and Haden. For that reason It the objective was to evaluate the response to the process of somatic embryogenesis of the mango varieties Ataulfo, Haden, and Tommy Atkins. Thus, nucellus of immature seeds was cultivated in a culture medium containing major salts of B5, minor salts and organic complements of MS supplemented with 400 mg/L of glutamine, 4.5 mM of 2,4- D, 60 g/L of sucrose and 8 g/L of agar. The embryogenic potential of the variety Ataulfo (12.38 %) was moderately embryogenic while the potential of Haden (2.86 %) was loin and being difficult to regenerate. The optimum state of development for explanting the nucellus for the induction of somatic embryogenesis was the relationship embryo/ovule of 1/3.
The varieties Ataulfo and Tommy Atkins
development proembriogenic masses while the variety
Haden only development
secondary embryogenesis. The coconut water and the activated charcoal didn't have effect on the maturation of somatic embryos of the studied varieties. Only was the complete germination of somatic embryos of the variety Ataulfo achieved. Welldeveloped plantlets regenerated from somatic embryos have been successfully established on soil. Key words: mango, somatic embryogenesis, varieties.
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I. INTRODUCCIÓN. El mejoramiento y la propagación convencional han contribuido significativamente por varias décadas en el mejoramiento genético de plantas, sin embargo, actualmente una de los principales retos que tienen, es la necesidad de incrementar la productividad por un lado y por otro el disminuir los costos de producción, por lo tanto en este sentido el uso de herramientas biotecnológicas es una alternativa viable para resolver estos retos (Mondal et al., 2004). En el proceso de modificar la composición genética de las plantas a través del uso de la biotecnología, el cultivo de tejidos tiene un importante papel, por que actúa como un intermediario entre los avances hechos por la biología molecular en el aislamiento y modificación de genes y la regeneración de plantas transformadas para ser evaluadas por los genetistas y fitomejoradores (Smith y Drew, 1990). Dentro de las técnicas de cultivo de tejidos la embriogénesis somática representa un método eficiente para la regeneración de plantas y se le ha preferido entre otros métodos, para ser usada en el mejoramiento genético de frutales, debido principalmente a la dificultad que existe para regenerar tejidos por otras vías, como la organogénesis, por el alto contenido de compuestos fenolicos en los explantes. (Litz y Jaiswal, 1991). La embriogénesis somática se define como el proceso por el cual células somáticas desarrollan los estados de embriogenia y dan como resultado plantas completas sin fusión de gametos (Merckle et al., 1990). Los principales factores que afectan la embriogénesis somática in vitro son la variedad, el origen del explante y la composición del medio de cultivo, particularmente con respecto a las hormonas (Zimmerman, 1993). Litz et al. (1982) reportaron por primera vez la embriogénesis somática recuperada de óvulos de mango (Mangifera indica L.) poliembriónico. Más tarde, los cultivos embriogénicos pudieron ser inducidos de tejido nucelar de cultivares poliembriónicos (Litz et al., 1984) y monoembriónicos (Litz, 1984).
7
En mango la competencia embriogénica es una característica intrínseca de ciertas variedades. Los niveles de competencia embriogénica, la morfología potencial de explantes nucelares y el establecimiento de cultivos embriogénicos proliferantes dependen del cultivar utilizado (Litz et al., 1993). Las variedades de mango difieren tanto en su respuesta a las condiciones de maduración como en el tiempo requerido para la diferenciación de embriones somáticos. Por lo tanto, cada fase de la embriogénesis somática debe ser determinada empírica y experimentalmente en cada variedad de mango (Litz et al., 1993; Litz, 1997; Litz et al., 1998). Para poder lograr la manipulación genética in vitro de mango es necesario contar con la disponibilidad de un protocolo eficiente de regeneración a partir de cultivos celulares (Litz et al., 1982). Para así junto con otras herramientas biotecnológicas, poder resolver los principales problemas del mango, sin alterar la integridad de los clones, además el tiempo del mejoramiento genético puede ser liberado del problema del largo periodo juvenil y los años adicionales para la evaluación de árboles en campo y por lo tanto superar los resultados obtenidos por las metodologías de mejoramiento genético convencional (Litz, 1997). Actualmente la embriogénesis somática ha sido reportada en mas de 30 variedades de mango (Litz, 1997), en las cuales no están incluidas las variedades Ataulfo y Haden, que junto con Tommy Atkins ya reportada por Litz (1984) son las variedades mas importantes en la región del pacífico de México. El desarrollar un protocolo eficiente de regeneración de cultivos celulares de las variedades Ataulfo, Haden y Tommy Atkins vía embriogénesis somática, abre la posibilidad, para poder resolver más rápido y eficazmente algunos de los problemas del mango, como la antracnosis y la pudrición interna del fruto, que hasta hoy no han sido resueltas a través de métodos convencionales.
8
El conocimiento antes descrito sobre la embriogénesis somática del mango permite plantear la hipótesis de que es factible establecer el proceso de embriogénesis somática en las variedades de mango Ataulfo, Haden y Tommy Atkins.
Para probar la hipótesis se tiene como objetivo general:
Desarrollar el proceso de embriogénesis somática en las variedades Ataulfo, Haden y Tommy Atkins.
Con los objetivos específicos siguientes:
Evaluar la inducción de embriones somáticos de nucela en tres estados de desarrollo de las variedades Ataulfo, Haden y Tommy Atkins.
Determinar la proliferación de masas proembriogénicas de las variedades Ataulfo, Haden y Tommy Atkins en medio de cultivo líquido y sólido.
Evaluar la maduración de embriones somáticos de las variedades Ataulfo, Haden y Tommy Atkins en medio de cultivo líquido y sólido.
Establecer la germinación de embriones somáticos de las variedades Ataulfo, Haden y Tommy Atkins.
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II. REVISIÓN DE LITERATURA 2.1. Biotecnología. El término Biotecnología es utilizado ampliamente, sin embargo se ha enfocado en mayor medida a las técnicas moleculares usadas para modificar la composición genética de una planta, por ejemplo la transformación genética. También se ha descrito como, el uso de organismos vivientes o procesos biológicos para producir sustancias o procesos útiles para el hombre (Brown y Thorpe, 1995). La biotecnología agrícola tiene potencial para desarrollar practicas agrícolas más sustentables, por ejemplo plantas que expresan proteínas que tienen un efecto insecticida, reduciendo sustancialmente el uso de insecticidas comerciales (Morandini y Salamini, 2003). La ingeniaría genética de plantas puede ser una herramienta muy importante, para producir variedades, que expresen uno o más genes de resistencia a diferentes factores como: plagas, enfermedades, tolerancia a sales, etc., y de esta manera incrementar al abasto mundial de alimentos (Yoshida, 2002; McCullum et al., 2003). Recientemente las técnicas moleculares y de ingeniería genética se han empleado en investigaciones para la conservación de reservas de árboles forestales y programas de manejo forestal (Vengadesan et al., 2002). Los cultivos desarrollados por biotecnología han estado en el mercado por solo 8 años, pero han causado un gran impacto tanto en nuestra producción de alimentos como en la agricultura moderna (Harlander, 2002). 2.2. Cultivo de Tejidos. Dentro de la biotecnología moderna el cultivo de tejidos puede ser definido como el cultivo de todo tipo de células, órganos, tejidos, embriones y protoplastos bajo condiciones asépticas (Smith y Drew 1990). El cultivo de tejidos comprende una gama de técnicas, métodos y estrategias in vitro que son parte del grupo de
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tecnologías llamadas biotecnología de plantas. El cultivo de tejido ha sido utilizado para crear variabilidad genética, mejorar la sanidad y para incrementar el germoplasma disponible. Actualmente los protocolos de cultivo de tejidos están disponibles para la mayoría de las especies aunque continua optimizándose (Brown y Thorpe, 1995). Las técnicas de cultivos de tejidos en combinación con técnicas moleculares han sido utilizadas para incorporar características a las plantas a través de la transformación genética. Las técnicas in vitro para el cultivo de protoplastos, anteras, microesporas, óvulos y embriones han sido utilizadas para crear una mayor variabilidad genética y generalmente para la producción de haploides (Brown y Thorpe, 1995). El cultivo de células individuales y meristemos puede ser utilizado para erradicar patógenos
en
las
plantaciones
comerciales
y
en
consecuencia
mejorar
sustancialmente la producción. Los laboratorios de micropropagación producen plantas en gran escala para el comercio de ornamentales y la agricultura (Brown y Thorpe, 1995). La aplicación de las técnicas de cultivo de tejido para la propagación clonal, tiene actualmente un gran uso debido a la alta demanda de biomasa de productos forestales (Vengadesan et al., 2002). El cultivo de tejidos de plantas tiene un importante rol en estudios básicos y aplicados, incluyendo el mejoramiento genético y son una herramienta, que junto con otros métodos biotecnológicos permiten modificar y mejorar las plantas cultivadas (Brown y Thorpe, 1995). Dentro de las técnicas de cultivo de tejidos se encuentran: 2.2.1. Cultivo de embriones. Es una de las primeras técnicas de cultivo de tejidos aplicadas al mejoramiento de plantas. Consiste en extraer el embrión de una semilla y posteriormente desarrollarlo bajo condiciones asépticas e in vitro hasta que desarrolle una planta completa para poder transplantarlo al suelo. El principal propósito del cultivo de embriones, es el de
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recuperar plantas (embriones) durante pruebas de hibridación sexual entre plantas de variedades cultivadas y especies distantes (Williams, 1982) 2.2.2. Cultivo de meristemos. El cultivo de meristemos consiste en remover el meristemo con dos o tres primordios de la hoja y subsecuentemente cultivarlos en un medio de cultivo especifico y al igual que en la micropropagación se pueden generar nuevas plantas vía organogénesis esta técnica es rutinariamente usado para la erradicación de enfermedades virales en combinación con otras técnicas como la termoterapia y la criopreservación (Manganaris, 2003; Keller y Senula, 2003). 2.2.3. Micropropagación. La micropropagación puede ser considerada como una extensión de la mayoría de los métodos de propagación convencional, cuando partes de plantas seleccionadas son puestas en un adecuado medio de cultivo bajo condiciones especificas de cultivo in vitro, para incrementar la producción de brotes y su posterior subcultivo en forma repetitiva, hasta producir una gran cantidad de plantas, con las características genéticas de la planta original (Hussey, 1983). Las principales cualidades de la micropropagación son la rapidez y la multiplicación clonal de genotipos de plantas superiores libres de enfermedades y plagas (Smith y Drew, 1990). Para cada cultivo en particular se deben de seguir generalmente dos rutas empíricas básicas para la producción de plantas, por un lado, la embriogénesis somática que se caracteriza por exponer a altos niveles de auxinas diferentes tejidos, para inducir la formación de estructuras embriogénicas. La otra ruta llamada organogénesis, consiste en la exposición de diferentes tejidos a balances definidos de auxinas y citocininas para inducir la formación de órganos diferenciados como brotes (Christianson et al., 1988; Jeannin et al., 1998).
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2.2.4. Variación somaclonal. La variación somaclonal, se define como la variación genética que puede ocurrir en una población de células que son manipuladas bajo condiciones in vitro y es una herramienta importante en el mejoramiento genético de plantas. Actualmente en los programas de mejoramiento el uso del cultivo de tejidos para producir variantes somaclonales es poco usado (Smith y Drew, 1990). 2.2.5. Selección in vitro. La selección in vitro es una herramienta importante para la identificación de líneas celulares que pueden ser tolerantes o resistentes al estrés producido por fitotoxinas de patógenos, herbicidas, bajas temperaturas y sales tóxicas de aluminio y/o manganeso. La selección in vitro implica el someter alguna población de células a una apropiada presión de selección, recuperando líneas variantes que han desarrollado tolerancia o resistencia a un factor. Posteriormente, a partir de esas células seleccionadas, recuperar plantas completas con tolerancia o resistencia al factor de selección (Smith y Drew, 1990; Jaysankar y Litz, 1998). 2.2.6. Producción de haploides. La producción de haploides se basa principalmente en la técnica de cultivo de anteras que consiste en extraer las anteras y/o polen inmaduro de una planta y explantarlos en un medio de cultivo adecuado. Y así inducir la regeneración de tejidos haploides a partir de las microsporas o el polen (Williams y Maheswaran, 1986). El cultivo de óvulos sin fertilizar es otro método para obtener haploides (Smith y Drew, 1990). Las células haploides son ampliamente usadas en la selección in vitro y pueden ser utilizadas para la
producción de plantas resistentes a varios
metabolitos inhibitorios secundarios, estrés ambiental, herbicidas y fitotoxina (Chaleff, 1983; Mazur y Falco, 1989). 2.2.7. Cultivo de protoplastos. Consiste en el manejo de protoplastos de células a las cuales se les ha removido su pared celular por medio de métodos mecánicos y/o enzimáticos (Smith y Drew,
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1990). Los protoplastos han sido usados en investigaciones de DNA recombinante para la manipulación de los genes en plantas (Caplan et al., 1983). La regeneración de plantas a partir de protoplastos es mas complicada en comparación con el cultivo de células y callos. Por lo tanto esta dificultad limita su aplicación a la hibridación somática y al estudio de transferencia de genes (Smith y Drew, 1990). 2.3. Embriogénesis Somática. En varias especies de plantas, en complemento con la formación de embriones sexuales (embriogénesis cigótica), existe otra alternativa posible. La formación de embriones a partir de células somáticas (embriogénesis somática). Varios tipos de embriogénesis han sido definidos: a) Androgénesis: embriones originados de microsporas; b) Partenogénesis: embriones originados de oosporas u óvulos; c) Ginogénesis: embriones originados de oosporas que no están completamente fertilizadas y d) Apometría: describe el origen de embriones tanto de células sinérgidas como de antípodas (Sharp et al., 1980). Se han reportado ejemplos específicos de embriogénesis somática que ocurren in vivo. Este fenómeno es conocido como una forma de apomixis obligada llamada embrionía adventicia (Merkle, 1990) que se caracteriza por un crecimiento y desarrollo embrionario de células somáticas después de la fertilización. Sin embargo, el proceso de embriogénesis somática es mejor conocido, como un camino de regeneración in vitro (Merkle, 1990). Comparativamente el desarrollo de embriones somáticos y
cigóticos en estado temprano, ha sido
muy similar en diferentes
especies, sin embargo el desarrollo es más variable en embriones somáticos (Mordhorst et al., 1997). La embriogénesis in vitro
tiene gran potencial en estudios experimentales y es
ampliamente usada en la investigación cuando se necesita resolver problemas genéticos de plantas, ingeniería genética, prácticas de mejoramiento, para estudiar la modulación de la expresión de los genes requeridos en el desarrollo de embriones en estado temprano para investigar los procesos de diferenciación que se dan en la formación de plantas completas a partir de una célula (Kato y Takeuchi, 1963; Sharp, 14
et al., 1980; Wetherell, 1984; Zimmerman, 1993; Feher et al., 2002; Feher et al., 2003). La embriogénesis somática in vitro también se ha considerado como un avance en las técnicas de micropropagación, aunque todavía presenta problemas en la reconversión ha planta comparada con la organogénesis (Smith y Drew, 1990). La embriogénesis somática fue descrita por primera vez en plantas de zanahoria (Steward et al., 1958) cuando se observó el desarrollo de estructuras embriogénicas in vitro. Comenzando con el desarrollo globular de embriones somáticos, que después se transformaron en embriones en estado de corazón, posteriormente estado de torpedo y finalmente germinaron produciendo plantas fértiles. Los factores que afectan esta frecuencia de eventos fueron estudiados en detalles y optimizados, resultando protocolos con alta producción de embriones bien desarrollados. Debido a la perfección del protocolo, el cultivo en suspensión de células somáticas de zanahoria se usó como el modelo favorito en el estudio de mecanismos embriogénicos (Kato y Takeuchi, 1963; Wetherell, 1984).
2.3.1. Conceptos de embriogénesis somática.
Proceso por el cual las células somáticas, desarrollan los estados de embriogenia y dan como resultado plantas enteras sin fusión de gametos (Merckle et al., 1990).
Se refiere al desarrollo de estructuras embriogénicas a partir de células de origen somático (no sexual) (Smith y Drew, 1990).
La formación de un embrión a partir de una célula, sin la necesidad de la fusión de gametos (Tisserat et al., 1979)
2.3.2. Morfología de la embriogénesis somática. En el caso de las dicotiledóneas, un embrión somático es morfológicamente similar a un embrión cigótico, sobre todo en su desarrollo evolutivo desde proembrión, fase globular, corazón, torpedo y fase cotiledonal o embrión maduro (Yasuda et al., 2000).
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En los estados iniciales, el suspensor esta en menor desarrollo en embriones somáticos (puede ser quizás un reflejo de inutilidad bajo condiciones in vitro). Otra diferencia importante es que el embrión cigótico forma un eje embrional con el meristemo apical, preparándose para la dormancia. Mientras que el embrión somático no sufre disecación ni dormancia, así la embriogénesis somática se dirige a formar de una célula, una planta sin interrupción (Merckle, 1990). Xu y Bewley (1992), con la ayuda de un microscopio electrónico describieron los contrastantes patrones de desarrollo entre los embriones somáticos y cigóticos, destacando un desarrollo lento en los estados tempranos y un desarrollo más rápido en los estados tardíos del embrión somático en comparación con el cigótico; otra diferencia fue la falta de un suspensor bien definido y la formación de múltiples cotiledones mal desarrollados en embriones somáticos. La embriogénesis somática es similar al desarrollo in vivo a partir del estado de torpedo. A partir de ese estado el desarrollo de embriones somáticos, particularmente el desarrollo programado de los meristemos, sigue un camino que en un sentido muestra más analogía con la organogénesis (Ammirato, 1983: Sung y Okimoto, 1981; Nomura y Komamine, 1985). 2.3.3. Embriones Somáticos. Los embriones somáticos son estructuras bipolares que cuentan con: un eje radical y otro apical, cotiledones, no poseen conexión vascular con el tejido materno y presentan bandas procambiales entre los ápices (Zimmerman, 1993). Su desarrollo es nutrido por células vecinas a través de conexiones protoplasmáticas, estas estructuras bipolares son capaces de crecer y formar plantas normales, debido a la naturaleza bipolar del embrión, es posible la alta velocidad de multiplicación (Escalant y Teissont, 1989; Sharp et al., 1980; Zimmerman, 1993).
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Yasuda et al. (2000) describieron en zanahoria una inusual secuencia de estados morfológicos en la formación de embriones en estado de corazón a partir de masas proembriogénicas. 2.3.4. Epigenética: dirección de la embriogénesis. La dirección de la embriogénesis es medida como epigenética: que es la distancia de las células del explante hasta el estado embriogénico. Se han clasificado a las células no embriogénicas como (CNEs) y a las células pre-embriogénicas ó células determinadas a inducir embriogenia como (CEs) (Sharp et al; 1980; Sharp et al., 1982; Evans et al., 1981). Las CEs son epigenéticamente embriogénicas al explantarlas y son determinadas durante el ciclo mitótico celular, ejemplo: células de embriones cigóticos, en cambio
las CNEs son el producto de un arranque
epigenético del estado embriogénico en el medio de cultivo, se originan de células que reingresan al ciclo mitótico celular y se rediferencian a CEs (Sharp et al., 1980). Los reguladores de crecimiento (auxinas y/o citocininas) son los agentes primarios que determinan a las CNEs, mientras que en las CEs actúan como activadores del desarrollo (Sharp et al., 1980). Una vez inducido las CNES, funcionan equivalente a CEs y ambos pueden mantenerse y multiplicarse en el estado embrionario bajo condiciones apropiadas de cultivo, tales cultivos consisten de proembriones globulares ó masas proembriogénicas proliferantes (MPEs). La embriogénesis puede ser directa con células embriogénicas desarrolladas directamente del explante, o puede ser indirecta, con desorganizados ciclos mitóticos no embriogénicos interpuestos entre el explante de tejido diferenciado y estructuras embriogénicas reconocidas (Merkle, 1990). Por lo tanto la diferencia crítica entre embriogénesis directa e indirecta es la diferencia entre CEs y CNEs. La embriogénesis directa e indirecta tienen distintas ventajas y limitaciones con respecto a su particular aplicación. Así células somáticas CEs, son generalmente
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más fácilmente inducidas a producir embriogénesis somática que células vegetativas diferenciadas CNEs (Merkle et al., 1990). 2.3.5. Potencial embriogénico: adquisición de totipotencia. Los estudios definen el fenómeno de totipotencia como: cualquier célula de la planta, puede actuar como un sustituto del cigoto para iniciar una nueva planta. Para poder generar una planta, la embriogénesis somática debe desarrollar un estado de embrión somático ó desarrollar estructuras morfogénicas, de las cuales, los órganos individuales de la planta puedan surgir (Kato y Takeuchi, 1963; Wetherell, 1984). Una vez adquirida la totipotencia es una capacidad larga y duradera, en este sentido, una población de células puede conservar esta propiedad, si es subcultivada en presencia de auxinas por meses ó años y todavía tienen la capacidad de generar embriones tan solo removiendo las hormonas (Zimmerman, 1993). 2.3.6. Embriogénesis somática directa La embriogénesis somática directa, especialmente en ausencia de auxinas exógenas, esta asociada con un período relativamente corto entre el tiempo de la iniciación cotiledonal y el comienzo de la maduración de los embriones (Maheswaran y Williams, 1986b). Durante este tiempo, en el explante aparece una clonación directa,
desarrollándose así células embriogénicas en un estado temprano. Del
amplio espectro de aplicaciones y condiciones asociadas con la embriogénesis, se busca enfatizar más, en sistemas basados en embriones cigóticos o explantes con embriogénesis somática directa. Este proceso
es conocido como clonación
embrionaria. Se supone que estos explantes están compuestos principalmente de CEs o células que requieren una menor epigenética para programar la expresión al estado embriogénico. (Merkle et al., 1990). Dentro de los factores que limitan la embriogénesis directa se encuentra la plasmolisis de las células explantadas descrita por Wetherell (1984). Este factor se cree que afecta el estado epigénico de las células y puede ser explicado por su
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capacidad de interrumpir las interacciones célula-célula requeridas para mantener coordinados los patrones de desarrollo (Merkle et al., 1990). 2.3.7. Embriogénesis somática secundaria. El poder de las técnicas de clonación de embriones y su explotación para: propagación, producción de metabolitos, ó transformación genética tienen como base la embriogénesis recurrente ó también llamada repetitiva, accesoria, proliferante ó secundaria. La cual ocurre cuando embriones somáticos primarios fallan, para madurar normalmente hasta plántulas y en lugar de eso dan origen a ciclos sucesivos de embriones somáticos, que provienen comúnmente de células superficiales de los cotiledones ó hipocotilo (Merkle et al., 1990). 2.3.8. Desarrollo anormal de embriones somáticos. In vivo el desarrollo normal embrionario es dado por el tejido circundante al óvulo y para imitar esta condición in vitro, se debe ser hábil para facilitar el desarrollo normal de embriones somáticos (Merkle, 1990). Debido a la gran sensibilidad a los factores externos. La embriogénesis somática presenta numerosos casos de desarrollo anormal in vitro como son : La aparición de estructuras de raíz o brotes unipolares, la formación de múltiples cotiledones, embriones secundarios, complejos de células proembriogénicas ó callo de la cual surgen brotes adventicios, raíces, hojas y algunos órganos florales y finalmente la hiperhidricidad (Kevers et al., 1984; Merkle, 1990). 2.3.9. Hiperhidricidad La hiperhidricidad o vitrificación (Debergh et al., 1992) es un serio problema que afecta a varias plantas que son cultivadas in vitro (Kevers et al., 1984). Los tejidos hiperhídricos se caracterizan por una apariencia vidriosa, tallos y hojas traslúcidas y una distorsión de sus órganos (Brand, 1990). El desarrollo y supervivencia de cultivos hiperhídricos es muy bajo (Debergh y Maene, 1984). Se ha descrito que la hiperhidricidad esta asociada con varios factores del medio del cultivo incluyendo un bajo potencial matrix (Debergh, 1983), baja concentración de agente gelificante, altas
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concentraciones de citocininas y la presencia de alguno de los nutrientes del medio de cultivo. En cultivos de membrillo el aumento del calcio eliminó la hiperhidricidad (Singha et al., 1990) y se registró que los bajos niveles de potasio están asociados con la hiperhidricidad. También al remover iones de cloro se encontró que también se reduce la hiperhidricidad en Prunus, en tanto que en Salix los iones de amonio estuvieron asociados con la hiperhidricidad, aunque también se describió, que está basada en la adicción o reducción de nitrato de amonio (Brand, 1990).
2.4. Fases de la embriogénesis somática
Inducción de embriogénesis somática
Proliferación y mantenimiento de embriones somáticos
Maduración de embriones somáticos Recuperación de embriones somáticos Maduración de embriones somáticos
Germinación de embriones somáticos
2.4.1 Inducción de embriogénesis somática. 2.4.1.1. Tipo de explante. La Embriogénesis somática han sido inducida a partir de una gran variedad de explantes de plantas, generalmente de embriones cigóticos, semillas germinadas, embriones inmaduros, cotiledones, brotes meristemáticos, inflorescencias inmaduras, óvulos, microesporas, hojas, estigma, estilo, células de raíz, embriones somáticos inmaduros y en algunas especies a partir de nucelas (Kochba et al., 1972; Srinivasan y Mullins, 1980; Litz, 1984; Lai y McKersie, 1994; Twyford y Mantell, 1996;
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Rodríguez-Garay et al., 1996; Lee et al., 1997; Carimi et al., 1998; y
Hofer et al.,
2000; Nhut et al., 2003). 2.4.1.2. Nucela. La nucela es un tejido no-vascular muy utilizado para estudios experimentales en ginogénesis, desarrollo de plántulas nucelares, inducción de poliembrionía, endospermo y desarrollo de embriones (Hossain et al., 1993; Linnestad et al., 1998; Dominguez y Cejudo, 1998). Se ha reportado que un inusual crecimiento nucelar ó formación de embriones adventicios ocurre de forma natural en por lo menos 16 familias de plantas. Actualmente se explota este tejido para la inducción de cultivos embriogénicos en varias plantas leñosas. Gracias a la recuperación de plantas de tejido nucelar vía embriogénesis somática se pueden eliminar enfermedades sistémicas (Rangaswamy, 1981; Litz, Chavez y Moon, 1998), 2.4.1.3. Factores que influyen en la adquisición de capacidad embriogénica. La adquisición de capacidad embriogénica en plantas mayores se debe a varios factores intra- y extracelular (De Jong et al., 1993). Se conocen diferentes factores químicos y ambientales que influyen en la embriogénesis somática. 2.4.1.3.1. Hormonas. La adquisición de totipotencia es el paso más critico en la embriogénesis somática y el factor mas importante que la afecta, es la aplicación de hormonas endógenas, debido a que el uso de auxinas a altas concentraciones es necesario para causar la desdiferenciación
y la estimulación de la totipotencia, varias auxinas han sido
usadas para este propósito: la auxina natural IAA y otras sintéticas como el ácido naphtalenacetico (NAA), el ácido diclorofenoxiacético (2,4-D), plicoram, ácido picolínico y cinetina (Finstad et al., 1993; Desamero et al., 1994; Litz et al., 1998; Xing et al., 2000; Cooke et al., 2002 . El 2,4 - D es la auxina más eficiente y la más comúnmente usada para la promoción de embriogénesis somática ya que: 1) estimulan una rápida división celular; 2) estimulan una división celular sincronizada que da como resultado células
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proembriogénicas y 3) estimulan la proliferación de células proembriogénicas (Litz et al., 1998). Cuando soló se uso benzilaminopurina (BAP) (citocinina) para inducir embriogénesis somática resulto ser limitado a explantes (CEs) del hipocotilo de embriones muy inmaduros. En contraste, las auxinas son efectivas en inducir embriogénesis somática de un amplio rango de tejidos y estados de desarrollo, solo las auxinas tienen el potencial para regenerar CNEs de tejido no embriogénico (Merkle et al., 1990). Tulecke y McGranahan (1985) usaron la combinación de ambos auxinas y citocininas para inducir embriogénesis somática y en este caso no estuvo claro cada papel, si están presentes o no las citocininas en la inducción de embriones somáticos. Iantcheva et al. (1999) reportaron en Medicago la inducción de embriogénesis somática en alta frecuencia con el uso de Thidiazuron (TDZ) y 6-Benzylaminopurina (BAP). Mithila et al. (2003) inducieron con TDZ, embriogénesis somática a partir de explantes de violeta africana. 2.4.1.3.2. Genotipo y tipo de tejido. El genotipo, tipo de tejido y estado de desarrollo pueden ser factores determinantes en la habilidad de respuesta comparativa a las auxinas o citocininas (Merkle et al., 1990). En alfalfa la respuesta embriogénica es específica del genotipo y altamente hereditable, al parecer, controlada por dos genes codominantes (Hernández y Christie, 1989; Kielly y Bowley, 1992). Nogan et al. (1989) describieron la embriogénesis somática de Medicago truncatula como altamente dependiente del genotipo. Esta restricción genotípica inhibe el uso de más fuentes de germoplasma para la introducción de nuevas características genéticas (Das Neves et al., 1999).
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Bailey et al. (1993a), reportaron que la formación de cultivos embriogénicos proliferantes de soya es dependiente del genotipo. Lo cual fue corroborado por Simmonds y Donaldson (2000), al evaluar 20 genotipos de soya de ciclo corto. Tanto que con cebada, Castillo et al. (1998) evaluaron 18 genotipos y obtuvieron los mismos resultados. Merkle y Battle (2000) reportaron en Liquidambar styraciflua especie maderable, que la inducción embriogénica es fuertemente afectada por el genotipo y el tipo de explante. En otra especie como Quercus robur L. Endemann y Wilhelm (1999) describieron que el estado de desarrollo del explante, así como la influencia de la estacionalidad, deben de ser considerados como factores importantes en la inducción de embriogénesis somática. En cacahuate (Arachis hypogaea L.) Baker y Wetzstein (1998), reportaron que la respuesta embriogénica en hojas, era influenciada por el estado de desarrollo del explante, el tiempo de inducción y el medio de cultivo. En papa dulce se describió que la respuesta embriogénica es influenciada por el genotipo y las concentraciones de auxinas (Desamero et al., 1994) 2.4.1.3.3. Enzimas y Genes. Yu y Pauls (1993) identificaron un marcador que co-segrega con uno de los genes que determinan la embriogénesis somática en alfalfa tetraploide. Boyer et al. (1993) demostraron que ocurrían cambios cualitativos y cuantitativos en la síntesis de polipéptidos (15 fueron especialmente acumulados) durante la adquisición de competencia embriogénica en tejido de hojas de Chichorium. En especies como zanahoria (Sung y Okimoto, 1981); arroz (Chen y Luthe, 1987); maíz (Franz et al., 1989); Pastos (Hahne et al., 1988) y chíncharo (Stirn y Jacobsen, 1987); se han descrito diferencias en la síntesis de proteínas entre tejido embriogénico y no-embriogénico. En estos cultivos el desarrollo de callo
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embriogénico estuvo acompañado de la síntesis de polipéptidos embriogénicos específicos en un rango entre 45 y 55 kDa. Corre et al. (1996) describieron que el gen Em puede ser usado como un marcador universal de la embriogénesis somática, ya que en estudios realizados con Triticum aestivum L. estaba asociado con cultivos que expresaban potencial embriogénico y mas precisamente a cultivos que presentaban embriones somáticos. Dupire et al. (1999) reportaron 116 proteínas dentro de 20 grupos potencialmente relacionados con la embriogénesis somática de Asparagus officinalis L., de los cuales, dos grupos fueron particularmente importante: 1) con 6 polipéptidos que están relacionados con la competencia
embriogénica y 2) once proteínas
relacionadas con la inhibición de la repuesta embriogénica. En Lycium barbarum, la diferenciación y desarrollo de células embriogénicas es regulada por tres distintas enzimas (disminutasa superoxidasa, peroxidasa y catalasa); Al igual que el peroxido de hidrógeno utilizado como un agente de estrés oxidativo, es capaz de inducir genes de expresión y síntesis de proteínas para promover la embriogénesis somática en esta especie (Kairong et al., 1999). Cvikrova et al. (1999) describieron en explantes de alfalfa, que la alta actividad meristemal y la formación de proembriones correlacionaba con altas cantidades de putrecina, espermidina, espermina y tiramida libre; al igual que tenía una correlación negativa con contenidos de feniletilamina libre. 2.4.1.3.4. Otros factores. Por otra parte, la densidad celular es también otro factor importante, que afecta le embriogénesis somática (Higashi et al., 1998), al igual que las concentraciones de Oxígeno (Kvaalen y Ernstsen, 1993).
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Kikuchi et al. (1995) describieron que las cerradas uniones intracelulares son esenciales
para
los
procesos
morfogenéticos
como
la
embriogénesis
y
organogénesis. Nakano y Mii (1993) en estudios hechos con Dianthus reportaron, que la cefatoxina (antibiótico), fue capaz de inducir embriogénesis somática en un medio sin auxinas. Schmidt et al. (1994) asentaron que el factor Nod (Rhizobium lipoligosacarido), una molécula bacterial, promueve la formación de embriones globulares de zanahoria y parte de su actividad puede estar relacionada con el balance de los reguladores de crecimiento endógenos. Pedroso y Pais (1995) en hojas de Camellia japonica estudiaron cambios en la distribución elemental, molecular, estructural e histológica, durante la inducción de embriogénesis somática. Encontraron severas fluctuaciones en el número de cristales de oxalato de calcio y la acumulación de almidón, que ocurrió solo en tejidos con respuesta embriogénica. En complemento Iwai et al. (1999), utilizando un microscopio electrónico para el análisis morfológico y histoquímico de callo de zanahoria, reportaron la presencia de estructuras amorfas en la superficie de callo embriogénico de zanahoria mientras que en la superficie de callo no embriogénico no se presentaron dichas estructuras. Así como que en células cultivadas de zanahoria no existe correlación entre los puentes de calcio de las pectinas y las uniones intercelulares. Por otra parte, en hojas de Chichorium, Bellettre et al. (1999) describieron que el glicerol en comparación con la sacarosa como fuente de carbón durante la fase de inducción, tuvo un efecto inhibitorio en la respuesta embriogénica. Actualmente se conoce que la embriogénesis somática en zanahoria es promovida y estimulada por una variedad de factores condicionantes, como son las proteínas
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arabinogalactan (Kreuger y Van Horst, 1993; Toonen et al., 1997), proteínas extracelulares (De Jong et al., 1992) y la fitosulfoquina-a (Kobayahi et al., 1999b). Fisichella y Moroni (2003) describieron que la composición de la atmósfera en el frasco con cultivos de hojas de membrillo, puede influenciar la embriogénesis somática de esta especie. 2.4.2. Proliferación y mantenimiento de embriones somáticos. 2.4.2.1 Eventos tempranos en presencia de auxinas. Si las auxinas son retenidas en el medio, el proceso de la embriogénesis se detiene en alguna parte antes del estado globular de los embriones. El punto donde se detiene es más o menos típico para cada una de las líneas de células. En las líneas de células proliferantes de zanahoria se observaron varios estados de desarrollo desde células indiferenciadas hasta embriones globulares, otras líneas solo mostraron células indiferenciadas y MPE (Masas proembriogénicas) (Zimmerman, 1993). Los efectos en el desarrollo celular por la acción de las auxinas en un explante para la inducción de desdiferenciación por un lado y para la formación de embriones primarios (EMP) por el otro. Deben ser anotados para cada línea de células. Esta aparente contradicción puede ser entendida si uno considera que una vez formados los (EMP) pueden hacerse insensible a las auxinas. La sensibilidad a las auxinas es recobrada en un estado posterior (post-globular), cuando los embriones en presencia de auxina detienen su avance definitivo y regresan a tejido indiferenciado. Debido a que los embriones (EMP) en estado globular no producen auxinas por lo que la embriogénesis procede normalmente. Después del estado globular los embriones comienzan a formar callo. Esto puede ser explicado, suponiendo la producción y transportación en bloque de auxinas (IAA) almacenadas a partir del estado globular. En consecuencia después del estado globular los embriones comienzan a producir auxinas y se hacen sensitivos a esta comportándose semejante al tejido somático (Zimmerman, 1993). 26
En Arabidopsis thaliana los altos contenidos intracelulares de 2,4-D pueden interferir con el desarrollo de embriones somáticos después del estado globular (Meijer et al., 1999). Dyachok et al. (2000) describieron que en Picea abies el factor Nod secretado por la especie Rhizobium, estimula el desarrollo de masas proembriogénicas en medio suplementado con 2,4-D. 2.4.2.2. Células proembriogénicas Un tejido explantado in vitro consiste de varios tipos de células. Los explantes al ser tratados con reguladores de crecimiento sus células comienzan a desdiferenciarse y proliferar. Para la inducción del estado embriogénico los explantes requieren de extensos ciclos de células proliferando desorganizadamente, la muerte o perdida de explantes celulares circundantes, y/o altos niveles de auxina sintética. En presencia de auxinas endógenas, después de varios días (a veces semanas) una población de pequeñas células compactas emergen (Nomura y Komamine, 1985). Esas pequeñas y compactas células divididas en forma asimétrica y sus células hermanas junto con ellas, se amontonan como un típico grupo de células acumuladas. Las cuales se conocen como: masas proembriogénicas ó agrupamiento embriogénico. Sobre estas masas proembriogénicas se desarrollan los embriones somáticos (Zimmerman, 1993). Nimura y Komamine, (1985) en cultivos en suspensión de zanahoria determinaron 3 diferentes tipos de desarrollo celular. Los cuales clasificaron en: Tipo 1. Células de forma esférica que tenían un diámetro de 12 mM que podrían diferenciar embriones a una frecuencia cercana al 90 %. Tipo 2. Células de forma ovalada que solo diferenciaron 10% embriones somáticos. Tipo3. Células elongadas que no diferenciaron embriones. Yasuda et al. (2000) describieron en zanahoria a partir de células somáticas individuales, la formación de masas proembriogénicas de diversas formas y con varios patrones de división. 2.4.3. Maduración de embriones somáticos.
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2.4.3.1 Obtención de embriones somáticos. En embriones somáticos en estado temprano, un alejamiento o disminución de la concentración de auxinas en el medio de cultivo puede romper el ciclo de continua proliferación de masas proembriogénicas y permitir a los embriones el desarrollo y maduración. Debido a que este alejamiento de auxinas ejerce un efecto de disminuir la friabilidad aumentando los contactos célula-célula y permitiendo un incremento en la polaridad dentro del grupo de células embriogénicas (Merkle et al., 1990). En el caso de zanahoria para que un embrión pueda emerger la masa proembriogénica debe tener por lo menos tres células. Aunque todas las células son totipotentes, el número de embriones formado es pequeño comparado con el número de células en las masas proembriogénicas (Wetherell, 1984). En ese mismo trabajo se determinó que la plasmolisis de células proembriogénicas, atrofia la interconexión intracelular, permitiendo que más células expresen independientemente su totipotencia a través de la formación de embriones somáticos. Masuda et al. (1995) registraron la formación de embriones somáticos, a partir de masas proembriogénicas desarrolladas en la epidermis de zanahoria sin fase de callo ni cultivo en suspensión. Kreuger y Van Holst (1995) describieron que las proteínas arabinogalactanas (AGPs) pueden incrementar (fracción Zum18 AGP) o inhibir (fracción ZUM 15 AGP) el desarrollo de embriones somáticos de zanahoria. En complemento Toonen et al. (1997) evidenciaron que los diferentes cultivos en suspensión de zanahoria tienen diferentes respuestas a una particular (AGPs) y que era muy claro que los diferentes tipos de AGPs presentes en cultivos en suspensión pueden ser tanto promotores como también inhibidores de la elongación celular. Overvoorde y Grimes (1994) indicaron que son necesarios 200 µM de Ca2+ exógeno, para lograr la formación de embriones somáticos de zanahoria. Litz (1986) señalo en Carica papaya, que el estrés osmótico es un importante factor que condiciona la embriogénesis somática de cultivos en suspensión. En palma de dátil se logro una mejor recuperación y desarrollo de embriones somáticos en suspensión sin sacarosa
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durante dos semanas (Veramendi y Navarro, 1996). Hohe et al. (1999) registraron que la acumulación de CO2 en cultivos en suspensión, incrementa la recuperación de embriones somáticos de Cyclamen persicum Mill. Fernando y Gamage (2000) en Cocos nucifera L. mencionaron que la incorporación de ABA en concentraciones de 2.5-5 µM durante cinco semanas incrementaba la formación y desarrollo de embriones somáticos en comparación con los producidos con bajos niveles de 2,4-D. Biahoua y Bonneau (1999) describieron que: La más alta frecuencia de embriogénesis somática de Euonymus europaeus L. fue obtenida en el medio de cultivo con concentraciones de 350 mM de sacarosa ó 89 mM de glucosa. Un mínimo potencial osmótico es requerido para estimular la emergencia de embriones somáticos; Elevadas concentraciones de glucosa tienen un efecto inhibitorio independientemente de su efecto osmótico, mientras que elevadas concentraciones de sacarosa mantienen su presión osmótica al igual que estimulan la emergencia de numerosos embriones somáticos. Se ha reportado la producción embriones somáticos de calidad y con un alta taza de conversión,
en varias especies de
confieras (Stasolla et al., 2002). 2.4.3.2. Factores que inhiben la obtención de embriones somáticos. Es conocido que el estado globular de embriones somáticos, es el mas sensitivo de todos los estados de desarrollo (Zimmerman et al., 1989) y que tratamientos con diversos inhibidores como el ácido benzil-isohexaloacetico (un análogo de las auxinas; Baldan et al., 1995), la pirimidina 2-amino-5-ethoxicarboril (una pirimidina causante de la hipometilación; Lo Schiavo et al., 1989) y la Brefeldina A (un inhibidor de la secreción de proteínas, Capitano et al., 1997) causan un bloqueo en el estado globular y en la producción de poliembriones. También se demostró la gran sensibilidad de embriones somáticos en estado globular a la temperatura (Lo Schiavo et al., 1990).
29
Osuga et al. (1993) determinaron que cuando células embriogénicas son cultivadas en medio libre de auxinas a una alta densidad celular, la formación de embriones somáticos de zanahoria se ve fuertemente reducida. Kobayashi et al. (1999a) demostraron que la inhibición es causada por un factor(es) que tiene un peso molecular
cercano a 3500 el cual es
adicionado(s) al medio por células
embriogénicas que han sido cultivadas a alta densidad. Kobayashi et al. (2000) reportaron la purificación y identificación del alcohol 4-hidroxibenzil, el cual es el mayor factor inhibitorio formado en el medio de cultivo por células de zanahoria a altas densidades. En un estudio realizado con membrillo, se determino que tanto la ventilación del frasco como el reemplazar la atmósfera del frasco con diferentes mezclas de gases reducen la formación de embriones somáticos por lo que se cree que componentes gaseosos diferentes a O2 y CO2 presentes en la atmósfera del frasco, pueden promover la formación de embriones somáticos (Fisichella y Moroni, 2003). 2.4.3.3. Polaridad de embriones somáticos Una de las cuestiones mas importantes a considerar durante los mecanismos de la embriogénesis somática, es lo relacionado a la diferenciación celular y la polaridad embrionaria durante la primera división celular (Feher et al., 2002). La formación de embriones somáticos prosigue del establecimiento de la polaridad en células indiferenciadas. A su vez la polaridad acciona para inducir la formación de embriones somáticos (Merkle et al., 1990). En ciertos instantes, se pueden aumentar la polaridad y así aumentar la diferenciación de MPEs (Dijak et al., 1986). La polaridad en el desarrollo de embriones en estado globular a embriones en estado de corazón es regulada por el transporte polar de auxinas. Este transporte esta íntimamente relacionado con la iniciación y el mantenimiento del crecimiento polarizado de embriones somáticos. Al interferir con este transporte se promueve la formación de embriones con cotiledones fusionados (Liu et al., 1993). Binarova y
30
Dolezel (1993) describieron que el rompimiento del esqueleto celular microtubular (el cual juega un importante rol en la generación y mantenimiento de la polaridad celular), interrumpe la embriogénesis somática de cultivos en suspensión de alfalfa y zanahoria. 2.4.3.4. Factores que intervienen en la maduración de embriones somáticos. 2.4.3.4.1. Acumulación de proteínas. Los embriones somáticos no acumulan la misma cantidad de proteínas que se observan en semillas in vivo. Se han detectado en embriones somáticos de alfalfa 10% de las proteínas almacenadas que se encuentra en embriones cigóticos (Stuart et al., 1988). Embriones somáticos son menos vigorosos que las semillas in vivo. En consecuencia, si se incrementa la acumulación de proteínas, podría ser posible incrementar el vigor de embriones somáticos (Stuart et al., 1988). Flinn et al. (1993) en un estudio realizado con abeto, reportaron que existía similitud en la regulación de la expresión del gen de reserva de proteína, durante los estados tempranos e intermedios de la embriogénesis somática y cigótica. Pero existieron diferencias en la expresión de genes en los estados posteriores durante la maduración,
lo cual puede ser atribuido a la influencia de la disecación de los
embriones cigóticos, la cual no ocurre en embriones somáticos. Reid et al. (1999a) describieron que las reservas almacenadas de nutrientes minerales (P,K,Mg,Ca,Fe y Zn) fueron similares tanto en embriones somáticos como en embriones cigóticos individuales de Picea glauca (Moench)Voss. En complemento trabajando con la misma especie Ried et al. (1999b) encontraron que embriones somáticos y embriones cigóticos también tienen una composición muy similar en los globoides y los Fe-rich. Por lo cual es factible pensar, en los embriones somáticos como una herramienta para desarrollar estudios nutrimentales que no son posible estudiar con embriones cigóticos.
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2.4.3.4.2. Sacarosa La sacarosa es un metabolito ampliamente utilizado en la regulación del desarrollo tanto de embriones somáticos como cigóticos (Anandarajah y McKersie, 1990). Para producir plantas vigorosas, se requiere un período de crecimiento y maduración embriogénica antes de la germinación. Esto se logra normalmente utilizando medios de cultivo con niveles del 3 al 6 % de sacarosa, aunque se han usado niveles que pasan el 40 % en algunas especies (Lee y Thomas, 1985; Janick, 1986; Buchheim et al., 1989). Incrementos progresivos en los niveles de sacarosa son usados para lograr la maduración, debido ha que altos niveles de sacarosa implican la disecación osmótica del medio (Merkle et al., 1990). Concentraciones mayores a 30 g por litro detienen la germinación precoz de embriones somáticos de M. Sativa y les permite continuar con los procesos de maduración sin la necesidad de ABA (Anandarajah y McKersie, 1990). Tremblay y Tremblay (1995) reportaron que las concentraciones optimas de sacarosa para la maduración de embriones somáticos de abeto negro variaron entre 4% y 6%, e indicaron que la sacarosa actúa principalmente como un regulador osmótico en la maduración de embriones somáticos. 2.4.3.4.3. Densidad del explante. El número de embriones somáticos por unidad de medio influye en el desarrollo, maduración y adquisición de tolerancia a la disecación de embriones somáticos, al igual que en la germinación de plántulas vigorosas (Lai et al., 1992). 2.4.3.4.4. Glutamina. La inclusión de glutamina, alanina, prolina y arginina en concentraciones de 30 mM en medio de regeneración de M. sativa incrementa la producción de embriones somáticos, su peso seco, la síntesis de proteínas almacenadas, al igual que el promedio de conversión a planta (Lai et al., 1992).
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Khlifi y Tremblay (1995) con embriones somáticos de abeto negro, reportaron que la L-glutamina a concentraciones de 2 a 3 g l-1, puede ser usada como única fuente de nitrógeno para la maduración, ya que incremento el número de embriones somáticos maduros en seis distintos genotipos. Morcillo et al. (1999) describieron que la adición de argenina y glutamina incremento la acumulación de proteínas en embriones somáticos de palma de aceite; pero que la acumulación de proteínas depende del genotipo y aminoácido utilizado. Nuutila et al. (2000) describieron que en los estados embriogénicos tempranos de embriones somáticos de cebada, se requiere la presencia de glutamina o otro aminoácido,
para
que
pueda
ser
transformado
hasta
proteínas.
También
determinaron que en los estados posteriores de maduración y regeneración la necesidad de nitrógeno orgánico disminuye. 2.4.3.4.5. Ácido absisico (ABA). El ABA tiene al menos dos funciones principales en los procesos de maduración de embriones somáticos de alfalfa. El primero es prevenir la germinación precoz de embriones somáticos a concentraciones de aproximadas a 1µM (Anandarajah y McKersie, 1990). El segundo es incrementar la tolerancia a la disecación en el estado de desarrollo cotiledonal, a concentraciones de 10 - 50 µM. (Senaratna et al., 1990). Ammirato (1974) reportó que impidió la germinación precoz de embriones somáticos en suspensión de alcaravea con ABA a 10-7 M. En complemento el ABA promovió el desarrollo de cotiledones bien formados y suprimió la producción de embriones secundarios. Ammirato (1983) reporto que los mismos niveles tuvieron efecto similar en cultivos de embriones somáticos en suspensión de zanahoria. Basado en estos resultados el propuso que la regulación de la maduración de embriones somáticos por ABA puede ser usado para facilitar cultivos en gran escala, plantaciones mecanizadas, inducción artificial de dormáncia y su incorporación en semillas artificiales. In vivo, existen altos niveles de ABA durante la maduración temprana de
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embriones dicotiledonales los cuales inducen la acumulación de un grupo de proteínas hidrofílicas, también el ABA le concede protección a la disecación (Merkle et al., 1990). La función del ABA en la iniciación de la acumulación de reservas no es desconocida. Debido a que cuando se inicia la acumulación de reservas, esta coincide con altos niveles de ABA endógena (Merkle et al., 1990). La aplicación de ABA exógena a embriones somáticos en un estado adecuado, puede ayudar a recuperar un mayor número de embriones somáticos normales (Merkle et al., 1990). Shiota et al. (1999) reportaron que diferentes tratamientos de ABA en embriones somáticos de zanahoria, pueden permitir su almacenaje a temperaturas de -25° C por más de 169 semanas. Visser et al. (1999) desarrollaron la hipótesis de que las proteínas G están involucradas en el efecto inhibitorio del ABA durante la germinación de embriones somáticos de cebada. 2.4.4. Germinación de embriones somáticos. El proceso que llamamos germinación, comienza con la pérdida de humedad de la semilla (inhibición) y se completa cuando una parte del embrión generalmente la radícula, se extiende penetrando las estructuras que lo rodean (Bewey, 1997). Para que la germinación ocurra en orden, los embriones somáticos deben de tener brotes funcionales y raíces capaces de tener crecimiento meristemático (Merkle et al., 1990). Altos niveles de auxinas pueden inhibir el desarrollo y crecimiento de brotes meristemales. Por lo que si embriones jóvenes no son transferidos a un medio con baja concentración o sin presencia de auxinas, después de la inducción a embriogénesis estos no madurarán adecuadamente y generarán embriogénesis secundaria. (Muralidharan y Mascarenhas, 1987; Gorst et al., 1987; Parrott et al., 1988). En esta etapa puede ser necesaria la adición de carbón activado al medio de cultivo para remover la mayor cantidad de auxinas como sea posible de los embriones
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somáticos (Buchheim et al., 1989). A bajos niveles de auxinas después de la iniciación de los cotiledones, se logra una temprana formación de brotes. En condiciones no apropiadas de cultivo, la germinación puede ocurrir prematuramente, teniendo como consecuencia plántulas débiles o sin viabilidad (Merkle, 1990). Para algunas especies, la eficiente conversión a plántula requiere la imposición de una
disecación temporal antes de la germinación. Este procedimiento imita la
maduración de semillas in vivo y puede ser necesario para iniciar los procesos metabólicos necesarios para la germinación y crecimiento de plántulas in vitro. (Rosenberg y Rinne, 1988). Gjuleva y Arnold (1999) reportaron que solo embriones perfectamente desarrollados de Picea abies fueron capaces de desarrollar hasta plantas normales, también determinaron que el extracto de semillas afecta positivamente tanto a embriones bien desarrollados como a embriones con pobre desarrollo, pero solo en el periodo inicial. En palma de aceite se logro la germinación de embriones somáticos derivados de cultivos de suspensión con diferentes niveles de BA (6-benziladenina) (AberlencBertossi et al., 1999).
2.4.5. Recuperación y aclimatación de plántulas. En la mayoría de las especies de plantas, la regeneración de plantas es un factor básico en el cultivo de tejidos, la micropropagación a gran escala y en la transformación genética (Nhut et al., 2003) En soya, entre los factores que tienen mayor influencia para la recuperación de plantas son; el tiempo de exposición a las auxinas (Parrott et al., 1988), el genotipo de la planta (Bailey et al., 1993b), morfología de los embriones somáticos (Lazzeri et al., 1985), la falta de elongación del hipocotilo (Komatsuda et al., 1992), el desarrollo de los cotiledones y tratamientos de deshidratación durante la germinación (Buchheim et al., 1989).
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Plántulas que crecieron in vitro en una atmósfera saturada de humedad mostraron un reducido desarrollo de ceras cuticulares y función anormal de los estomas (Wetztein y Siommer, 1983). En la fase de aclimatación mientras que hojas y raíces normales se desarrollan, las perdidas de plántulas pueden ser altas si no son protegidas de la perdida de agua al transpirar. Debido a que las plántulas deben estar sujetas a ir reduciendo progresivamente la humedad. La aclimatación de plántulas presenta un problema en la micropropagación comercial, (Merkle et al., 1990). La mayoría de las especies cultivadas requieren un proceso de aclimatización, para contar con una alta sobrevivencia de plantas vigorosas, que nos permitan tener éxito en el transplante (Hazarika, 2003). Para la aclimatización de plantas, la embriogénesis somática es una alternativa debido a que se pueden evitar ó minimizar los problemas de aclimatación, si los embriones pueden ser removidos de su cultivo en madurez fisiológica y germinar bajo condiciones normales de crecimiento (Pretova y Williams, 1986). 2.5 Aplicaciones de la Embriogénesis Somática. La embriogénesis somática es un modelo que nos permite estudiar y entender las bases moleculares y celulares de plantas, así como estudiar la capacidad embriogénica de células somáticas (Feher et al., 2003).
En los últimos años se ha
utilizado para estudiar la capacidad embriogénicas de células somáticas utilizando como modelo embriogénesis de mutantes de Arabidopsis (Feher et al., 2003). Ahora la manipulación genética de células tiene un alcance tal que el alto nivel de refinamiento de las técnicas regeneración de plantas a partir de cultivos celulares es extremadamente importante (Sharp et al., 1980). En este respecto, la embriogénesis somática tiene muchas ventajas sobre la organogénesis debido a:
Embriones a diferencia de brotes se originan de una célula individual.
Los cultivos embriogénicos pueden ser sincronizados y purificados.
Se pueden tener cultivos de material homogéneo.
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Algunas especies son recalcitrantes a la embriogénesis somática, así como algunos cultivares de la misma especie. Los recientes hallazgos de mutantes y variantes epigénicas desvirtúan a la embriogénesis somática, pero puede ser resuelta con adición al medio de factores condicionantes (glicoproteínas) secretados por cultivos embriogénicos, particularmente si estos factores condicionantes comprueban no ser específicos (Sharp et al., 1980). En frutales tropicales el uso de la genética de células somáticas para mejoramiento genético, depende de la disponibilidad de protocolos eficientes para la regeneración de plantas a partir de explantes de árboles maduros. La recuperación de cultivos embriogénicos a partir de tejido maduro de árboles tropicales y subtropicales depende de la especie, cultivar, tipo de explante (estado de desarrollo) y el medio de inducción (Litz et al., 1998a). Los cultivos embriogénicos de especies tropicales y subtropicales han sido utilizadas para propagación, selección in vitro a factores bióticos y abióticos, aislamiento y cultivo de protoplastos, transformación genética y para estudios de conservación de germoplasma (Litz et al., 1998a). Actualmente se está implementando el uso de bioreactores de inmersión temporal, en especies leñosas, los cuales representan una alternativa para la producción de semillas artificiales ( Etienne-Barry et al., 1999). Ibaraki y Murata (2001) reportaron que la automatización de los procesos biotecnológicos puede incrementar el uso de la embriogénesis somática para la micropropagación, en dos sentidos: 1. Como una importante herramienta para la investigación en Embriogénesis somática y 2. Mejorando la eficiencia de producción de embriones con un reducido costo de producción. 2.6. Organogénesis en Mango. Rao et al. (1981) describieron la inducción de raíces adventicias a partir de callo iniciado de cotiledones de mango, en medio de crecimiento de Murashige y Skoog
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(1962) MS, suplementado con cinetina y ácido naftalenacetico (ANA). Sin embargo, no observaron la diferenciación de brotes. Posteriormente el potencial morfogenético de hojas de árboles maduros de mango fue demostrado por Raghuvanshi y Srivastava (1995), quienes iniciaron callo caulogénico a partir de hojas jóvenes del variedad Amrapalli. Se controlo la exudación fenólica con un antioxidante (0.05% polivinilpirolidona). La formulación reguladora optima para la formación de brotes múltiples a partir de callo de hoja fue el medio MS que contenía 13.0 µM de cinetina junto con 1.1 µM de ácido indolacético (AIA). El enraizamiento de los brotes se obtuvo al subcultivarlos en medio con 9.8 µM de AIA. Los cultivos se mantuvieron a 25 º C con fotoperiódo de 16/8 h proporcionado por luz blanca fluorescente (50 – 70 micromoles ms). 2.7. Embriogénesis somática en Mango. La embriogénesis se a logrado en más de 30 variedades de mango (Litz, 1997). Litz et al. (1982) fueron los primero en inducir el crecimiento lento de callo in vitro de explantes nucelares de mango, extraídos de óvulos fertilizados de frutos inmaduros (4.0 – 4.8 cm.) de mangos poliembriónicos y posteriormente (Litz, 1984) de mango monoembriónicos. En medio MS modificado: con la mitad de sales y complementado con 60 gr./l de sacarosa, 400 mg/L de glutamina, 100 mg/L de ácido ascórbico, 1.0 mg/L de 2, 4-D y 8.0 gr./L de Difco Agar. Se obtuvo embriogénesis somática a partir de callo en este medio y posteriormente se subcultivó en medio sin reguladores. De Wald et al. (1989a), estudiaron los componentes del medio y las características que afecta el crecimiento de cultivos embriogénicos nucelares de mango y la producción de embriones somáticos in vitro. Se incluyo
el papel de los
complementos orgánicos, formulaciones básales, agentes solidificantes y estado físico del medio (sólido ó liquido). Obteniendo los siguientes resultados: El crecimiento de cultivo embriogénico en suspensión fue más eficiente que en medio sólido. Sin embargo, el cultivo en medio sólido fue esencial para una alta frecuencia y producción de embriones morfológicamente normales, el agente gelificante gelrite 38
fue más efectivo con respecto al Bacto Agar Difco. El medio basal B-5 modificado fue mejor para el mantenimiento de los cultivos embriogénicos y la producción de embriones somáticos morfológicamente normales, en comparación con los medio MS ó WPN. La concentración de sacarosa al 5 y 6% resultaron optimas para la producción de embriones somáticos y también incrementaron la frecuencia de embriones recuperados, quienes se diferenciaron normalmente a estado temprano de corazón. El agua de coco al 20% mejoró la producción de embriones somáticos en 18%. Otros complejos orgánicos agregados solos ó en combinación con agua de coco fueron inefectivos (Caseína Hidrolizada) ó altamente inhibitorios (Extracto de malta) en comparación con el testigo. De Wald et al. (1989b)
reportaron la maduración y germinación de embriones
somáticos de mango que lograron por transferencias secuenciales de embriones somáticos en estado de corazón, a una serie de medios a base de la formulación B5. La germinación precoz y otras anormalidades en el desarrollo, se controlaron con la incorporación de 3 µM de ácido absisico (ABA) y 6% (P/V) de sacarosa al medio. Otros factores incluyendo: la sustitución de Gelrite (0.175%) por Agar, el uso de medio sólido en vez de medio líquido y el cultivo de los embriones somáticos en oscuridad hasta la madurez fisiológica, también afectaron el crecimiento y desarrollo normal de los embriones. El agua de coco (20% V/V) fue esencial en la embriogénesis somática. Los embriones somáticos germinados se establecieron con éxito en medio de transplante y continuaron su crecimiento en el invernadero. Jana et al. (1993) registraron un método para la rápida producción de embriones somáticos de tres cultivares monoembriónicos, a partir de tejido nucelar. El medio de inducción consistió de medio MS suplementado con 5.0 mg/L de 2,4-D, 60 g/l de sacarosa y 2.5 g/l de carbón activado. La maduración de los embriones se observo al reducir las concentraciones del medio basal suplementado con 1.0 mg/L de ABA, 20% de agua de coco, 100 mg/L de caseína hidrolizada, 40 g/l de sacarosa y 2.5 g/L de carbón activado. La normal germinación de embriones somáticos se vio
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favorecida con 5 mg/L de BA. El desarrollo a planta se completo en un período de 75 a 80 días. Monsalud et al. (1995) asentaron que la hiperhidricidad en embriones somáticos inmaduros de mango, es un factor limitante para el desarrollo de cultivos embriogénicos en suspensión de varios cultivares de Mango. La solución ha este problema se llevo a cabo por dos caminos. 1.-Embriones somáticos en estado de corazón (2-3 mm) fueron parcialmente deshidratados bajo condiciones controladas a una alta humedad relativa (RH) por un lapso de 24 – 28 h. 2.-La concentración del agente solidificante en medio con reguladores de crecimiento fue incrementada de 2.0 hasta 6.0 g/l. Los resultados obtenidos fueron los siguientes: la parcial deshidratación de los embriones somáticos fue normal en apariencia, pero los embriones somáticos parcialmente deshidratados germinaron precozmente cuando se cultivaron en medio de maduración y el ácido absisico (ABA) no revierte la hiperhidricidad en embriones somáticos primarios. El ABA (500 mM) estimuló la reversión de este patrón anormal en el desarrollo de embriones secundarios ya que inhibe la germinación precoz y permite la maduración de embriones somáticos. Los embriones somáticos parcialmente deshidratados (4-7 mm) permanecieron viables por encima de 32 días en ausencia de medio de maduración bajo una alta humedad relativa. El incremento en las concentraciones del agente gelificante en el medio de cultivo, resulto en una alta frecuencia de reversión de la hiperhidricidad (Monsalud et al., 1995). Pliego-Alfaro et al. (1996) con la finalidad de lograr una maduración completa de embriones nucelares de mango mencionaron que el desarrollo en el estado cotiledonal de embriones nucelares de mango disminuyo in vitro por la exposición a 750 – 1750 mM de ABA,
ya que la elongación y
germinación de embriones
nucelares fue inhibida a lo largo de 4 semanas después de ser subcultivado en
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medio conteniendo ABA. Mientras que el Mannitol en concentraciones entre 7.5 y 12.5 % inhibió el desarrollo de embriones nucelares, al tener posiblemente un efecto osmótico. No se observo efecto residual después de subcultivar los embriones somáticos en medio sin mannitol. Temperaturas entre 22.5 y 37.5° C estimularon el desarrollo embriogénico, mientras que las temperaturas bajas (7.5 y 15° C) retardan la germinación. En el primer mes no hubo germinación. En complemento embriones somáticos se establecieron 8 semanas a 7.5° C y posteriormente a 22.5 °C y después de 2 meses, 86 % de estos embriones germinaron. Este resultado indico que es posible
frenar el desarrollo de embriones recalcitrantes con altas
concentraciones de ABA, mannitol o bajas temperaturas (Pliego-Alfaro et al., 1996). Pliego et al. (1996b) señalaron que la inhibición del crecimiento en embriones somáticos de mango fue inducida in vitro por más de cuatro semanas con ABA (0 – 100 mM)
con o sin alta osmolaridad provista por mannitol (0 – 10 %). La alta
osmolaridad y ABA afectaron significativamente la longitud de embriones somáticos, la germinación precoz y la producción de embriones somáticos secundarios. La alta osmolaridad afecto la elongación de raíz.
El ABA fue efectivo en controlar el
crecimiento y desarrollo en 0.5 cm de longitud de embriones somáticos, resultando embriones somáticos más pequeños. El desarrollo más allá del estado de corazón fue inhibido significativamente por ambos tratamientos ABA y mannitol. Se incremento la recuperación de embriones somáticos de calidad con altos niveles de ABA (100 mM) con y sin mannitol (0 – 5%). Embriones somáticos que estuvieron expuestos con ABA fueron parcialmente deshidratados a diferente humedad relativa. La humedad relativa ocasionó pesos bajos de los embriones somáticos y el ABA no proveo tolerancia a la disecación (Pliego et al., 1996b). Posteriormente con la finalidad de conocer los requerimientos temporales de 2,4 D y el desarrollo optimo del explante en la inducción de cultivos embriogénicos. Lad et al. (1997) establecieron cultivos embriogénico a partir de nucela, en medio B5 de
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sales mayores, MS sales menores y compuestos orgánicos, 400 mg/L de glutamina, 60 gr/L de sacarosa, 2gr/l de goma gelificante y 4.5 mM 2,4 – D. Se determino el requerimiento temporal de 2,4-D ( 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 y 63 días) para la iniciación de cultivos y para la inducción de competencia embriogénica de explantes nucelares. El cultivo de iniciación requirió un mínimo de 7 – 14 días en contacto con 2,4 – D y un máximo de 56 días; sin embargo, la expresión embriogénica fue optima después de un mínimo de 28 días expuesto al 2,4 – D. No existió una clara relación entre la edad de desarrollo del explante nucelar y la inducción de cultivos embriogénicos. La embriogénesis somática directa de explantes nucelares fue de baja frecuencia. La maduración de embriones somáticos solo ocurrió cuando se subcultivaron en medio semisólido después de estar en cultivo en suspensión, y fue estimulado por 2.4 – 4.8 µM cinetina y 4.4 µM BA (Lad et al., 1997). En estudios relacionados con la inducción embriogénica Litz y Yurgalevich (1997) evaluaron el efecto de anminoethoxilvinilglacina (AUG), 1- aminociclopropano; 1ácido carboxilico (ACC), sulfato dicycyclohexilomonium (DCHA) y methyglyoxal bis – (guanylhydrazone)(MGBG) sobre la inducción de la capacidad embriogénica de nucela de dos variedades de mango, Thutehua (Poliembriónico) y Tommy Atkins (Monoembriónico). La inducción de la capacidad embriogénica en los explantes nucelares de Tommy Atkins fue más sensible a AVG y DGCHA que Thutehua. MGBG no tuvo efecto en la inducción de capacidad embriogénica en ambos cultivares. La biosíntesis de etileno fue mayor en explantes de Tommy Atkins. ACC estimula la biosíntesis de etileno en cultivos no embriogénicos de los dos genotipos. En cultivos embriogénicos de Tommy Atkins la biosíntesis de etileno fue 7X mayor que el cultivo embriogénico de Thutehua y esto demuestra la gran susceptibilidad del Tommy Atkins a el etileno antagonista AVG y DCHA. La ausencia de embrionía nucelar in vivo en Tommy Atkins puede ser debido a su gran sensibilidad a la biosíntesis de etileno y síntesis de spermidina (Litz y Yurgalevich, 1997). Litz et al. (1998b) con la finalidad de aumentar la inducción de embriogénesis somática. Utilizaron tejido nucelar de frutos inmaduros de 4 variedades de mango
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(poliembriónicos Hindi y Nam Doc Mai y monoembriónicos Lippens y Tommy Atkins). Los explantes nucelares se cultivaron en medio B5 basal modificado, bajo las siguientes condiciones de inducción: 1) 4.52 mM 2,4 – D; 2) Sin reguladores de crecimiento (Control); 3) 4.52 mM 2,4 – D + cultivo embriogénico Parris; 4) Cultivo embriogénico Parris sin reguladores de crecimiento. Demostraron que la inducción embriogénica es mediada por 4 factores: Genotipo, explante, 2,4-D y la presencia de cultivos nodriza con alta embriogénesis. Hubo considerable diferencia en el genotipo utilizado. Hindi tiene gran potencial embriogénico seguido por Lippens, Tommy Atkins y Nam Doc Mai, respectivamente. En el medio control la inducción de cultivos embriogénicos de todos los genotipos ocurrió en baja frecuencia. El tratamiento más efectivo para inducir cultivo embriogénico fue: 2,4 D + cultivo embriogénico nodriza Parris para las variedades Hindi, Lippens, y Nom Doc Mai. Mientras que en Tommy Atkins , el tratamiento con solo 2,4 – D fue el más efectivo (Litz et al.,1998b). Thomas (1999) logro una alta frecuencia de embriogénesis somática a partir de explantes nucelares del mango monoembrionico Arka Anmol. El tamaño ideal de frutos estuvo entre los 2-3 cm de longitud con aproximadamente 30-40 días después de la polinización. Cultivar las mitades de los óvulos con la nucela intacta, tuvo mayor porcentaje de formación de callo en comparación con cultivar la nucela extraída. El mejor medio de inducción fue el RO seguido por el B5 y MS, sin embargo el medio B5 fue superior para la conversión y desarrollo de embriones. La maduración de embriones se obtuvo en presencia de 1 mg 1/L de ABA. Mientras que la germinación (desarrollo de raíz y tallo) se logra con TDZ en concentraciones de 0.01 a 0.1 mg/L. Finalmente resalto que estudios preliminares en otros cultivares monoembriónicos, mostraron que las diferentes respuestas embriogénicas dependen del genotipo utilizado (Thomas, 1999).
43
Laxi et al. (1999) desarrollaron un protocolo para la producción de embriones somáticos de mango de la variedad Amrapalli. Cuando en el medio de cultivo disminuyeron las concentraciones de nitrógeno particularmente sales de amonio y lo complementaron con altas concentraciones de BAP, se incremento la producción de embriones somáticos. La germinación de embriones somáticos y la posterior recuperación de plantas se logro en un medio con bajas concentraciones de sacarosa, ácido giberelico y BAP. Ara et al. (2000) describieron la embriogénesis somática de dos cultivares monoembriónicos de mango Amrapali y Chausa a partir de nucelas. De las cuatro auxinas evaluadas solo el 2,4-D estimulo la iniciación de masas proembriogénicas. El mejor medio para la producción, desarrollo y maduración de embriones somáticos fue el M4E modificado. De los embriones somáticos obtenidos se logro su establecimiento en macetas. 2.8. Usos de la Embriogénesis Somática en Mango. Mathews y Litz (1990) indicaron que embriones somáticos de mango representando varios estados de desarrollo, fueron sujetos a varias concentraciones de kanamicina en el medio de cultivo. Los niveles de kanamicina necesarios para inhibir el crecimiento estuvieron en relación con el tamaño y estado de desarrollo del embrión somático, el tiempo del tratamiento y el tipo de exposición. El crecimiento de los proembriones en suspensión líquida se detuvo a 12.5 mg(ml), mientras que la maduración de estadios posteriores de los embriones somáticos en medio sólido se inhibió a 200 mg (ml). Linz et al. (1991) mencionaron que la eficiente regeneración de plantas de mango vía embriogénesis somática a partir de suspensiones celulares, permite la utilización de células somáticas para el mejoramiento varietal en mango. Asentaron la factibilidad de la transformación genética en mango usando una cepa desactivada de Agrobacterium tumefaciens
como vector, al igual que la selección in vitro para
44
resistencia a antracnosis
y para identificar variantes somaclonales que son
producidas in vitro. Mathews et al. (1993) reportaron la obtención de embriones somáticos transformados de dos cultivares de mango Hindi y Keitt, que obtuvieron usando dos diferentes cepas modificadas de Agrobacterium tumefaciens. En Keitt (Monoembrionico) sé cocultivaron segmentos de embriones somáticos derivados de embriones cigóticos con
Agrobacterium
tumefaciens
cepa
c58cl
que
contenía
el
plasmido
pgGV3850:1103 con el gen de resistencia a kanamicina. Después de la prueba en medio de selección, los embriones somáticos en estado globular se transfirieron a medio de maduración donde se desarrollaron hasta plántula. Los embriones nucelares de Hindi (Poliembriónico) se cocultivaron con A. tumefaciens cepa A208 albergando pTiT37-SE::PMON9749 (9749ASE) con el gene marcador β-Glucoronidasa y Neomicina fosfatasa (NPT II). Los embriones transformados fueron capaces de crecer en medio de selección con kanamicina y se tiñeron de azul en presencia de X-gluc. Los proembriones se evaluaron en medio sólido con 400 mg/L de kanamicina y luego en medio líquido de selección con 100 mg/L de kanamicina. Este estricto procedimiento de selección permitió recuperar clones puros de embriones transformados de Hindi. Posteriormente pruebas de hibridación, confirmaron la integración de genes de NPTII y GUS en el genoma del mango (Mathews et al., 1993). Jaysankar y Litz (1998) desarrollaron la selección de cultivos embriogénicos de dos cultivares poliembriónicos de mango Hindi y Carabao, resistentes a la fitotoxina de Colletrotichum gloeosporoides Penz agente causal de la antracnosis. Los cultivos fueron
recurrentemente
seleccionados
con
el
progresivo
incremento
de
concentraciones del cultivo filtrado ó por continuas pruebas de concentración de fitotoxinas en el medio de cultivo.
45
El crecimiento del micelio fue inhibido cuando el patógeno estuvo cocultivado con los cultivos embriogénicos resistentes previamente seleccionados. Medio de cultivo conteniendo embriones resistentes macerados no inhibió el crecimiento del micelio, confirmando respuesta
la composición extracelular antifungal
en la cual esta envuelta la
de resistencia. En el medio de cultivo donde
cultivos embriogénicos
resistentes y embriones somáticos regenerados estuvieron creciendo, se observo un incremento en la secreción de kitinasa y glutanasa (Jaysankar y Litz, 1998). Jayasankar et al. (1998) al analizar el DNA genómico de cultivos embriogénicos de los dos cultivares de mango Hindi y Carabao, seleccionados por su resistencia a un cultivo filtrado de Colletotrichum gloeosporoides Penz. La selección in vitro causo cambios en los marcadores RAPD de los cultivos embriogénicos seleccionados con respecto al del control inalterado y el resto de las plantas de reserva. Las diferencias involucraron la ausencia y la presencia de marcadores RAPD adicionales en las líneas resistentes, aunque la ausencia fue lo mas observado. La falta de diferencias entre el control inalterado de ambos cultivares y el DNA de las hojas de árboles, confirmaron que esos cambios no son debidos al mantenimiento prolongado en cultivos en suspensión (Jayasankar et al., 1998). Posteriormente Jayasankar et al. (1999) Describieron que la fitotoxina producida in vitro de Colletotrichum gloeosporoides Pent., fue toxica para cultivos embriogénicos en suspensión de dos variedades de mango, Hindi y Carabao e inhibe la germinación in vitro. Por lo tanto el cultivo del hongo purificado o la fitotoxina pueden ser usados como agentes de selección in vitro para probar la resistencia a este patógeno. Aunque la transformación genética del mango
con marcadores genéticos
seleccionables y medibles no es un factor limitante (Mathews y Litz, 1992). Se tienen actualmente pocos genes aislados de mango. Los códigos genéticos de importancia hortícola como: tamaño de árbol, producción, resistencia a plagas y enfermedades, larga vida de anaquel y calidad de fruta no están disponibles (Gardner, 1993; Litz, 1997).
46
Ara et al. (1999) encapsularon embriones individuales en estado dicotiledonal (de 3 a 5 mm) originados de explantes nucelares de la variedad Amarapali en 2% de gel alginate. Lograron la germinación de embriones somáticos en medio de cultivo conteniendo 0.6% de Agar, Sales mayores de B5 al 50%, micronutrientes de MS, 3% de sacarosa y 2.9 mM de ácido giberélico. El porcentaje de germinación fue mayor en embriones encapsulados en comparación con embriones similares pero sin encapsular. Finalmente también lograron el establecimiento en macetas de plantas bien desarrolladas. Wu et al. (2003) compararon tres técnicas para la criopreservación de masas embriogénicas de mango de la variedad Zinhua. 1. Encapsulacion/rehidratación, 2. disminución del crecimiento/rehidratación y 3. Vitrificación. Con la (1) No fue posible la recuperación del tejido después de la criopreservación.
En (2) solo se logro
recuperar el 8.3 % de masas embriogénicas y en el (3) se logro recuperar un 94.3 % de los tejidos después del tratamiento con la solución de vitrificación.
47
III. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Materiales. 3.1.1. Material biológico. Se utilizaron frutos inmaduros de mango (Mangifera indica L.) de 40 días después de la antesis aproximadamente (Figura 1), de las variedades de mango monoembrionicos Haden, Tommy Atkins y de la variedad poliembrionica Ataulfo. Las cuales fueron colectadas en huertas ubicadas en las localidades de Cerro de Ortega municipio de Tecomán y en Coquimatlán, Colima, México.
ATAULFO
T. ATKINS
HADEN
Figura 1. Frutos inmaduros de tres variedades de mango 40 días después de la Antesis.
3.1.2. Lugar experimental. La presente investigación se realizó entre los aňos 1998 y 2002, en el laboratorio de cultivo de tejidos vegetales del INIFAP, “Campo Experimental Tecomán” localizado
48
en el Km. 34 de la carretera Colima-Manzanillo y en el Laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Colima, localizado en el crucero de Tecomán, Colima. 3.1.3. Medios de cultivo. Los medios de cultivo utilizados fueron basados en las sales menores y compuestos orgánicos del medio MS (Murashige y Skoog, 1962) (Cuadro 1), y las sales mayores del medio B5 (Gamborg et al.,1968) (Cuadro 2).
Cuadro 1. Sales menores y compuestos orgánicos del medio de cultivo de Murashige y Skoog (1962). Compuesto
Concentraciones (mg/L)
KI H3BO3 MnSO4 4H2O ZnSO4 7H2O NaMoO4 2 H2O CuSO4 5 H2O CoCl2 6 H2O Na2 EDTA FeSO4 7 H2O
0.83 6.2 17 8.6 0.25 0.025 0.025 37.3 27.8
Compuestos orgánicos Inositol Ac. nicotínico Piridoxina Tiamina Glicina
100 0.50 0.50 0.10 2.0
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Cuadro 2. Sales mayores del medio de cultivo de Gamborg et al. (1968) (B5). Compuesto
Concentración (mg/L)
NaH2PO4 2H2O
150
KNO3
2500
(NH4)2SO4
134
MgSO4 7H20
250
CaCl 2 H2O
150
Los medios de cultivo se ajustaron a pH 5.7 con KOH 0.2 N y HCl 0.1N con ayuda de un potenciómetro (Orion modelo 420 A). Posteriormente se esterilizaron en un autoclave vertical (MeaAESA) a 1.2 kg f /cm2 y 121º C durante 15 minutos. 3.2. Métodos. 3.2.1. Determinación del estado de Desarrollo. Para determinar el estado de desarrollo de las semillas de mango, se toma como base, la relación entre el tamaño del fruto y el óvulo como se describe a continuación. Los frutos se desinfectaron superficialmente por inmersión durante 30 minutos en una solución de hipoclorito de sodio (Cloralex) al 20 %, con tres gotas de detergente Tween 20. Posteriormente se enjuagaron dos veces con agua esterilizada bajo ambiente aséptico en campana de flujo laminar (VECO). Después del tratamiento de desinfección los frutos se bisectaron a lo largo de su eje longitudinal para extraer el óvulo el cual también se corto a lo largo de su eje longitudinal, para eliminar la masa embriogénica (Figura 2).
50
Masa embriogénica
Nucela
Ovulo
Figura 2. Extracción de nucela de óvulo inmaduro de mango.
3.2.2. Tamaño de fruto y óvulo. Al momento de abrir el óvulo se determinaron tres estados de desarrollo de la nucela (1/3, 1/2, 2/3) con base a la relación longitud del embrión/longitud del óvulo (Figura 3). Se midió tanto la longitud del fruto como la longitud del óvulo. El diseño experimental fue un factorial con arreglo de tratamientos completamente al azar, con 9 tratamientos (3 variedades y 3 estados de desarrollo) considerando 5 frutos como unidad experimental con 7 repeticiones por tratamiento.
1/3
1/2
2/3
Figura 3. Estado de desarrollo de la nucela en base a las relaciones embrión/óvulo (1/3, 1/2 y 2/3) evaluadas. 51
3.2.3. Inducción de embriogénesis somática. Con la finalidad de evaluar el efecto del variedad de mango y los tres diferentes estados de desarrollo de la nucela sobre la inducción de embriogénesis somática, al óvulo bisectado, se le extrajo la nucela completa con la ayuda de una espátula, cuidando no llevar tejido de la pared del óvulo para evitar mayor grado de oxidación (Figura 4). Cada nucela se sembró dentro de un frasco de 6 cm de diámetro y 7 cm de altura, conteniendo 20 mL de medio de inducción descrito por deWald (1989a) el cual consiste de sales mayores de B5, sales menores y complementos orgánicos de MS complementado con 400 mg/L de glutamina (Sigma), 4.5 mM de 2,4 – D (Sigma), 60 g/L de sacarosa (Sigma) y 8 g/L de Agar-agar (Merck). Los frascos con los explantes se incubaron a 25° C en condiciones de oscuridad. Durante los primeros 7 días los explantes se subcultivaron a medio fresco cada 24 horas y posteriormente cada 7 días. El diseño experimental fue un factorial con arreglo de tratamientos completamente al azar con 9 tratamientos (3 variedades y 3 estados de desarrollo) y 7 repeticiones, considerando 5 nucelas como unidad experimental. Después de 9 semanas se registró el número de nucelas que formaron embriones como lo describieron (Litz et al., 1998b).
Figura 4. Nucela de mango al momento de ser cultivada en medio de inducción.
52
3.2.4. Proliferación de tejido embriogénico. Para evaluar la respuesta en la proliferación de masas embriogénicas de las tres variedades de mango en medio líquido y sólido, se utilizó como explante inicial tejido embriogénico (Figura 5).
Figura 5. Tejido embriogénico ( masas proembriogénicas ) de la variedad Ataulfo desarrollas a partir de nucelas después de nueve semanas en medio de inducción. El establecimiento de cultivos en suspensión y en medio sólido se realizó de acuerdo al procedimiento descrito por DeWald et al. (1989a), posteriormente modificado por Litz (1997). Se explantaron 100 mg de tejido embriogénico en matraces Erlenmeyer de 125 mL conteniendo 25 mL de medio líquido ó en cajas petri conteniendo 20 mL del medio sólido utilizado en el experimento de inducción. Se utilizo como unidad experimental 1 matraz o caja petri con cinco repeticiones de cada tratamiento. Después de sellar con papel de aluminio los matraces se mantuvieron en agitación con un agitador (Lab–Line) a 100 rpm Los matraces ó cajas petri se mantuvieron a 25º C en oscuridad y se transfirieron a medio fresco cada 7 días. Después de 4 semanas se registro el incremento en peso de masas proembriogénicas y el número de embriones en estado temprano.
53
El diseño experimental fue un factorial con arreglo de tratamientos completamente al azar con 6 tratamientos (3 variedades y 2 estados físicos del medio de cultivo) y 5 repeticiones,
considerando
100
mg
de
tejido
embriogénico
como
unidad
experimental. 3.2.5. Recuperación de embriones somáticos. Para evaluar la respuesta en la recuperación de embriones somáticos en medio de cultivo líquido y sólido, se utilizaron como explante inicial 100 mg de cultivos embriogénicos friables consistentes de masas proembriogénicas provenientes de la fase de proliferación. Se inocularon 100 mg de masas proembriogénicas dentro de matraces Erlenmeyer de 125 mL o en cajas petri. Cada matraz contenía 25 mL de medio líquido de maduración mientras que cada caja petri contenía 20 mL de medio sólido de maduración que consistía de sales mayores de B5 excepto sulfato de amonio, sales menores y compuestos orgánicos de MS complementado con 400 mg/L de glutamina, 4.44 mM de 6-benzilaminopurina (BA) (Sigma), 60 g/L de sacarosa. Los matraces se sellaron con papel de aluminio y se mantuvieron a 100 rpm en un agitador rotatorio las cajas se sellaron con película plástica. Todos los tratamientos se mantuvieron a 25º C en oscuridad, posteriormente se transfirieron a medio fresco cada 7 días. Después de 30 días se cuantificó el número de embriones en estado temprano (3-5 mm), número de embriones hiperhídricos y el incremento en peso del explante. El diseño experimental fue un factorial con arreglo de tratamientos completamente al azar con 6 tratamientos (3 variedades y 2 estados físicos del medio de cultivo) y 5 repeticiones, considerando 100 mg de tejido embriogénico como unidad experimental 3.2.6. Maduración de embriones somáticos. Para evaluar el efecto del agua de coco y el carbón activado en la maduración de embriones somáticos de tres variedades de mango se utilizaron embriones
54
somáticos en estado temprano (3-5 mm) provenientes de cultivos embriogénicos de la fase de recuperación (Figura 6).
Figura 6. Embriones somáticos de la variedad Tommy Atkins en estado temprano (35 mm) subcultivados en medio de maduración. Se evaluaron cinco diferentes formulaciones basadas en medio de cultivo de maduración el cual consistió de sales mayores de B5 excepto sulfato de amonio, sales menores y compuestos orgánicos de MS complementado con 400 mg/L de glutamina, 40 g/L de sacarosa y 6 g/L Gel gro. Las formulaciones utilizadas fueron las siguientes: a) Medio de maduración complementado con 20% de agua de coco esterilizada por filtración y 30 mg de carbón activado. b) Medio de maduración complementado con 20% de agua de coco esterilizada por autoclave y 30 mg de carbón activado. c) Medio de maduración complementado con 30 mg de carbón activado. d) Medio de maduración complementado con 20% de agua de coco esterilizada por filtración. e) Únicamente medio de maduración (testigo).
55
El agua de coco se esterilizó por filtración en un sistema Millipore con membrana de nitrocelulosa de 0.45 um y se agregó al medio de cultivo, cuando éste se enfrió una temperatura de 45 0 C, en una campana de flujo laminar bajo condiciones asépticas. Los embriones somáticos se explantaron en 20 mL de medio sólido de las distintas formulaciones en cajas petri. Las cajas petri se incubaron en oscuridad a 25º C. Después de 30 días se cuantifico el número de embriones somáticos sobrevivientes, número de embriones somáticos con germinación precoz, la longitud de embriones somáticos y número de embriones somáticos con embriogénesis secundaria. El diseño experimental fue un factorial con arreglo de tratamientos completamente al azar con 15 tratamientos (3 variedades y 5 formulaciones del medio de cultivo) y 3 repeticiones, considerando 10 embriones como unidad experimental. 3.2.7. Germinación de embriones somáticos. Con la finalidad de evaluar la germinación de embriones somáticos de los tres variedades. Se utilizaron como explantes, embriones somáticos en estado dicotiledonal de10 a 20 mm de longitud, provenientes de la fase de maduración. Los embriones se explantaron individualmente en tubos de ensayo de 30 X 150 mm. Conteniendo 25 mL de medio de cultivo de germinación el cual consistió de sales mayores de B5 excepto sulfato de amonio, sales menores y compuestos orgánicos de MS complementado con 400 mg/L de glutamina, 20% de agua de coco esterilizada por filtración, 50 mg de carbón activado, 10 g/L de sacarosa y 6 g/L de Gel gro. Los embriones se incubaron a 25º C con un fotoperíodo de 16 horas (76 Mmol·s1·m2) (Figura 7). Después de 4 semanas se cuantificó el número de embriones sobrevivientes, número de embriones que presentaron emergencia de brotes y número de embriones que presentaron emergencia de raíces. El diseño experimental fue completamente al azar con 3 tratamientos (3 variedades) y 4 repeticiones, considerando 5 embriones como unidad experimental.
56
Figura 7. Embriones somáticos en estado dicotiledonal (10 a 20 mm de longitud) en medio de germinación. 3.2.8. Análisis estadísticos. Los datos de las variables expresadas en porcentaje fueron sometidas a transformación angular de asen√ % previó al análisis estadístico. Todos los datos obtenidos se sometieron a un análisis de varianza (ANDEVA) y prueba de Tukey al 0.05 de probabilidad, utilizando el paquete estadístico Statistix ( Statistix, 1996).
57
IV. RESULTADOS 4.1. Estado de Desarrollo de la Semilla. De acuerdo al ANDEVA (Cuadro 3), el tamaño del óvulo y del fruto de mango fue diferente entre las variedades y la relación embrión/óvulo de la semilla, no así para la interacción de ambos factores. Cuadro 3. Análisis de varianza del efecto de tres variedades y la relación del embrión/óvulo sobre el tamaño del óvulo y del fruto. Valores de F calculada Fuente de variación
GL
Tamaño de óvulo
Tamaño de fruto
Tratamientos
6
0.8532 NS
1.8935 NS
Variedad (G)
2
13.481 8***
5.5414 **
Embrión/óvulo (R)
2
48.9591 ***
41.7353 ***
G*R
4
0.4062 NS
0.56 NS
Error
48
Total
62 0.016
0.065
8.05
6.69
CME CV (%) ** P=0.01 ***P=0.001
Los valores del tamaño de fruto entre las tres variedades oscilaron de 2.7 a 3.9 cm (Cuadro 4). El valor más alto se observó en el mango Ataulfo y el más bajo en Tommy Atkins. Respecto a las tres relaciones embrión/óvulo, se observó que el tamaño del fruto fluctuó de 3.4 a 4.1 cm de longitud. El valor más alto (4.1 cm) se observó en la
58
relación embrión/óvulo de 2/3 y el valor más bajo (3.4 cm), ocurrió en frutos cuya relación embrión/óvulo fue de 1/3 (Cuadro 4). Cuadro 4. Comportamiento de la longitud de fruto de tres variedades de mango con semillas de tres relaciones en tamaño del embrión/óvulo.
Longitud de Fruto (cm) Variedad Relación tamaño del embrión/óvulo
Ataulfo
Haden
Tommy Atkins
Promedio
1/3
3.5 a
3.58 a
3.2 a
3.43 c
1/2
3.95 a
3.87 a
3.84 a
3.89 b
2/3
4.27a
4.18 a
3.96 a
4.14 a
Promedio 3.91 a 3.88 a 3.67 b Promedios con letra distinta dentro de la columna del cuadro son diferentes estadísticamente (Tukey P = 0.05, n = 7). El comportamiento del tamaño del óvulo entre las tres variedades varió de 1.45 a 1.65 cm (Cuadro 5), observándose los valores más altos en el cultivar Ataulfo y Haden, y el valor más bajo en Tommy Atkins. En relación a las tres relaciones embrión/óvulo, se observó que el tamaño del óvulo fluctuó de 1.39 a 1.77 cm de longitud. El valor más alto (1.77 cm) se observó en la relación embrión/óvulo de 2/3 y el valor más bajo (1.39 cm), ocurrió en frutos cuya relación embrión/óvulo fue de 1/3 (Cuadro 5).
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Cuadro 5. Comportamiento de la longitud del óvulo de la semilla de tres variedades de mango con semillas de tres relaciones en tamaño del embrión/óvulo. Longitud de óvulo (cm) Variedad Relación tamaño del embrión/óvulo
Ataulfo
Haden
Tommy Atkins
Promedio
1/3
1.47 a
1.43 a
1.28 a
1.39 c
1/2
1.59 a
1.57 a
1.45 a
1.54 b
2/3
1.89a
1.81 a
1.63 a
1.77 a
Promedio 1.65 a 1.60 a 1.45 b Promedios con letra distinta dentro de la columna del cuadro son diferentes estadísticamente (Tukey P = 0.05, n = 7). 4.2. Inducción de Cultivos Embriogénicos. A partir de las 4 primeras semanas del cultivo de las nucelas, las variedades monoembriónicas Haden y Tommy Atkins presentaron la formación de callo blanco (Figura 8), que después de unos días se torno café oscuro, y a partir del cual se desarrollaron embriones somáticos en las 4 a 5 semanas posteriores (Figura 9). En cambio, en la variedad poliembriónica Ataulfo, se desarrollaron embriones directamente del tejido subcultivado sin la formación de callo y comenzó a manifestarse a partir de la sexta semana del cultivo (Figura 10).
60
Callo nucelar Embrión somático
Figura 8. Desarrollo de embriones somáticos a partir de callo nucelar, característico de las variedades monoembriónicos Haden y Tommy Atkins
Masas proembriogénicas
Explante nucelar
Figura 9. Desarrollo de masas proembriogénicas a partir de tejido nucelar después de 9 semanas en medio de inducción
61
Embrión en estado globular Nucela
Figura 10. Embriogénesis directa a partir del tejido nucelar, característico de la variedad poliembriónica Ataulfo. Como se observa en el Cuadro 6 el ANDEVA muestra diferencias estadísticas significativas en la respuesta embriogénica de las nucelas de mango de acuerdo a los factores variedad y a la relación embrión/óvulo, no así para la interacción de ambos factores.
62
Cuadro 6. Análisis de varianza del efecto de la variedad y la relación embrión/óvulo sobre la respuesta embriogénica en medio de cultivo de inducción Valores de F calculada Fuente de variación
GL
Respuesta embriogénica
Tratamientos
6
0.6832 NS
Variedad (G)
2
9.4636 **
Embrión/óvulo (R)
2
11.1475 ***
G*R
4
3.6724 NS
E. experimental
48
Total
62
CME
2.22147
CV (%) ** P=0.01 ***P=0.001
56.25
En el Cuadro 7 se observa que la variedad Tommy Atkins registró el mayor potencial embriogénico aunque resultó estadísticamente semejante a Ataulfo, en contraste Haden tuvo el menor potencial embriogénico y fue estadísticamente diferente a Tommy Atkins y Ataulfo. En lo que respecta a la respuesta embriogénica de los distintos estados de desarrollo de la semilla, determinados con la relación embrión /óvulo. La relación 1/3 resultó con el mayor potencial embriogénico y tuvo diferencias estadísticas
significativas
con
las
relaciones
1/2
y
1/3
quienes
fueron
estadísticamente iguales. En el mismo Cuadro 7 se observa que dentro de la variedad Ataulfo la relación 1/3 resultó con el mayor potencial embriogénico y no tuvo diferencias estadísticas significativas con la relación 1/2, sin embargo ambas presentaron diferencias significativas con la relación 2/3. Dentro de la variedad Haden no existieron diferencias estadísticas significativas entre las distintas relaciones en su respuesta
63
embriogénica. Finalmente dentro de la variedad Tommy Atkins la mayor respuesta embriogénica se dió en la relación 1/3 y tuvo diferencias estadísticas significativas con las relaciones 1/2 y 2/3. Cuadro 7. Potencial embriogénico de tejido nucelar de tres estados de relación en tamaño del embrión/óvulo de tres variedades de mango después de nueve semanas en medio de cultivo de inducción.
Potencial Embriogénico (%) Variedad Relación del tamaño embrión/óvulo
Ataulfo
Haden
Tommy Atkins
Promedio
1/3
22.86 a
5.71 a
25.71 a
18.1 a
1/2
11.43 ab
2.86 a
2.86 b
5.71 b
2/3
2.86 b
0.0 a
14.29 b
5.71 b
Promedio 12.38 a 2.86b 14.28 a Promedios con letra distinta dentro de la columna del cuadro son diferentes estadísticamente (Tukey P = 0.05, n = 7)
4.3. Proliferación de Cultivos Embriogénicos. 4.3.1. Incremento en peso. El análisis estadístico encontró diferencias estadísticas significativas en el incremento en peso de tejido embriogénico de mango para los factores variedad, estado físico del medio de cultivo y para la interacción de ambos factores (Cuadro 8).
64
Cuadro 8. Análisis de varianza del efecto de la variedad y el estado físico del medio de
cultivo sobre el incremento en peso y el número de embriones
desarrollados en medio de mantenimiento. Valores de F calculada Fuente de variación
GL
Incremento en peso
Número de embriones
Tratamientos
4
0.190 NS
0.514 NS
Variedad (G)
2
0.000 ***
0.026 NS
Estado Físico del medios
1
0.000 ***
0.000 ***
GxR
2
0.000 ***
0.026 NS
E. experimental
20
Total
29 0.125558
1.365255
24.15
56.41
CME CV (%) ** P=0.01 ***P=0.001
Las masas proembriogénicas comenzaron a aparecer en las variedades Ataulfo y Tommy Atkins después de dos a tres semanas en el medio de inducción (Figuras 11, 13 y 14). La variedad Haden nunca presentó crecimiento de masas proembriogénicas, el desarrollo de embriones de esta variedad fue a través de embriogénesis secundaria (Figura 12). Debido a esta situación los explantes utilizados en la variedad Haden consistieron de embriones somáticos con embriogénesis secundaria.
65
Figura 11. Embriogénesis secundaria en la variedad Haden.
Figura 12. Masas proembriogénicas en medio sólido de mantenimiento.
66
Figura 13. Masas proembriogénicas en medio líquido de mantenimiento.
Figura 14. Embriones en estado de corazón creciendo a partir de masas proembriogénicas, después de treinta días en medio de recuperación.
67
La variedad Ataulfo tuvo el mayor incremento en peso de tejido embriogénico y fue estadísticamente diferente a las variedades Haden y Tommy Atkins. El estado líquido del medio de cultivo de mantenimiento presentó el mayor incremento en peso de tejido embriogénico y tuvo diferencias estadísticas significativas con el medio de cultivo en estado sólido. La variedad Ataulfo presentó el mayor incrementó en peso de tejido embriogénico en medio de cultivo líquido y fue estadísticamente diferente al medio de cultivo en estado sólido. En la variedad Haden no existieron diferencias estadísticas significativas entre los dos estados físicos del medio de cultivo de mantenimiento. Tommy Atkins resultó con un mayor incremento en peso de tejido embriogénico en medio de cultivo líquido el cual fue estadísticamente diferente al medio de cultivo en estado sólido (Cuadro 9). Cuadro 9. Efecto variedad-estado físico del medio de cultivo sobre el incremento en peso de 100 mg de tejido embriogénico de mango después de cuatros semanas en medio de cultivo de mantenimiento.
Incremento en Peso (mg) Variedad Estado físico del medio de cultivo
Ataulfo
Haden
Tommy Atkins
Promedio
Sólido
1622 a
1026 a
835 a
1161 b
Líquido
3110 b
696 a
1513 b
1773 a
Promedio
2366 a
861b
1174 b
Promedios con letra distinta dentro de la columna del cuadro son diferentes estadísticamente. Tukey .05 4.3.2. Número de embriones en estado temprano. El Cuadro 8 muestra las diferencias estadísticas significativas encontradas por el ANDEVA en el número de embriones desarrollados a partir de tejido embriogénico
68
de mango, en el factor estado físico del medio de cultivo no así para el factor variedad y la interacción de ambos factores. La variedad Haden tuvo el mayor número de embriones en medio de mantenimiento y fue estadísticamente similar a la variedad Tommy Atkins, sin embargo respecto a la variedad
Ataulfo
tuvo
significativamente
el
menor
número
de
embriones
desarrollados. El medio de cultivo en estado sólido resultó con el mayor número de embriones desarrollados y tuvo diferencias estadísticas significativas con el medio de cultivo líquido, el cual no presentó desarrollo de embriones somáticos en ninguna de las variedades estudiadas. En la
variedad Ataulfo no existieron diferencias
estadísticas entre los dos estados físicos del medio de cultivo de mantenimiento en el desarrollo de embriones somáticos. Haden y Tommy Atkins mostraron un comportamiento similar al desarrollar el mayor número de embriones en medio de cultivo en estado sólido teniendo diferencias estadísticas significativas con el medio de cultivo de mantenimiento en estado líquido (Cuadro 10). Cuadro 10. Número de embriones somáticos desarrollados a partir de 100 mg de tejido embriogénico en dos estados físicos del medio de cultivo de mantenimiento en tres variedades de mango después de cuatros semanas en medio de cultivo de mantenimiento.
Número de embriones en estado temprano Variedad Estado físico del medio de cultivo
Ataulfo
Haden
Tommy Atkins
Promedio
Sólido
2.37 a
26.36 a
9.1 a
12.611 a
Líquido
0.0 a
0.0 b
0.0 b
0.0 b
Promedio 1.18 b 13.18 a 4.55 ab Promedios con letra distinta dentro de la columna del cuadro son diferentes estadísticamente. Tukey .05
69
4.4. Recuperación de Embriones Somáticos. El crecimiento y desarrollo de los embriones somáticos comenzó a darse a partir de la cuarta semana, los embriones en estado de corazón se describen como estructura blancas y brillantes, el crecimiento de estos embriones se dio solamente sobre masas embriogénicas necróticas que estaban en contacto con el medio de cultivo (Figura 15).
Figura 15. Embriones somáticos hiperhídricos desarrollados en medio de cultivo de recuperación líquido después de 30 días.
4.4.1. Incremento en peso. En el Cuadro 11 se observa la variable de incremento en peso de masas proembriogénicas de mango en medio de recuperación, en la cual el ANDEVA no encontró diferencias estadísticas significativas, en los factores de variedad y estado físico del medio de cultivo, ni en la interacción de ambos factores.
70
Cuadro 11. Análisis de varianza del efecto de la variedad y el estado físico del medio de
cultivo sobre el incremento en peso y el número de embriones
desarrollados en medio de recuperación. Valores de F calculada Fuente de variación
GL
Incremento en peso
Número de embriones
Embriones Hiperhidricos
Tratamientos
4
0.1056 NS
0.299 NS
0.184 NS
Variedad (V)
1
2.0867 NS
0.000***
0.000 ***
Estado Físico del medios
1
1.2447 NS
0.266 NS
0.000 ***
V*R
1
0.0064 NS
0.142 NS
0.000 ***
E. experimental
12
Total
19
CME
1.739279
1883.932
191.766
CV (%)
46.09
34.09
20.01
**P=0.01 ***P=0.001
El mayor incremento en peso lo registró, la variedad Tommy Atkins y fue estadísticamente igual a la variedad Ataulfo. El medio de cultivo líquido de recuperación resultó con el mayo incremento en peso y no tuvo diferencias estadísticas con el medio de cultivo en estado sólido (Cuadro 12).
71
Cuadro 12. Incremento en peso de 100 mg de masas proembriogénicas en dos estados físicos del medio de cultivo en dos variedades de mango después de 30 días en medio de cultivo de recuperación.
Incremento en Peso (mg) Variedad Estado físico del medio de cultivo
Ataulfo
Tommy Atkins
Promedio
Sólido
2130 a
2935 a
2532 a
Líquido
2741 a
3640 a
3190 a
Promedio
2435 a
3287 a
Promedios con letra distinta dentro de la columna del cuadro son diferentes estadísticamente. Tukey .05
4.4.2. Embriones somáticos desarrollados. El ANDEVA encontró diferencias estadísticas significativas en el número de embriones desarrollados en medio de recuperación en el factor variedad. Sin embargo en el factor estado físico del medio de cultivo y en la interacción de ambos factores no existieron diferencias estadísticas (Cuadro 11). La variedad Tommy Atkins presentó el mayor número de embriones desarrollados en medio de cultivo de recuperación y fue estadísticamente diferente a la variedad Ataulfo. El medio de cultivo sólido tuvo el mayor número de embriones desarrollados y fue estadísticamente igual al medio de cultivo líquido. Dentro de la variedad Tommy Atkins se mantuvo este comportamiento, mientras que en la variedad Ataulfo el medio de cultivo sólido tuvo un mayor número de embriones somáticos desarrollados
72
pero sin llegar a tener deferencias estadísticas con el medio de cultivo líquido (Cuadro13). Cuadro 13. Efecto variedad-estado de desarrollo sobre el número embriones en estado temprano (3-5 mm) desarrollados a partir de 100 mg de masas proembriogénicas de mango después de 30 días en medio de cultivo de recuperación.
Número de embriones desarrollados Variedad Estado físico del medio de cultivo
Ataulfo
Tommy Atkins
Promedio
Sólido
24.46 a
252.76 a
138.61 a
Líquido
32.12 a
199.89 a
116.0 a
Promedio
28.29 b
226.32 a
Promedios con letra distinta dentro de la columna del cuadro son diferentes estadísticamente. Tukey .05 4.4.3. Embriones somáticos hiperhídricos. Se desarrollaron embriones somáticos hiperhídricos en medio de cultivo de recuperación sólido y líquido. Los embriones somáticos hipehídricos se describen como estructuras blandas y cristalinas (Figura 16). En el Cuadro 11 se observan las diferencias estadísticas significativas en el número de embriones hiperhídricos desarrollados en medio de recuperación para los factores variedad y estado físico del medio de cultivo así como para la interacción de ambos factores. La variedad Tommy Atkins mostró el mayor número de embriones hiperhídricos desarrollados y fue estadísticamente diferente a la variedad Ataulfo. El medio de cultivo líquido resultó con el mayor número de embriones hiperhídricos desarrollados
73
y tuvo diferencias estadísticas significativas con el medio de cultivo en estado sólido. La variedad Ataulfo mostró un mayor número de embriones hiperhídricos desarrollados en medio de cultivo líquido, el cual tuvo diferencias estadísticas con el medio de cultivo sólido. En la variedad Tommy Atkins se observo el mismo comportamiento con un mayor número de embriones hiperhídricos producidos en medio de cultivo líquido siendo estadísticamente diferente al medio de cultivo sólido(Cuadro 14).
Cuadro 14. Número de embriones somáticos hiperhídricos en estado temprano (35 mm ) desarrollados en 100 mg de masas proembriogénicas en dos estados físicos del medio de cultivo en dos variedades de mango después de 30 días en medio de cultivo de recuperación.
Número de embriones hiperhídricos Variedad Estado físico del medio de cultivo
Ataulfo
Tommy Atkins
Promedio
Sólido
3.43 b
41.4 b
22.41 a
Líquido
32.12 a
199.89 a
116.0 a
Promedio
17.77 b
120.64 a
Promedios con letra distinta dentro de la columna del cuadro son diferentes estadísticamente. Tukey .05
74
4.5. Maduración de Embriones Somáticos. Los embriones que no sobrevivieron se necrosaron completamente en las primeras tres semanas de cultivo en medio de maduración. El incremento en longitud se dio principalmente de la base a la punta del embrión somático, casi no incrementaron su tamaño a lo ancho del embrión. La germinación precoz comenzó a partir de la tercera semana en medio de maduración, con el desarrollo de raíces en la base de los embriones somáticos, que estaba en contacto con el medio de cultivo (Figura 17). La embriogénesis secundaria se desarrollo a partir de la segunda semana, con el crecimiento de estructuras embriogénicas (embriones en estado globular) en los cotiledones de los embriones somáticos (Figura 18). Se desarrollo una alto número embriones somáticos aberrantes en las diferentes formulaciones del medio de maduración (Figura 19)
.
Desarrollo de raíz Embrión somático
Figura 16. Embrión somático de la variedad Tommy Atkins con germinación precoz después de 3 semanas en medio de maduración
75
Figura 17. Embrión somático de la variedad Ataulfo con embriogénesis secundaria después de 2 semanas en medio de maduración.
Figura 18. Embriones somáticos aberrantes de las variedades Ataulfo y Tommy Atkins después de 4 semanas en medio de maduración.
76
Cuadro 15. Análisis de varianza del efecto de la variedad y la formulación del medio de cultivo sobre la sobrevivencia, incremento en longitud, germinación precoz y embriogénesis secundaria de embriones somáticos en medio de maduración. Valores de F calculada Fuente de variación
GL
Sobrevivencia
Incremento en Germinación longitud precoz
Embriogénesis secundaria
Tratamientos
2
0.145 NS
0.2784 NS
0.1784 NS
0.9472 NS
Variedad (V)
2
0.1182 NS
2.4086 NS
16.3169**
0.1836 NS
Formulación del medio de cultivo (M)
4
0.1868 NS
0.6498 NS
6.4715**
1.235 NS
V*M
8
0.3572 NS
0.3775 NS
3.7888**
1.123 NS
E. experimental
28
Total
44
CME
0.037174
1.933027
0.21758
0.030367
CV (%)
22.39
101.55
46.03
101.58
** P=0.01 ***P=0.001 4.5.1. Sobrevivencia de embriones somáticos. El Cuadro 15 muestra los resultados obtenidos en el ANDEVA en la sobrevivencia de embriones somáticos en medio de maduración donde no existieron diferencias estadísticas significativas para los factores variedad y formulaciones del medio del medio cultivo así como para la interacción de ambos factores. La variedad con la sobrevivencia más alta fue Tommy Atkins sin embargo no tuvo diferencias estadísticas significativas con Ataulfo y Haden. Las formulaciones (3) y
77
(5) obtuvieron la mayor sobrevivencia pero fueron estadísticamente iguales a las formulaciones (1), (2) y (4). Ataulfo resultó con la mayor sobrevivencia en la formulación (5) sin tener diferencias estadísticas con las otras cuatro formulaciones. Haden obtuvo el efecto más positivo en la formulación (3) la cual resulto estadísticamente igual a las otras cuatro formulaciones. En Tommy Atrkins la formulaciones (1) y (3) resultaron con la mayor sobrevivencia pero sin diferencias estadísticas significativas con las restantes formulaciones (Cuadro 16). 4.5.2. Germinación precoz de embriones somáticos. Las diferencias estadísticas significativas encontradas en el ANDEVA en el número de embriones somáticos con germinación precoz para los factores variedad y formulaciones del medio de cultivo, al igual que para la interacción de ambos factores (Cuadro 15). La variedad Haden resultó con el mayor número de embriones germinando precozmente y fue estadísticamente diferente a las variedades Ataulfo y Tommy Atkins.La formulación (2) obtuvo el mayor número de embriones somáticos con germinación precoz y tuvo diferencias estadísticas significativas con la formulación (5) que resultó con el efecto mas positivo con el menor número de embriones somáticos con germinación precoz. Dentro de la variedad Ataulfo
las cinco
formulaciones estudiadas resultaron estadísticamente iguales. En la variedad Haden la formulación (5) tuvo el menor número de embriones somáticos con germinación precoz y tuvo diferencias estadísticas con las formulaciones (4) y (2).
Las
formulaciones (1) y (2) resultaron con el efecto más negativo dentro de la variedad Tommy Atkins siendo estadísticamente diferentes a las formulaciones (3), (4) y (5) (Cuadro 17). 4.5.3. Embriogénesis secundaria. En el Cuadro 15 se observan los resultados del ANDEVA en los cuales no existieron diferencias estadísticas significativas en el número de embriones somáticos con
78
embriogénesis secundaria para los factores variedad y formulación del medio de cultivó de maduración así como para la interacción de ambos factores. Ataulfo resultó con el mayor número de embriones con embriogénesis secundaria pero estadísticamente igual a las variedades Haden y Tommy Atkins. La formulación (5) tuvo el menor número de embriones somáticos con embriogénesis secundaria sin obtener diferencias estadísticas con las formulaciones restantes. Dentro de los tres variedad el efecto más positivo se observo en la formulación (5) con el menor número de embriones somáticos que presentaron
embriogénesis secundaria sin
lograr obtener diferencias estadísticas con las otras cuatro formulaciones (Cuadro 18). Cuadro 16. Porciento de sobrevivencia de embriones somáticos en estado temprano (3-5 mm) de tres variedades de mango en cinco formulaciones del medio de cultivo después de 30 días en medio de maduración. Sobrevivencia (%) Variedad Medio de cultivo*
Ataulfo
Haden
Tommy Atkins
Promedio
(1) MM+CA+ACF
86.67 a
83.33 a
90.0 a
86.67 a
(2) MM+CA+ACA
93.33 a
83.33 a
83.33 a
86.67 a
(3) MM+CA
86.67 a
93.33 a
90.0 a
90.0 a
(4) MM+ACF
73.33 a
90.0 a
86.67 a
83.33 a
96.67 a
83.33 a
83.33 a
90.0 a
87.33 a
86.67 a
88.0 a
(5) MM
Promedio
*(MM) Medio de mantenimiento; (CA) Carbón activado; (ACF) Agua de coco esterilizada por filtración; (ACA) Agua de coco esterilizada por autoclave..
Promedios con letra distinta dentro de la columna del cuadro son diferentes estadísticamente. Tukey .05
79
Cuadro 17. Efecto variedad-formulaciones del medio de cultivo sobre el porcentaje de embriones somáticos en estado temprano (3-5 mm) con germinación precoz después de 30 días en medio de maduración.
Germinación Precoz (%) Variedad Medio de cultivo*
Ataulfo
Haden
Tommy Atkins
Promedio
(1) MM+CA+ACF
34.33 a
37.67 ab
49.0 a
40.33 a
(2) MM+CA+ACA
11.0 a
65.67 a
50.0 a
42.22 a
(3) MM+CA
11.0 a
53.33 ab
16.67 b
27.0 ab
(4) MM+ACF
36.67 a
67.33 a
11.0 b
38.33 a
(5)
12.33 b
MM
10.0 a
23.67 a
3.33 b
Promedio
20.6 b
49.53 a
26.0 b
*(MM) Medio de mantenimiento; (CA) Carbón activado; (ACF) Agua de coco esterilizada por
filtración; (ACA) Agua de coco esterilizada por autoclave. Promedios con letra distinta dentro de la columna del cuadro son diferentes estadísticamente. Tukey .05
80
Cuadro 18. Efecto variedad-formulaciones del medio de cultivo sobre el porcentaje de embriones somáticos en estado temprano ( 3-5 mm ) con embriogénesis secundaria después de 30 días en medio de maduración.
Embriogénesis secundaria (%) Variedad Medio de cultivo*
Ataulfo
Haden
Tommy Atkins
Promedio
(1) MM+CA+ACF
13.33 a
19.33 a
22.0 a
18.22 a
(2) MM+CA+ACA
13.33 a
17.33 a
26.67 a
19.11 a
(3) MM+CA
21.0 a
26.67 a
10.0 a
19.22 a
(4) MM+ACF
43.33 a
17.67 a
8.33 a
23.11 a
3.33 a
6.67 a
8.33 a
6.11 a
18.87 a
17.53 a
15.07 a
(5) MM
Promedio
*(MM) Medio de mantenimiento; (CA) Carbón activado; (ACF) Agua de coco esterilizada por filtración; (ACA) Agua de coco esterilizada por autoclave.
Promedios con letra distinta dentro de la columna del cuadro son diferentes estadísticamente. Tukey .05
81
4.6. Germinación de Embriones Somáticos. Los embriones que no sobrevivieron, se necrosaron lentamente a partir de la punta que no estaba en contacto con el medio de cultivo, esto sin presentar ninguna emergencia de brotes ni raíces (Figura 20). Existieron embriones que solo tuvieron desarrollo del meristemos de raíz (Figura 21). En la germinación siempre se inicio primero la emergencia de raíces y posteriormente la emergencia de brotes (Figura 22). El ANDEVA no encontró diferencias estadísticas significativas en las ninguna de las variables: sobrevivencia, emergencia de brotes y emergencia de raíz de embriones somáticos de mango para el factor variedad (Cuadro 19). Cuadro 19. Análisis de varianza del efecto de la variedad sobre la sobrevivencia y la emergencia de brotes y raíz en embriones somáticos en medio de germinación. Valores de F calculada Fuente de variación
GL
Sobrevivencia Emergencia de Brotes
Tratamientos
2
0.1946 NS
2.5222 NS
1.2229 NS
Bloques
3
0.5849 NS
0.9999 NS
1.106 NS
E. experimental
6
Total
11
CME
0.009631
0.008934
0.010554
CV (%)
7.28
9.06
8.79
** P=0.01 ***P=0.001
82
Emergencia de Raíz
4.6.1. Sobrevivencia de embriones somáticos. El mayor número de embriones somáticos sobrevivientes se presentó en la variedad Ataulfo sin embargo fue estadísticamente similar a las variedades Haden y Tommy Atkins ( Cuadro 20). 4.6.2. Emergencia de brotes. Solo los embriones somáticos de la variedad Ataulfo presentaron emergencia de brotes pero no tuvieron diferencias estadísticas con las variedades Haden y Tommy Atkins (Cuadro 20). 4.6.3. Emergencia de raíces En el número de embriones somáticos con emergencia de raíces el efecto más negativo se presento en la variedad Haden sin embargo no fué estadísticamente diferente a las variedades Ataulfo y Tommy Atkins ( Cuadro 20).
Cuadro 20. Germinación y sobrevivencia de embriones somáticos de tres variedades de mango, después de 30 días en medio de germinación. Variedades
Sobrevivencia (%)
Emergencia de brotes (%)
Emergencia de raíces (%)
Ataulfo
90.0a
30.0a
50.0a
Haden
80.0a
0.0a
25.0a
Tommy Atkins
80.0a
0.0a
40.0a
83.33a
10.0a
38.33a
Promedio Promedios con letra distinta dentro de la columna del cuadro son diferentes estadísticamente. Tukey 0.05
83
Figura 19. Embriones somáticos necrosados de la variedad Haden después de cuatro semanas en medio de germinación.
Figura 20. Embriones somáticos de la variedad Ataulfo con desarrollo del meristemo de raíz después de 30 días en medio de germinación.
84
Figura 21. Germinación de embriones somáticos de mango después de 60 días en medio de cultivo de germinación.
85
V. DISCUSIÓN 5.1. Estado de Desarrollo de la Semilla. Para la inducción de embriogénesis somática de mango se utilizaron frutos que en promedio tuvieron un tamaño para las variedades Ataulfo 3.91, Haden 3.88
y
Tommy Atkins 3.67 cm. Litz (1984) utilizo frutos de nueve variedades de mango para inducir embriogénesis somática con un tamaño de entre 0.7 y 7.0 cm, de los cuales solo tuvo respuesta embriogénica con frutos de 4.0 a 4.8 cm. En lo que respecta al tamaño del óvulo
en las tres variedades se obtuvieron promedios que no
sobrepasaron los 2.0 cm. Lad et al. (1997) reportaron en un estudio hecho con la variedad Carabao que la mayor respuesta embriogénica se dio en óvulos que en promedio median 4.6 cm; mientras que Litz (1984) reporto que el estado de desarrollo del óvulo no tiene efecto en la inducción de callo, de lo anterior se desprende, que en los estudios hechos en Florida se han utilizado frutos más grandes en promedio, que los utilizados en el presente estudio en Colima. Por lo tanto el tamaño de fruto y óvulo no pueden ser utilizados como un factor que nos indique el estado de desarrollo de los frutos de mango. 5.2 . Inducción de Cultivos Embriogénicos. En el presente experimento, fue posible la inducción de embriogénesis somática en las variedades Ataulfo, Haden y Tommy Atkins. El tipo de crecimiento de callo nucelar en las variedades monoembriónicas Haden y Tommy Atkins concuerda con lo reportado por Litz (1984) quien describió en variedades monoembriónicas un callo de lento crecimiento de color inicialmente blanco o verde claro y de textura friable, que posteriormente se torna de color café oscuro. En contraste la embriogénesis somática de variedades monoembriónicas de Citrus ocurre directamente de nucelas explantadas sin la fase intermedia callo (Rangan et al., 1968).
86
Litz (1984) describió que la embriogénesis somática se origino de callo nucelar después de 5-7 semanas ó 3-4 semanas después de la iniciación de callo y que esta respuesta depende fuertemente del cultivar utilizado. Lo anterior concuerda con las nuevas observaciones, en las variedades Haden y Tommy Atkins después de 4 a 5 semanas se desarrollaron embriones somáticos después de la iniciación del callo nucelar. En la variedad poliembriónica Ataulfo, se desarrollaron embriones directamente del tejido explantado esto comenzó a manifestarse a partir de la sexta semana del cultivo,
como lo reportó (Litz, 1997). Lo anterior sugiere fuertemente que, el
desarrollo de embriones adventicios nucelares de mango en el óvulo, es inhibida en variedades monoembriónicos por la presencia de un represor y el efecto de este represor se pierde al explantar la nucela (Litz et al., 1998a). Los mismos autores observaron también que explantes nucelares de variedades poliembrionicas y monoembriónicas de mango, por si solos tiene la capacidad de inducir embriogénesis en baja frecuencia en medio de cultivo sin hormonas. La variedad Ataulfo tuvo un potencial embriogénico de 12.38%, el cual se considera intermedio si se compara con otros cultivares poliembriónicos: Hindi: 53.5%, Nam Doc Mai: 45%, Carabao: 63.2 % (Litz et al. 1998b). La variedad Haden tuvo un potencial embriogénico relativamente bajo comparado con otras variedades monoembriónicas: Irwin: 40%, Ruby: 23.1%, (Litz, 1984), Lippens: 17%, (Litz et al., 1998b). En lo que respecta a Tommy Atkins con 14.28 %, tuvimos resultados muy similares a otros autores en lo que respecta a su potencial embriogénico: 11.1% (Litz, 1984), 10% (Litz et al., 1998b). Estas diferencias genotípicas pueden ser explicadas debido a que existe diferente sensibilidad a agentes represores ó ausencia de receptores que los induce y/o reprime, entre variedades de mango. Ya que en la inducción de competencia embriogénica puede estar involucrado más de un agente y estos agentes pueden ser antagonistas en algunos cultivares (Litz et al., 1998a).
87
Litz y Yurgalevitch (1997) demostraron que explantes de óvulos de mangos monoembriónicos producían mayores niveles de etileno en comparación con variedades poliembrionicas. Los cultivos embriogénicos de mango en suspensión han mostrado que producen proteínas extracelulares, incluida la citinasa, la cual aparentemente esta involucrada en el desarrollo de embriones somáticos en estado temprano (De Jong et al., 1992; Jayasankar y Litz, 1998). Las nuevas observaciones siguieren, que el estado de desarrollo óptimo para inducir embriogénesis somática de tejido nucelar de mango, se dio en la relación embrión/óvulo 1/3. Lo anterior no corresponde con lo reportado por Litz en 1987 quien describió que la relación más apropiada es ½ . En contraste en la variedad Carabao
los óvulos más desarrollados resultaron con la mayor respuesta
embriogénica (Lad et al., 1997). El estado de desarrollo del óvulo no tuvo efecto en la producción de callo en las variedades monoembriónicas como lo describió Litz (1984). 5.3. Proliferación de Cultivos Embriogénicos. El mantenimiento y proliferación estuvo caracterizado por dos distintos tipos
de
cultivos embriogénicos lo cual concuerda con lo observado por (Witjaksono y Litz, 1999) quienes describieron que este comportamiento depende de la variedad. Ataulfo y Tommy Atkins proliferaron como masas proembriogénicas en presencia de auxinas, esta proliferación a sido descrita en cacao (Figueira y Janick, 1995), Salix viminalis (Gronroos, 1995), Rosa hybrida (Robert et al., 1995), Citrus (Button et al., 1974) y Aguacate (Witjaksono y Litz, 1999a). Estas estructuras pierden la habilidad integrativa y se forman múltiples estructuras de embriones globulares secundarios (Williams y Maheshwaran, 1986). En estas variedades se logro el mantenimiento y proliferación de cultivos embriogénicos en suspensión.
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Existió desarrollo y maduración de embriones somáticos en medio sólido de mantenimiento, debido a que existe polaridad dentro del cultivo embriogénico y el desarrollo de embriones somáticos es posible que ocurra en sectores donde el cultivo esta distante del medio de cultivo. En cultivos en suspensión este desarrollo es reprimido (Litz et al., 1998a). En la variedad Haden no se logro el mantenimiento y proliferación de cultivos embriogénicos en suspensión, pero se ha reportado que otros cultivares de mango son incapaces de proliferar en suspensión (Litz et al., 1998a). En cambio, en esta variedad se presenté el desarrollo de embriones somáticos en estado de corazón y estados posteriores en medio sólido con presencia de auxinas, la cual a sido descrita en Aguacate (Witjaksono y Litz, 1999b) y Magnolia (Merkle, 1995). En mango algunas variedades responden a las condiciones de mantenimiento formando embriones somáticos a partir de cultivos embriogénicos, los cuales se desarrollan hasta madurar aun en medio con altos contenidos de auxinas (Litz et al., 1998a). 5.4. Recuperación de Embriones Somáticos. El crecimiento y desarrollo de embriones somáticos a partir de masas proembriogénicas de las variedades Ataulfo y Tommy Atkins, comenzó a darse a partir de la cuarta semana. El tiempo requerido para la diferenciación de embriones somáticos depende del cultivar y esta en un rango entre 30 y 60 días (Litz, 1997). Sin embargo, los embriones en estado de corazón se describen como estructuras blancas y brillantes, el crecimiento de estos embriones se dio solamente sobre masas embriogénicas necróticas que estaban en contacto con el medio de cultivo. Los embriones de las tres variedades solo se desarrollaron hasta madurar en medio de cultivo sólido, debido a que los cultivos en suspensión tienen un efecto negativo en el desarrollo de embriones (Cabasson et al., 1997). Se requirieron altas concentraciones de agente gelificante para lograr el desarrollo de embriones somáticos y evitar la hiperhidricidad.
Lo anterior concuerda con lo reportado en
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mango, aguacate y Pinus strobus (Monsalud et al., 1995; Witjaksono y Litz, 1999b; Klimaszewska y Smith, 1997). 5.5. Maduración de Embriones Somáticos. La maduración de los embriones somáticos de mango es un proceso continuo sin interrupciones desde el estado temprano de corazón hasta la germinación (Litz, 1997). Para madurar los embriones cigóticos de mango se requiere un periodo de 3 a 4 meses, de ahí nace la importancia de las interacciones físicas y químicas de los factores que regulan el crecimiento y desarrollo de los embriones somáticos hasta completar su madures fisiológica (DeWald et al., 1989a). En la maduración de las tres variedades mango, no existieron diferencias entre utilizar agua de coco esterilizada por filtración y utilizar agua de coco esterilizada en autoclave. El carbón activado redujo la embriogénesis secundaria en las tres variedades estudiadas. Existió un alto porcentaje de germinación precoz debido a que el medio de cultivo utilizado no permitió que los embriones somáticos completaran su desarrollo y llegaran a madures fisiológica. Se ha observado que el ácido abscisico puede ser un supresor de la embriogénesis secundaria y también puede controlar la germinación precoz (Litz et al., 1998a). Ara et al., (1999) describieron que el ABA a bajas concentraciones no tiene influencia en la germinación y conversión de embriones somáticos de mango, variedad Amrapalli, aunque si causa un retardo de tres semanas en la germinación y a altas concentraciones de ABA se inhibió completamente la germinación. Los embriones somáticos de mango se desarrollaron hasta madurar en oscuridad y solo germinaron normalmente cuando completaron su maduración. Debido a que los embriones de especies recalcitrantes se desarrollan hasta la maduración en oscuridad y germinan sin un periodo de dormancia (Litz et al., 1998a).
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5.6. Germinación de Embriones Somáticos. Solo se logro la completa germinación de los embriones de la variedad Ataulfo. La variedad Haden y Tommy Atkins tuvieron desarrollo del meristemo de raíz. La elongación del hipocotilo fue seguida por el crecimiento de meristemo de raíz, y aproximadamente dos semanas después se da el crecimiento del meristemo apical. Esto es debido a que el meristemo apical presenta una especie de dormancia, la cual se rompe hasta que la germinación se ha completado (Litz et al., 1998; Litz, 1997). Coutos-Thevenot et al. (1992) reportaron que moléculas extracelulares con un alto peso molecular de 10 kDa probablemente están envueltas en la inhibición de la iniciación del meristemo apical. El fracaso en el desarrollo del brote apical se la ha atribuido al fracaso del desarrollo del meristemo durante la maduración de embriones somáticos de zanahoria y aguacate (Nickel y Van Staden, 1993; Pliego-Alfaro y Murashige, 1988). Kimura y Komamine, (1995) observaron que las citoquininas son importantes durante la organización del meristemo apical de embriones somáticos de zanahoria. Sin embargo en aguacate el ABA no mejora la conversión a planta (Witjaksono y Litz, 1999b). Existió necrosis del hipocotilo y de los meristemos del tallo de los embriones somáticos, lo cual concuerda con lo reportado por otros autores, en especies con semillas recalcitrantes el brote apical se puede necrosar, por lo que la plántula no sobrevive (Litz et al., 1998; Litz, 1997). Ara et al. (1999) reportaron que en algunas plántulas de mango los meristemos apicales se necrosan y posteriormente mueren.
Se ha demostrado que
incrementando el fotoautotrofismo de las plántulas se puede mejorar su habilidad para sobrevivir (Figueira et al., 1991). Esto a sido posible exponiendo embriones somáticos germinando a un medio de cultivo con un mínimo de nutrientes, altos niveles de CO2 (20,000 ppm) y una alta intensidad de luz (Kozai y Iwanami, 1988). Ara et al. (1999) describieron que el promedio de germinación a conversión de embriones somáticos de mango decreció al incrementar las concentraciones de sales mayores B5.
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VI. CONCLUSIONES.
Las variedades de mango Ataulfo, Haden y Tommy Atkins, mostraron diferentes respuestas a la inducción de embriogénesis somática a partir de tejido nucelar, determinando así, que es posible desarrollar embriones somáticos de estas tres variedades de mango. Debido a las diferentes respuestas, es importante considerar a la variedad Ataulfo como un material que tiene posibilidades para ser utilizado en estudios posteriores de regeneración de plantas. Por su parte para las variedades Haden y Tommy Atkins será necesario adecuar los protocolos para obtener una mejor respuesta embriogénica.
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