Universidad Simón Bolívar Decanato de Estudios de Postgrado Maestría en Ciencias Biológicas

EFECTO DE LA DENSIDAD EMBRIONARIA SOBRE EL DESARROLLO DE EMBRIONES DE RATÓN. FACTORES DE CRECIMIENTO IMPLICADOS

Trabajo de grado presentado a la Universidad Simón Bolívar por Ana Patricia Contramaestre Montezuma

Como requisito parcial para optar al grado de Magíster en Ciencias Biológicas

Realizado con la tutoría de la Profesora María Isabel Camejo Bermúdez

Febrero, 2006

ii

iii

Dedicatoria

Este manuscrito va dedicado a mi hija Patricia Alejandra, luz de mi existencia, alegría permanente, aliento y equilibrio ante las dificultades, fuerza y determinación para seguir adelante, fe en la vida y esperanza de un mundo mejor… A ti -amada hija- una pequeña demostración de mi inmenso amor y agradecimiento.

iv

Agradecimientos La culminación de la siguiente investigación, fue lograda gracias al apoyo recibido por parte de personas e instituciones, que son nombradas a continuación. En primer lugar, mi profundo agradecimiento a la Dra. María Isabel Camejo, profesora del departamento de Biología de Organismos de la Universidad Simón Bolívar, tutora y amiga, quien con su respaldo continuo, vocación de servicio y fuente inagotable de conocimientos, hizo posible la culminación exitosa del presente trabajo de grado. Al Dr. Freddy Sifontes, antiguo coordinador del Bioterio del Instituto Nacional de Higiene y actual Jefe (e) de la División de Servicios Técnicos Auxiliares, quien muy amablemente aportó sus conocimientos y pericia en el manejo de los animales utilizados en la fase experimental de nuestra investigación. Sin su apoyo, hubiese sido sumamente difícil el logro de los objetivos. A la Dra. Lilian Spencer, profesora del departamento de Biología Celular de la Universidad Simón Bolívar, quien desinteresadamente nos ayudó con la realización de la electroforesis de proteínas (técnica SDS Page) para la confirmación del adecuado funcionamiento de los reactivos del kit de ELISA. A la Dra. Karen Noris, profesora del departamento de Biología Celular de la Universidad Simón Bolívar, la cual atentamente, facilitó de manera temporal, las instalaciones de su laboratorio, para el cultivo embrionario. Al Bioterio del Instituto Nacional de Higiene, institución que proporcionó los ratones de la cepa CD1 para la ejecución de los experimentos. Por último, y no menos importante, a mis padres, cuyo apoyo personal y emocional irrestricto y permanente, permitieron el desarrollo y culminación de mis estudios de postgrado.

v

RESUMEN Durante el cultivo in vitro de embriones de mamíferos, existe un retraso evidente en su desarrollo en comparación al desarrollo in vivo, fenómeno atribuido a condiciones subóptimas de cultivo, entre otras causas. Diversos factores de crecimiento y citocinas producidas por la madre y el embrión han sido involucrados en el desarrollo embrionario temprano contribuyendo a mejorarlo. Por otra parte, algunas investigaciones se han enfocado en el estudio de los cultivos en grupo, donde se observa un incremento de la calidad embrionaria, debido –probablemente- a la concentración de ciertos factores embriotróficos. Los objetivos de esta investigación fueron determinar si el cultivo de embriones en grupo genera embriones murinos de mayor calidad; establecer la existencia de secreción embrionaria del Factor Estimulador de Colonias de Granulocitos-Macrófagos (GM-CSF) y del Stem Cell Factor (SCF) y analizar el efecto de su adición exógena sobre la calidad embrionaria. Se recuperaron embriones en estadio de dos células de ratones hembras (cepa CD1), estimuladas hormonalmente y se cultivaron aleatoriamente, en forma aislada o en grupo, durante cinco días hasta alcanzar el estadio de blastocisto. La concentración de GM-CSF Y SCF se determinó en la gota de cultivo con la técnica de ELISA. Además, se adicionaron –separadamente- ambos factores al medio de cultivo de una segunda cohorte y se comparó su desarrollo con aquellos cultivados en forma aislada. Los resultados demuestran que existe una variación significativa entre la calidad de los embriones que fueron cultivados en forma aislada o en grupo. Se estableció que GM-CSF y SCF son secretados por embriones murinos y por último, la adición de ambos factores mostró una marcada mejoría de la calidad embrionaria, a partir del estadio de ocho células, lo que confirma que GM-CSF y SCF actúan como factores de regulación embrionaria en fases tempranas del desarrollo.

Palabras clave: blastocisto, cultivo embrionario, desarrollo embrionario preimplantación, GMCSF, SCF

vi

ÍNDICE GENERAL Aprobación del Jurado Dedicatoria Agradecimientos Resumen Índice General Índice de Figuras Introducción Marco Teórico Requerimientos de nutrientes y metabolismo energético Técnicas de cultivo y desarrollo embrionario 1. Cocultivo 2. Medios Secuenciales 3. Densidad Embrionaria Factores de Crecimiento 1. Factores de crecimiento de origen embrionario 2. Efecto de los factores de crecimiento sobre el embrión 3. Factor de Estimulador de Colonias de Granulocitos-Macrófagos 4. Factor de Células Madre ó Stem Cell Factor Objetivos Materiales y Métodos Resultados Discusión y Conclusiones Referencias Bibliográficas

Pág. ii iii iv v vi vii 1 5 7 12 14 19 24 26 27 28 30 33 37 38 44 53 64

vii

ÍNDICE DE FIGURAS

Fig. 1. Etapas del desarrollo desde el ovocito maduro hasta el proceso de eclosión Fig. 2. Recorrido del ovocito fecundado a través del tracto reproductor materno Fig. 3. Etapa de activación y expresión del genoma embrionario Fig. 4. Componentes celulares del blastocisto Fig. 5. Rol de los aminoácidos durante el período de preimplantación en embriones de

Pág. 1 6 8 9 11

mamíferos Fig. 6. Comunicación química entre el embrión y el tracto reproductor materno Fig. 7. Comparación morfológica por microscopia electrónica de cultivos de

15 18

monocapas de CEE de pacientes fértiles (n=10 A-C) y pacientes con fallos de fertilización (n=10, D-F) cultivadas en presencia de blastocistos humanos Fig. 8. Composición de los medios secuenciales desarrollados por Gardner y

21

colaboradores Fig. 9. Cultivo embrionario en grupo Fig. 10. Estructura del GM-CSF Fig. 11. Eventos intracelulares que se desencadenan para que el SCF entre en contacto

24 30 34

con el receptor de membrana c-kit Fig.12. Estructura de los Receptores de membrana para GM-CSF y SCF Fig. 13. Porcentaje de embriones que formaron Blastocisto y que eclosionaron

36 45

(“hatching”) cuando fueron cultivados de forma aislada (n: 19) o en grupo (n: 112). Fig. 14. Porcentaje de embriones que presentaron retraso en el crecimiento y arresto en

45

el desarrollo cuando fueron cultivados de forma aislada (n: 19) o en grupo (n: 112) Fig. 15. Cultivos embrionarios aislados desde el estadio de 2 células hasta la formación

46

de blastocisto Fig. 16. Cultivos embrionarios aislados desde el estadio de 2 células hasta la

46

degeneración o muerte Fig. 17. Cultivo embrionario en grupo Tabla 1. Concentración de GM-CSF y SCF en las gotas de medio donde fueron

47 49

cultivados los embriones murinos en forma individual o en grupo Fig.18. Porcentaje de embriones que formaron Blastocisto y que realizaron “hatching”

51

cuando fueron cultivados en presencia de GM-CSF (n: 24) y SCF (n: 24), comparados a

viii

aquellos cultivados en forma aislada sin la adición de factores de crecimiento (n: 56) Fig. 19. Porcentaje de embriones que presentaron retraso en el crecimiento o arresto en

51

el desarrollo cuando fueron cultivados en presencia de GM-CSF (n: 24) y SCF (n: 24), comparados a aquellos cultivados en forma aislada, sin la adición de factores de crecimiento (n: 56) Tabla 2. Tasas de formación de blastocisto, “hatching”, retraso en el desarrollo y arresto embrionario, en embriones cultivados en presencia de GM-CSF y SCF, comparados con los embriones cultivados en forma aislada, sin la adición de factores de crecimiento

52

1

INTRODUCCIÓN El desarrollo embrionario de los mamíferos en fase de preimplantación es marcadamente similar, e implica la división del ovocito fecundado, la formación y compactación de la mórula y finalmente, la cavitación con la formación del blastocisto (Fig.1).

Fig. 1. Etapas del desarrollo desde el ovocito maduro hasta el proceso de eclosión

ovocito maduro

cigoto

1º división

2º división

3º división

mórula

compactación

blastocisto temprano

blastocisto cavitado

blastocisto expandido

eclosión o “hatching”

2 El embrión en período de preimplantación es único ya que él se desarrolla en ausencia de contacto celular directo con el tracto reproductor materno, durante aproximadamente una semana (en el caso de los humanos) antes de implantarse en el útero. Durante este período, el embrión sufre divisiones celulares, apoptosis y diferenciación y es dependiente de las secreciones luminales del oviducto y del útero para su nutrición. Se ha determinado que la actividad celular del embrión (incluyendo la división celular, expresión génica y metabolismo), está influenciada por varios factores como la calidad ovocitaria (Moor et al.1998), las condiciones de cultivo -CO2 y temperatura entre otras- (Bavister et al 1995) y la densidad embrionaria en el mismo (Lane y Gardner, 1992), así como la comunicación materno embrionaria (Simon y Valbuena 1999).

Luego del advenimiento de las técnicas de fecundación in vitro en 1969 (Edwards et. al 1969), se ha evidenciado que en el desarrollo embrionario in vitro hay un retraso en la tasa de crecimiento de los embriones, en relación al desarrollo in vivo, lo que puede comprometer el potencial de desarrollo e implantación, (Bowman y Mc Laren, 1970; Papaioannou y Ebert, 1986). Más aún, en los blastocistos de ratón, los niveles de apoptosis son tres veces mayores in vitro que in vivo (Brison y Shultz 1997). Esto sugiere que el tracto reproductor materno produce importantes factores para el desarrollo embrionario, que actúan a través de una ruta paracrina, los cuales se encuentran ausentes en condiciones de cultivo in vitro convencionales.

En los últimos años, se han utilizado con éxito, técnicas como el cocultivo de embriones con monocapas de células epiteliales provenientes del endometrio, oviducto o incluso células Vero, las cuales han demostrado un incremento en la formación del blastocisto y número celular en los mismos (Mènezo et. al 1990; Vlad et. al 1996), así como un incremento en las tasas de embarazo en humanos (Seta, 2001; Simon y Valbuena, 1999). Se piensa que este fenómeno se debe tanto a la remoción de sustancias embriotóxicas del medio, por parte de las células de soporte, como a la secreción de factores de crecimiento que mejoran el desarrollo. Sin embargo, la técnica de cocultivo es extremadamente laboriosa para mantener en un laboratorio de fecundación asistida y puede acarrear el riesgo de contaminación, por lo que se ha enfocado la atención en el desarrollo de medios de cultivo definidos (Gardner et. al, 1998a), capaces de mantener la viabilidad de los embriones, sin necesidad de los cocultivos.

3 Por otra parte, hay evidencias importantes -que no escapan a la controversia- que demuestran que la reducción del volumen de medio en el cual se cultiva al embrión o el cultivo in vitro de embriones en grupo, mejora el desarrollo y reduce los niveles de apoptosis (Paria y Dey, 1990; Stoddart et al, 1996; Brison y Shultz, 1997; O´Neill 1998; Lane y Gardner, 1992), apuntando al hecho de que los embriones por si mismos, también producen una serie de factores embriotróficos . Un buen número de investigaciones demuestran que un conjunto de factores de crecimiento son producidos tanto por el tracto reproductor materno como por el embrión en fase de preimplantación y que muchos de sus receptores pueden ser detectados sobre la superficie de este último, sugiriendo la presencia de vías de señalización tanto paracrinas como autocrinas, respectivamente. Estos incluyen miembros de las familias de factor de crecimiento insulínico, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), factor de crecimiento epidermal (EGF), factor de crecimiento fibroblástico (FGF), factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), factor estimulador de colonias (CSF), factor estimulador de colonias de granulocitos macrófagos (GM-SCF) y factor de necrosis tumoral (TNF) (Kane et. al, 1997). Los estudios en donde se evalúan los efectos de los factores de crecimiento de origen materno y embrionario in vitro, tanto en ratones como en otras especies, evidencian que estos factores juegan un papel importante durante la fase de preimplantación (Kaye, 1997; Hardy y Spanos, 2002), regulando el metabolismo (Ryan et. al, 1990) y la expresión génica (Babaola y Shultz, 1995), así como la división celular (Robertson et. al 2001) y los niveles de apoptosis (Wuu et. al 1999). El efecto de los factores de crecimiento sobre la calidad embrionaria puede ser analizado a través de diferentes aspectos, tales como la evaluación de embriones que alcanzan el estado de blastocisto, tasa de desarrollo embrionario, metabolismo, número de células en el blastocisto, incidencia de división y muerte celular, así como tasas de implantación, embarazo y fetos nacidos.

4 Las bajas tasas de embarazo producto de los procedimientos de fecundación in vitro (FIV) han llevado a la necesidad de evaluar y mejorar las condiciones de cultivo embrionario entre la fase de fecundación y transferencia. Se espera que mejorando tales condiciones, mejore la viabilidad embrionaria, junto con las tasas de embarazo. Esta es la razón principal que nos motiva a la realización de la siguiente investigación, en la cual se valorará el efecto que tiene la densidad embrionaria sobre la calidad del desarrollo de embriones en estadio de preimplantación. Se determinará la presencia del Factor estimulador de colonias de Granulocitos–Macrófagos y del Factor de células madre o Stem Cell Factor (GM-CSF y SCF respectivamente, por sus siglas en inglés) en los medios donde se desarrollaron embriones cultivados en forma aislada o en grupo, a través de técnicas de ELISA. Por último, se evaluará el efecto que presentan estos factores sobre el embrión, a través de su adición exógena a los medios de cultivo donde éstos se desarrollan in vitro. Como método de apreciación de la calidad embrionaria, se utilizarán sistemas de clasificación y graduación morfológica convencionales establecidos en la literatura especializada (Van Royen et. al, 1999; Gardner et. al, 2000b; Fisch et. al, 2001).

5

MARCO TEÓRICO En condiciones naturales, la fecundación en el ser humano ocurre en la región ampularístmica de las trompas de Falopio; luego, el embrión es transportado a través de la trompa u oviducto hasta el útero, con la ayuda de secreciones epiteliales tubáricas, cilios y contracciones peristálticas de la musculatura local. Los primeros 3-4 días de desarrollo embrionario desde la singamia al estadio de mórula, ocurren a nivel de la trompa. Durante todo este tiempo, las blastómeras permanecen desunidas y se mantienen muy próximas entre sí, gracias a la zona pelúcida. Las blastómeras de los embriones tempranos tienen una fisiología análoga a los organismos unicelulares y sólo después que sufren compactación y se genera el primer epitelio de transporte, es cuando las células de la nueva mórula presentan una fisiología similar a la de las células somáticas. (Gardner et. al, 1998b; Lane, 2001). En el estadio de mórula, el embrión desciende al útero, donde –a través de un proceso dependiente de energía- ocurre la formación del blastocele y la pérdida de la zona pelúcida, ya sea a través de la eclosión o “hatching” o por la acción de proteasas uterinas. Una vez que el blastocisto queda libre de la zona pelúcida, éste se adhiere e implanta en el endometrio del útero (fig. 2).

6

Fig. 2. Recorrido del ovocito fecundado a través del tracto reproductor materno

Vitrolife, Closer to Nature (2002).

7

REQUERIMIENTOS DE NUTRIENTES Y METABOLISMO ENERGÉTICO Conjuntamente con los cambios en la fisiología, el embrión de mamífero sufre cambios en los requerimientos y utilización de nutrientes durante el período preimplantación. El embrión humano, al igual que el de muchas otras especies de mamíferos, tienen una preferencia inicial por el piruvato sobre la glucosa, como nutriente (Hardy y Hooper, 1989). Sin embargo, durante el desarrollo progresivo del embrión, éste exhibe un incremento en su capacidad para utilizar la glucosa y durante el proceso de compactación, éste es el principal carbohidrato utilizado. La razón para el cambio en la utilización de fuentes de energía, se puede explicar en términos de cambio en la fisiología del embrión una vez que progresa el desarrollo (Gardner, 1997a). Previo a la activación y expresión del genoma embrionario, el cigoto exhibe un bajo nivel de biosíntesis, (Fig. 3). Como resultado directo, hay una alta proporción de ATP/ADP dentro del embrión (Leese, 1984), la cual inhibe el flujo de glucosa a través de la vía glicolítica. Una vez que el embrión comienza a incrementar su actividad transcripcional, la síntesis proteica se incrementa y una vez que el blastocele se forma a través de la acción de las ATPasas

basolaterales,

hay

un

incremento

en

la

demanda

de

energía

(ATP).

Consecuentemente, la proporción de ATP/ADP en los estadios más tardíos del embrión disminuye y ocurre un incremento en el flujo glucolítico, lo que conlleva a un incremento en la utilización de glucosa. (Gardner et. al, 2002)

8 Fig. 3.- Etapa de activación y expresión del genoma embrionario

Hardy y Spanos (2002)

Otro aspecto de la regulación intracelular del metabolismo del embrión, que ha sido recientemente considerado, es el transporte de malato-aspartato (Lane y Gardner, 2005; Lane y Gardner, 2000). Estos estudios han revelado que este transporte mitocondrial es fundamental para controlar el sistema de oxidorreducción intracelular y la utilización de carbohidratos en el embrión temprano. Por otra parte, se ha establecido que los diferentes tipos celulares que componen el blastocisto de ratón, presentan diferentes comportamientos metabólicos (Hewitson y Leese, 1993). Se ha determinado que mientras el trofoectodermo convierte cerca del 50 % de la glucosa consumida a lactato, la masa celular interna (MCI) es totalmente glucolítica. En el ratón (Lane y Gardner, 1997) y en el humano (Hardy et. al 1989), la MCI constituye cerca del 35% de las células del blastocisto (Fig. 4). Los análisis del consumo de nutrientes por embriones individuales desarrollados in vitro han revelado que blastocistos provenientes del mismo paciente, con características similares desde el punto de vista morfológico, pueden presentar un amplio rango de consumo de nutrientes (Gardner et. al, 2000c). Esto ha llevado a

9 la hipótesis de que podría ser posible seleccionar blastocistos humanos para transferencia, utilizando medidas de actividad metabólica no invasivas Gardner et. al, 2000a) Fig. 4.- Componentes celulares del blastocisto

Hardy y Spanos (2002)

En contraste a la vasta literatura sobre el rol de los carbohidratos en el desarrollo embrionario, el papel que juegan los aminoácidos (aa) ha recibido poca atención (Gardner et. al, 2002). Incluso, hasta principios de los años 90, éstos se encontraban ausentes de los medios de cultivo para embriones, a pesar del hecho de que los aa se encuentran presentes de forma abundante en los fluidos del tracto reproductor femenino (Casslen, 1987). Más aún, el ovocito y el embrión mantienen un pool endógeno de aa (Shultz, 1981) y poseen un sistema específico de trasporte para tomarlos de su entorno (Van Winkle, 1988). La primera indicación de que los aa jugaban un rol en el desarrollo embrionario, fue apoyada por Gwatkin en 1966 quien demostró que se requería de ellos para el desarrollo de los blastocistos de ratón. Cerca de 20 años después, Juetten y Bavister (1983) iniciaron las investigaciones sobre los efectos de un grupo de aa en el desarrollo de embriones de hámster. Estudios ulteriores en ratas (Zhang y Amstrong, 1990) y en ratones (Gardner y Sacas, 1993; Gardner y Lane, 1993) mostraron que los aa no sólo son beneficiosos para los embriones en cultivo, sino que incrementan significativamente la viabilidad de los mismos.

10 Otros estudios revelaron que los embriones de mamíferos exhiben un requerimiento bifásico de aa durante el período de preimplantación (Steeves y Gardner, 1999). Por ejemplo, el cigoto y el embrión temprano se benefician de la inclusión de aa no esenciales, componentes de medio mínimo esencial de cultivo (MEM) denominado “Eagle” y glutamina.

Es importante señalar que esta composición de aa presenta una alta homología con aquella presente en altos niveles a nivel del tracto reproductor femenino. Sin embargo, después del estadio de 8 células, el embrión de mamífero se beneficia de la presencia de un grupo más complejo de aa, encontrándose que aa esenciales “Eagle”, estimulan el desarrollo de la MCI. Esta diversificación en la utilización de aa, refleja las necesidades específicas de los dos tipos celulares dentro del blastocisto y el incremento general en la síntesis proteica durante el progreso del desarrollo (Epstein y Smith, 1973).

En 1997, Lane y Gardner lograron tasas de implantación equivalentes a la de embriones desarrollados in vivo, en cigotos de murinos cultivados con aa no esenciales hasta el estadio de 8 células, seguido del cultivo hasta blastocisto en presencia de aa esenciales. En 2001 Devrecker y colaboradores, reportaron resultados similares con la utilización inicial de aa no esenciales, seguido de un grupo más complejo de aa para mantener el desarrollo en cultivo.

La utilización de aa por los embriones humanos ha sido confirmada con la medición de la producción de amonio por blastocistos individuales, lo cual refleja la transaminación de los aa. (Lane et. al, 2001). El rol de los aa ha sido el foco de atención de muchas investigaciones y algunas de sus funciones durante el desarrollo embrionario están enumeradas en la figura 5.

11 Fig. 5. Rol de los aminoácidos durante el período de preimplantación en embriones de mamíferos

*Precursores de biosíntesis *Buffer de pHi *Fuente de energía *Antioxidantes *Reguladores del metabolismo energético *Quelantes *Osmolitos Gardner et al, (2002) J Reprod Immunol

Se ha demostrado que aa como la glicina y la taurina, presentes a niveles relativamente altos en el fluido del oviducto, ayudan al desarrollo de embriones en estadio de clivaje. Por lo tanto, la diferencia en los nutrientes disponibles para el embrión durante su desarrollo y pasaje a lo largo del tracto reproductor femenino parece confirmar los requerimientos estadioespecíficos del embrión.

12

TÉCNICAS DE CULTIVO Y DESARROLLO EMBRIONARIO En los laboratorios de fecundación in vitro (FIV), los embriones en estado de preimplantación, se transfieren rutinariamente al útero alrededor del estadio de dos a ocho células (día 2 o 3 de cultivo), momento en el cual, en condiciones naturales, deberían estar transitando por la trompa de Falopio. En estas condiciones, cerca del 90% de los embriones aparentemente saludables, están destinados a morir (ASRM, 1994) por lo que se hace difícil lograr la tasa de implantación cercana al 30%, presente en condiciones in vivo (Wilcox et. al, 1998). Las tasas de implantación por embrión transferido varían entre el 10 y el 40%, lo cual depende de la calidad morfológica de los embriones, el número de embriones transferidos, la edad materna, la calidad del endometrio y de otros factores aún desconocidos (Giscard d ´Estaing et. al, 2001). Con el incremento del número de embriones transferidos, las tasas de embarazos aumentan pero hay un concomitante aumento en el riesgo de multigestación. Aún cuando la utilización de las Técnicas de Reproducción Asistida (ART) se ha expandido rápidamente, las tasas de embarazos no han mejorado de manera importante (aproximadamente 20%), debido a la baja calidad en el desarrollo de los embriones cultivados in vitro. Muchos son los factores que se han implicado en este pobre desarrollo, entre los cuales se encuentran la edad materna como factor más importante en lo referente a la viabilidad embrionaria y desarrollo de blastocistos (Janny y Ménezo, 1996), factores paternos (Janny y Ménezo 1994; Jones et. al, 1998b), así como la técnica de reproducción asistida utilizada, ya sea IVF o ICSI (Shoukir y col., 1998). Otros factores, no menos importantes, se refieren a las condiciones subóptimas de cultivo (medios no enriquecidos, alteraciones en el CO2, factores embriotóxicos, etc.), así como al bajo potencial reproductivo que presenta la especie humana (Edwards y Brody, 1995).

13 Debido a que el embrión humano –en condiciones naturales- entra a la cavidad endometrial sólo después del día 5 post-fecundación, en estadio de mórula o blastocisto, lo más fisiológico sería transferir embriones en este estadio, sin embargo, el problema principal con este tipo de transferencia, ha sido el desarrollo de un sistema de cultivo consistente, seguro y efectivo para obtener un adecuado porcentaje de blastocistos en el laboratorio. En los últimos años se han desarrollado una serie de técnicas para lograr el cultivo de embriones hasta el estadio de blastocisto. Las primeras investigaciones fueron realizadas en animales y posteriormente, la técnica fue introducida en humanos al inicio de los años 90, mostrando un éxito limitado (Bolton et. al, 1991), ya que se utilizaron medios de cultivo simples que no cumplían con los requerimientos necesarios para la viabilidad del embrión. Sin embargo, con la introducción del cocultivo embrionario con células de soporte, el porcentaje de formación de blastocistos se incrementó hasta un 40-60 %. Subsecuentemente, la tasa de embarazo por embrión transferido, así como la tasa de implantación (por número de embriones transferidos) también se incrementó (Ménezo et. al, 1992; Olivennes et. al, 1994). A finales de los años 90, Gardner y colaboradores (Gardner et. al, 1998a) reportaron una tasa de formación de blastocistos mayor del 60%, con el uso de dos medios de cultivo estadio-específicos que teóricamente, cumplen con los requerimientos en los cambios fisiológicos y metabólicos durante el desarrollo de embriones in vitro. Scholtes y Zeilmaker (1996) también reportaron una alta correspondencia con estos resultados, cuando sólo se transfirieron blastocistos expandidos, utilizando medios definidos para su desarrollo. Se ha sugerido que el incremento en las tasas de implantación con la transferencia de blastocistos, se debe tanto a la selección natural de los embriones con mayor potencial implantatorio, así como a su sincronización con el endometrio uterino. Las condiciones óptimas de cultivo para lograr el desarrollo de blastocistos aún se encuentra en investigación y desarrollo, por lo cual, aún queda mucho trabajo por realizar con la finalidad de lograr la composición ideal necesaria para obtener altas tasas de formación de

14 blastocistos y aumento en las tasas de implantación embrionaria hecho que podría permitir la transferencia de menos embriones, evitando el riesgo de gestación múltiple.

1. Cocultivo Se ha comprobado, que los embriones de mamíferos tienen la capacidad de crecer en cultivo con células de soporte o “feeder cells” y que este fenómeno se traduce en un incremento tanto en la formación de blastocistos (Mènezo et. al, 1990), como en las tasas de embarazo en humanos (Seta, 2001, Simon et. al, 1999). Este hecho ha estimulado el desarrollo de diversos sistemas de cocultivo; así, múltiples tipos celulares han sido utilizados para este propósito, yendo desde tejido reproductor humano, como el de los oviductos, (Bongso et. al, 1992; Xu et. al, 2001) endometrio (Jayot et. al, 1995), cocultivo secuencial de oviductoendometrio (Bongso et. al, 1994) y células del cúmulo y la granulosa (Freeman et. al, 1995), hasta tejidos y líneas celulares no humanas (Neimer et. al, 1993; Mènezo et. al, 1992), e incluso, células de carcinoma ovárico (Ben-Chetrit et. al, 1996). Desafortunadamente, no hay consenso general sobre la eficacia de los diferentes sistemas de cocultivo (Bavister, 1995). Aún con los sistemas de cocultivo más utilizados, como por ejemplo el de las células Vero, los resultados en los diversos estudios, son discrepantes (Van Blerkom, 1993; Sakkas et al, 1994). Se ha sugerido que los efectos benéficos de este sistema, incluyen la secreción de factores embriotróficos, como nutrientes, substratos, factores de crecimiento y citocinas (Sakkas et. al, 1994) y la remoción de sustancias potencialmente embriotóxicas como metales pesados, amonio y formación de radicales libres, detoxificando el medio de cultivo. Por tanto, el objetivo básico del sistema de cocultivo, es incrementar las oportunidades metabólicas del embrión humano para alcanzar el estadio de blastocisto, y aumentar su potencial de implantación.

15 Cabe señalar, que los resultados de un número importante de estudios han generado evidencia de la existencia de comunicación bidireccional de tipo química entre el embrión y el endometrio materno (Cross et. al, 1994; Edwards, 1995), la cual se da a través de factores de crecimiento (Hardy y Spanos, 2002) (Fig. 6) secretados tanto por el tracto materno, como por el embrión (Threadgill, 1995; Harvey et. al, 1995). Fig. 6. Comunicación química entre el embrión y el tracto reproductor materno

Hardy y Spanos ( 2001)

Si bien es cierto que se ha demostrado que estos factores de crecimiento no son imprescindibles por si solos (en la mayoría de los casos), en conjunto pueden coadyuvar en el desarrollo embrionario adecuado. Estos hallazgos han provisto la base para estudios en el desarrollo humano, con la idea futura de suplementar los medios de cultivo con estos factores embriotróficos, lo que se traduciría en el mejoramiento de las condiciones de cultivo en reproducción asistida. Hace pocos años, el grupo del Instituto Valenciano de Infertilidad, demostró que el sistema de cocultivo con células endometriales humanas autólogas, es beneficioso para el blastocisto humano debido a la inducción de la secreción de moléculas embrionarias

16 paracrinas (Galan et. al, 2000). Más aún, el embrión cultivado en estas condiciones mejora la receptividad de las células endometriales cultivadas in vitro, ya que induce la expresión de las moléculas de adhesión en las células epiteliales endometriales (CEE), como la subunidad β3 de las integrinas (Simon et. al, 1997). En 1999, Simón y colaboradores, publicaron una investigación donde se utilizaron CEE autólogas para cocultivo embrionario, encontrando que en más del 88 % de los casos con ovodonación y en el 91% de los pacientes en protocolos de FIV, se transfirieron más de dos blastocistos, con porcentajes de formación de los mismos del 60,1% y 49,2 % respectivamente, lo que avala la viabilidad clínica del cocultivo con CEE: La razón por la cual se observa un incremento en la formación de blastocistos y en las tasas de embarazo en los casos de ovodonación, en comparación con los pacientes FIV, se basa en que estos ovocitos siempre provienen de mujeres jóvenes (menores de 35 años). Estos resultados confirman la eficacia clínica de este sistema. Por otra parte, estudios donde se ha comparado la eficacia del sistema de cocultivo con el uso de medios estándar, han demostrado un incremento significativo en la calidad de los embriones cocultivados con células endometriales, así como un aumento en la expresión de factor inhibidor de leucemia (LIF) el cual se ha asociado con una mejoría en el desarrollo embrionario y un aumento de embarazos clínicos (Spandorfer et. al, 2001). Así mismo, Seta en el año 2001, demostró que comparando el cultivo estándar con el cocultivo endometrial autólogo, las tasas de embarazo clínico fueron mucho más altas en el segundo grupo (24,3% y 48,5% respectivamente), y las tasas de aborto fueron bastantes menores. Sus datos confirmaron que el cocultivo con endometrio autólogo, también incrementa las tasa de embarazo en pacientes que habían tenido al menos dos ciclos de FIV fallidos anteriores, lo que sugiere que el cocultivo por si mismo, mejora la calidad embrionaria y por ende, las tasas de éxito.

17 Cabe señalar que el cultivo secuencial con células epiteliales tubo-endometriales, también ha demostrado eficiencia (Bongso et. al, 1994), sin embargo, el epitelio tubárico, no es accesible de manera rutinaria, por lo tanto, no es práctico. Con respecto al uso de líneas celulares no humanas, éste es un hecho que siempre levanta controversias desde el punto de vista médico, debido a que estas células podrían ser fuente de patógenos desconocidos (virus o priones). Finalmente, se podrían presentar conflictos de tipo ético cuando se utilizan tejidos diferentes a los del paciente, ya que los embriones se desarrollan e interactúan con este tipo celular. Sólo el uso de CEE autólogas de un ciclo ovulatorio previo elimina totalmente el riesgo de bacterias y virus exógenos conocidos o desconocidos, evitándose así, problemas de tipo ético y médico. También, hay algunos reportes concernientes al uso de células estromales endometriales: Jayot y colaboradores (1995) publicaron los resultados obtenidos luego de la realización de varios ciclos con cocultivo de embriones con estas células, realizando la transferencia uterina en estadio de mórula (día 4). Ellos reportaron una tasa de embarazo de 21% en comparación a un 8% de ciclos previos. Resultados similares fueron obtenidos por Prapas y colaboradores (1993), sobre una pequeña muestra, utilizando células endometriales y transfiriendo en día 3. El objetivo principal que se busca con el cultivo embrionario en monocapas de CEE autólogas, es generar, no sólo el incremento de la tasa de formación de blastocistos, sino también, la inducción de la secreción de moléculas embrionarias de tipo paracrinas, que en algunos casos, regulan la secreción de moléculas de adhesión producidas por las células endometriales (Simon et. al, 1997), y así, mejorar la receptividad uterina, una vez que el embrión entre en contacto con este tejido, in vivo (Simon et. al, 1999) (Fig. 7).

18 Fig. 7.-Comparación morfológica por microscopia electrónica de cultivos de monocapas de CEE de pacientes fértiles (n=10 A-C) y pacientes con fallos de fertilización (n=10, D-F) cultivadas en presencia de blastocistos humanos

Simon et al. (1999)

Aún no se ha determinado en forma veraz si el cocultivo con CEE autólogas es más o menos eficiente que los medios secuenciales para el desarrollo de blastocistos, pero el argumento primordial para el uso de esta técnica se basa en que el cultivo embrionario se realiza bajo condiciones más fisiológicas, muy similar al ambiente in vivo. Sin embargo, la técnica de cocultivo es extremadamente laboriosa para mantenerse en un laboratorio de fecundación asistida y puede acarrear el riesgo de contaminación, por lo que la atención ha sido enfocada en el desarrollo de medios sintéticos definidos (Gardner et. al, 1997a), para mantener la viabilidad de los embriones, evitando la utilización del cocultivo.

19 2. Medios Secuenciales Como se comentó anteriormente, cultivo de embriones de mamífero en estado de preimplantación, representa un desafío importante para los embriólogos, debido a que éste presenta cambios importantes en su fisiología durante su desarrollo y diferenciación. El ovocito fecundado, específicamente, presenta modificaciones metabólicas durante su desarrollo, comportándose al inicio, como un tejido quiescente mientras que unos pocos días más tarde, el blastocisto se asemeja a un tumor invasivo, previo a la implantación (Gardner et. al, 1997a). Estos cambios en la fisiología facilitan el desarrollo exitoso del embrión, a lo largo del tracto reproductor femenino y lo prepara para implantarse en el endometrio uterino. Esta dinámica en la fisiología ha llevado al desarrollo de medios de cultivo secuenciales capaces de mantener el desarrollo de blastocistos humanos viables. El embrión humano sufre muchos cambios en su fisiología durante los primeros 4 días de vida, es decir, se desarrolla y se diferencia de un ovocito fertilizado o cigoto hasta llegar al estadio de blastocisto. Como concomitante, el embrión está expuesto a gradientes de nutrientes en el tracto reproductor femenino y exhibe cambios en los requerimientos y utilización de los mismos. Determinando tanto la naturaleza de estos gradientes como el cambio en los requerimientos del embrión, se ha facilitado la formulación de medios de cultivo estadio-específicos, diseñados para mantener el desarrollo embrionario a través del período de preimplantación. Las tasas de implantación alcanzadas con el cultivo y transferencia de blastocistos humanos, son más altos que aquellos asociados con la transferencia uterina de embriones en estadio de división temprana. Este incremento ha facilitado el establecimiento de altas tasas de embarazo, reduciendo también, el número de embriones transferidos. Con base en los datos crecientes sobre la composición de los fluidos del tracto reproductor femenino y de los estudios en la dinámica de la fisiología del embrión, se ha llegado a la conclusión que el cultivo extendido de embriones (cultivo hasta estadio de blastocisto) debería llevarse a cabo con más de una formulación específica de medios de cultivo (Gardner y Lane, 1998c). Los medios de cultivo secuenciales han sido desarrollados y

20 probados de manera extensa sobre modelos animales y luego, utilizados clínicamente (Gardner y Lane, 1997a; Mènezo et. al, 1998; Alves et. al, 1998), con excelentes resultados. El sistema de cultivo secuencial, fue utilizado inicialmente en pacientes con una buena respuesta a las hormonas gonadotrópicas (Gardner et. al, 1997a; Gardner et. al, 1998 a, b), o con más de 4 embriones en estadio de 8 células en el día 3 (Milki et. al, 1999). Esta aproximación en pacientes de buen pronóstico llevó a un significativo incremento de las tasas de implantación y facilitó el establecimiento de altas tasas de embarazo (70%) con una concomitante reducción en el número de embriones transferidos. Por tanto, el uso de medios secuenciales llevó a la reducción de gestaciones múltiples de alto orden. Subsecuentemente, los medios secuenciales y la transferencia de blastocistos, han sido utilizados de manera exitosa para tratar pacientes con embriones de mala calidad (Balaban et. al, 2001; Langley et. al, 2001), pacientes con múltiples fallas de FIV (Cruz et. al, 1999) y en protocolos de ovodonación (Schoolcraft y Gardner, 2000). En todas estas situaciones, el cultivo extendido de embriones se asocia con un incremento en las tasas de éxito de FIV. En investigaciones similares, Marek y colaboradores (1999), reportaron que la utilización del cultivo extendido y la transferencia de blastocistos, en todos los pacientes que consultaron por problemas de infertilidad, incrementó en un 20% la eficiencia total de un ciclo de FIV establecido. El grupo de Gardner cultiva rutinariamente en medios secuenciales G1.3 y G2.3, (Fig. 8. a.b.) a 6% CO2 / 5% O2 / 89% N2 en grupos de 4 embriones en gotas de 50 µl de medio, bajo cubiertas de aceite mineral. Las macromoléculas escogidas son albúmina sérica (preferiblemente recombinante) y hialuronan (Gardner y Lane, 2000).

21 Fig. 8. Composición de los medios secuenciales desarrollados por Gardner y colaboradores 8 a. componentes del medio G-1.3 para el cultivo y desarrollo de embriones en estadio temprano, hasta el estadio de 8 células

Vitrolife. Closer to nature. GIII series (2002)

8 b. componentes del medio G2.3, para el cultivo y desarrollo de blastocistos

Vitrolife. Closer to nature. GIII Series (2002)

22 La investigación realizada por Giscard d’Estaing y colaboradores en el año 2001, donde se compara el método de cocultivo (utilizando células Vero), con medios secuenciales para el cultivo extendido de embriones, confirma los estudios previos, indicando que ambos sistemas pueden mantener el cultivo embrionario hasta este período. Los resultados, según los autores, indican que los medios sintéticos responden adecuadamente a las necesidades del embrión, a pesar de la ausencia de un ambiente más fisiológico. Como se comentó anteriormente, durante el estadio de preimplantación, el embrión humano presenta dos fases distintas antes y después de la activación del genoma. En la fase previa a la activación del genoma (día 3 o estadio de 8 células) la síntesis proteica depende de las reservas del RNA materno; este período requiere de una protección efectiva contra la producción de radicales libres y de una concentración reducida de glucosa y fosfato para balancear el déficit de mitocondrias. En el momento de la activación del genoma embrionario, los requerimientos de éste se hacen mayores tanto cuantitativa como cualitativamente, lo que confirma la necesidad de medios de cultivo con metabolitos diferentes. A pesar de que el sistema de cocultivo embrionario aporta un ambiente más fisiológico para el desarrollo de los blastocistos, los medios secuenciales han demostrado ser tan efectivos como aquellos, para permitir un adecuado desarrollo embrionario hasta el estadio de blastocisto (Fong y Bongso, 1998), lo que sugiere que el sistema de medios secuenciales es superior en cuanto a practicidad en el manejo en el laboratorio, siendo ésta una razón de peso para reemplazar al sistema de cocultivo. Los sistemas de cultivo secuenciales se han desarrollado tomando en cuenta la dinámica de la fisiología del embrión y el ambiente materno. Los mismos han demostrado la capacidad de lograr altas tasas de desarrollo de blastocistos humanos viables, a pesar de no contar con los factores de crecimiento secretados por las células del tracto reproductor materno.

23 Muchos pacientes se han beneficiado con los sistemas de cultivo extendido debido a las altas tasas de implantación de los blastocistos cultivados in vitro, permitiendo la transferencia de una menor cantidad de los mismos y evitando el riesgo de multigestación (Gardner et. al, 1997; Veiga et al, 1999; Marek et. al, 1999). Finalmente, la implementación exitosa del cultivo y transferencia de blastocistos se facilita con la optimización tanto de los procedimientos clínicos como de laboratorio, por lo que la utilización de un adecuado sistema de control de calidad es un requisito indispensable para el éxito clínico, permitiendo el logro de tasas de formación de blastocistos del 50% y tasas de implantación de hasta el 40%. Es esencial que se considere el sistema de cultivo como un todo y no enfocarlo simplemente sobre el medio de cultivo utilizado. Todos los aspectos del sistema como la fase de gas, el volumen de incubación de los embriones, tamaño del grupo de embriones, suplementación de macromoléculas, temperatura, adecuada inducción de la ovulación, transferencia embrionaria óptima y buen soporte de la fase lútea (Gardner et. al, 2000), interactúan entre sí para influir positiva o negativamente en los resultados.

24 3. Densidad Embrionaria Es indiscutible el excelente resultado que diversas investigaciones han señalado con el cultivo de embriones hasta el estadio de blastocisto, ya sea utilizando cocultivo de embriones con células de soporte o medios secuenciales. Fig. 9.- Cultivo embrionario en grupo

Olympus. Folleto demostrativo LCPlan F20X (2002)

Textbook of assisted reproductive techniques, (2001)

Sin embargo, otra línea de investigación muy interesante se fundamenta en la influencia de factores de crecimiento producidos por los propios embriones, los cuales podrían actuar a través de vías paracrinas y autocrinas (Hardy y Spanos, 2002). En referencia a este fenómeno, estudios en blastocistos de ratones han reportado la influencia beneficiosa de los micro cultivos y del cultivo en grupo (Fig. 9), sobres las tasas de embarazo e implantación, lo cual se atribuye a estos factores embriotróficos (Paria y Dey, 1990; O'Neill 1997, 1998). Datos publicados previamente, habían demostrado que los cultivos en gotas de pequeño volumen (Gardner et. al, 1997), así como el cultivo de embriones en grupo (Wiley y col., 1986; Lane y Gardner 1992; Moessner y Dodson, 1995; Almagor et. al, 1996), no sólo pueden contribuir a mejorar el desarrollo embrionario, sino también a incrementar las tasas de embarazo.

25 Se ha reportado que tanto el cultivo de embriones en grupo, así como una disminución en el volumen de cultivo, facilitan la formación de blastocistos en el ratón (Wiley, 1986; Gardner y Lane, 1992; Gardner et. al, 1997b). En humanos, el crecimiento embrionario en grupo hasta el día dos (2) post inseminación, también parece influenciar positivamente las tasas de clivaje y embarazo (Moessner y Dodson, 1996). Es especialmente notable que Paria y Dey en 1990 sugirieron que el efecto primario fue ejercido entre el desarrollo de 8 células/mórula y estadio de blastocisto. En 1992, Lane y Gardner (1992) demostraron un incremento significativo en la formación de blastocistos incubados en comunas, independientemente del volumen utilizado (5 y 320µl). Adicionalmente, Almagor y colaboradores (1996) encontraron que los embriones cultivados en grupo mostraban tasas de embarazo mayores a las observadas en aquellos que fueron cultivados individualmente. Sin embargo, existen controversias en cuanto a los beneficios del cultivo en grupos. Rijnders y colaboradores (1999), realizaron un estudio prospectivo randomizado, en humanos, donde no evidenciaron influencia significativa del cultivo en grupos ni del volumen del medio de cultivo desde el día 3 hasta el estadio de blastocistos, sobre las tasas de formación de blastocistos ni sobre las tasas totales de embarazo.

26

FACTORES DE CRECIMIENTO Como se comentó anteriormente, se ha determinado a través de diversas investigaciones, la existencia de comunicación bidireccional entre el embrión y el endometrio materno, la cual es ejercida a través de ciertos factores de crecimiento que inciden en el proceso de implantación (Ryan et. al, 1990). Por una parte, la síntesis de algunos factores secretados por el embrión que actúan a nivel del endometrio (Galan et. al, 2000), interviniendo directamente en el proceso de adhesión e invasión endometrial y por otra, la expresión de factores de crecimiento por el tracto reproductor materno (Harvey et. al, 1995) y la existencia de receptores a nivel del embrión, sugieren una comunicación paracrina (Stewart et. al, 1992; Threadgill et. al, 1995). Es importante recordar que el desarrollo embrionario in vitro, está retrasado en comparación al desarrollo in vivo (Harlow y Quinn 1982). Más aún, los niveles de apoptosis son tres veces mayores in vitro que in vivo (Brison y Shultz 1997). Esto sugiere que el tracto materno produce factores importantes para el desarrollo embrionario (Kane et al. 1997). Estos factores de origen materno probablemente sean los candidatos más importantes para mejorar el desarrollo embrionario in vitro, sin embargo, es importante evaluar la seguridad de su uso en forma exógena antes de su aplicación clínica, por lo que algunos autores se han enfocado en el estudio de aquellos factores producidos por embrión en fase de preimplantación.

27 1. Factores de Crecimiento de origen Embrionario Haciendo referencia a los procedimientos de cultivo donde se aumenta la densidad embrionaria y se reduce el volumen de medio en donde se cultivan los embriones -como ya se dijo- se ha observado una mejoría en su desarrollo y una disminución en los niveles de apoptosis (Paria y Dey 1990; Lane y Gardner 1992; O´Neill 1998), indicando que los embriones per se, producen ciertos factores de crecimiento y que existen vías autocrinas y paracrinas operando in vivo, las cuales no están presentes o se encuentran diluidas en condiciones in vitro. El rol de los factores de crecimiento en el desarrollo embrionario se ha sustentado en una serie de estudios en ratones y otras especies, donde se demuestra que una gama de ligandos polipeptídicos de factores de crecimiento son producidos por los embriones en estadio de preimplantación, y muchos de sus receptores han sido detectados en la superficie embrionaria. Estos incluyen miembros de la familia del Factor de Crecimiento Insulino Similar (IGF), la familia del Factor de Crecimiento Fibroblástico (FGF), la familia del Factor de Crecimiento derivado de las Plaquetas (PDGF) y la familia del Factor de Necrosis Tumoral (TNF) (Kane et al. 1997). La expresión de algunos factores de crecimiento y sus receptores, muestran un interesante cambio tanto temporal como espacial, durante el desarrollo preimplantación: Así, estudios de inmunohistoquímica han demostrado que TGF-β2 se expresa después de la activación del genoma embrionario y sólo se localiza en el trofoectodermo (TE) durante el estadio de blastocisto, sin expresión en la masa celular interna (MCI) (Slager et al. 1991) y el mRNA para el receptor de insulina e IGF-I sólo se expresa después del estadio de 8 células, entre otros ejemplos. Otro punto importante a tratar, es el concerniente a la presencia de vías autocrinas y paracrinas que actúan directamente sobre el desarrollo embrionario. Así, una vía paracrina descrita es la de la insulina, cuyo receptor se encuentra localizado en la superficie apical del trofoectodermo y sobre las células de la masa celular interna (Heyner, 1989); el embrión por si

28 mismo, no es capaz de producir insulina, pero responde a la hormona, apuntando a la presencia de una vía paracrina en donde la insulina materna induce respuestas metabólicas y mitogénicas en el embrión. Un ejemplo de vía autocrina es provisto por el TGF-α en ratones. Este factor es producido por la MCI y su receptor, el receptor para Factor de Crecimiento Epidermal (EGFR) está presente predominantemente en la superficie basolateral de la células del TE. La MCI puede responder a TGF-α, lo que sugiere un “loop” o asa autocrina en el blastocisto (Dardik et al. 1992).

2. Efectos de los Factores de Crecimiento sobre el Embrión Un número importante de factores de crecimiento y citocinas han demostrado promover la formación de blastocistos e incrementar la tasa de desarrollo en diferentes especies mamíferas (Hardy y Spanos, 2002). Factores como el EGF y EL TGF-α tienen efectos beneficiosos sobre el desarrollo embrionario, aún en condiciones subóptimas como es el caso del cultivo individual en grandes volúmenes de medio de cultivo (Paria y Dey, 1990). La insulina, el IGF-I y el IGF-II, específicamente actúan sobre las células de la MCI, aumentando su número (Harvey y Kaye, 1990, 1992a, 1992b) y el CSF-1 incrementa el número celular del TE (Bhatnagar et. al, 1995). También se han reportado efectos sobre la síntesis proteica (Dardik et. Al, 1992), transporte de glucosa (Robertson et. al, 2001), metabolismo (Ryan et al, 1990) y apoptosis (O´Neill, 1998). La suplementación de medios de cultivo con TGF-α, Factor activador de Plaquetas (PAF) o IGF-I disminuye la apoptosis en blastocistos murinos, indicando que éstos podrían actuar como factores de supervivencia durante el desarrollo preimplantación (Brison y Shultz,

29 1997). Por el contrario, algunos factores como el TNF-α, pueden inducir apoptosis en la MCI de los blastocistos de ratón (Wuu et al 1999). Los factores de crecimiento no son esenciales -por si mismos- para que se lleve a cabo el desarrollo embrionario. Los embriones de ratón y de humanos son relativamente autosuficientes y pueden sobrevivir aislados y crecer hasta el estadio de blastocisto en medios de cultivo tan simples como solución salina suplementada con piruvato y albúmina (Devreker et al. 1998). Más aún, estudios en ratones con un gen knockout para un factor de crecimiento en particular, son capaces de completar su desarrollo e implantación. La única excepción se presenta con el Factor Inhibidor de Leucemia (LIF) y con el receptor para el Factor de Crecimiento Epidermal (EGF-R) donde su ausencia genera fallos de implantación (Stewart et al. 1992; Threadgill et al. 1995). Otros estudios en ratones “Knockout” muestran que la ausencia de un factor de crecimiento específico puede generar efectos sutiles sobre el desarrollo. Por ejemplo, ratones deficientes en Factor Estimulador de Granulocitos-Macrófagos (GM-CSF) desarrollan blastocistos con un número reducido de células (Robertson et al. 2001), mientras que los blastocistos

de ratones deficientes en Factor Transformador de Crecimiento α (TGF-α)

presentan altos niveles de apoptosis, comparados con ratones “wild-type” (Brison y Schultz 1998). Como hemos visto, una variedad de factores de crecimiento inciden en el desarrollo embrionario preimplantación de diversas formas, sin embargo, en esta ocasión nos enfocaremos en dos factores particulares: El Factor Estimulador de Granulocitos-Macrófagos (GM-CSF), el Factor de Células Madre o “Stem Cell Factor” y sus receptores en el embrión de ratón, los cuales han demostrado presentar efectos beneficiosos sobre el desarrollo y sobre el potencial de implantación de los mismos (Hardy y Spanos, 2002).

30 3. Factor Estimulador de Colonias de Granulocitos-Macrófagos

El GM-CSF es una citocina linfo-hematopoyética con efectos in vitro bien estudiados sobre la supervivencia, proliferación y diferenciación de leucocitos mieloides y sus precursores (Metcalf, 1989). La estructura general del GM-CSF (recombinante) es altamente

compacta

y

globular,

con

un

núcleo

predominantemente hidrofóbico. El rasgo estructural principal de rhGM- CSF es un “racimo” de cuatro hélices, la cual representa el 42% de la estructura. Las hélices están dispuestas en un haz antiparalelo “left handed”, con dos conexiones entrelazadas. Fig. 10. Estructura del GM-CSF

(hp.vector.co.jp)

Entre las conexiones se encuentra una lámina-β antiparalela. En este “esquema de cintas”, el N Terminal está representado por la esquina superior derecha (Walter et. al, 1992) (Fig. 10).

La actividad hematopoyética in vivo de GM-CSF ha sido confirmada en modelos murinos (Lang et. al, 1987), con la administración exógena de este factor (Metcalf et. al, 1987).

Experimentos in vivo e in vitro indican que la GM-CSF también modula la función de monocitos-macrófagos, granulocitos y células dendríticas maduras, promoviendo la presentación del antígeno, quimiotaxis, adhesión, fagocitosis e inducción de inmunidad antitumoral (Gasson, 1991).

31 En las células hematopoyéticas, el GM-CSF ejerce sus efectos sobre la superficie de la célula blanco a través de la unión a un complejo receptor de alta afinidad, compuesto de una subunidad α específica para el GMCSF y una subunidad β de traducción de señal, compartida con el receptor de la interleukina (IL)-3 y (IL)-5 (Hayashida et. al, 1990).

Células no linfohematopoyéticas que incluyen células endoteliales, oligodendrocitos, ciertas células tumorales y células trofoblásticas, también pueden expresar receptores y respuesta biológica a esta citocina (Baldwin, 1992).

En el tracto reproductor femenino murino (Robertson, 1992) y humano (Imakawa, 1993), el GM-CSF es sintetizado bajo la regulación del estrógeno producido por las células epiteliales glandulares y luminales del útero (Giacomini, et. al, 1995). En ratones, se libera un pico de este factor posterior al apareamiento (Robertson, 1992), el cual es inducido por factores específicos presentes en el plasma seminal incluyendo el factor de crecimiento transformador TGF-β1 (Robertson et. al, 1996; Tremellen, 1998). Este proceso se acompaña de la infiltración del estroma endometrial, con la activación de leucocitos, incluyendo macrófagos, células dendríticas, neutrófilos y eosinófilos (Mc Master et. al, 1992; Robertson et. al, 1996). Se ha propuesto que esta respuesta inflamatoria modula tanto la remodelación tisular, así como los cambios inmunológicos necesarios en el ambiente donde se implantará el embrión (Robertson et. al, 1994, 1997). También se ha reportado que el GM-CSF es un regulador del crecimiento y desarrollo del producto de la concepción y de los tejidos derivados de éste (Sjöblom et. al, 2005).

Embriones murinos en estadio de preimplantación expresan receptores para este factor y logran un mayor número celular (Robertson et. al, 2001), así como una mayor capacidad para eclosionar y adherirse a la placa de cultivo, cuando son cultivados con medios suplementados con GM-CSF (Sjöblom et. al, 1999). Behr y colaboradores (2005) hallaron que los niveles de apoptosis disminuyeron significativamente en presencia de dosis exógenas de GM-CSF agregadas al medio de cultivo embrionario, a través de la alteración en la expresión

32 de Bcl-2, lo que sugiere que este factor actúa como un regulador en el proceso de muerte celular programada. Los efectos embriotróficos del factor son más pronunciados en humanos (Sjöblom et. al, 1999) y bovinos (de Moraes y Hansen, 1997), especies en las cuales, el desarrollo in vitro es particularmente difícil, pero también se ha descrito en porcinos, donde este factor mejora la viabilidad de los embriones desarrollados en medios de cultivo libres de proteínas (Cui et. al, 2004).

También se le ha implicado en el desarrollo morfológico y funcional de la placenta, promoviendo la diferenciación y actividad secretora de las células del citotrofoblasto in vitro (Armstrong y Chaouat, 1989; Garcia-Lloret et. al, 1994).

Hay evidencia importante del rol que juega la GM-CSF

durante el embarazo:

Experimentos en ratones han demostrado que cuando se administra esta citocina de manera exógena, puede alterar dramáticamente el resultado del embarazo. La administración de dosis únicas de GM-CSF protege contra la resorción fetal inducida por interferón γ y mejora el peso fetal y placentario (Chaouat et. al, 1990). Más aún, la administración de pequeñas cantidades durante el período de preimplantación puede revertir las altas tasas de fallo de implantación y resorción fetal que se presenta en ratones con tumores productores de Factor Estimulador de Colonias-1 (CSF-1) o en ratones inyectados con CSF-1 recombinante (Tartacovsky, 1991).

A pesar de que inicialmente no se había relacionado la deficiencia de GM-CSF con alteraciones a nivel reproductivo, se ha evidenciado que ratones manipulados genéticamente para que generaran deficiencia en GM-CSF, se presenta una disminución moderada en el tamaño de la camada (Seymour et. al, 1997). Por otra parte, Robertson y colaboradores (1999), demostraron que ratones con deficiencia genética de este factor, mostraron un retraso en la formación de blastocistos, con una significativa disminución en el número de blastómeras, a expensas del tamaño de la MCI. Los efectos en ratones “knockout” también incluyeron disminución en el tamaño fetal e incremento tanto en las tasa de resorción fetal durante la gestación tardía, como en la mortalidad durante la vida post-natal temprana.

33

En cuanto al receptor de la GM-CSF, éste está compuesto de dos sub-unidades, las cuales pertenecen a la superfamilia de receptores de citocinas tipificados por el receptor de la hormona de crecimiento (Fig. 12). La cadena α (GM-Rα) confiere una unión de baja afinidad, mientras que la cadena βcomún (Bc) no se une a GM-CSF por si mismo, sino que forma un complejo de alta afinidad cuando se asocia con el complejo ligando-cadena α (Lopez et. al, 1992). No existe referencia acerca de la especificidad en la expresión de este receptor con respecto a los diferentes estadios del desarrollo embrionario preimplantación. En humanos, los embriones en estadio de preimplantación no expresan mRNA para Bc en ningún momento del desarrollo, por lo que la regulación de la apoptosis es mediada sólo por la interacción del ligando GM-CSF con el receptor GM-Rα, independientemente de Bc (Sjöblom et. al, 2002).

4. Factor de Células Madre ó Stem Cell Factor El Factor de Células Madre ó Stem Cell Factor (SCF) es un factor de crecimiento relacionado en estructura al CSF-1 y actúa a través del receptor tirosina kinasa, c-kit. (fig. 9). Durante investigaciones en ratones W, se evidenció que mutaciones en el locus W generaban la aparición de manchas blancas en ratones pigmentados, defectos en el desarrollo de células progenitoras y alteraciones en la hematopoyesis (Silvers, 1979). En 1988 se determinó que este locus codificaba un receptor tirosina kinasa, conocido como c-kit (Chabot et. al, 1988). Luego del descubrimiento del locus W, se identificó una mutación en el locus S1 cuyo fenotipo era prácticamente idéntico al presentado en los ratones W. Esto llevó a los investigadores a elucubrar sobre la posible relación entre las proteínas codificadas en este

34 segundo loci. En 1990, la proteína codificada en el locus S1 fue denominada SCF ligando c-kit (Zsebo et al, 1990). En la médula ósea, SCF y CSF-1 trabajan sinérgicamente para promover la proliferación y diferenciación de las células madre en colonias de macrófagos. Durante el desarrollo embrionario, SCF y su receptor, c-kit (el mecanismo de acción del ligando y el receptor se encuentran descritos en la Fig. 11) son imprescindibles para la proliferación y supervivencia de las células germinales y de su migración a través de la gónada. El mRNA de c-kit se expresa en las células primordiales germinales, mientras que el transcripto de SCF se expresa a lo largo de la ruta migratoria hacia el canal genital (Matsui et. al, 1990). En el ovario postnatal, el complejo ligando-receptor es importante para el buen desarrollo folicular (Yoshida et. al, 1997). Fig. 11. Eventos intracelulares que se desencadenan para que el SCF entre en contacto con el receptor de membrana c-kit

Gewirtz A. (2001)

35 Durante el período periovulatorio, c-kit es expresado en las células de la teca y en el ovocito, mientras que SCF es expresado en las células de la granulosa (Latinen et. al, 1995). Después de la ovulación, se ha demostrado que en el ratón y en el humano, el c-kit (Fig.12) se expresa durante el desarrollo preimplantación. Durante ciertos estadios, los embriones humanos también expresan mRNA para SCF, sugiriendo que este factor podría actuar a través de una ruta autocrina, lo cual contrasta con los hallazgos hechos en murinos, donde no se ha detectado SCF en los embriones en período de preimplantación (Arceci et. al, 1992). El mRNA para SCF se expresa en humanos en el estadio de 2 células, para luego reaparecer en el estadio de 6-8 células, lo cual es consistente con la expresión genómica embrionaria durante este período (Braude et. al, 1988). Transcriptos de SCF también han sido detectados en el oviducto y en el útero (Arceci et al, 1992), lo que sugiere que el embrión podría estar expuesto a dicho factor producido por las células maternas. Por otra parte, estudios realizados por Kauma y colaboradores (1996) demostraron la expresión de SCF en el endometrio humano y la expresión de c-kit en el tejido placentario, durante el embarazo. La expresión del ligando y del receptor en la interfase fetoplacentaria sugiere que SCF juega un importante rol en el desarrollo embrionario post implantación así como en el crecimiento placentario. Investigaciones realizadas por Masahiro Mitsunari y colaboradores en 1999, detectaron mRNA SCF y mRNA c-kit tanto en blastocistos eclosionados como en células endometriales. Por otra parte, demostraron que la adición de SCF exógena a los medios donde cultivaron blastocistos, promovió la expansión del área de superficie del trofoblasto, una vez que el blastocisto eclosionó. Sin embargo, es muy poca o casi nula la información disponible acerca del papel que juega este factor de crecimiento durante el período preimplantacional temprano.

36 Con base en los hallazgos de la influencia que tienen ciertos factores de crecimiento producidos por el embrión sobre su propio desarrollo preimplantacional y tomando en cuenta que estos factores podrían ser secretados hacia el medio de cultivo in vitro, esta investigación pretende demostrar que la técnica de cultivo en grupos de embriones puede ser beneficiosa para la actividad celular del embrión, ya que bajo esta técnica, los factores de crecimiento producidos por éste, podrían concentrarse y actuar de manera más eficaz, probablemente a través de una vía de señalización de tipo paracrina.

Fig.12. Estructura de los Receptores de membrana para GM-CSF y SCF

www.mh-hannover.de

37

OBJETIVOS

Objetivos Generales Determinar si el cultivo de embriones en grupo implica un beneficio en el potencial de desarrollo de embriones de ratón, gracias a la presencia de factores de crecimiento secretados por los embriones hacia el medio de cultivo. Y dilucidar si la adición exógena de los factores de crecimiento en estudio proveen ayuda adicional al adecuado desarrollo embrionario durante el cultivo in vitro.

Objetivos Específicos 1.- Determinar si existen diferencias en la calidad de los embriones de ratón, cuando estos se cultivan en grupo o de manera aislada. 2. - Cuantificar la concentración de GM-CSF y SCF en los medios de cultivo donde se encuentran los embriones aislados o en grupo, a través de la técnica de ELISA. 3. - Evaluar si las concentraciones de estos factores de crecimiento en el medio de cultivo varían en base a la densidad embrionaria utilizada. 4. - Definir si la calidad de los embriones en cultivo se ve modificada por las concentraciones de factores de crecimiento presentes en el medio. 5.- Establecer si la calidad embrionaria se ve influenciada por la adición exógena de GM-CSF y SCF al medio de cultivo embrionario.

38

MATERIALES Y MÉTODOS 1. Población Se utilizaron ratones hembra pre-púberes de la cepa CD1, con un peso que oscilaba entre los 17 y los 20 gr., aportadas por el Bioterio de Instituto Nacional de Higiene.

2. Inducción de la Ovulación Se indujo superovulación en los ratones hembra con la inyección de 5 IU de Pregnant mare’s serum gonadotropin (PMSG) Sigma, seguidas de inyección de 5 UI de Human chorionic gonadotropin (hCG) Sigma, 48 horas después. La noche inmediatamente posterior a la segunda inyección, se colocaron junto con machos de probada fertilidad. El apareamiento se confirmó en ambos grupos, por la presencia del tapón vaginal en las hembras, a la mañana siguiente.

3. Recolección La recolección de embriones se realizó 46-48 horas después de la inyección de hCG, mediante el lavado del oviducto resecado, posterior al sacrificio del animal, luego de lo cual se lavaron en medio con buffer, Gamete (Vitrolife, Sweden). Posteriormente, los embriones fueron colocados al azar en gotas de 20 µl de medio de cultivo IVF (Vitrolife, Sweden) bajo una cubierta de aceite mineral testado en embriones (Sigma).

39 4. Cultivo Embrionario Los embriones se dividieron en dos grupos en el día 1 (día de la recolección): Un grupo fue colocado en forma individual en las gotas de cultivo, mientras que el otro grupo se concentró en grupos de 5 por gota. El modelo experimental se dividió en dos fases: en la primera fase, los embriones se cultivaron hasta el día 5 post recolección, en la misma gota de medio de cultivo original y se valoró el desarrollo embrionario a las 24h, 48h, 72h y 96 h. La segunda fase del experimento, constó de dos etapas: a) En la primera etapa, los embriones fueron lavados en el día 3 de cultivo (48 horas post recuperación) y transferidos a nuevas gotas de medio (para evitar los efectos tóxicos del amonio liberado debido al metabolismo aminoacídico) y se cultivaron durante 48 horas adicionales (día 5) para permitir el desarrollo hasta estadio de blastocisto. Las gotas de cultivo del día 3 y del día 5 fueron almacenadas para

medir

posteriormente los factores de crecimiento GM-CSF y SCF. b) En la segunda etapa, los embriones fueron divididos en dos grupos y se cultivaron en forma aislada en gotas de 20 µl, a las cuales se adicionó GM-CSF (PreproTech EC, México) a una concentración de 50 ng/ml y SCF (PreproTech EC , México) a una concentración de 2ng/ml, respectivamente. Las concentraciones utilizadas fueron tomadas en forma arbitraria, tomando en cuenta lo reportado en la literatura.

5. Condiciones de cultivo Todos los cultivos se realizarán bajo condiciones controladas de CO2 (5,3%), temperatura (37ºC) y humedad (90%).

40 6. Sistema de clasificación morfológica La clasificación embrionaria inicial (día 1: recuperación de embriones) se realizó tomando en cuenta las siguientes características: *Número y simetría de las blastómeras *Fragmentación *Multinucleación Los embriones de ratón fueron evaluados diariamente hasta el día 5 post recolección, evaluándose: *Número y simetría de las blastómeras *Porcentaje de fragmentación. *Compactación *Formación de blastocisto *Expansión blastocélica * Eclosión o “Hatching” *Velocidad de clivaje/retraso en el desarrollo *Arresto embrionario *Muerte celular

41 7. Determinación de GM-CSF en las gotas de medio donde se realizaron los cultivos embrionarios Se determinó la presencia de GM-CSF, en las gotas donde se realizaron los cultivos embrionarios, mediante un ELISA tipo sándwich de la casa PreproTech EC (Catalogo #900K55, México). Para ello se diluyó el anticuerpo monoclonal de captura contra murine GMCSF (anti-mGM-CSF) a una concentración de 2 µg/ml en buffer carbonato 0,1 M, pH. Inmediatamente se adicionaron 100 µl de este anticuerpo a cada pozo de la placa de micro titulación (Nunc Maxisorp Prod # 4420404) y se incubó durante toda la noche a 4ºC. Al día siguiente se lavaron los pozos con 300µl de buffer de lavado (PBS-0.05% Tween 20) y se le agregó 300µl de buffer de bloqueo (1% de BSA en PBS) y se dejo al menos 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente se le realizaron 4 lavados con buffer de lavado y se procedió a remover el exceso de buffer colocando la placa con los pozos hacia abajo en un papel absorbente. La placa así preparada con el anticuerpo de captura fue sellada en una bolsa y conservada en nevera hasta su uso. Se preparó una curva estándar a partir de mGM-CSF de la casa PreproTech EC (México), con los siguientes puntos: 3000, 2000, 1000, 500, 250 y 125 pg/ml. Las muestras de medio de cultivo obtenidas de las gotas donde fueron cultivados los embriones fueron diluidas 1:5 en solución diluyente (PBS-0.05% Tween 20, 1% BSA) previo al ensayo de ELISA. Para la realización del ensayo se adicionaron 100µl de cada uno de los puntos de la curva estándar y de las muestras a cada pozo de la placa sensibilizada previamente (por triplicado). Se incubó por dos horas a temperatura ambiente. Posteriormente se aspiró el contenido de los pozos y se lavó 4 veces con el buffer de lavado. Luego se adicionó 100µl del anticuerpo de detección biotinilado antígeno-afinidad purificado anti mGM-CSF (PreproTech EC) a una concentración de 0,25µg/ml y se incubó 2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente se aspiró en contenido de los pozos y se lavó 4 veces con el buffer de lavado y se adicionó 100µl de avidin peroxidasa (Avidin peroxidase conjugate, Sigma Cat. # A-4419), diluido 1:2000 en diluyente. Se incubó 30 min. a temperatura ambiente. Se aspiraron y lavaron los pozos cuatro veces con 100µl de buffer de lavado y se le agregó 100µl de la solución sustrato a cada pozo (ABTS liquid substrate solution, Sigma Cat. # A-3219). Se incubó a temperatura ambiente

en

42 oscuridad y se monitoreó el desarrollo de color cada 5 min. hasta aproximadamente 30 min. utilizando un lector de ELISA (BioTek Instrument INC, ELx800 UV) a una longitud de onda de 405 nm y una longitud de onda de corrección de 650 nm. Las concentraciones de GM-CSF de las muestras problema fueron calculadas a partir de la ecuación de la recta obtenida de la curva estándar.

8. Determinación de SCF en las gotas de medio donde se realizaron los cultivos embrionarios Se determinó la presencia de SCF, en las gotas donde se realizaron los cultivos embrionarios, mediante un ELISA tipo sándwich de la casa PreproTech EC (Catalogo #900K78, México). Para ello se diluyó el anticuerpo monoclonal de captura contra murine SCF (anti-mSCF) a una concentración de 1µg/ml en buffer carbonato 0,1 M, pH. Inmediatamente se adicionaron 100µl de este anticuerpo a cada pozo de la placa de micro titulación (Nunc Maxisorp Prod # 4420404) y se incubó la placa durante toda la noche a 4ºC. Al día siguiente se lavaron los pozos con 300µl de buffer de lavado (PBS-0.05% Tween 20) y se le agregó 300 µl de buffer de bloqueo (1% de BSA en PBS) y se dejó al menos 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente se le realizaron 4 lavados con buffer de lavado y se procedió a remover el exceso de buffer colocando la placa con los pozos hacia abajo en un papel absorbente. La placa así preparada con el anticuerpo de captura fue sellada en una bolsa y conservada en nevera hasta su uso. Se preparó una curva estándar a partir de mSCF de la casa PreproTech EC (México), con los siguientes puntos: 5000, 4000, 3000, 2000, 1000 y 500 pg/ml. Las muestras de medio de cultivo obtenidas de las gotas donde fueron cultivados los embriones fueron diluidas 1:5 en solución diluyente (PBS-0.05% Tween 20, 1% BSA) previo al ensayo de ELISA. Para la realización del ensayo se adicionaron 100µl de cada una de los puntos de la curva estándar y de las muestras a cada pozo de la placa sensibilizada previamente (por triplicado). Se incubó por dos horas a temperatura ambiente. Posteriormente se aspiró en contenido de los pozos y se lavó 4 veces con el buffer de lavado. Luego se adicionó 100µl del anticuerpo de detección

43 biotinilado antígeno-afinidad purificado anti mSCF (PreproTech EC) a una concentración de 0,50 µg/ml y se incubó 2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente se aspiró en contenido de los pozos y se lavó 4 veces con el buffer de lavado y se adicionó 100µl de avidin peroxidasa (Avidin peroxidase conjugate, Sigma Cat. # A-4419), diluido 1:2000 en diluyente. Se incubó 30 min. a temperatura ambiente. Se aspiraron y lavaron los pozos 10 veces con 100µl de buffer de lavado y se le agregó 100µl de la solución sustrato a cada pozo (ABTS liquid substrate solution, Sigma Cat. # A-3219). Se incubó a temperatura ambiente

en

oscuridad y se monitoreó el desarrollo de color cada 5 min. hasta aproximadamente 30 min. utilizando un lector de ELISA (BioTek Instrument INC, ELx800 UV) a una longitud de onda de 405 nm y una longitud de onda de corrección de 650 nm. Las concentraciones de SCF de las muestras problema fueron calculadas a partir de la ecuación de la recta obtenida de la curva estándar.

9. Análisis Estadístico Los resultados fueron evaluados por el test de χ². Valores de p