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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

A61K 47/48 (2006.01) A61K 39/085 (2006.01) A61K 39/385 (2006.01) C07K 14/31 (2006.01)

ESPAÑA

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11 Número de publicación: 2 284 209

51 Int. Cl.:

TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 98935025 .1

86 Fecha de presentación : 02.07.1998

87 Número de publicación de la solicitud: 0998305

87 Fecha de publicación de la solicitud: 10.05.2000

54 Título: Citolisis de células diana por conjugados de superantígenos que inducen la activación de células T.

30 Prioridad: 21.07.1997 US 53211 P

14.11.1997 SE 9704170

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

01.11.2007

73 Titular/es: Active Biotech AB.

Box 724 220 07 Lund, SE

72 Inventor/es: Soegaard, Morten;

Abrahmsen, Lars; Lando, Peter; Forsberg, Göran; Kalland, Terje y Dohlsten, Mikael

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Elzaburu Márquez, Alberto

ES 2 284 209 T3

01.11.2007

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid

ES 2 284 209 T3 DESCRIPCIÓN Citolisis de células diana por conjugados de superantígenos que inducen la activación de células T. 5

Campo de la invención La presente invención se refiere a la inactivación/citolisis de células diana causada por células T activadas por superantígenos funcionales. La citolisis se puede aplicar en la terapéutica y en ensayos in vitro.

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Definiciones

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Superantígenos. De acuerdo con la primera de todas las definiciones (en torno a 1.988-1.993), los superantígenos son proteínas bacterianas o víricas capaces de unirse a antígenos del MHC de clase II sin un procesamiento celular previo y de activar a las células T uniéndose a la región variable de la cadena Vβ (Vβ) del receptor de las células T (TCR). Esta unión da lugar a la activación de una proporción/subgrupo relativamente grande de células T, restringida a la familia Vβ, y a la lisis de células que expresan el MHC de Clase II (citolisis mediada por células y dependiente de superantígenos = SDCC). Normalmente el subgrupo de células T activadas por superantígenos constituye aproximadamente un 1% - 30% de la cantidad total de células T de un individuo.

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Superantígenos muy conocidos conforme a la anterior definición son las enterotoxinas estafilocócicas SE (del inglés, Staphylococcal Enterotoxins) (SEA, SEB, SEC1, SEC2, SED, SEE y SEH). Otros ejemplos son la Toxina 1 de síndrome de choque tóxico [TSST-1 (del inglés “Toxic Shock Syndrome Toxin 1”, también de origen estafilocócico), Toxinas Exfoliantes (EXft), Exotoxinas Pirogénicas estreptocócicas A, B y C (SPE A, B y C), Proteínas del Virus del Tumor Mamario de Ratón (MMTV) (del inglés, “Mouse Mammary Tumor Virus”), proteínas M estreptocócicas, Enterotoxina de Clostridium Perfringens (CPET), superantígenos de la artritis producida por micoplasmas, etc. Para una revisión sobre los superantígenos y sus propiedades, véase Kotzin y col., 1993. Los superantígenos de tipo salvaje y los superantígenos quiméricos se han sometido también a mutaciones para que presenten una unión disminuida o una ausencia de unión al MHC de clase II y/o a los TCRVβ (Kappler y col., documento WO 9314264; Kappler y col., 1993; Blanco y col.; Abrahmsén y col., documento WO9601650; Antonsson y col., documento WO 9736932; Antonsson y col., 1997). Este tipo de superantígenos se convierte en menos tóxico. Cuando carecen por completo de la capacidad de unirse al MHC de clase II o a los TCRVβ, ya no son superantígenos funcionales porque han perdido entonces su capacidad para activar a las células T. Mediante mutación de superantígenos de tipo salvaje estructuralmente similares ha sido posible construir superantígenos quiméricos y funcionalmente activos (superantígenos híbridos) (Lamphaer y col., 1996 y Antonsson y col., documento WO 9736932). Se ha descubierto que la activación y la posterior lisis celular pueden tener lugar de una manera independiente del MHC de clase II cuando el superantígeno de tipo salvaje está conjugado con un resto buscador de células diana, capaz de unirse a una estructura de superficie celular (Dohlsten y col., documento WO9201470). A este nuevo mecanismo efector se le ha llamado citolisis mediada por células y dependiente de superantígenos y anticuerpos (= SADCC) (del inglés, “Superantigen Antibody Dependent Cell-mediated Cytolysis”). Este mecanismo incluye mecanismos análogos para otros restos de direccionamiento que no sean anticuerpos (Abrahmsén y col., documento WO9601650; Antonsson y col., documento WO 9736932). Por consiguiente, el concepto actual de superantígeno abarca cualquier compuesto (preferiblemente de estructura polipeptídica) que sin experimentar procesamiento intracelular es capaz de unirse a una estructura de superficie celular (estructura diana) y a una o más cadenas polimórficas de TCR, en particular a la cadena Vβ, activando con ellos a un subgrupo de células T que expresan esa cadena de TCR específica implicada en la unión. Las células T se convierten entonces en citotóxicas y dirigen su citotoxicidad contra células que portan esa estructura de superficie (estructura diana, células diana). La definición de superantígeno (SAG), según se usa en el contexto de esta invención y siempre que no se especifique lo contrario, abarcará por lo tanto conjugados formados por un resto de direccionamiento y un superantígeno libre según se ha expuesto anteriormente en relación con la SADCC.

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Por el término superantígeno se contemplan, salvo que se especifique lo contrario, solamente superantígenos funcionales. 60

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Un superantígeno (Sag) libre es un superantígeno de tipo salvaje, posiblemente mutado o de alguna otra manera modificado, que no está conjugado con un resto de direccionamiento ni con un inmunomodulador. La capacidad de los superantígenos libres para unirse al MHC de clase II es una propiedad inherente de direccionamiento. Debido a que los superantígenos libres carecen de restos de direccionamiento conjugados con ellos, únicamente ejercerán una SDCC. Un superantígeno conjugado es un conjugado formado por un superantígeno libre y un resto de direccionamiento o un inmunomodulador. Un superantígeno conjugado ejerce o una SDCC o una SADDC, o bien ejerce tanto una SDCC como una SADDC. 2

ES 2 284 209 T3

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Un inmunomodulador (IM) es un compuesto capaz de regular el sistema inmunitario. En el contexto de esta invención, los superantígenos se tratan aparte y no están incluidos cuando se usa el término inmunomodulador. Un inmunomodulador frecuentemente posee una capacidad de direccionamiento inherente, como por ejemplo, hacia su correspondiente receptor linfocitario. Salvo que se especifique lo contrario, un inmunomodulador está en forma no conjugada. Un resto de direccionamiento (T) es un resto que es capaz de unirse a una estructura de superficie celular y/o a una estructura tisular.

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Un conjugado se compone de dos o más restos Sag, IM, T, etc., que están unidos entre sí covalentemente. Por formas solubles de componentes activos se indica formas que son solubles en fluidos corporales tales como suero y plasma.

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Técnica anterior Uso terapéutico de los superantígenos

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Se ha recomendado el uso de superantígenos no conjugados, de tipo salvaje y mutados, en terapias con efectos curativos que presumiblemente se llevan a cabo a través de una activación del sistema inmunitario, ya sea localmente en células que expresan la Clase II y que están vinculadas con la enfermedad que ha de ser tratada, o ya sea en forma de una activación sistémica (Kalland y col., documento WO9104053; Terman y col., documentos WO9110680 y WO9324136; Antonsson y col., documento WO 9736932; y Newell y col. 1991). Debido a la extrema toxicidad de los superantígenos de tipo salvaje, esta estrategia, en relación con el tratamiento del cáncer, sería aplicable solamente a una fracción muy minoritaria de todos los cánceres. Se ha recomendado también el uso de superantígenos conjugados con restos buscadores de células diana (Dohlsten y col., documento WO9201470; Abrahmsén y col., documento WO9601650, Antonsson y col., documento WO 9736932 y Ochi y col., 1993).

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En relación con estudios sobre prevención de la disminución inducida por superantígenos, de la actividad citotóxica mediada por células T y producida por la IL-2 in vivo, se ha especulado que debería ser beneficioso coadministrar IL2 con superantígenos de tipo salvaje no conjugados y con superantígenos de tipo salvaje conjugados con anticuerpos (Belfrage, Thesis agosto/septiembre de 1996; Belfrage y col., 1994; Belfrage y col., 1995; Belfrage y col., 1997a; Belfrage y col., 1997b (superantígenos de tipo salvaje)). Se ha sugerido también que el CD80 anclado en membranas celulares desempeña una función en la activación de las células T producida por superantígenos, en ausencia de antígenos del MHC de clase II (Lando y col., 1993 y 1996).

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La figura 4 de la publicación de Lando y col., 1996, muestra un experimento en el que se analiza la capacidad de un superantígeno conjugado con un anticuerpo solo o en combinación con IL-2, para inducir la proliferación de células T humanas en reposo. En este experimento de 4 días, el superantígeno conjugado se presentó sobre células CHO de la línea original y sobre células CHO transfectadas para que expresasen la Clase II o C215, o para que expresen la Clase II más C215. El efecto de la IL-2 fue insignificante.

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Kappler y col. (documento WO9314634) han recomendado el uso de la SEB de tipo salvaje y no conjugada, mutada de manera que ha perdido su capacidad de unión a Vβ o al MHC de Clase II (en el contexto de las vacunas y como agente encargado de neutralizar los efectos tóxicos de los superantígenos). Abrahmsén y col., (documento WO9601650) han recomendado una terapia contra el cáncer con superantígenos conjugados que poseen una capacidad modificada, preferiblemente disminuida, para unirse a antígenos de la Clase II. Antonsson y col., (documento WO 9736932) ha recomendado una terapia con superantígenos quiméricos y con superantígenos que poseen una serorreactividad disminuida (véase también Abrahmsén y col.). Mutaciones como las descritas por Abrahmsén y col. (documento WO9601650) y Antonsson y col. (documento WO 9736932) implicarán que los superantígenos poseerán una menor toxicidad sistémica, una menor inmunogenicidad y/o una menor serorreactividad en el mamífero que ha de ser tratado. Se ha recomendado una terapia con administración de ácidos nucleicos que codifican superantígenos de tipo salvaje (Terman y col., documento WO9110680; documento WO9324136) y Dow y col., documento WO9636366). Dow y col. van aún más lejos y recomiendan la coadministración de un ácido nucleico que codifica una citoquina o una quimioquina con un ácido nucleico que codifica un superantígeno. Sin facilitar el soporte experimental, el documento WO9636366 también recomienda construcciones en forma de una construcción génica bicistrónica en las que un cistrón contiene el gen que codifica el superantígeno y el otro cistrón contiene el gen que codifica una citoquina o una quimioquina. Sin facilitar el soporte experimental, Pouletty P. (Sangstat, documento EP510949) ha especulado que conjugados formados por restos de direccionamiento, tales como IL-2, y superantígenos de tipo salvaje, podrían ser útiles para inactivar células que expresan el receptor para IL-2. 3

ES 2 284 209 T3 Técnica anterior Uso terapéutico de inmunomoduladores en combinación con anticuerpos específicos de células que han de ser inactivadas 5

En publicaciones previas se ha recomendado conjugar anticuerpos con modificadores de respuestas biológicas, por ejemplo, una quimioquina o una citoquina, tal como la interleuquina 2 (Fell y col., documento EP 439095; Rosenblum y col., documento EP 396387, Pancook y col., 1996; y Becker y col., 1996). 10

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Problema que la presente invención se propone resolver La presente invención se propone proporcionar mejoras en relación con una terapia con superantígenos que implica la activación del sistema inmunitario con el fin de inactivar células diana no deseadas en un mamífero que ha de ser tratado. En particular las mejoras se refieren a: 1) prolongar el período de activación localmente, por ejemplo en un tumor, durante en un primer ciclo de tratamiento; 2) contrarrestar la aparición de una hiporrespuesta debida a la tendencia de las células T activadas a escapar hacia el estado de anergia; 3) facilitar la activación de las células T, independiente del MHC de clase II, en la zona del tumor; y 4) ampliar el intervalo terapéutico en relación con la citolisis a través de una activación con superantígenos. En la actualidad se ha descubierto que estas mejoras se pueden llevar a cabo en su totalidad o parcialmente con la condición de que la administración del superantígeno (SAG) se combine con la administración de un inmunomodulador en forma soluble, estando al menos uno de entre el superantígeno y el inmunomodulador en forma de conjugado con un resto que posee propiedades de direccionamiento hacia la célula que ha de ser inactivada. Primer aspecto principal de la invención

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Método para inactivar células diana

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El primer aspecto de la invención cubre tanto la terapéutica como los ensayos in vitro y es un método para inactivar células diana no deseadas en presencia de células T, poniendo en contacto estos dos tipos de células con un superantígeno (SAG), en particular con un superantígeno que activa las células T a través de su unión a TCRVβ, en presencia de un inmunomodulador (IM) que no es un superantígeno (Sag). En su aspecto más amplio, el método se caracteriza porque al menos uno de entre el superantígeno y el inmunomodulador está en forma de conjugado con un resto (T) que posee propiedades de direccionamiento hacia la célula que ha de ser inactivada. El primer aspecto principal de la invención cubre nuevos conjugados que contienen superantígeno y que tienen la fórmula: a) de un triple conjugado (T) (Sag) (IM);

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b) de un doble conjugado (T) (Sag) en combinación con otro doble conjugado (T’) (IM), en los que T y T’ son iguales o diferentes; o c) un doble conjugado (T) (Sag) en combinación con (IM), en el que T es un resto de direccionamiento, Sag es un superantígeno, IM es un inmunomodulador que no es un superantígeno.

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El superantígeno y el inmunomodulador pueden estar dirigidos hacia el mismo tipo de células, por ejemplo, hacia estructuras/epítopos idénticos o que presentan reacciones cruzadas, o hacia un tipo diferente de células dentro del mismo tejido. El direccionamiento se puede realizar hacia células normales o hacia células enfermas asociadas a ese mismo tejido. El superantígeno o el inmunomodulador, o tanto el superantígeno como el inmunomodulador, pueden ser dirigidos con uno o con varios anticuerpos.

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T es un resto de direccionamiento, Sag corresponde a un superantígeno libre e IM es un inmunomodulador que no es un superantígeno. T, Sag e IM están unidos entre sí a través de fragmentos enlazadores B que pueden ser iguales o diferentes dentro de la misma molécula o materia del conjugado. Los conjugados abarcan conjugados químicos así como también conjugados producidos mediante técnicas recombinantes (proteínas de fusión). A. El inmunomodulador IM IM significa un inmunomodulador que no es un superantígeno ni libre ni conjugado.

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El inmunomodulador puede ser una citoquina o una quimioquina. Son citoquinas ilustrativas el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) (del inglés, “Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor”), factor α o β de necrosis tumoral (TNFα o TNFβ), factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF) (del inglés, “Macrophage Colony Stimulating Factor”), factor estimulador de granulocitos (G-CSF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 e IGF. Son quimioquinas ilustrativas C5a, IL-8, la proteína 1 alfa quimiotáctica de monocitos (MIP1alpha) o la proteína 1β quimiotáctica de monocitos (MIP1β), la proteína 1 quimioatrayente de monocitos (MCP-1) (del inglés, “Monocyte Chemoattractant Protein 1”), la proteína 2 quimioatrayente de monocitos (MCP-2), la proteína 3 quimioatrayente de monocitos (MCP-3), factor activador de plaquetas (PAFR), N-formil-metionil-leucil4

ES 2 284 209 T3 fenilalanina (FMLPR) (del inglés, “N-Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine”), leucotrieno B4 (LTB4 R), péptido liberador de gastrina (GRP) (del inglés, “Gastrin Releasing Peptide”), RANTES, eotaxina, linfotactina, IP10, I-309, ENA78, GCP-2, NAP-2, MGSA/gro, DC-CK1, Flt3L (dominio ectópico), fractalquina, PF-4, etc. 5

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Otro tipo de inmunomoduladores son los derivados de pares de receptor/ligando anclados a membranas celulares, implicados en la modulación de una inmunorrespuesta desencadenada, tal como una coestimulación (por ejemplo, receptores unidos a la superficie de linfocitos y sus correspondientes ligando unidos a células). Ejemplos ilustrativos son los miembros seleccionados entre los pares CD40L/CD40, 4-BB1/4-BB1L, CD28/B7, CTLA-4/B7, etc. B7 incluye variantes tales como CD80 y CD86 con preferencia para la primera de ellas. Las formas preferidas son solubles, contienen la parte extracelular (dominio ectópico) y están desprovistas de la parte intracelular y de la parte anclada a membrana. Los inmunomoduladores particularmente preferidos son capaces de potenciar los efectos de los superantígenos in vivo, por ejemplo, contrarrestando el escape de las células T activadas por superantígeno hacia el estado de anergia. Pares de receptores/ligandos apropiados típicos, unidos a células, son CD28/B27 incluyendo sus análogos y fragmentos según se ha definido en lo que antecede. Las citoquinas típicas de este grupo son IL-2, por ser el principal efector aguas abajo de la señalización de CD28/B7, y las citoquinas IL-7 e IL-15, similares a IL-2. Entre los pares de receptor asociado a la superficie de células T/ligando, se prefiere que el miembro no unido a la célula T que ha de ser activada esté incorporado en un conjugado según la invención. En el caso de CD40L/CD40, 4-BB1/4-BB1L y CD28/B7 esto significa las formas solubles de CD40, 4-BB1L y B7, con preferencias según se ha definido en lo que antecede. La parte experimental de este texto ilustra las variantes de inmunomoduladores que en la fecha de prioridad se encontraron óptimas en esta invención. Los inmunomoduladores preferiblemente deben ser originarios de la misma especie que el individuo que va a ser tratado. Los inmunomoduladores naturales, tales como citoquinas y quimioquinas, a menudo muestran una elevada toxicidad sistémica y una semivida relativamente corta en mamíferos. Existe una extensa literatura científica sobre cómo modificar los inmunomoduladores para aumentar su estabilidad en relación con la oxidación, alargar su semivida in vivo, disminuir su toxicidad, mejorar su plegamiento cuando se producen mediante técnicas recombinantes, etc. Por ejemplo, el documento US 5.229.109 (Grimm y col.) describe análogos de IL-2 de baja toxicidad que poseen una afinidad disminuida por el receptor para IL-2 (IL-2R) de alta afinidad, por ser deficientes en la unión a la subunidad p55 α del receptor. Los análogos se preparan principalmente mutando el codón correspondiente a un aminoácido situado en las posiciones 33 - 46 de IL-2 (por ejemplo, Arg38Ala y Phe42Lys o Phe42Ala). El mutante Asp20Lys posee una afinidad disminuida 100 - 500 veces por p75/cadena β del receptor de IL-2 sin que se afecte su unión a p55 (Collins y col., 1988). Otras mutaciones, p. ej., Asp20Ser son menos graves (Berndt y col., 1994). Estudios realizados sobre la IL-2 murina indican que el Asp84 y el Asp88 de la IL-2 humana están también implicados en la unión a p75 (Zurawski y col., 1993). Esto está apoyado por los modelos de la unión entre la IL2 humana y su receptor (Bamborough y col., 1994). La disminución en afinidad esperada de estas mutaciones es Asp20>Asp88>Asp84. Al combinar las mutaciones en Arg38 y Phe42 con mutaciones en las posiciones 88 y 20 se obtendría como resultado una afinidad todavía más baja por IL-2R. Otra potente mutación de IL-2, y en la fecha de prioridad preferida, es Thr51Pro que da lugar a un análogo de IL-2 que tiene una menor velocidad de internalización celular y una duración prolongada de su efecto inmunomodulador (Chang y col., 1996). La numeración de las posiciones de los aminoácidos se ha hecho conforme a Taniguchi y col., 1983. Las publicaciones de Grimm y col.; Collins y col., 1988; Berndt y col., 1994; Zurawski y col., 1993; Bamborough y col., 1994; Chang y col., 1996; y Taniguchi y col. 1983 se incorporan a modo de referencia.

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El uso de análogos de citoquinas y quimioquinas que poseen una menor afinidad por sus receptores normales en conjugados como los anteriormente descritos, reforzará su direccionamiento hacia la célula diana preseleccionada. Es concebible que las citoquinas y quimioquinas mutadas muestren una menor velocidad de internalización celular tras unirse a su respectivo receptor celular e, incorporadas en un conjugado según la fórmula 1, producirán una actividad prolongada del superantígeno comparada con la de los correspondientes conjugados que contienen la forma natural del inmunomodulador. El término inmunomodulador (IM) abarca por lo tanto cualquier forma modificada, por ejemplo cualquier forma mutada, que es capaz de agonizar o antagonizar los efectos de la correspondiente forma natural del inmunomodulador.

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B. Parte correspondiente al superantígeno Sag Sag representa un superantígeno según se ha definido anteriormente para los superantígenos libres y en el epígrafe “Técnica anterior-...”, es decir, superantígenos de tipo salvaje posiblemente modificados, por ejemplo, mediante mutación,

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a. para que posean una menor capacidad de unión a un antígeno del MHC de clase II en comparación con el correspondiente superantígeno de tipo salvaje (véase por ejemplo Abrahmsén y col., (documento WO9601650)); 5

ES 2 284 209 T3 b. para que posean una menor serorreactividad en sueros humanos en comparación con el correspondiente superantígeno de tipo salvaje (véase por ejemplo Abrahmsén y col., (documento WO9601650) y Antonsson y col., documento WO 9736932 y Antonsson y col., 1997); 5

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c. para que posean una menor inmunogenicidad en seres humanos en comparación con el correspondiente superantígeno de tipo salvaje (véase por ejemplo Antonsson y col., documento WO 9736932 y Antonsson y col., 1997); d. para que sean una quimera formada por dos o más superantígenos análogos de tipo salvaje, en la que una región de un primer superantígeno de tipo salvaje ha sido sustituida por la correspondiente región de un segundo superantígeno análogo. La región en cuestión puede ser una región determinante de la unión a TCRVβ, ej., según se ha definido para las quimeras SEE/SEA y SEA/SEE) véase por ejemplo Antonsson y col., documento WO 9736932; Antonsson y col., 1997; y Lamphaer y col., 1996). También están incluidas otras modificaciones/mutaciones que se puedan considerar apropiadas, por ejemplo, para evitar una glicosilación no deseada cuando esas modificaciones/mutaciones se producen en células eucariotas. Mutaciones representativas para los superantígenos similares a SEA/SEE en la fecha de prioridad fueron (numeración según la usada por Antonsson y col., 1997 y Antonsson y col., documento WO 9736932):

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a. menor capacidad de unión al MHC de clase II: Asp227Ala (= SEAm9), Phe47Ala y/o Asp70Arg. El mutante Phe47Ala/Asp227Ala = SEAm23. b. y d. quimeras formadas por SEA y SEE, que tienen como objetivo disminuir la serorreactividad en seres humanos, y al mismo tiempo conservar la capacidad de SADCC del correspondiente superantígeno conjugado: SEE contiene las siguientes sustituciones: Gly20Arg, Thr21Asn, Gly24Ser, Lys27Arg. Los mutantes usados en la parte experimental son SEA(Asp227Ala) = SEAm9, SEA(Phe47Ala/Asp227Ala) = SEAm23 y SEA(Phe47Ala/Asn102Q/Asn149Asp/Thr218Val/Asp227Ala) = SEAm57.

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En la presentación de prioridad los super-antígenos preferidos se seleccionaron entre: 1. superantígenos (Sag) que exhiben dos sitios de unión al MHC de clase II (por ejemplo, las enterotoxinas A y E estafilocócicas),

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2. superantígenos (Sag) que en sus formas no mutadas requirieron el ion Zn para su unión óptima al MHC de clase II (por ejemplo, SEA, SEE y SEH), 3. enterotoxinas estafilocócicas.

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Una molécula de Sag que se ha de incorporar a un conjugado según la invención, no es necesario que sea un superantígeno funcional, siendo la cuestión principal que el conjugado final sí lo sea, ejerciendo una SADCC o una SDCC, o ejerciendo tanto una SADCC como una SDCC según se han descrito en lo que antecede. C. El resto de direccionamiento T

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T puede en principio ser cualquier estructura capaz de unirse a una estructura de superficie celular, preferiblemente a una estructura específica de una enfermedad. La estructura contra la que T está dirigido usualmente difiere de: (a) el epítopo de la cadena polimórfica del TCR al que el Sag se une, y (b) los epítopos del MHC de clase II a los que el Sag se une. El resto buscador de células diana se puede seleccionar entre interleuquinas (p. ej., interleuquina 2), hormonas, anticuerpos incluyendo fragmentos de anticuerpos que se unen antígenos, factores de crecimiento, etc. Véase por ejemplo Woodworth 1993 (incorporado aquí como referencia). El resto del direccionamiento puede ser por lo tanto una proteína que contienen 1, 2, 3 ó 4 cadenas polipeptídicas.

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En la fecha de prioridad, se prefirió que T fuera un anticuerpo (un anticuerpo de longitud completa, Fab, F(ab)2 , Fv, ScFv (anticuerpo monocatenario) (del inglés, “Single chain Fv”), múltiples anticuerpos monocatenarios (ScFv)n y cualquier otro fragmento de anticuerpo que se una a antígenos), incluyendo cualquier forma truncada y funcionalmente activa de las formas de anticuerpos anteriormente mencionadas. Otras variantes son monoespecíficas y biespecíficas. El anticuerpo en principio puede estar dirigido hacia cualquier estructura de superficie celular asociada/específica de una enfermedad, por ejemplo, estructuras ligadas a cualquiera de las formas de cáncer anteriormente mencionadas, con particular énfasis en los fragmentos activos de anticuerpos (tales como Fab). Típicamente el anticuerpo puede estar dirigido hacia un epítopo específico de colon y/o páncreas, por ejemplo, el denominado epítopo C242 (Lindholm y col., documento WO9301303), hacia un epítopo específico de cáncer de pulmón, por ejemplo, el epítopo para el anticuerpo 5T4 (Stern col., documento WO8907947), hacia un epítopo específico de linfomas, por ejemplo, sobre CD19, hacia un epítopo específico de melanoma, por ejemplo, HMW-MAA, etc. El término “anticuerpo” comprende variantes monoclonales así como también variantes policlonales, con preferencia para las preparaciones monoclonales. 6

ES 2 284 209 T3 En caso de que el resto diana sea un fragmento Fab, los residuos de cisteína que normalmente unen entre sí las cadenas pesadas y ligera de Fab, preferiblemente han sido sustituidos por un aminoácido que no permite la formación de enlaces disulfuro, por ejemplo, serina. Véase también Antonsson y col., documento WO 9736932. 5

Lo anteriormente dicho incluye también que T puede estar dirigido hacia estructuras únicas dispuestas sobre células más o menos sanas, que regulan o controlan el desarrollo de una enfermedad. D. El fragmento enlazador B

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El fragmento enlazador B se puede seleccionar de la manera descrita en trabajos previos (Dohlsten y col., documento WO9201470; Abrahmsén y col., documento WO9601650; y Antonsson y col., documento WO 9736932), es decir, B será preferiblemente hidrófilo y exhibirá una o más estructura(s) seleccionadas entre amida, tioéter, disulfuro, etc. Los fragmentos enlazadores más destacados son los obtenidos mediante técnicas recombinantes, es decir, la conjugación tiene lugar a un nivel genómico, obteniéndose como resultado fragmentos en enlazadores oligopeptídicos. Los fragmentos enlazadores oligopeptídicos típicamente contienen 1 - 30, tal como 1 - 20, residuos de aminoácido que preferiblemente se seleccionan de manera que el fragmento enlazador en su totalidad es hidrófilo. Los residuos del fragmento enlazador por lo tanto se seleccionan preferiblemente entre residuos de aminoácidos hidrófilos, tales como Gln, Ser, Gly, Glu, Pro, His y Arg. Fragmentos enlazadores oligopeptídicos típicos comprenden el tripéptido GlyGlyPro o el denominado fragmento enlazador Q (Wootton y col., 1989, incorporado aquí como referencia) posiblemente modificado con gly-pro en el extremo amino terminal. E. Puntos de unión entre T, SAG e IM

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Los conjugados químicos típicamente contendrán una mezcla de moléculas conjugadas que difieren en las posiciones de las uniones. La materia del conjugado contendrá heteroconjugados así como homoconjugados. En el caso de los conjugados recombinantes (proteínas de fusión), la materia del conjugado obtenido será uniforme con respecto a la posición de los enlaces. En cada subunidad individual (T, Sag, IM) la terminación amino está fusionada con la terminación carboxi de otra subunidad, o viceversa, preferiblemente a través de un puente oligopeptídico insertado. Las combinaciones cuando el conjugado contiene una cadena de cada una de las partes T, IM y Sag serán T-IM-Sag, IM-T-Sag, Sag-IM-T, Sag-T-IM, T-Sag-IM, IM-Sag-T (la presencia de la estructura enlazadora de B no se muestra). Cuando una o más de las subunidades contiene dos o más cadenas polipeptídicas, el número de posibilidades aumentan En el caso en el que T sea un fragmento Fab de un anticuerpo, las posibilidades serán (los fragmentos enlazadores oligopeptídicos B no se muestran):

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1. Sag-Fab (cadena ligera)-IM Fab (cadena pesada)

2. Fab (cadena ligera) Sag-Fab (cadena pesada)-IM

3. Sag-Fab (cadena ligera) Fab (cadena pesada)-IM

4. Fab (cadena ligera)-IM Sag-Fab (cadena pesada)

5. Sag-Fab (cadena ligera) IM-Fab (cadena pesada)

6. IM-Fab (cadena ligera) Sag-Fab (cadena pesada)

7. Fab (cadena ligera)-Sag Fab (cadena pesada)-IM

8. Fab (cadena ligera)-IM Fab (cadena pesada)-Sag

En otras variantes, el inmunomodulador y el superantígeno pueden estar fusionados uno al lado del otro por cualquiera de los extremos de cualquiera de las cadenas del anticuerpo. En la fecha de prioridad se prefirieron los conjugados recombinantes, con máxima preferencia por los fragmentos Fab como restos de direccionamiento y por la unión de la terminación amino del superantígeno libre con el primer dominio constante de la cadena pesada (CH l) o de la cadena ligera del anticuerpo, y por la unión del inmunomodulador con la terminación carboxi restante (válido para las fórmulas I-IV). Para una producción y función óptimas la proteína de fusión se expresa mediante técnicas recombinantes en forma de un producto de dos cadenas en el que el superantígeno está fusionado por el extremo C-terminal al dominio CH 1 del fragmento Fab del anticuerpo a través de un fragmento enlazador flexible de aminoácidos hidrófilos de 3-11 residuos. Este fragmento enlazador puede tener la secuencia Gly-Gly-Pro o Pro-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-GlyGly-Pro (SEQ ID NO: 19) o puede tener 4-9 residuos basados en SEQ ID NO: 19, siendo preferido SEQ ID NO: 19. El resto del inmunomodulador está fusionado por el extremo C-terminal a la cadena ligera a través de un fragmento enlazador hidrófilo y con carga neutra o con carga positiva, de 10-20 residuos (fragmento enlazador Q). Preferiblemente, el fragmento enlazador Q puede tener las siguientes secuencias: Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Asn-Glu-Leu-Pro-GlyAla-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg (SEQ ID NO: 23), Gly-Pro-Arg-Gln-Ser-Asn-Glu-Thr-Pro-Gly-Ser-Pro-Ser-Gln-GluGlu-Arg (SEQ ID NO: 20), Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Thr-Thr-Arg (SEQ ID NO: 7

ES 2 284 209 T3 21) o Gly-Pro-Thr-Glu-Ala-Asp-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Glu-Glu-Glu-Thr (SEQ ID NO: 22), siendo los más preferidos los SEQ ID NO: 20 y 21 (para mayor información, véase el Ejemplo 2). 5

Las combinaciones análogas por la terminación amino o la combinación de uniones por las terminaciones amino y carboxi del dominio VH y del dominio VL se pensó en este momento que producían conjugados activos pero menos eficaces. F. Otras entidades

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Superantígenos (Sag) libres: Véase en el epígrafe “Definición”. En los epígrafes “Técnica Anterior-...” y “B. La parte del superantígeno Sag” se proporcionan Sag típicos. Inmunomoduladores no conjugados: Véase en el epígrafe “Definición”. En principio, se pueden usar los mismos inmunomoduladores mencionados en el epígrafe “A. El inmunomodulador IM”. Son preferidas las citoquinas y quimioquinas, con énfasis en la IL-2 y en las citoquinas similares a IL-2. Inmunomoduladores dirigidos (conjugados de T, IM): Estos conjugados satisfacen la fórmula general:

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(T0 )x (IM0 )z

en la que T’ e IM’ están unidos entre sí por un fragmento enlazador orgánico B’. T’, IM’ y B’ se seleccionan entre los mismos grupos de compuestos/estructuras que T, IM y B. Las letras x y z son números enteros que se seleccionan típicamente entre 0-10, tales como 0-5, y representan el número de restos de T e IM, respectivamente, presentes en una molécula de conjugado determinada, con preferencia por uno o dos IM’ por cada T’ y por molécula de conjugado. Los puntos para las uniones entre T’ e IM’ son según se han definido en lo que antecede. Véase también en el epígrafe “E. Puntos para las uniones entre...” en el que las fórmulas 1-8 y los comentarios a ellas son también aplicables a los conjugados de T, IM excepto que Sag se ha omitido. Los conjugados de la fórmula III se pueden preparar conforme a técnicas conocidas, es decir, técnicas convencionales de formación de enlaces químicos o técnicas recombinantes (proteínas de fusión), con preferencia para estas últimas (Fell y col., documento EP 439095; Rosenblum y col., documento EP 396387). De manera particularmente importante, los conjugados formados por T e IM comprenden un resto IM’ que ha sido modificado, por ejemplo, ha sido mutado, para disminuir la afinidad y/o para disminuir la velocidad de internalización según se ha definido en los antecede. Superantígenos dirigidos (conjugados formados por T y Sag): Estos conjugados satisfacen la fórmula general: (T00 )x (Sag00 )y

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Fórmula III

Fórmula IV

en la que T” y Sag” están unidos entre sí por fragmentos enlazadores B” orgánicos. T”, Sag” y B” se seleccionan entre los mismos grupos de compuestos/estructuras que T, IM y B. Las letras x e y son números enteros que se seleccionan típicamente entre 0-10, tales como 0-5, y representan el número de restos de T e IM, respectivamente, presentes en una molécula de conjugado determinada, con preferencia por uno o dos Sag” por cada T” y por molécula de conjugado. Los puntos de unión entre T” y Sag” son según se han definido en lo que antecede. Véase también en el epígrafe “E. Puntos de unión entre...” en el que las fórmulas 1 - 8 y los comentarios a ellas son también aplicables a los conjugados formados por T y Sag excepto que IM está omitido en la fórmula. Los conjugados de la fórmula II se pueden preparar conforme a técnicas conocidas, es decir, técnicas convencionales de formación de enlaces químicos o técnicas recombinantes (proteínas de fusión), con preferencia por las primeras. Véanse por ejemplo Dohlsten y col., documento WO9201470; Abrahmsén y col., documento WO 9601650; Antonsson y col., documento WO 9736932. Enfermedades a tratar con la composición farmacéutica de la invención o con el medicamento fabricado según la invención

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Las enfermedades a tratar son en principio las mismas que las previamente sugeridas en relación con los superantígenos. Véase, por ejemplo, en los anteriores epígrafes “Técnica anterior-...”. Ejemplos ilustrativos son cánceres, enfermedades autoinmunitarias, infestaciones parasitarias, infecciones víricas y otras enfermedades asociadas a células que expresan en sus superficies antígenos del MHC de clase II y/u otras estructuras que son específicas de la enfermedad respectiva y que se unen al resto buscador de células diana incorporado en el superantígeno de acuerdo con el planteamiento teórico de la invención (fórmula I). También se pueden combatir infecciones bacterianas con el uso de esta invención. Formas importantes de cáncer en el contexto de la invención son: melanomas, carcinomas, neoplasias hematopoyéticas y fibrosarcomas, e incluyen formas específicas tales como carcinoma de células escamosas, cánceres de mama, carcinomas de cabeza y cuello, carcinomas de tiroides, carcinomas de tejidos blandos, sarcomas óseos, cáncer testicular, cáncer prostático, cánceres ováricos, cánceres de vejiga, cánceres de piel, cánceres de mama, angiosarcomas, hemangiosarcomas, tumores de células cebadas, cánceres hepáticos primarios, cánceres del pulmón, cánceres de cérvix, carcinomas de células renales, leucemias y linfomas. Están incluidos cualquier todos los tipos de tumores 8

ES 2 284 209 T3 benignos o malignos así como también cánceres resistentes a multitud de fármacos, cánceres metastásicos, formas diversas de cánceres inducidos mediante métodos químicos o por virus (herpes, SV40, HIV, etc.). Preparación de los conjugados anteriormente definidos 5

La preparación de los conjugados se puede llevar a cabo en principio conforme a dos rutas principales: 1. Formación de enlaces químicos entre las subunidades individuales T, Sag e IM. Cada una de las subunidades individuales o cada combinación de las mismas se puede haber producido mediante técnicas recombinantes. 10

2. Técnicas recombinantes que proporcionan directamente un conjugado como los definidos en cualquiera de las fórmulas anteriormente mencionadas. Los métodos factuales son muy conocidos por el experto medio y comprenden una gran cantidad de variantes. 15

La formación de enlaces químicos típicamente utiliza grupos funcionales (por ejemplo, grupos amino primarios, grupos carboxi, grupos mercapto, grupos carbohidrato) que típicamente están presentes de manera natural en varias posiciones de los superantígenos, de los inmunomoduladores proteínicos y de los restos proteínicos de direccionamiento. Estos métodos son muy conocidos en la técnica. 20

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La principal célula hospedadora para una producción recombinante a gran escala de los conjugados de la invención formados por un superantígeno y un inmunomodulador (formas fusionadas así como también formas no conjugadas) es E. coli. Este hospedador proporciona en principio dos rutas: la de producción intracelular y la de secreción. Se prefiere esta última variante ya que ofrece la purificación de las proteínas correctamente plegadas a partir del periplasma y del medio de cultivo. Lo anteriormente dicho no excluye que sea posible producir conjugados activos también en otras células hospedadoras, por ejemplo, en células eucariotas, tales como levaduras o células de mamíferos. Los resultados preliminares hasta ahora han indicado que las células eucariotas, tales como las células de mamíferos, se pueden preferir para incorporar inmunomoduladores que interaccionen con CD28, por ejemplo, B7 y sus análogos.

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Segundo aspecto de la invención Construcciones génicas que codifican los nuevos conjugados de la invención 35

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Un segundo aspecto de la invención lo constituye una molécula de ácido nucleico recombinante, preferiblemente DNA, tal como cDNA o RNA, que codifica un superantígeno y un inmunomodulador según se ha definido en lo que antecede, con preferencia por IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, RANTES, dominio ectópico de CD80, dominio ectópico de CD86, 4-BB1L y Flt3L, y sus análogos según se han definido en lo que antecede. En este aspecto de la invención, el ácido nucleico típicamente debería contener secuencias reguladoras de control, tales como secuencias reguladoras de la traducción, un origen de replicación, secuencias señal de secreción, ya sea para el inmunomodulador o para el superantígeno, o para ambos de ellos, etc., que sean compatibles con la célula hospedadora en la que el inmunomodulador y el superantígeno se han de expresar. La región situada entre las secuencias de las partes que codifican el superantígeno y el inmunomodulador puede comprender una secuencia que codifica sitios de entrada para el ribosoma tal como sucede en construcciones génicas bicistrónicas. Estas últimas permitirán la expresión independiente de cada una de las cadenas polipeptídicas comprendidas en el conjugado. En el caso de combinaciones multicatenarias de los conjugados que contienen un conjugado formado por IM, Sag y el resto de direccionamiento, y las secuencias señal apropiadas, las construcciones bicistrónicas facilitarán el plegamiento y ensamblaje de los conjugados plenamente activos, con el IM unido a una de las cadenas. Esto será importante en los casos en los que el resto de direccionamiento es una molécula de anticuerpo bicatenaria y al menos uno de entre el superantígeno (Sag) y el inmunomodulador está fusionado a un extremo terminal de la cadena del anticuerpo. Véase lo que antecede. Composiciones farmacéuticas, dosificación y vías de administración

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Un tercer aspecto de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica que contiene la combinación de la invención formada por un superantígeno (Sag), un resto de direccionamiento (T) y un inmunomodulador (IM). El rasgo característico de este aspecto de la invención es que al menos uno de entre el superantígeno y el inmunomodulador está en forma de un conjugado que permite el direccionamiento hacia las células que han de ser inactivadas según se ha descrito en lo que antecede.

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Las composiciones contempladas son conocidas en éste campo técnico, a excepción de que ahora contienen la combinación de conjugados de la invención. En una composición particular la combinación puede comprender: 65

a. un conjugado triple que comprende un superantígeno (Sag), un resto de direccionamiento (T) específico para las células diana y un inmunomodulador (IM) (conjugado formado por T, IM y Sag);

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ES 2 284 209 T3 b. dos conjugados dobles, uno formado por un anticuerpo encargado del direccionamiento (T) y un superantígeno, y otro formado por un anticuerpo encargado del direccionamiento (T’) y un inmunomodulador (es decir, un conjugado de T y Sag + un conjugado de T’ e IM). T y T’ pueden ser iguales o diferentes en cuanto a la especificidad de epítopo. 5

c. un conjugado doble formado por un superantígeno (Sag) y un resto de direccionamiento (T), y por un inmunomodulador (IM) en forma libre (conjugado de T y Sag + IM). 10

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Véase más arriba en lo referente a los conjugados de la invención. Cuando las composiciones contienen dos componentes activos (anteriores apartados b-c), la composición pueden permitir guardar los componentes por separado hasta el momento de su administración. Las composiciones pueden estar en forma de un material en partículas y liofilizado, de una disolución esterilizada o producida en condiciones asépticas, de un comprimido, una ampolla, etc. Pueden estar presentes vehículos tales como agua (preferiblemente agua tamponada a un valor de pH fisiológicamente aceptable, por ejemplo, PBS) u otros materiales sólidos o líquidos inertes. En términos generales, las composiciones se preparan con el conjugado, posiblemente en combinación con un componente activo no conjugado, mezclándolas con, disolviéndolas en, uniéndolas a, o combinándolas de alguna otra manera con uno o más vehículos acuosos o no acuosos, solubles o no solubles en agua, junto con aditivos y adyuvantes adecuados en caso necesario. Es imperativo que los vehículos y las condiciones no afecten adversamente la actividad de los componentes activos según se han definido en los anteriores apartados a-c. Normalmente los superantígenos (SAG) que han de ser usados en la invención se comercializarán y administrarán en dosificaciones previamente preparadas, conteniendo cada una de ellas una cantidad efectiva de SAG que, sobre la base de los resultados que aquí se presentan, se piensa que esté en el intervalo de 1 pg - 50 mg. La dosificación exacta variará de un caso a otro dependiendo del peso y la edad del paciente y del título previo de anticuerpos específicos para el SAG usado, de la vía de administración, del tipo de enfermedad, del resto buscador de células diana, del superantígeno, de las uniones (-B-), del inmunomodulador, etc. Un factor importante a tener en cuenta al determinar la dosis de una combinación que se ha de usar en el método de la invención es que los superantígenos y los inmunomoduladores se empleen en intervalos de dosis óptimos. Una dosis demasiado baja dará como resultado la ausencia de efecto o un efecto subóptimo, y una dosis demasiado alta dará lugar a efectos secundarios inaceptables, tales como una toxicidad que puede ser letal. Por ello se ha de hacer hincapié en que el amplio intervalo de dosis anteriormente mencionado es un intento para abarcar todos los intervalos posibles para todas las variantes del método de la invención. Así pues, cada una de las combinaciones específicas según el método de la invención tiene un subintervalo de dosis dentro del intervalo desde 0,1 pg hasta 50 mg. Esto no excluye que progresos y resultados futuros puedan conducir a niveles de dosis fuera de este intervalo. Las vías de administración serán las comúnmente contempladas dentro de este campo técnico, es decir, una cantidad efectiva o terapéuticamente activa para matar células diana, de una combinación de superantígeno-inmunomodulador según la invención, se pone en contacto con las células diana. Para las indicaciones anteriormente especificadas, esto quiere decir en la mayoría de los casos una administración parenteral, tal como una inyección o infusión (por vía subcutánea, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intraperitoneal) a un mamífero, tal como un ser humano. La combinación de conjugados de la invención se puede administrar localmente o por vía sistémica. Con la expresión “cantidad efectiva para matar células diana” se contempla que esa cantidad es efectiva para activar y dirigir las células T para que destruyan las células diana.

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Las vías de administración preferidas en la fecha de prioridad son las mismas que las contempladas para los conjugados con superantígenos según Dohlsten y col., documento WO9201470; Abrahmsén y col., documento WO9601650 y Antonsson y col., documento PCT/97/00537. Esto significa una infusión intravenosa durante 1 - 5 horas (preferiblemente durante 4 horas) cada día, combinada con un agente antipirético (paracetamol). La administración se ha de repetir durante algunos días, por ejemplo, durante 5 - 8 días, teniendo en especial consideración el riesgo de estimular anticuerpos dirigidos contra el conjugado. Óptimamente, se administrarán varios ciclos de terapia, conteniendo cada ciclo el tratamiento durante uno o más días, seguidos de un período de descanso durante uno o más días, p. ej., ciclos de tratamiento y descanso durante 5 días y 2 días respectivamente. Las composiciones de la invención se pueden administrar ya sea como terapia principal o, en las modalidades preferidas, como terapia adyuvante en conexión con una cirugía o con otros fármacos. Parte experimental Leyendas de las figuras

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Figura 1. Análisis de FACS de células CHO-CD28 inmunoteñidas con CD80-C215Fab, CD80-C215Fab-SEAm57 o C215Fab-SEA seguido de incubación con un mAb anti-cadena kappa de ratón, marcado con PE. La inmunotinción se realizó a 4ºC sin lavados. Ordenadas: canal principal. 10

ES 2 284 209 T3 Figura 2. Análisis de FACS de células Colo205 inmunoteñidas con CD80-C215Fab, CD80-C215Fab-SEAm57 o C215Fab-SEA seguido de incubación con un mAb anti-cadena kappa de ratón, marcado con PE. La inmunotinción se realizó a 4ºC con tres lavados entre cada etapa de inmunotinción. Ordenadas: canal principal. Abcisas: Proporción entre células efectoras (E) y células diana (T). 5

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Figura 3. Proliferación. Se incubaron células T con células Colo205 y con C242Fab-SEA 4 µM y con cantidades variables de CD80-C215Fab, durante 4 días, después de los cuales se midieron las cuentas de la 3 H-timidina incorporada. La actividad obtenida en ausencia de CD80-C215Fab fue 20.039 cpm +/- 1.750 cpm. Figura 4. Producción de IL-2. Se incubaron células T con células Colo205 y con C242Fab-SEA 4 µM y con cantidades variables de CD80-C215Fab, durante 4 días, después de los cuales el sobrenadante se recogió y se determinó la cantidad de IL-2. La actividad de IL-2 obtenida en ausencia de CD80-C215Fab fue 2.849 pg/ml. Figura 5. Proliferación. Se incubaron células T con células Colo205 y con cantidades variables de CD80-C215FabSEAm57 o C215Fab-SEAm23 durante 4 días, después de los cuales se midieron las cuentas de la 3 H-timidina incorporada. Figura 6. Producción de IL-2. Se incubaron células T con células Colo205 y con cantidades variables de CD80C215Fab-SEAm57 o C215Fab-SEAm23, durante 4 días, después de los cuales se recogieron los sobrenadantes y se determinó el contenido en IL-2. Figura 7. Capacidad proliferativa de células T de sangre humana, incubadas durante 7 días con las proteínas indicadas y con células CHO transfectadas e irradiadas (para la presentación de SEA). Ordenadas: Incorporación de 3 Htimidina (cpm).

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Figura 8. La administración simultánea de la SEA dirigida y de IL-2 da lugar a un aumento de la activación de las células T in vivo. Citotoxicidad (expresada en forma de porcentaje) contra células Raji, MHC de clase II+ , revestidas con SEA, por parte de esplenocitos de ratones tratados con 1 ó 3 inyecciones de C215FabSEA (FS), C215Fab-Q-hIL2 (FI), con una combinación de los dos (FS + FI) o con C215FabSEA-Q-hIL2 (FSI). La proporción células efectoras:células diana fue 30:1 y la citotoxicidad se midió en un ensayo estándar de liberación de 51 Cr en 4 h. Figura 9. Terapia de tumores B16-C215 en el día 5, en ratones C57Bl/6, con tres inyecciones (en los días 5, 6 y 7 después de la inoculación del tumor) de C215FabSEA (FS), C215Fab-Q-hIL2 (FI), C215FabSEA + C215Fab-Q-hIL2 (FS + FI) o C215Fab-Q-hIL2 (FSI). Se usaron cantidades equimolares de FabSEA y Fab-Q-hIL2. Abcisas: cantidad de proteína inyectada. Ordenadas: disminución del tumor expresada en porcentaje. Figura 10. Aumento de la infiltración de células T CD25+ en el tumor después de un tratamiento con C215FabSEA (FS), C215Fab-Q-IL2 (FI) o C215FabSEA-Q-IL2. Las células CD25+ que se infiltraron en el pulmón de ratones portadores de los tumores de pulmón B16-GA733 establecidos, se estimaron mediante estudio inmunohistoquímico. Ordenadas: porcentaje del área inmunoteñida. Abscisas: 1 = PBS; 2 = primera inyección; 3 = segunda inyección; 4 = tercera inyección; 5 = cuarta inyección. Figura 11. Niveles mantenidos de Interferón γ después de hasta cuatro inyecciones, una vez al día (37 mg/inyección), de C215FabSEA-Q-hIL2 (FSI) (37 mg). La sangre ser recogió cuatro horas después de la última inyección y el contenido en interferón γ (en ordenadas) se determinó mediante medida por ELISA usando como estándar Interferón γ murino recombinante (Pharmingen). Se realizó un experimento similar con cantidades equimolares (30 mg/inyección) de C215FabSEA (FS).

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Figura 12. Citotoxicidad (expresada en forma de porcentaje en ordenadas), contra células Raji, MHC de clase II+ , revestidas con SEA, por parte de esplenocitos de ratones tratados con PBS o con 1, 4 ó 6 inyecciones de C215FabSEAD227A -Q-hIL2 (= FSm9-IL2). La citotoxicidad se midió en un ensayo estándar de liberación de 51 Cr en 4 h. Se usó PBS como control negativo.

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Figura 13. Terapia de tumores B16-C215 en el día 3, en ratones C57 Bl/6 después de un tratamiento con 8 inyecciones de C215FabSEAD227A (= FSm9) o C215FabSEAD227A -Q-hIL2 (= FSm9-IL2). El tratamiento se administró diariamente durante 8 días consecutivos. Los animales fueron sacrificados en el día 21 y se efectuó el recuento de las metástasis pulmonares. Ordenadas: disminución del tumor expresada en porcentaje.

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Figura 14. Terapia de tumores B16-C215 en el día 3, en ratones transgénicos Vb3 TCR después de un tratamiento con 8 inyecciones de C215FabSEAD227A -Q-hIL2F42A (= FSm9-IL2 (F42A)), C215FabSEAD227A -Q-hIL2 (= FSm9-IL2) o C215FabSEAD227A (= FSm9-IL2). El tratamiento se administró diariamente durante 8 días consecutivos. Los animales fueron sacrificados en el día 21 y se efectuó el recuento de las metástasis pulmonares. Ordenadas: disminución del tumor expresada en porcentaje.

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Figura 15. Terapia de tumores B16-C215 en el día 3, en ratones transgénicos Vb3 TCR después de un tratamiento con 8 inyecciones de C215FabSEAD227A -Q-hIL2F42A (F42A), C215FabSEAD227A -Q-hIL2F42E (F42K) o C215Fab SEAD227A -Q-hIL2F42A/D20S (F42A/D20S). El tratamiento se administró diariamente durante 8 días consecutivos. Los ani11

ES 2 284 209 T3 males fueron sacrificados en el día 21 y se efectuó el recuento de las metástasis pulmonares. Ordenadas: disminución del tumor expresada en porcentaje. 5

Ejemplo 1 Actividad biológica de las proteínas de fusión CD80-C215Fab de uso en la coestimulación de una terapia antitumoral con un Fab dirigido a un Sag

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Sumario: Se han construido las proteínas de fusión CD80-C215Fab y CD80-C215Fab-SEAm57 de manera que contienen el dominio extracelular del CD80 humano. Las proteínas de fusión se produjeron en células de mamífero y se ensayaron, con respecto a su unión a CD28 usando transfectantes de células CHO, y con respecto a su unión al antígeno C215 usando células Colo205. Ambas proteínas de fusión se unieron a CD28 y al antígeno C215, siendo esta última unión 100 veces menor en comparación con la de C215Fab-SEA. Debido a que CD80 está unido a la parte N-terminal de la cadena L, es posible el resto de CD80 interfiera con la unión de C215Fab. Ambas proteínas de fusión coestimulan a las células T humanas activadas por SAG, demostrando que el CD80 soluble conserva su función biológica. Materiales y métodos

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Técnicas de DNA recombinante y enzimas: Las preparaciones de DNA plasmídico y el resto de las operaciones se realizaron esencialmente según Sambrook y col., (Sambrook y col., 1989). E. coli HB101 (Boyer y col., 1969) se usó como cepa hospedadora. Las endonucleasas de restricción y el fragmento de Klenow de la DNA-polimerasa I se obtuvieron procedentes de Boehringer Mannheim o de New England Biolabs y se usaron conforme a las recomendaciones de los proveedores. La Taq-polimerasa se obtuvo procedente de Perkin Elmer. Se preparó cDNA a partir de RNA total usando el kit GeneAmp para PCR de RNA (Perkin-Elmer). Los oligonucleótidos se sintetizaron en un sintetizador de DNA/RNA Gene Assembler (Pharmacia Biotech AB) o ABI 392 (Applied Biosystems) y se purificaron mediante cromatografía en fase inversa en un sistema de FPLC (Pharmacia Biotech.). La secuenciación se realizó según el principio de terminación didesoxi de las cadenas (Sanger y col., 1977) usando el kit de secuenciación Taq DyeDeoxy Termination Cycle de Applied Biosystems y los productos se separaron y se detectaron en un secuenciador de DNA ABI 373A (Applied Biosystems). Se seleccionaron las bacterias que albergaban plásmidos diferentes sobre placas que contenían YT 2X y 15 g de agar base por litro, suplementado con kanamicina 70 mg/l, o con ampicilina 100 mg/l. El caldo líquido fue YT 2X (por cada litro: 10 g de extracto de levadura (Difco), 16 g de triptona (Difco) y 5 g de NaCl).

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Construcciones en plásmidos Los genes que codifican un fragmento Fab que contiene los dominios variables del anticuerpo C215 murino se ensamblaron según ha sido descrito previamente (Dohlsten y col., 1994). La clonación y mutagénesis del gen de la enterotoxina A estafilocócica (SEA) que produce las sustituciones F47A y D227A ha sido descrita previamente (Abrahmsén y col., 1995). Otras tres mutaciones se introdujeron en el gen de la SEA usando los cebadores LAKQ8893 (todos los oligonucleótidos están reunidos en la Tabla I) para obtener el mutante 57 de SEA. LAKQ5 y LAKQ7 se usaron en la RT-PCR pata introducir una caja de Kozak en dirección aguas arriba y para clonar el gen que codifica el péptido señal y la parte extracelular de CD80 humano a partir de RNA total de bazo humano. Se encontró que la 13

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secuencia de nucleótidos correspondía a la secuencia de CD80 del banco de genes (Número de registro M27533). Se prepararon dos variantes del gen de CD80 que tienen diferentes sitios de clonación en el extremo 3’: en PCR independientes los cebadores LAKQ30 y LAKQ108 se usaron para obtener un sitio BssHII o un sitio MroI respectivamente. Una fusión génica que codifica un CD80 fusionado delante de la cadena kappa por medio de un fragmento enlazador Q (Wooton y col., 1989), se construyó insertando el DNA enlazador LAKQ37/38 BssHII-Esp3I, entre el gen de CD80 relevante y un sitio DsaI que precede inmediatamente al gen kappa. El plásmido pKGE987 se obtuvo insertando la fusión génica que codifica CD80-(fragmento enlazador Q)-kappa, precedida por el péptido señal de CD80, en un vector que, además de un promotor de CMV y una cola de poli A, contiene un gen de neomicina para ser usado en la selección de los transformantes. Esta última versión del gen de CD80 se usó para construir una fusión génica en la que este gen precede a la fusión génica Fd-mutante 57 de SEA: un fragmento de DNA (LAKQ117/118) que codifica un fragmento enlazador Q se insertó entre un sitio MroI del gen CD80 y un sitio PstI situado en el codón 4 y 5 del gen de C215 VH. Esta fusión génica se insertó en un segundo vector que contiene el promotor de CMV para obtener el plásmido pMB189, que codifica por lo tanto el péptido señal y la porción extracelular de CD80 seguida de Fd y del mutante 57 de SEA, conectados por el espaciador de tres residuos GGP. En el plásmido pKGE961, el gen de Fd se ha insertado detrás de una secuencia señal (derivada de otro gen de VH murino). El plásmido pMB156 codifica la cadena kappa natural, precedida por su péptido señal natural, y contiene el gen de la neomicina. Producción

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Células 293 de riñón embrionario de hámster se transfectaron o con pKGE961 y pKGE987, o con pMB156 y pMB189, para obtener líneas celulares que producen CD80-C215Fab y CD80-C215Fab-SEAm57, respectivamente. Para obtener líneas celulares estables, el medio de selección fue DMEM sin rojo de fenol (Pharmacia Núm. MS 0127) suplementado con L-glutamina (GIBCO BRL, Núm. 25030-24), suero bovino de ternera al 10% y Geneticina 1 mg/ml. El medio de producción fue DMEM sin rojo de fenol, suplementado con L-glutamina y HSA al 0,1% (Pharmacia & Upjohn AB, Suecia). Las proteínas de fusión se purificaron a partir del medio de cultivo filtrado (Sartobran 0,65 µm 0,4 µm) mediante cromatografía de afinidad sobre Sepharose FF con proteína G (Pharmacia Biotech, AB), seguida de una purificación por afinidad a anti-CD80 (anticuerpo anti-CD80 humano inmovilizado; Camfolio L307.4) o mediante cromatografía de intercambio iónico sobre SP Sepharose FF (Pharmacia Biotech.).

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Reactivos. El Medio RPMII 1640 (Gibco, Middlesex, UK) suplementado con L-glutamina 2 mM (Gibco, Middlesex, UK), HEPES 0,01 M (Biological Industries, Israel), NaHCO3 1 mM (Biochrom KG, Berlín, Alemania), sulfato de gentamicina 0,1 mg/ml, (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel), piruvato sódico 1 mM (JRH Biosciences Industries, EE. UU.) y suero bovino fetal, inactivado con calor, al 10% (Gibco Middlesex, UK) se usó como medio completo para todos los cultivos celulares. Anticuerpos. Los mAb dirigidos contra CD57 (HNK1) y contra CD56 (HB55) humanos se obtuvieron a partir de células de hibridoma productoras de mAb (American Type Culture Collection, Rockville, MD.). El mAb anti-cadena kappa de ratón, marcado con PE, se obtuvo procedente de Becton Dickinson (San Jose, CA).

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Células. Células K1 de ovario de hámster chino (CHO) se transfectaron con el cDNA humano que codifica el gen CD28, en Pharmacia and Upjohn, Estocolmo, Suecia. Los transfectantes se analizaron mediante métodos de rutina con respecto a la expresión de CD28 y se mantuvieron mediante la técnica de clasificación celular FACS en niveles de expresión de antígeno similares. La línea celular Colo205 de carcinoma de colon humano se obtuvo procedente de la ATCC. Todas las líneas celulares se encontraban libres de micoplasmas. Ensayo de proliferación de linfocitos T. Las células T se obtuvieron a partir de células mononucleares humanas de sangre periférica (PBM) (del inglés, “human Peripheral Blood Mononuclear cells”) según ha sido descrito previamente (Lando y col., 1996) mediante el método de selección negativa de tapizado (del inglés, “panning”) de una superficie con mAb específicos para CD57, HLA-DR4, CD14 y CD56. Todos los ensayos con células T se realizaron con 0,1 x 106 células/pocillo, en volúmenes de 200 µl, utilizando placas de 96 pocillos de fondo plano (Nunc, Roskilde, Dinamarca). La síntesis de DNA se estudió después de exponer los cultivos a [3 H]-timidina [3 H]TdR (0,5 mCi/pocillo) según ha sido descrito con anterioridad (10).

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Análisis mediante citometría de flujo. La clasificación y análisis mediante citometría de flujo se realizaron conforme a un montaje estándar en un citómetro de flujo FACStarPlus (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Debido a la baja afinidad de CD80 por CD28, la inmunotinción de las células CHO-CD28 con las proteínas de fusión CD80C215Fab se hizo omitiendo los lavados de las células.

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Ensayo de determinación citoquina. La producción de IL-2 se analizó usando un kit de ELISA de determinación de IL-2 (huIL-2 Duoset, Genzyme). Resultados

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Descripción de las proteínas de fusión CD80-Fab. El resto de Fab es un isotipo IgG1/k murino aunque contiene los dominios variables del anticuerpo monoclonal C215, IgG2A/k (Dohlsten y col., 1995). La secuencia del tripéptido GGP va a continuación de la cisteína que forma el enlace disulfuro intercatenario en el dominio CH1. En la proteína de triple fusión CD80-C215Fab-SEAm57, este tripéptido actúa como espaciador entre Fd y un mutante de la 14

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enterotoxina A estafilocócica (SEA; Betley y col., 1988) que contiene cinco sustituciones. Las sustituciones F47A y D227A se introdujeron para disminuir la afinidad por el MHC de clase II (Abrahamsén y col., 1995) y las sustituciones N102Q, N149D y T218V se introdujeron para evitar una glicosilación fortuita cuando las proteínas se producen en células eucariotas. Estas últimas sustituciones se seleccionaron con la ayuda de la estructura obtenida con rayos X (Sundström y col., 1996). Al penta-mutante final se le denominó mutante 57 de SEA. Ambas proteínas de fusión contienen el dominio extracelular del CD80 humano (definido de manera que finaliza en FPDN). Se usó el péptido señal natural de CD80 y se encontró que la proteína madura comenzaba con VIHV, según se determinó mediante secuenciación de aminoácidos de la CD80-C215Fab purificada. Un espaciador de 18 aminoácidos conecta CD80 con la cadena kappa presente en CD80-C215Fab, o con la porción Fd del fragmento Fab en la proteína de triple fusión CD80-C215Fab-SEAm57. Los espaciadores se asemejan a un fragmento enlazador Q (Wooton y col., 1996) y tienen las secuencias SARQANELPGAPSQEERA (SEQ ID NO 15) y SARQANELPGAPSQEERP (SEQ ID NO 16) respectivamente. Análisis de FACS: Unión de proteínas de fusión CD80-C215Fab a células CD28 positivas y a células C215 positivas

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Células CD28 positivas: Células CHO-CD28 se inmunotiñeron con CD80-C215Fab, CD80-C215Fab-SEAm57 o C215Fab-SEA seguido de incubación con un mAb anti-cadena kappa de ratón, marcado con PE. La inmunotinción se realizó a 4ºC sin lavados. 20

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Tanto la proteína de fusión CD80-C215Fab como la proteína de triple fusión se unieron a CD28 expresado sobre células CHO en una manera dependiente de la dosis. No se observó inmunotinción, como era de esperar, con la proteína de fusión C215Fab-SEA de control. Células C215 positivas. La unión de las proteínas de fusión frente al antígeno C215 se evaluó frente a células Colo205. Las células Colo205 se inmunotiñeron con CD80-C215Fab, CD80-C215Fab-SEAm57 o C215Fab-SEA seguido de incubación con un mAb anti-cadena kappa de ratón, marcado con PE. La inmunotinción se realizó a 4ºC con tres lavados entre cada una de las etapas de la inmunotinción. Resultados (figuras 1-2): Tanto CD80-C215Fab como CD80-C215Fab-SEAm57 se unieron a las células Colo205 positivas al antígeno C215 en una manera dependiente de la dosis. Esta unión fue 50 - 100 veces menor que la de C215Fab-SEA. Esto indica que la introducción de CD80 en la parte N-terminal de la proteína de fusión pudiera interferir con la unión de la parte C215Fab al antígeno C215. Fusiones dobles. Coestimulación de células T activadas por superantígeno

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Para determinar la actividad biológica de las proteínas de fusión, éstas se ensayaron con respecto a la coestimulación de células T activadas por superantígeno. 40

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Proliferación: Las células T se incubaron con células Colo205 y con C242Fab-SEA 4 µM y cantidades variables de CD80-C215Fab durante 4 días, pasados los cuales se midió la proliferación en forma de las cuentas de la 3 H-timidina incorporada. La actividad obtenida en ausencia de CD80-C215Fab fue de 20.039 cpm +/- 1.750 cpm. Producción de IL-2: Las células T se incubaron con células Colo205 y con C242Fab-SEA 4 µM y cantidades variables de CD80-C215Fab durante 4 días, pasados los cuales se recogió el sobrenadante y se determinó la cantidad de IL-2. La cantidad de IL-2 obtenida en ausencia de CD80Fab-C215Fab fue de 2.849 pg/ml. Resultados (figuras 3-4): CD80-C215Fab coestimuló la activación de las células T inducida por C242Fab-SEA en una manera dependiente de la dosis, observada tanto en cuanto a la proliferación como en cuanto a la producción de IL-2.

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Fusiones triples. Coestimulación de células T activadas por superantígeno

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Para determinar la actividad biológica de las proteínas de triple fusión, células T purificadas se incubaron con C215Fab-SEAm23 (siendo m23 la misma SEA mutante que afecta a la unión al MHC de clase II, que se usó en la proteína de triple fusión, es decir, Phe47Ala/Asp227Ala) o con CD80-C215Fab-SEAm57 presentada sobre células Colo205. Proliferación: Las cuentas de la 3 H-timidina incorporada se midieron después de 4 días. Producción de IL2: Los sobrenadantes se recogieron y el contenido de IL-2 se determinó después de 4 días. Resultados (figuras 5-6): La proteína de triple fusión indujo activación de células T y producción de IL-2 cuando se presentó sobre células Colo205. No se observó esa actividad con la C215Fab-SEAm23 lo que indica la importancia de la coestimulación producida por CD80 para la activación. Debido a la menor afinidad de unión de la proteína de triple fusión (50-100 veces menor que la de C215Fab-SEA, véanse los datos de FACS), la cantidad real de la C215Fab-SEAm23 unida a las células es probable que sea sustancialmente más alta que la de la proteína de triple fusión.

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ES 2 284 209 T3 Ejemplo 2 La IL-2 dirigida potencia y prolonga los efectos de FabSEA sobre la activación de las células T y en una terapia antitumoral 5

Materiales y métodos

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Construcción de plásmidos de expresión de IL-2. El cDNA de IL-2 se clonó mediante RT-PCR usando un mRNA aislado de células mononucleares de sangre periférica (PBM) humana que habían sido estimuladas con el superantígeno SEA durante 24 horas. El mRNA se aisló a partir de 5 x 106 células usando un kit mRNA Direct procedente de Dynal, Oslo, conforme a las instrucciones del fabricante. El mRNA hibridado sobre bolitas magnéticas revestidas con oligo(dT)26 , se eluyó calentando a 95ºC. Posteriormente, se obtuvo un producto de PCR mediante una RT-PCR, aprovechando las actividades de RT y DNA-polimerasa de la Taq polimerasa. Una fracción 1/10 del mRNA eluido se mezcló con los cebadores IL2-1 e IL2-2 de PCR y se llevó a cabo una reacción de PCR estándar (30 ciclos). El producto resultante de la PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa, la banda se cortó en el gel y se purificó usando el kit Prep-a-gene kit (Bio-Rad). Después de una digestión con EcoRI y BamHI, el fragmento se clonó en pBluescript KS II digerido con EcoRI/BamHI. El inserto se secuenció y se confirmó que era idéntico al cDNA de IL-2 previamente publicado por Taniguchi y col., 1983). Sin embargo, como resultado de la reacción de PCR, un segmento de DNA que codifica Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Asn-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg (SEQ ID NO: 23), “Gly-Pro-fragmento enlazador Q”, se había añadido en 5’ al segmento que codifica la IL-2 humana madura. Q-hIL2 se clonó en un plásmido procedente de una colección de una casa comercial (cortado con RsrII-KbaI) en forma de un fragmento RsrII-NheI. El plásmido resultante, pMS306, dirige la secreción de C215FabSEA-Q-hIL2 hacia el periplasma de E. coli. Los fragmentos enlazadores situados entre los restos se optimizaron más de la siguiente manera. Una región codificadora de un fragmento enlazador, que codifica Pro-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Ala-GlyGly-Gly-Pro (SEQ ID NO: 19) (que sustituye el Gly-Gly-Pro original) se introdujo entre las regiones que codifican el resto del superantígeno y el resto de Fab usando una mutagénesis dirigida a sitio específico. De manera similar, los fragmentos enlazadores Gly-Pro-Arg-Gln-Ser-Asn-Glu-Thr-Prol-Gly-Ser-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg (SEQ ID NO: 20), Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Thr-Thr-Arg (SEQ ID NO: 21) o Gly-ProThr-Glu-Ala-Asp-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Glu-Glu-Glu-Thr (SEQ ID NO: 22) sustituyeron el fragmento enlazador Q original situado entre IL-2 y el resto del Fab. En el caso de las combinaciones de las proteínas de doble fusión, también se compararon las construcciones que llevaban la con IL-2 fusionada a la cadena ligera o a la cadena pesada, respectivamente. Cebadores

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Expresión de las proteínas de fusión en fermentador. Las proteínas de fusión se expresaron en la cepa UL 635 de E. coli K-12 (xyl-7, ara-14, T4R , deltaompT) usando un plásmido que contiene un gen de resistencia a kanamicina y el promotor lacUV5. Bacterias procedentes de la preparación de reserva congelada se incubaron a 25ºC durante aproximadamente 21 h en matraces provistos de agitación que contenían (NH4 )2 SO4 2,5 g/l; KH2 PO4 4,45 g/l; K2 HPO4 11,85 g/l; citrato sódico 0,5 g/l; MgSO4 ·7 H2 O 1 g/l; glucosa monohidrato 11 g/l, kanamicina 0,11 mM y una disolución de elementos traza en concentración de 1 ml/l (Forsberg y col., 1989), aunque sin Na2 MoO4 ·2 H2 O. Las células se hicieron crecer hasta alcanzar una OD600 de 1 - 2 y 450 ml del medio de cultivo se usaron para inocular un fermentador (Chemap, Suiza) hasta un volumen final de 5 litros. El medio de fermentación contenía (NH4 )2 SO4 2,5 g/l; KH2 PO4 9 g/l; K2 HPO4 6 g/l; citrato sódico 0,5 g/l; glucosa monohidrato 22 g/l; MgSO4 ·7 H2 O 1 g/l; kanamicina 0,11 mM; 1 ml de adecanol (Asahi Denka Kogyo K. K., Japón) y una disolución de elementos traza en concentración de 1 ml/l. El pH se mantuvo en 7,0 mediante valoración con amoníaco al 25%, la temperatura fue 25ºC y la aireación con aire atmosférico fue de 5 l/min. La presión parcial de O2 disuelto se controló para que fuera del 30% aumentando la agitación desde 300 rpm hasta 1.000 rpm durante la fase en discontinuo y regulando la alimentación de glucosa al 60% (p/v) durante la fase alimentada en discontinuo. La formación de producto se indujo a una OD600 de 50 añadiendo isopropil-β-D-tiogalactopiranósido, IPTG, 0,1 mM. Después de la fermentación, las células se retiraron mediante centrifugación a 8.000 x g durante 40 min a 4ºC. El medio clarificado o se analizó y purificó directamente o se almacenó a -20ºC. 16

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Purificación de las proteínas de fusión. El DNA presente en el medio clarificado se separó usando una precipitación con polietilenimina al 0,19% y NaCl 0,2 M durante 30 min (Atkinson y Jack, 1973). Después de una centrifugación en las condiciones anteriormente mencionadas, el sobrenadante se recogió y la concentración de NaCl se ajustó a 0,5 M. Este medio se aplicó a una columna de Sepharose-Proteína G (Pharmacia Biotech. AB, Uppsala, Suecia) equilibrada con fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, que contenía Tween 80 al 0,05%, PBST. La columna se lavó luego con un volumen de PBST igual a 5 veces el volumen de la columna y la proteína unida se eluyó con ácido acético 0,1 M, Tween 80 al 0,02%, pH 3,2. El pH de la muestra se ajustó a 5,0 usando Tris-HCl 1 M, pH 8,0, y se aplicó a una columna de SP Sepharose HP (Pharmacia Biotech.) equilibrada con acetato amónico 50 mM, Tween 80 al 0,02%. La columna se lavó luego con un volumen de tampón de equilibrado igual a 2 veces el volumen de la columna y la proteína de fusión se eluyó usando un gradiente lineal de acetato amónico desde 50 mM hasta 500 mM durante el paso de 10 volúmenes de la columna. Para las proteínas de fusión C215Fab-IL2 se utilizó un pH de 6,0, mientras que para las proteínas de triple fusión C215Fab-SEA-IL2 el pH fue 5,7 durante la separación. Las proteínas de fusión se filtraron a través de un filtro de 0,22 µm y se guardaron a -70ºC. En caso de estar más diluido, el eluido se concentra hasta una concentración final de 0,5 mg/ml - 1 mg/ml usando un Centricon 30 (Amicon) conforme a las instrucciones del fabricante. Ensayos de citotoxicidad. Los ensayos de citotoxicidad dependientes e independientes del MHC de clase II se realizaron de la manera previamente descrita (Dohlsten y col., 1990). Brevemente expuesto, en el caso de los ensayos dependientes del MHC de clase II, células Raji marcadas con 51 Cr (2.500 células por pocillo en un volumen final de 200 µl) se mezclaron con una línea de células efectoras dependiente de SEA, generada mediante incubación de células PBM humanas en presencia de niveles bajos de hIL-2 recombinante. La proporción células efectoras:células diana fue 30:1. En el caso de los ensayos independientes del MHC de clase II, células colo205 C215+ , marcadas con 51 Cr (2.500 células), se incubaron con células efectoras dependientes de SEA en una proporción E:T (células efectoras:células diana) 45:1. El 51 Cr liberado en el medio se determinó después de 4 horas de incubación mediante medida de las cuentas por centelleo. Ensayo de coestimulación in vitro en células T humanas purificadas. Células T humanas naturales se purificaron esencialmente de la manera descrita por Lando y col., (1993). Brevemente expuesto, se purificaron células T humanas naturales a partir de células PBM de sangre humana mediante centrifugación en gradiente de Ficoll, seguida de separación a lo largo de columnas de gelatina, y por último de un método de selección negativa mediante tapizado en placas de Petri que contienen los mAb HNK1 y HLA-DR. Los experimentos de proliferación en los que se usan células T humanas naturales se realizaron esencialmente de la manera descrita por Lando y col., (1996). Brevemente expuesto, las células T naturales (100.000 células por pocillo) se mezclaron con células transfectantes CHO irradiadas (10.000 células por pocillo) en un volumen total de 200 µl de RPMI-1640 con suplementos (Lando y col., 1993). En los experimentos con proteínas de fusión que contienen IL-2, las células se incubaron durante 7 días en presencia de una concentración 1 nM de las sustancias indicadas. En el último día del experimento las células recibieron pulsos de 3 H-Timidina para medir su incorporación en el DNA de las células en división. Terapia contra tumores B16-C215. La terapia se realizó esencialmente de la manera previamente descrita (Dohlsten y col., 1994; Hansson y col., 1997). En el día 0, los ratones C57Bl/6 recibieron una inyección i.v. en la vena caudal con 75.000 - 150.000 células B16-F10 singeneicas de melanoma. Estas células B16 expresaban el antígeno GA-733 humano reconocido por el mAb de C215. En el día 1, 3 ó 5 se inició la terapia con proteínas C215Fab. El experimento finalizó en el día 21, momento en el que los pulmones se extirparon y se efectuó el recuento de los tumores pulmonares diseminados.

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Se realizaron estudios inmunohistoquímicos de los pulmones de los animales que portaban tumores B16-C215 en el día 18, esencialmente de la manera previamente descrita (Dohlsten y col., 1995). Las muestras se extrajeron 4 horas después de la última inyección. La zona inmunoteñida se determinó manualmente. 50

Se realizaron estudios inmunofarmacológicos esencialmente de la manera que se encuentra descrita (Rosendahl y col., 1996). Los bazos procedentes de los ratones C57Bl/6 que habían recibido 1 ó 3 inyecciones, una vez al día, se extirparon 48 horas después de la última inyección y se determinó la citotoxicidad dependiente de SEA, usando células Raji como células diana en un ensayo estándar de liberación de 51 Cr según se ha descrito en lo que antecede. La proporción E:T (células efectoras:células diana) fue 100:1.

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Resultados y Discusión

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Producción y purificación de proteínas de fusión que contienen IL-2. Se construyó un vector de expresión en E. coli que codifica una proteína de triple fusión C215FabSEA-Q-hIL2. Este vector codifica las dos subunidades de la proteína de triple fusión en un mRNA bicistrónico transcrito desde el promotor LacUV5. Cada una de esas dos subunidades está precedida por un péptido señal que dirige la exportación hacia el espacio periplásmico de E. coli. La primera subunidad es la VH de C215Fab seguida por un fragmento enlazador Gly-Gly-Pro (VH-CH l-Gly-Gly-ProSEA). La otra subunidad es la VK de C215Fab seguida por la CK de C242Fab, que está unida a la IL-2 humana a través de un fragmento enlazador Gly-Pro-fragmento enlazador Q (Vk-Ck-Gly-Pro-Q-hIL2). La secuencia Gly-Profragmento enlazador Q (SEQ ID NO: 23) es una versión ligeramente modificada de un fragmento enlazador natural encontrado en la proteína OmpR de E. coli (Wootton y col., 1989). Véase el apartado de materiales y métodos para una información más completa. También se produjo una proteína de fusión C215Fab-Q-hIL2. Esta proteína es idéntica a C215FabSEA-Q-hIL2 excepto en que el resto de Gly-Gly-Pro-SEA de esta última proteína ha sido retirado. La 17

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secuencia de DNA correspondiente está por consiguiente delecionada en el vector de expresión. Se generaron derivados mutados de C215FabSEA-Q-hIL2 mediante una mutagénesis dirigida a sitio específico y mediada por PCR, con métodos estándar, para producir una serie de proteínas tales como C215FabSEAD227A -Q-hIL2 y C215FabSEAD227A -QhIL2F42A . En variantes de la proteína de triple fusión generadas posteriormente, la cisteína situada entre las subunidades está sustituida por dos residuos de serina. Este cambio no afecta a la actividad biológica. Los plásmidos que codificaban proteínas que contenían IL-2 se utilizaron para transformar la cepa productora UL635 de E. coli y posteriormente se realizó una fermentación. Las proteínas de fusión se purificaron a partir del medio de cultivo usando una cromatografía de afinidad a proteína G. Las variantes degradadas de las proteínas de fusión se retiraron usando una cromatografía de intercambio iónico. Los productos obtenidos fueron la proteína de fusión de longitud completa en al menos el 90%, según se determinó mediante SDS-PAGE (materiales y métodos). Usando el diseño óptimo de la proteína de fusión, se obtiene una concentración de la proteína de fusión en el medio de crecimiento de hasta 130 mg/l y por lo general se obtuvieron 70 mg de la proteína de triple fusión por 1 litro de medio.

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Caracterización funcional de proteínas de fusión con Fab que contienen IL-2. La capacidad de las proteínas de fusión que contienen IL-2, tales como C215FabSEA-Q-hIL2 y C215Fab-Q-hIL2, para inducir la proliferación de la línea CTLL-2 de células murinas, dependiente de IL-2, fue esencialmente similar a la de la IL-2 humana recombinante sobre la base de una relación en concentración molar (datos no mostrados). Además, la actividad de unión a antígeno y la actividad de SEA presentadas por C215FabSEA-Q-hIL2 y por C215FabSEA, se encontró que eran indistinguibles en varios ensayos, lo que indica que no se producían efectos adversos por introducir IL-2 en la molécula. Estos ensayos incluyeron el de la capacidad para inducir la muerte de la línea celular colo205 de cáncer de colon humano, C215+ , independiente del MHC de clase II, por acción de una línea celular efectora de células T reactivas frente a SEA, en un ensayo de liberación de 51 Cr en 4 horas. También la muerte de células Raji (linfoma de rata) MHC de clase II+ , dependiente del MHC de clase II, por acción de células T efectoras reactivas frente a SEA, tuvo lugar con eficiencias similares (datos no mostrados). Una evidencia más directa de que la capacidad de unión al antígeno C215 y al MHC de clase II no se alteraba se obtuvo mediante análisis de FACS. La dependencia de la dosis que presentaba la capacidad de unión de C215FabSEA y de C215FabSEA-Q-hIL2 a las células Raji se encontró que era similar sobre la base de una relación en concentración molar (datos no mostrados). También se encontró que la unión dependiente de la dosis de C215FabSEA-Q-hIL2 y C215Fab-Q-hIL2 a células colo205, era similar a la observada en el caso de C215FabSEA (datos no mostrados), lo que indica que la capacidad de unión a antígeno no estaba alterada en las proteínas de fusión que contienen IL-2. Proliferación dependiente de IL-2 e inducida por FabSEA. Las células T humanas en reposo requieren una señal 1 y una señal 2, para iniciar la activación y proliferación óptimas de las células T (Schwartz, 1990). Los superantígenos pueden aportar la señal 1, cuando se presentan sobre a una célula. La IL-2, que es el principal efector aguas abajo de la señalización B7/CD28, se espera que proporcione la señal 2. En la presente invención, usando células T en reposo purificadas de sangre humana, se muestra que una proteína de triple fusión C215FabSEA-Q-hIL2, o una proteína C215FabSEA en combinación con C215Fab-Q-hIL2 o con IL2 recombinante humana, efectivamente induce la proliferación de células T in vitro (figura 7). Células T humanas en reposo se incubaron con SEA dirigida (C215FabSEA o C215FabSEA-Q-hIL2) en presencia de IL-2 (en forma de C215Fab-Q-hIL2, C215FabSEA-Q-hIL2 o de IL-2 humana recombinante). La SEA se presentó sobre células CHO irradiadas, transfectadas con el antígeno C215 (a través de la parte del Fab), MHC de clase II/Dr, que se une a SEA. Células CHO no transfectadas hicieron de control. A los 7 días de incubar las células T con los transfectantes de células CHO y con las sustancias en cuestión, se midió la proliferación por medio de la incorporación de 3 H-Timidina al DNA. C215FabSEA-Q-hIL2 indujo la proliferación de las células T humanas cuando se presentó sobre células CHO transfectadas con el antígeno C215 humano (CHO-C215), contra el que el Fab está dirigido (figura 7). Así mismo, se indujo proliferación cuando la proteína se presentó sobre CHO-Dr (MHC de clase II humano), mientras que no se observó proliferación en presencia de células CHO no transfectadas (CHO) o en ausencia de células CHO (R10). C215FabSEA o C215Fab-Q-hIL2 no indujeron una proliferación significativa por sí solas cuando se presentaron sobre células CHO, lo que indica que tanto SEA como IL-2 son efectivamente necesarias para inducir la proliferación. Esto se confirmó, ya que la combinación de C215FabSEA y C215Fab-Q-hIL2 o de C215FabSEA e IL-2 humana recombinante, indujo un efecto cualitativamente similar al inducido por C215FabSEA-Q-hIL2. Esto también demuestra que en este ensayo la IL-2 es necesaria pero que, a diferencia de la SEA, no necesita estar unida a células.

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C215FabSEA-Q-hIL2, así como la combinación de C215FabSEA y C215Fab-Q-hIL2, produce una activación aumentada y mantenida de células T y una mejor infiltración del tumor in vivo. Tanto C215Fab-Q-hIL2+C215FabSEA como C215FabSEA-Q-hIL2 fueron inductores de la activación de las células T mucho más potentes que C215FabSEA, según se midió por la capacidad de inducir la muerte de las células diana de manera dependiente de SEA (figura 8). Brevemente expuesto, los ratones recibieron 1 ó 3 inyecciones, administradas diariamente, de las proteínas indicadas. Dos días después de la última inyección, se extrajeron los bazos de los ratones tratados y se determinó la actividad citotóxica contra células Raji revestidas con SEA en un ensayo estándar de liberación de 51 Cr en 4 h. 18

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Tanto C215FabSEA-Q-hIL2 como C215FabSEA/C215Fab-Q-hIL2 indujeron no sólo una activación de las células T aumentada sino también mantenida. Los niveles de citoquinas séricas tales como el IFN-gamma, que desciende drásticamente después de la cuarta inyección de C215FabSEA, permanecen a un nivel muy alto incluso después de la cuarta inyección de C215FabSEA-Q-hIL2 (datos no mostrados). En general, los niveles de IFN-gamma y TNF-alpha fueron mucho más altos (hasta 10 veces más altos) que en el caso de C215FabSEA. Mejora en la terapia contra tumores B16-C215 establecidos con un tratamiento combinado con C215FabSEA y C215Fab-Q-hIL2. El efecto de potenciación de la terapia antitumoral con FabSag, por acción de IL-2, se investigó en el modelo del melanoma B16 murino (Fig. 9). En el ejemplo mostrado, ratones C57 Bl/6 hembras, de 8 - 12 semanas de edad, se inocularon en el día 0 con 150.000 células B16 transfectadas con el antígeno GA-733 de tumores humanos, contra el que el mAb C215 está dirigido (en lo sucesivo B16-C215). Las sustancias indicadas se inyectaron en los días 5, 6 y 7. Cada uno de los puntos de datos corresponde a 7 animales. En el día 21 los animales se sacrificaron y se efectuó el recuento de los tumores B16 pigmentados con melanina que colonizaban los pulmones. En varios experimentos se demostró que la combinación de C215FabSEA y C215Fab-Q-hIL2 inducía una terapia mejor que C215FabSEA en comparación con un control no tratado (figura 9). En el experimento indicado, el tratamiento combinado con C215FabSEA/C215Fab-Q-hIL2 proporcionó un mejor efecto terapéutico que el proporcionado por la proteína de triple fusión C215FabSEA-Q-hIL2. Estudios inmunohistoquímicos posteriores revelaron que la C215FabSEA sola o la combinación de C215FabSEA y C215Fab-Q-hIL2 daba lugar a cantidades similares de células T CD4 y T CD8 infiltrantes del tumor B16-C215. Curiosamente sin embargo, el número de células positivas a CD25 (IL2Ra), un buen marcador de la activación de las células T, aumentó considerablemente entre la 3ª y la 4ª inyección de C215FabSEA/C215Fab-Q-hIL2 (figura 10). En cambio, disminuyó en el caso de C215FabSEA, lo que indica el comienzo de la anergia. La calidad de las células T infiltrantes parece por lo tanto ser más alta en el caso del tratamiento combinado que en el caso del tratamiento con C215FabSEA sola, lo cual puede ayudar a explicar el efecto terapéutico mejorado. Así mismo, citoquinas séricas tales como el Interferón γ, producidas de manera secundaria a la activación de las células T, disminuyen notablemente después de la cuarta inyección de FabSEA (Fig. 11). Con una proteína de triple fusión FabSEA-Q-hIL2, sin embargo, los niveles del Interferón permanecen en un nivel alto incluso después de la cuarta inyección. Esta observación proporciona una indicación adicional de que incluir IL-2 en la construcción puede contrarrestar la anergia de las células T inducida por Fab-SEA. Mejora en la terapia contra tumores B16-C215 con C215FabSEAD227A -Q-hIL2. Los superantígenos son mucho más tóxicos en seres humanos que en ratones, en parte debido a que su afinidad por el MHC de clase II en seres humanos es considerablemente más alta (Hansson y col., 1997). La toxicidad sistémica de las proteínas FabSEA se prevé por lo tanto que sea la principal limitación para la terapia en seres humanos. Una de las maneras de aumentar la activación local en el tumor (dependiente de Fab) frente a la inmunoactivación sistémica (dependiente de SEA-MHC de clase II) consistiría en disminuir la afinidad de SEA por el MHC de clase II. Tomando como base la estructura cristalina de SEA, los autores de la invención han hecho un mutante de C215FabSEA, el C215FabSEAD227A , que posee una afinidad 100 veces disminuida por el MHC de clase II. A diferencia de la C215Fab-SEA de tipo salvaje, este mutante no posee la capacidad de formar enlaces cruzados con las moléculas del MHC de clase II, lo que se cree que es uno de los motivos principales de la toxicidad sistémica mediada por SEA (Hansson y col., 1997). El intervalo entre la terapia eficiente y la toxicidad en el tratamiento de tumores B16-C215 en el día 1, en ratones transgénicos Vb3 TCR, fue al menos 50 veces más amplio para el mutante C215FabSEAD227A comparado con C215FabSEA (Hansson y col., 1997). En conformidad con esta observación, los estudios inmunohistoquímicos revelaron que a las dosis en las que estas dos proteínas producían una terapia similar, se observaba una inmunoactivación comparable en el tumor, mientras que se observaba una inmunoactivación sistémica mucho menor en el bazo con el tratamiento con C215FabSEAD227A (Hansson y col., 1997). Además, los estudios farmacodinámicos realizados en conejos mostraron una disminución considerable en el direccionamiento de C215FabSEAD227A hacia el bazo o hacia otros órganos linfáticos, en los que se localizan la mayoría de las células del MHC de clase II+ , en comparación con el direccionamiento de C215FabSEA (datos no mostrados). Para uso clínico, se espera que una proteína de triple fusión Fab-SEA-IL2 contenga un superantígeno mutado. Los autores de la invención construyeron por lo tanto una proteína de triple fusión C215FabSEAD227A -Q-hIL2. La proteína producida fue capaz de inducir la proliferación de células T humanas en reposo (datos no mostrados) e indujo una actividad mantenida de los CTL, dependiente de SEA, en ratones durante hasta 6 inyecciones (Figura 12). Por el contrario, se observó la actividad de fondo de los CTL cuando se usó C215FabSEAD227A (90% de las células T se activan por acción de SEA) que portan tumores B16-GA733 en el día 3. Aunque todavía se observó cierta toxicidad a la dosis más alta, ésta sobrevino más tarde cuando se usó C215FabSEAD227A -Q-hIL2F42A o C215FabSEAD227A -Q-hIL2F42K (8ª inyección) en lugar de C215FabSEAD227A -Q-hIL2 (6ª inyección) y el tratamiento a la dosis más alta consecuentemente conduce a una disminución del tamaño del tumor de más del 90% cuando se compara con un control tratado con PBS (figura 14). Los autores de la invención en la actualidad están explorando esta estrategia tan prometedora, introduciendo mutaciones adicionales en las partes correspondientes a la SEA y a la IL-2 para mejorar aún más el intervalo terapéutico frente al intervalo de toxicidad. Además, existe un trabajo en curso para construir proteínas de triple fusión C215FabSEA-Q-hIL2 que comprenden una mutación Thr51Pro en la parte correspondiente a la IL-2 (Chang y col., 1996). Esta mutación puede servir para bloquear la internalización de la proteína de fusión, mediada por IL2R, sin disminuir la bioactividad de la IL-2. Esto va a ser probablemente importante porque disminuirá la retirada de la proteína de fusión por esta ruta e incrementará por lo tanto la concentración local y la eficacia de este fármaco. Las proteínas que contienen la mutación Thr51Pro pueden contener otras mutaciones en las partes correspondientes a la SEA y a la IL-2 que disminuyen su afinidad por el MHC de clase II y por el receptor de IL-2 respectivamente. Ejemplo 3

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Experimentos para verificar los efectos de conjugados de (Sag, IM). Células diana positivas al receptor del IM o células positivas al MHC de clase II Una molécula Sag-IM se puede unir a células que expresan el MHC de clase II, facilitando así la SDCC. Como alternativa, el direccionamiento se puede realizar hacia células diana que expresan el receptor específico para el IM. Es por lo tanto posible que una molécula Sag-IM pueda ser útil para inducir la muerte de células no deseadas que expresan el receptor específico para el IM. Se puede considerar que una proteína de triple fusión C215FabSEA-hIL2 es una molécula Sag-IM en el caso en el que ni la célula efectora ni la célula diana expresen el antígeno reconocido por el C215Fab. Las células efectoras serían células T del subtipo Vβ correcto. Las células diana podrían ser, p. ej., células hematopoyéticas aberrantes que expresan el receptor para IL-2, tales como las presentes en determinadas leucemias o linfomas. Exp. A: Demostración del planteamiento teórico in vitro: Células T efectoras (células T humanas estimuladas de manera repetida con SEA) y células diana (p. ej., células “Raji” de linfoma de células B humanas) se incubarán con la proteína de triple fusión C215FabSEA-IL2 mutada para disminuir su unión al MHC de clase I. Este es el montaje estándar para los ensayos de SDCC (células T efectoras, células Raji, sustancia experimental). Los autores de la presente invención han encontrado realmente que una proteína C215FabSEAD227A -hIL2 que posee una afinidad enormemente disminuida por el MHC de clase II, posee una potencia aproximadamente 10 veces mayor que C215FabSEAD227A para 20

ES 2 284 209 T3 matar a las células Raji. Una explicación obvia para este aumento de potencia es que la proteína de triple fusión es presentada sobre los receptores para la IL-2, expresados sobre las células Raji. 5

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Exp. B: Demostración del planteamiento teórico in vivo: Los modelos murinos de linfoma (tal como el linfoma RBL-5 en ratones C57 Bl/6 mice) están perfectamente establecidos (Hoglund y col., J. Exp. Med. 168, 1469-1474). Un direccionamiento hacia el receptor de la IL-2 o hacia otro receptor R-IM (receptor del inmunomodulador) con una proteína Sag-IM en esos modelos podría proporcionar la demostración del planteamiento teórico del direccionamiento hacia células positivas al receptor del IM in vivo. El direccionamiento hacia células positivas al R-IM efectuado con Sag-IM es complicado por el hecho de que tanto las células efectoras como las células diana expresan frecuentemente el receptor del IM. No obstante, en determinadas circunstancias esta modalidad de terapia puede ser eficaz. Es probable que factores tales como la densidad de expresión del R-IM sobre las células diana, el número y la localización de las células diana, etc., desempeñen una función. Se debe también hacer hincapié en que, p. ej., IL2R alpha solamente aumenta tras la activación de las células T, y habría por lo tanto un intervalo temporal durante el cual el R-IM se expresa a un nivel de alta abundancia sobre las células diana, pero no sobre las células efectoras. Las proteínas de fusión Sag-IM en las que Sag representa un superantígeno de tipo salvaje mutado para que presente una menor afinidad por el MHC de Clase II, se pueden utilizar de manera similar.

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ES 2 284 209 T3 REIVINDICACIONES

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1. Una composición farmacéutica que comprende una combinación de un superantígeno (Sag), un resto de direccionamiento (T) y un inmunomodulador (IM) que no es un superantígeno, combinación que se elige entre: a) un conjugado triple (T) (Sag) (IM);

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b) una combinación de un conjugado doble (T) (Sag) y otro conjugado doble (T’)(IM), en la que T y T’ son iguales o diferentes; o c) una combinación de un conjugado doble (T) (Sag) y un (IM) libre.

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2. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que el resto de direccionamiento (T y T’) se selecciona entre el grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno perteneciente a un anticuerpo, un fragmento Fab de un anticuerpo, un fragmento Fab2 de un anticuerpo o un anticuerpo monocatenario. 3. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 2, en la que el superantígeno (Sag) ha sido modificado para que posea una menor capacidad de unión a un antígeno del MHC de clase II en comparación con el correspondiente superantígeno de tipo salvaje. 4. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 2, en la que el superantígeno (Sag) ha sido modificado para que presente una menor serorreactividad y/o inmunogenicidad en sueros humanos en comparación con el correspondiente superantígeno de tipo salvaje.

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5. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en la que el superantígeno es quimérico y comprende regiones derivadas de dos o más superantígenos libres. 6. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en la que el inmunomodulador (IM) se selecciona entre el grupo que consiste en citoquinas, quimioquinas y partes extracelulares de receptores y ligandos unidos a la superficie de los linfocitos. 7. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6, en la que el inmunomodulador (IM) es una IL-2 natural o mutante.

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8. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6, en la que el inmunomodulador (IM) es una parte de la molécula B7 seleccionada entre el grupo que consiste en CD80 y CD86. 9. Un conjugado que contiene un superantígeno, que tiene la fórmula:

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a) de un conjugado triple (T) (Sag) (IM); b) de un conjugado doble (T) (Sag) en combinación con otro conjugado doble (T’)(IM), en el que T y T’ son iguales o diferentes; o

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c) de un conjugado doble (T) (Sag) en combinación con (IM), en el que T es un resto de direccionamiento, Sag es un superantígeno e IM es un inmunomodulador que no es un superantígeno. 10. Un conjugado que contiene un superantígeno según la reivindicación 9, en el que T comprende al menos un resto de direccionamiento T’ y un resto de direccionamiento T”, el superantígeno Sag está fusionado por el extremo C-terminal a T’ y el inmunomodulador (IM) está fusionado por el extremo C-terminal a T”. 11. Un conjugado que contiene un superantígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 9 - 10, en el que el resto de direccionamiento se selecciona entre el grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno perteneciente a un anticuerpo, un fragmento Fab de un anticuerpo, un fragmento Fab2 de un anticuerpo o un anticuerpo monocatenario. 12. Un conjugado que contiene un superantígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 9 - 11, en el que el superantígeno ha sido modificado para que posea una menor capacidad de unión a un antígeno del MHC de clase II en comparación con el correspondiente superantígeno de tipo salvaje. 13. Un conjugado que contiene un superantígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 9 - 11, en el que el superantígeno ha sido modificado para que presente una menor serorreactividad y/o inmunogenicidad en sueros humanos en comparación con el correspondiente superantígeno de tipo salvaje.

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14. Un conjugado que contiene un superantígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 9 - 13, en el que el superantígeno es quimérico y comprende regiones derivadas de dos o más superantígenos libres.

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ES 2 284 209 T3 15. Un conjugado que contiene un superantígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 9 - 14, en el que el inmunomodulador se selecciona entre el grupo que consiste en citoquinas, quimioquinas y partes extracelulares de receptores y ligandos unidos a la superficie de los linfocitos. 5

16. Un conjugado que contiene un superantígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 9 - 15, en el que el inmunomodulador es una IL-2 natural o mutante. 17. Un conjugado que contiene un superantígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 12 - 14, en el que el inmunomodulador es una parte extracelular de una molécula B7.

10

18. Un conjugado que contiene un superantígeno según la reivindicación 17, en el que la parte de la molécula B7 se selecciona entre el grupo que consiste en CD80 y CD86. 15

19. Un conjugado que contiene un superantígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 9 - 18, en el que el inmunomodulador ha sido modificado para que presente una menor afinidad por un receptor linfocitario, en comparación con la afinidad de la correspondiente forma natural.

20

20. Un conjugado que contiene un superantígeno según la reivindicación 10, en el que el superantígeno es la enterotoxina A estafilocócica, T’ es el dominio CH 1 de C215Fab, T” es la cadena ligera del anticuerpo C215 y el inmunomodulador es una IL-2 natural o mutante.

25

21. Un conjugado que contiene un superantígeno de la reivindicación 10, en el que el superantígeno está fusionado a T’ a través de un fragmento enlazador B’ flexible de aminoácidos hidrófilos, de 3 - 11 residuos de aminoácidos, y el inmunomodulador está fusionado a T” a través de un fragmento enlazador Q de aminoácidos hidrófilos con carga neutra o positiva, de 10 - 20 residuos de aminoácidos.

30

35

22. Un conjugado que contiene un superantígeno de la reivindicación 21, en el que B’ se selecciona entre el grupo que consiste en Gly-Gly-Pro y Pro-Ala-Ser- Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro (SEQ ID NO: 19) y Q se selecciona entre el grupo que consiste en Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Asn-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg (SEQ ID NO: 23), Gly-Pro-Arg-Gln-Ser-Asn-Glu-Thr-Pro-Gly-Ser-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg (SEQ ID NO: 20), Gly-Pro-ArgGln-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Thr-Thr-Arg (SEQ ID NO: 21) y Gly-Pro-Thr-Glu-Ala-Asp-GluLeu-Pro-Gly-Ala- Pro-Ser-Glu-Glu-Glu-Thr (SEQ ID NO: 22). 23. Un conjugado que contiene un superantígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 9 - 22, para usar como medicamento. 24. Uso de un conjugado que contiene un superantígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 9 - 22, para fabricar un medicamento para el tratamiento de cánceres, enfermedades autoinmunitarias, infestaciones parasitarias, infecciones víricas o infecciones bacterianas.

40

25. Uso según la reivindicación 24, para el tratamiento de melanomas, carcinomas, neoplasias hematopoyéticas o fibrosarcomas. 45

26. Uso según la reivindicación 25, para el tratamiento de tumores benignos o malignos, cánceres resistentes a multitud de fármacos, cánceres metastásicos o diversas formas de cánceres inducidos por métodos químicos o inducidos por virus.

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ES 2 284 209 T3 LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: 5

(i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Pharmacia & Upjohn AB (B) CALLE: Lindhagensgatan 133

10

(C) CIUDAD: Estocolmo (E) PAÍS: Suecia (F) CÓDIGO POSTAL: S-112 87 (G) TELÉFONO: +46 8 695 80 00

15

(ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Citolisis dirigida de células diana, agentes y composiciones causantes de la citolisis y compuestos que se pueden usar para producir esos agentes. (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 23

20

(iv) FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) ORDENADOR: IBM PC compatible

25

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release Núm. 1.0, Versión 1.30 (EPO)

30

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases

35

(B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal

40

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc.= “cebador oligonucleotídico de DNA”. (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

45

ATATAAGCTT CCACCATGGG CCACACACGG AGG

33

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 2: 50

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla

55

(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc.= “cebador oligonucleotídico de DNA”.

60

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: ACGCAGATCT TTAGTTATCA GGAAAATGCT CTTGC

65

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 1

35

ES 2 284 209 T3 (A) LONGITUD: 39 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla 5

(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc.= “cebador oligonucleotídico de DNA”.

10

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: TCAAAGCTTC TCGAGCGCGC TGTTATCAGG AAAATGCTC

15

39

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 46 pares de bases

20

(B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal

25

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc.= “cebador oligonucleotídico de DNA”. (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

30

CGCGCGTCAG GCTAACGAAC TGCCAGGCGC CCCGRCACAG AGACGA

46

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 5: 35

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 60 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico

40

(C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

45

(A) DESCRIPCIÓN: /desc.= “cebador oligonucleotídico de DNA”. (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: AGCTTCGTCT CACGCGCGTT CTTCCTGTGA CGGGGCGCCT GGCAGTTCGT TAGCCTGACG

60

50

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 55

(A) LONGITUD: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla

60

(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc.= “cebador oligonucleotídico de DNA”.

65

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: TGGTACACCA CAGAAGACAG CTTGTATGTA TG 2

32

ES 2 284 209 T3 (2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5

(A) LONGITUD: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal

10

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc.= “cebador oligonucleotídico de DNA”. (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: 15

CATACATACA AGCTGTCTTC TGTGGTGTAC CA

32

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 8: 20

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 25

(C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

30

(A) DESCRIPCIÓN: /desc.= “cebador oligonucleotídico de DNA”. (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

35

CGAATAAGAA AGACGTCACT GTTCAGGAGT TGG

33

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 40

(A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla

45

(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc.= “cebador oligonucleotídico de DNA”.

50

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9: CCAACTCCTG AACAGTGACG TCTTTCTTAT TCG

55

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 32 pares de bases

60

(B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal

65

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc.= “cebador oligonucleotídico de DNA”.

3

33

ES 2 284 209 T3 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: GAGATAATAA AGTTATTAAC TCAGAAAACA TG 5

32

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

10

(A) LONGITUD: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal

15

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc.= “cebador oligonucleotídico de DNA”. (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

20

CATGTTTTCT GAGTTAATAA CTTTATTATC TC

32

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 12: 25

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 49 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico

30

(C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

35

(A) DESCRIPCIÓN: /desc.= “cebador oligonucleotídico de DNA”. (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

40

CGCGGATCCG CGCGGCACCA GGCCGCTGTT ATCCGGAAAA TGCTCTTGC (2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

45

(A) LONGITUD: 77 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla

50

(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc.= “cebador oligonucleotídico de DNA”.

55

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

60

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 14: 65

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 69 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 4

49

ES 2 284 209 T3 (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal 5

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc.= “cebador oligonucleotídico de DNA”. (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

10

15

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 aminoácidos

20

(B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal

25

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

30

35

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 40

(A) LONGITUD: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: sencilla

45

(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

50

55

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 17: 60

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 84 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico

65

(C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal

5

ES 2 284 209 T3 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc.= “cebador oligonucleotídico de DNA”. 5

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

10

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 18: 15

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla

20

(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc.= “cebador oligonucleotídico de DNA”.

25

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18: CCGAATTCGC TAGCTTATCA AGTTAGTGTT GAGATGAT

30

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 11 aminoácidos

35

(B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal

40

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

45

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 20: 50

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos

55

(C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

60

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

65

6

38

ES 2 284 209 T3 (2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5

(A) LONGITUD: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal

10

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21: 15

20

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 22: 25

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: sencilla

30

(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:

35

40

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 23: 45

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos

50

(C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

55

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:

60

65

7