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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k 2 148 733 kInt. Cl. : C07C 59/305

11 N´ umero de publicaci´on: 7

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˜ ESPANA

C07C 59/353 C07C 59/315 C07D 257/04 A61K 31/19

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 96903794.4 kFecha de presentaci´on : 05.02.1996 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 820 428 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 28.01.1998

T3

86 86 87 87

k

54 T´ıtulo: Grupos carboxi o tetrazol conteniendo dialquilo-´ eteres.

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73 Titular/es: WARNER-LAMBERT COMPANY

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72 Inventor/es: Bisgaier, Charles Larry;

k

74 Agente: Tom´ as Gil, Tesifonte-Enrique

30 Prioridad: 24.03.1995 US 409780

201 Tabor Road Morris Plains New Jersey 07950, US

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.10.2000

ES 2 148 733 T3

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

16.10.2000

Aviso:

k k

Creger, Paul Leroy; Saltiel, Alan Robert y Tafuri, Sherrie Rae

k

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 148 733 T3 DESCRIPCION Grupos carboxi o tetrazol conteniendo dialquilo-´eteres. 5

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Campo de la invenci´ on Esta invenci´on se refiere a compuestos que son dialquilo-´eteres que tienen grupos terminales carboxi o tetrazol. Los compuestos son u ´ tiles para la reducci´on de algunos l´ıpidos en el plasma de animales, incluyendo Lp(a), triglic´eridos, colesterol VLDL y colesterol LDL, y el aumento de otros como el colesterol HDL. Los compuestos son eficaces para prevenir y tratar las enfermedades vasculares y la diabetes, por ejemplo, aumentando la sensibilidad a la insulina. Estado de la t´ ecnica

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Las enfermedades vasculares como la cardiopat´ıa coronaria, el derrame cerebral, la restenosis, y la enfermedad vascular perif´erica siguen siendo la principal causa de muerte y minusval´ıas en todo el mundo. Cada a˜ no cerca de un mill´ on y medio de personas mueren de infarto de miocardio solo en los EEUU como resultado de un fallo card´ıaco congestivo. Mientras que la dieta y el estilo de vida pueden acelerar la aparici´ on de las enfermedades vasculares, la predisposici´ on gen´etica a la dislipidemia es un factor significante en las minusval´ıas relacionadas con enfermedades vasculares y las muertes. “Dislipidemia” quiere decir niveles anormales de lipoprote´ınas en el plasma sangu´ıneo. Se han asociado varios factores de riesgo con el aumento del riesgo de sufrir enfermedades vasculares. Entre ´estos est´an las dislipidemias de altos niveles de lipoprote´ınas de baja densidad (LDL) y los niveles bajos de lipoprote´ınas de alta densidad (HDL). El ratio de colesterol HDL a colesterol LDL se usa a menudo para evaluar el riesgo de enfermedad vascular. Un ratio alto de colesterol HDL/LDL es deseable. Los compuestos que aumentan este ratio, bien reduciendo las LDL o aumentando las HDL, o haciendo ambas cosas, son, en consecuencia, beneficiosos. Estudios recientes han demostrado que los niveles elevados de una forma modificada de LDL llamada lipoprote´ına (a), “Lp (a)” son perjudiciales. El colesterol Lp(a) parece ser indeseable, puesto que se han asociado los niveles elevados de Lp(a) con el desarrollo de la arterioesclerosis, cardiopat´ıa coronaria, infarto de miocardio, derrame cerebral, infarto cerebral y restenosis siguiente a la angioplastia de globo. De hecho, la Lp (a) parece ser un excelente factor de predicci´ on del derrame cerebral. En consecuencia, las altas concentraciones de colesterol en forma de Lp (a) son uno de los mayores factores de riesgo de muerte por enfermedad coronaria. Hemos descubierto ahora que ciertos ´eteres son eficaces para disminuir las concentraciones en el plasma de Lp(a). Esta invenci´ on proporciona as´ı un m´etodo para reducir los niveles de Lp(a) en el plasma que incluye la administraci´ on de un ´ester dialcanoico o un ´eter derivado. Estos tipos de compuestos no han sido utilizados hasta la fecha para tratar enfermedades vasculares. Por ejemplo, la patente de EEUU 3,320, 079 expone el a´cido 3,3’-oxibis(2,2-dimetilpropi´ onico) como un plastificante. La patente de EEUU 3, 930, 024 expone una serie de alcanodioles que se dice disminuyen los triglic´eridos del suero. La patente de EEUU 3, 674, 836 expone a´cidos fenoxialcanoicos que se dice reducen los triglic´ oridos. La patente de EEUU 4, 711, 896 expone ciertos a´cidos α,ω-dicarbox´ılicos que se dice disminuyen los l´ıpidos. Un objetivo de esta invenci´ on es proporcionar una serie de dialquilo-´eteres carboxisustituidos que sean eficaces para disminuir los Lp(a) del plasma. Otro objetivo es proporcionar formulaciones farmac´euticas que contengan los compuestos, y un m´etodo para tratar las enfermedades vasculares utilizando los compuestos. Resumen de la invenci´ on Esta invenci´on facilita nuevas entidades qu´ımicas caracterizadas como dialquilo-´eteres carboxi o tetrazolsustituidos, y las sales y ´esteres derivados. La invenci´on, m´ as particularmente, proporciona compuestos definidos por la F´ ormula I Y2 \ / /\—–( CH2 )n —O—(CH2 )m ——/\ R3 R4 R1 R2

Y1

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en la que

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I

ES 2 148 733 T3 n y m independientemente son n´ umeros enteros del 2 al 9;

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R1 , R2 , R3 , y R4 son independientemente alquilo C1 -C6 , alquenilo C2 -C6 , alquinilo C2 -C6 , y R1 y R2 junto con el carbono al que est´ an unidos y R3 y R4 junto al carbono al que est´ an unidos pueden completar un ciclo carboc´ıclico teniendo de 3 a 6 carbonos; Y1 e Y2 son independientemente COOH, CHO, tetrazol, y COOR5 donde R5 es alquilo C1 -C6 , alquenilo C2 -C6 , alquinilo C2 -C6 ;

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y donde los grupos alquilo, alquenilo, y alquinilo pueden ser sustituidos con uno o dos grupos seleccionados de halo, hidroxi, alcoxi C1 -C6 , y fenilo. Los compuestos preferidos de la invenci´ on tienen la f´ ormula anterior donde n y m son el mismo n´ umero entero, y donde R1 , R2 , R3 , y R4 son cada uno alquilo.

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M´ as preferidos son los compuestos- donde Y1 e Y2 son independientemente COOH o COOR5 donde R5 es alquilo. Los compuestos m´ as preferidos de la invenci´on tienen la f´ ormula 20

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HO OH | \ H   @ , O —(CH2 )n —O–(CH2 )m —H O /\
donde n y m son cada uno un n´ umero entero seleccionado de 2, 3, 4, ´o 5, idealmente 4 ´o 5. Un compuesto especialmente preferido tiene la f´ ormula

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HO OH | \ O  @QQ QQQ,H O O /\
H Tambi´en se muestran las sales derivadas farmac´euticamente aceptables de los ´acidos de la invenci´on. Otra forma de realizaci´ on de la invenci´ on son formulaciones farmac´euticas incluyendo un compuesto de la F´ormula I junto a un soporte, diluyente o excipiente suyo farmac´euticamente aceptable.

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La invenci´on tambi´en propone m´etodos para tratar enfermedades vasculares como la enfermedad vascular perif´erica, la cardiopat´ıa coronaria, el ataque al coraz´ on y la restenosis. La invenci´ on propone un m´etodo para la reducci´ on de Lp(a), triglic´eridos del plasma, colesterol de lipoprote´ınas de muy baja densidad (VLDL), colesterol de lipoprote´ınas de baja densidad (LDL), y, apolipoprote´ına B. La invenci´on adicionalmente proporciona un m´etodo para elevar el colesterol de lipoprote´ına de alta densidad en el plasma (HDL), apolipoprote´ına A-I, y apolipoprote´ına E. La invenci´ on tambi´en proporciona un m´etodo para tratar y prevenir la diabetes mellitus no dependiente de la insulina aumentando la sensibilidad a la insulina al administrar un compuesto de la F´ ormula I. Descripci´ on detallada de la invenci´ on Los compuestos de esta invenci´on ser´an denominados a´cidos alcanoicos y ´esteres. Por ejemplo, el compuesto de la f´ ormula

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CH2 CH2 CH3 HO CH3 @ , O C CH2 O CH2 @, , , @, @ , @ , @ ,@ , , O ,@ CH2 CH2 CH2 C @ CH3 CH2 CH3 @ OH ser´ a denominado a´cido pentanoico, espec´ıficamente a´cido 2-metil-2-n-propil-5-(3-metil-3-hidroxi-carbonil)-pentoxipentanoico. Como se ha se˜ nalado anteriormente, los compuestos preferidos son aquellos en 3

ES 2 148 733 T3 los que n y m en la f´ ormula I son iguales, y R1 , R2 , R3 y R4 son todos el mismo grupo alquilo. Cuando an a´cidos oxibisalcanoicos. Por ejemplo, Y1 e Y2 son ambos grupos carboxi, los compuestos se denominar´ un compuesto preferido de la f´ ormula HO OH | \ H   @ , O —(CH2 )n —O–(CH2 )m —H O /\


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donde n y m son ambos 4, puede denominarse a´cido 6,6’-oxibis(2,2-dimetilhexanoico). En la f´ ormula I, R1 , R2 , R3 y R4 son definidos incluyendo “alquilo C1 -C6 ”, t´ermino que incluye metilo, etilo, isopropilo, terc-butilo, n-exilo y 2-metil-pentilo. El grupo alquilo puede ser sustituido con halo, hidroxi, alcoxi C1 -C6 y fenilo. “Halo” incluye cloro, bromo y yodo. “alcoxi C1 -C6 ” es un grupo alquilo C1 -C6 ligado a trav´es de ox´ıgeno, como etoxi, isopropoxi, n-exiloxi y similares. Los t´ıpicos grupos alquilo sustituidos son clormetilo, 3-hidroxi-hexilo, 4-fenilbutilo, 2-iodopentilo, isopropoximetilo y similares. R1 , R2 , R3 y R4 tambi´en pueden incluir alquenilo C2 -C6 y alquenilo sustituido y alquinilo C2 -C6 y alquinilo sustituido. Los grupos t´ıpicos incluyen vinilo, 2-propenilo, 3-cloro-4-hexenilo, 2-fenil-3-pentenilo, etinilo, 2-metoxietinilo, 2-bromoetinilo, 6-fenil-3-hexinilo y similares. an unidos para completar un ciclo carboc´ıclico R1 y R2 pueden ser combinados con el carbono al que est´ como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclohexilo y ciclopentilo. De la misma manera, R3 y R4 pueden tomarse juntos con el carbono al que est´ an unidos para completar un ciclo carbox´ılico C3 -C6 como ciclopropilo, ciclohexilo y similares. ormula I incluyen independientemente el grupo COOR5 donde R5 es alquilo, alquenilo, Y1 e Y2 en la f´ o alquinilo o sustituido por alquilo alquenilo o alquinilo. Estos grupos han sido descritos m´ as arriba para R1 , R2 , R3 y R4 .

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Los compuestos de la invenci´on que tienen al menos un grupo de a´cido carbox´ılico (es decir, o bien Y1 o bien Y2 es COOH) forman r´apidamente sales derivadas farmac´euticamente aceptables por reacci´on con bases org´anicas o inorg´ anicas. Las bases t´ıpicas com´ unmente utilizadas para formar sales incluyen el hidr´ oxido s´ odico, hidr´ oxido pot´ asico, carbonato s´ odico, amina de trietilo, piridina, amonio y similares. Los compuestos t´ıpicos provistos por la invenci´ on son mostrados m´ as adelante: Y2 \ / /\—–( CH2 )n —O—(CH2 )m ——/\ R3 R4 R1 R2

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n

m

2 3 2 3 4 4 4 4 4 4

3 3 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 2

4 4 5 5 5

R1

R2

CH3 CH3 CH3 CH3 Et i-Pr 3-cloropropilo CH3 CH3 CH3 Et Et Et CH3 HOCH2 HOCH2 nPr nPr
A  H A
fenilmetilo CH3 CH3 CH3 Et iPr n-hexilo n-hexilo

R3

R4

Y1

Y2

CH3 Et Et CH3 CH3 Et n-Bu HOCH2 nPr

CH3 Et Et 2-hidroxietilo CH3 Et n-Bu HOCH2 nPr
A

COOH COOCH3 COOH COOH COOH COO− Na+ COOH COOEt tetrazolilo COOH

COOH COOH COOCH3 CHO COOH COO− Na+ COOCH3 COOEt CHO COOH

CH3 CH3 Et iPr n-hexilo

CH3 CH3 Et Et n-hexilo

CHO CHO COOH COOH COOH

CHO CHO CHO COOH COOH

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ES 2 148 733 T3 (Continuaci´ on)

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n

m

R1

R2

R3

R4

Y1

Y2

2 3 3 4 4 4 5 9

6 6 7 7 8 9 8 9

iBu CH3 HOCH2 n-pentilo CH3 CH3 Et Et

iBu CH3 ClCH2 n-pentilo CH3 CH3 Et Et

nPr Et BrCH2 CH3 OCH2 CH3 CH3 Et ClCH2

nPr Et ICH2 CH3 OCH2 CH3 CH3 Et fenilmetilo

COO− K+ COOH COOH COO− Et3 N+ CHO COOn-hexilo tetrazolilo COOH

COO− K+ COOH COOH COOH COOH COOEt tetrazolilo COOH

Los compuestos de esta invenci´on son preparados utilizando metodolog´ıas bien conocidas en el campo de la qu´ımica org´ anica. En una s´ıntesis t´ıpica, un haluro de alquilo carboxisustituido es hecho reaccionar con un alcanol carboxi sustituido en presencia de una base para efectuar una condensaci´ on para proporcionar el compuesto de la invenci´ on. Se utilizan ´esteres de carboxi t´ıpicos, dando as´ı compuestos de on simple convierte a uno o ambos de los invenci´on donde Y1 e Y2 son ambos COOR5 . La saponificaci´ grupos de ´ester al ´acido libre cuando se desea. A continuaci´on se muestra la reacci´on de condensaci´ on anterior: Y2 Y1 \ / /\—(CH2 )n —halo + HO–(CH2 )m ——/\ R3 R4 R1 R2 donde halo es bromo, cloro, yodo o similar, e Y1 e Y2 son preferiblemente COOR5 , aunque la reacci´on trabaja igualmente bien cuando Y1 e Y2 son independientemente tetrazolilo o CHO. La reacci´on generalmente se realiza en primer lugar haciendo reaccionar el alcanol con cerca de una cantidad equimolar de una base como hidruro de sodio o sodio met´ alico, generalmente en un solvente org´anico no reactivo como benceno, tolueno, xileno, tetrahidrofurano o similar. Esto produce la forma de o´xido del alcanol, que reacciona entonces r´ apidamente con una cantidad equimolar de un haluro de alquilo para producir un compuesto de la invenci´on. La reacci´on generalmente se ha completado notablemente al cabo de entre unas 2 y 10 horas cuando se realiza a una temperatura elevada de entre unos 50◦ C y 120◦ C. El compuesto de la invenci´on es aislado r´apidamente al extraer el solvente de reacci´ on, por ejemplo, por evaporaci´ on. El producto puede ser purificado si se necesita mediante m´etodos comunes como la cristalizaci´on de solventes como etilacetato, benceno, hexano y similares, o cromatograf´ıa, por ejemplo, en soportes s´olidos como el gel de s´ılice. Un m´etodo alternativo para preparar los compuestos de la invenci´on conlleva la reacci´on de un dialquilo-´eter halosustituido con un α,α ´ acido ac´etico disustituido o ´ester, etanal, o un metiltetrazol. A continuaci´ on se muestra dicha reacci´on: Y1 / halo—(CH2)n —O—(CH2 )m —halo + HC / \ R1 R2 ? Y1 \ C—(CH2 )n —O—(CH2 )m —halo /\ R1 R2 Y2 / + HC /\ R3 R4

? 5

ES 2 148 733 T3

? Y1

Y2 / C —(CH2 )n —O—(CH2 )m —— C / \ / \ R3 R4 R1 R2

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\

El proceso anterior se utiliza preferiblemente para preparar compuestos de la invenci´ on donde R1 y R2 son lo mismo que R3 y R4 , respectivamente, y donde Y1 e Y2 son iguales. En tal caso, al dialquilo-´eter halosustituido se le hace reaccionar con 2 equivalentes o m´as del derivado del a´cido ac´etico o tetrazol, por ejemplo, un compuesto como

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N —— N | k | N ,@ , HC N H , @ , @ CH3 CH3

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La reacci´on generalmente se realiza en un solvente mutuo como el tetrahidrofurano, dioxano, dietil´eter, o similar, y en la presencia de una base como hidruro de sodio, sodio met´alico, litio de butilo o similar. La reacci´on se completa generalmente entre las 2 y 10 horas aproximadamente cuando se realiza on, a una temperatura de entre 0◦ C y 50◦C aproximadamente. El producto, un compuesto de la invenci´ es aislado r´apidamente extrayendo el solvente de reacci´ on, y se puede conseguir una mayor purificaci´ on por m´etodos de rutina si as´ı se desea, incluyendo cromatograf´ıa, cristalizaci´on y similares. A veces puede ser deseable proteger algunos grupos reactivos con radicales org´anicos extra´ıbles para impedir reacciones secundarias indeseadas. Por ejemplo, los grupos hidroxi y carboxi libres pueden ser derivados con radicales que eliminen su capacidad de entrar en las reacciones qu´ımicas que se est´en llevando a cabo, y donde el radical puede ser f´ acilmente extra´ıdo cuando se desee para regenerar el grupo hidroxi o carboxi libre. Los grupos protectores t´ıpicos de hidroxi y carboxi, y los m´etodos para su enlace y extracci´on subsiguiente, han sidos descritos en su totalidad por Greene y Wirts en “Protective Groups in Organic Synthesis”, 2a ¯ Ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1991. Por ejemplo, los grupos hidroxi son r´ apidamente protegidos por conversi´ on a grupos o-benzilos, que son f´acilmente divididos cuando se desea por hidrogen´ alisis. Los grupos carboxi generalmente son convertidos a ´esteres, por ejemplo, ´esteres de para-nitrobenzilo o ´esteres de 2,2,2-tricloroetilo. Tales grupos ´ester son r´ apidamente hidrolizados cuando se desea para conseguir el grupo carboxi libre. Como se ha se˜ nalado anteriormente, los a´cidos carbox´ılicos de esta invenci´on forman r´ apidamente sales por reacci´on con una base inorg´ anica o base org´ anica. Las sales preferidas incluyen sales inorg´anicas hechas con bases como hidr´oxido s´ odico, hidr´ oxido de potasio, hidr´ oxido de calcio y similares. Las bases org´ anicas t´ıpicas incluyen trietilamina, piridina, metilasmina y similares. Los siguientes ejemplos ilustran con m´as detalle la s´ıntesis de compuestos de esta invenci´on. Los ejemplos son s´olo ilustrativos y no deben ser interpretados como limitadores en ning´ un aspecto.

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Ejemplo 1 Acido 6,6’-Oxibis(2,2-dimetilhexanoico)

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A una soluci´ on agitada de hidruro de sodio (28 g dispersos en aceite mineral al 60 %, 700 mmol) en 600 mL de tetrahidrofurano seco conteniendo 61 g (600 mmol) de diisopropilamina se le a˜ nadi´ o 52.9 g (600 mmol) de ´acido isobut´ırico. Se agit´ o la mezcla de reacci´on a 24◦ C durante 30 minutos, y fuego se no de hielo/acetona. A la soluci´on fr´ıa se le a˜ nadi´ o 286 mL de una soluci´ on 2.1 M enfri´ o a 0◦ C en un ba˜ de litio de n-butilo (600 mmol) y la mezcla fue agitada a 0◦ C durante 1 hora. A la mezcla de reacci´ on agitada fr´ıa se le a˜ nadi´ o 59.7 g (297 mmol) de ´eter 4,4’-diclorobutilo gota a gota durante 15 minutos. Se o durante 48 horas. La mezcla de reacci´on fue diluida por adici´ on de calent´o la mezcla a 24◦C y se agit´ 600 mL de agua. El estrato acuoso fue separado, lavado con 200 mL de ´eter diet´ılico y luego acidificado a pH 5.0 (rojo Congo) con cerca de 150 mL de 6N a´cido hidrociorh´ıdrico. La soluci´ on a´cida acuosa 6

ES 2 148 733 T3 fue extra´ıda tres veces con porciones de 300 mL de dietilo-´eter. Se combinaron los extractos et´ereos, se on bajo presi´ on lavaron con agua salina, se secaron sobre MgSO4 y se extrajo el solvente por evaporaci´ reducida para dar el producto como un aceite. Se destil´ o el aceite a 160◦C a 3 mm Hg para dar 66.7 g de ´acido 6,6’-oxibis(2,2-dimetilhexanoico), punto de fusi´ on 49-51◦C. 5

An´ alisis calculado para C16 H30 O5 : C, 63.47; H, 9.88. 10

Hallado: C, 63.75; H, 10.00. Ejemplos 2 a 9 Siguiendo el procedimiento general del Ejemplo 1, se prepararon los siguientes compuestos:

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Acido 7,7’-oxibis(2,2-dimetilheptanoico), Acido 5,5’-oxibis(2,2-dimetilpentanoico), Acido 4,4’-oxibis(2,2-dimetilbutanoico), Acido 8,8’-oxibis(2,2-dimetiloctanoico), Etilo 2,2-dimetil-5-(4-metil-4-etoxicarbonilpentiloxi)pentanoato, Etilo 2,2-dimetil-6-(5-metil-5-etoxicarbonilhexiloxi)hexanoato, Metilo 2,2-dimetil-8-(7-metil-7-metoxicarboniloctiloxi)octanoato, y Acido 7-(4-metil-4-hidroxicarbonilpentiloxi)-2,2-dimetilheptanoico. Como se ha se˜ nalado anteriormente, los dialquilo-´eteres de esta invenci´on son u ´tiles para tratar y prevenir enfermedades vasculares como la cardiopat´ıa coronaria, ataque al coraz´ on, restenosis y similares, por virtud de su capacidad de disminuir los niveles de colesterol en el plasma de triglic´eridos lipoprote´ınicos como LDL, y aumentar los niveles de colesterol HDL. Los compuestos son particularmente eficaces para reducir las Lp(a), as´ı como para aumentar el colesterol HDL. La capacidad de los derivados de los dialquilo-´eteres de la F´ormula I para disminuir las Lp(a) y elevar el colesterol HDL se determin´o en estudios in vivo utilizados rutinariamente por los expertos en la materia. Se llevaron a cabo estudios animales en ratas seg´ un el protocolo siguiente. Se obtuvieron ratas macho Sprague-Dawley (100-200 g) de Charles River Laboratories; se distribuyeron de 3 a 6 ratas por jaula y se les suministr´ o Purina rat chow y agua ad libitum en habitaciones con temperatura controlada, con un ciclo luz/oscuridad de 12 horas empezando con el encedido de luces a las 6.AM. A las ratas se les suministr´ o las dosis diariamente entre las 6 y las 9 AM mediante alimentaci´on forzada oral con compuestos de prueba disueltos o suspendidos en un veh´ıculo 0.2 % Tween-20 m´as 1.5 % de carboximetilcelulosa (en agua) o con veh´ıculo solo. El volumen de veh´ıculo represent´o el 0.25 % del peso corporal y se us´ o gemfibrozil (100 mg/kg/d) como un agente de referencia para todos los estudios. De los compuestos de prueba se administraron hasta 100 mg/kg/d durante 7 a 14 d´ıas. Las ratas que estaban en ayunas fueron sacrificadas con inhalaci´ on de ´eter, pesadas, desangradas por el coraz´ on y sometidas a hepaticotom´ıa para determinar el peso del h´ıgado. La sangre fue vertida en tubos vacutainer que conten´ıan EDTA (´ acido etilendiaminotetrac´etico) para el aislamiento del plasma. Se introdujo sangre de simio cynomolgus directamente en los tubos vacutainer para el aislamiento del suero y del plasma. Los simios cynomolgus machos (macaca fascicularis) se obtuvieron de Charles River Laboratories (Wilmington, MA), se les aloj´o individualmente y se les aliment´ o con una dieta diaria consistente en 20 galletas para simios chow normales (Raiston Purina, St. Louis, MO) y fruta (1 banana y 12 uvas). Los simios fueron previamente adiestrados en dispositivos b´ asicos para contener primates (Primate Products, Woodside, CA) y tambi´en se les equip´o con puertos de acceso vasculares (Norfolk Medical Products, Skokie, IL) para obtener muestras de sangre. Se estudiaron los efectos del compuesto del Ejemplo 1 aumentando las dosis. A lo largo de un per´ıodo de tres semanas, se obtuvieron tres muestras de sangre fundamentales previas al estudio de los simios atados en las sillas de contenci´on a trav´es de los puertos vasculares. Para los estudios con el Ejemplo 1, se contuvo a los simios en sillas y se les suministraron oralmente dosis diarias por alimentaci´on forzada con 3 mg/kg (Semana 1), 10 mg/kg (Semana 2), y 30 mg/kg (Semana 3) del compuesto del Ejemplo 1 suspendido en un 0.2 % de Tween-20 m´ as 1.5 % de veh´ıculo de carboximetilcelulosa entre las 5 y las 7 AM. Durante el per´ıodo de estudio, se extrajo sangre semanalmente, 24 horas despu´es del suministro de la dosis de los animales en ayunas. Se obtuvieron 7

ES 2 148 733 T3 muestras de sangre adicionales de simios en ayunas 1 semana despu´es de cesar el tratamiento con el Ejemplo 1. El consumo de alimentos y el comportamiento observado fue normal a lo largo del estudio.

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Las muestras de plasma de simio fueron mantenidas en hielo, repartidas en partes al´ıcuotas en m´ ultiples tubos microfuge y r´ apidamente congeladas y almacenadas a -70◦C. Las muestras de suero alisis para enzimas espec´ıficas del suero o alb´ umina como se desfueron almacenadas a 4◦ C antes del an´ cribe m´as adelante. An´ alisis de la muestra

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Los triglic´eridos fueron determinados usando un equipo disponible comercialmente (Trigli-cinct2, Sclavo, Siena, Italia, o Triglyceride G, Wako Pure Chemical Industries, Ltd; Osaka, Jap´ on). Se determinaron enz´ımicamente los colesteroles totales en el plasma como se describe en Allain, et al., Clin. Chem., 20:470-474 (1974). Se determinaron los niveles de lipoprote´ınas del colesterol total en el plasma por an´ alisis en l´ınea postcolumna sobre Superose 6 por cromatograf´ıa de gel de alto rendimiento (HPGC), en un Rainin HPLC (ver Kieft, et al., J. Lipid Res., 32:859-866 (1991)). Se determin´ o el colesterol lipoprote´ınico a partir de la determinaci´on del colesterol total y el porcentaje de distribuci´ on del a´rea del colesterol determinado por HPGC. Las apolipoprote´ınas A-I y E en todo el plasma fueron cuantificadas por inmunoelectroforesis de “cohete” por el m´etodo de Laurell, et al., Methods Enzymol, 73:339-369 (1981) usando anticuerpos criados en un conejo contra apolipoprote´ınas A-I de rata, en una cabra contra apolipoprote´ınas E de rata (de Dr Patrick Tso, LSU Medical Center, Shreveport, LA). Se diluyeron muestras de plasma en 4 M de urea, Trit´ on X-100 al 1 %, 12 mM de Tricina, 40 mM de Tris, 0.6 mM de lactato de calcio, azida de sodio al 0.01 %, pH 8.2, y se incubaron durante 60 minutos a 52◦C antes de la inmunoelectroforesis. Se realizaron diluciones apropiadas de plasma de rata para determinar que las apolipoprote´ınas estaban en el margen lineal de la evaluaci´ on. La inmunoelectroforesis se efectu´o sobre pel´ıcula de GelBond (Cat 53748, FMC Bioproducts, Rockland, ME) normalmente conteniendo o bien apolipoprote´ınas A-I al 4 % de conejo anti-rata, o bien apolipoprote´ınas E al 2 % antisuero de cabra anti-rata en 1 % de agarosa, 2 % de polietilenoglicol 6000 en 24 mM de Tricina, 80 mM de Tris, y 1.2 mM de lactato de calcio. La altura del “cohete” fue determinada sobre geles de amido te˜ nidos de negro. Para el an´alisis de los datos, las apolipoprote´ınas en plasma de animales en los grupos de control fueron arbitrariamente establecidas a 100.

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Se evaluaron las apolipoprote´ınas B de rata en placas de microvaloraci´ on con modificaciones menores seg´ un lo descrito por Rifai, et al., Clin. Chem., 32:957-961 (1986), es decir, un m´etodo inmunoturbidom´etrico que utiliza anticuerpos para apolipoprote´ınas B de rat´ on criadas en ovejas que reacciona con apoliporpote´ınas B de rata. Las muestras de plasma de animales experimentales (5, 10, 20 y 30 µL) o un est´ andar de plasma lavado de rata (0-50 µL) fueron combinadas con 2 m de urea, suero de apolipoprote´ınas B al 10 % de oveja anti-rat´ on, 1.6 % de polietilenoglicol 8000 (concentraciones finales) en un volumen total de 200 µL de agua salina fosfato-tamponada. La turbidez (OD = 340 nm) fue determinada inicialmente y despu´es de una incubaci´ on durante la noche a temperatura ambiente utilizando un espectrofot´ ometro de absorbencia de 96-pocillos Titertek Multiscan MCC/340MK II (Flow Laboratories). Se utiliz´ o una diluci´ on apropiada de plasma de rata (normalmente 10 µL) para determinar las apolipoprote´ınas B en el margen lineal de la evaluaci´ on. Para el an´ alisis de los datos, se compararon los niveles de apopolipoprote´ınas B en el plasma de los animales tratados con el medicamento con los que se obtuvieron en el grupo de control que fue arbitrariamente establecido a 100 para cada experimento. Los niveles de Lp(a) en simios fueron evaluados con un equipo ELISA de Lp(a) disponible comercialmente (Apo-Tek Lp(a) Elisa test System, Organon Teknika, Biotechnology Research Institute) desarrollado para la detecci´ on de la Lp(a) humana. La Lp(a) es cuantificada por una t´ecnica con una disposici´on a modo de emparedado en la que las apolipoprote´ınas (a) capturadas por las anti-apolipoprote´ınas (a) (placas de microvaloraci´on revestidas) son determinadas por su asociaci´ on con apolipoprote´ınas B por un anticuerpo soluble enz´ımicamente ligado. Las curvas est´andar generadas con plasma humano y de simio cynomolgus eran paralelas, sugiriendo que esta evaluaci´ on podr´ıa ser usada para cuantificar la Lp(a) de simio cynomolgus. Las mediciones de Lp (a) para todos los plasmas de simio cynomolgus se determinaron en una u ´nica evaluaci´ on realizada por triplicado para muestras descongeladas s´ olo una vez. En ratas alimentadas con chow, se compar´o el gemfibrozil al compuesto del Ejemplo 1 por su potencial para influir en una variedad de par´ ametros de los l´ıpidos. Estos datos representan los datos recogidos de diferentes estudios separados de una semana y un u ´nico estudio de dos semanas (N = 8 ratas/grupo). 8

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Los datos para cada estudio se normalizaron a valores obtenidos con las ratas tratadas con veh´ıculo de cada estudio. El gemfibrozil (100 mg/kg/d) no tuvo efecto alguno sobre las apolipoprote´ınas A-I del plasma, las cuales aumentaron principalmente en las dosis m´as altas del compuesto del Ejemplo 1. Las apolipoprote´ınas E aumentaron s´ olo ligeramente con gemfibrozil, pero la dosis dependiente del Ejemplo 1 se elev´o marcadamente. Estos datos se basan ampliamente en estudios de una semana (1 semana, N = 30; 2 semana, N = 8) y, en consecuencia, no reflejan el aumento marcado de apolipoprote´ınas E de plasma observado con gemfibrozil a las 2 semanas. Tanto el gemfibrozil como el compuesto del Ejemplo 1 redujeron significativamente las apolipopprote´ınas B. Estos cambios de apolipoprote´ına pueden tambi´en apreciarse como ratios, bien de apolipoprote´ına E y apolipoprote´ına B, bien de apolipoprote´ına A-I y apolipoprote´ına B. Los par´ ametros de los l´ıpidos del plasma que incluyen el colesterol total, el colesterol lipoprote´ınico y los triglic´eridos se ven tambi´en influidos favorablemente por el compuesto del Ejemplo 1 (Figura 2). El colesterol del plasma total disminuy´ o ligeramente con 100 mg/kg de gemfibrozil pero se aument´o en forma dependiente de la dosis por el compuesto del Ejemplo 1. Este efecto se reflej´ o principalmente en el aumento del colesterol HDL. Tanto el gemfibrozil como el Ejemplo 1 redujeron el colesterol VLDL y el LDL. Estos efectos pueden considerarse como el ratio de colesterol HDL y VLDL m´as el colesterol LDL, donde 100 mg de gerrifibrozil aumentaron este ratio a un nivel similar al de 10 mg del Ejemplo 1 (1 a 2 veces), mientras que los niveles m´as altos (30-100 mg) del Ejemplo 1 aumentaron m´as este ratio alcanzando un aumento de 8 a 9 veces en la m´axima concentraci´ on evaluada. Tanto el gemfibrazil como el compuesto del Ejemplo 1 redujeron los triglic´ oridos del plasma.

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Se us´ o la cromatograf´ıa de gel de alto rendimiento (HPGC) para caracterizar los niveles de colesterol lipoprote´ınico en ratas (Figura 3) y simios cynomolgus tratados con el compuesto del Ejemplo 1 (Figura 4). La Figura 3 muestra los niveles de colesterol lipoprote´ınico de ratas (8/grupo) tratadas solo con veh´ıculo, 100 mg/kg/d gemfibrozil o 1, 3, 10, 30, o 100 mg/kg/d del compuesto del Ejemplo 1 durante 2 semanas. Cada nivel es de una u ´ nica rata. Todos los niveles son extra´ıdos a la misma escala, y se expone el nivel de la primera rata del grupo de control (nivel oscurecido) delante de cada grupo de tratamiento para su comparaci´on. Los niveles del grupo gemfibrozil a 100 mg/kg/d eran similares a los del Ejemplo 1 compuesto de 3 a 10 mg/kg/d. Con dosis de tratamiento del Ejemplo 1, los efectos sobre el colesterol lipoprote´ınico son m´ as exagerados, incluyendo la atenuaci´ on de VLDL y colesterol LIDL y aumento de colesterol HDL. Tambi´en se us´o HPGC para caracterizar los niveles de colesterol lipoprote´ınico en tres simios machos cynomolgus antes, durante y despu´es del tratamiento con el compuesto del Ejemplo 1. Estos animales fueron preseleccionados para representar animales con ratios de colesterol LDL y HDL altos, medios, o bajos. Los tres niveles fundamentales de cada simio fueron esencialmente id´enticos, se recogieron estos datos y se hall´ o la media para generar un nivel fundamental representativo. Un tratamiento de una semana con 3 mg/kg/d del compuesto del Ejemplo 1 no influy´ o en el nivel de colesterol lipoprote´ınico. Sin embargo, el tratamiento con 10 mg/kg/d del Ejemplo 1 durante la Semana 2, y 30 mg/kg/d durante la Semana 3, hizo decrecer progresivamente el VLDL, LDL, y el colesterol HDL, el cual comenz´ o a recuperarse y a controlar los niveles en dos de los tres simios despu´es de un periodo de una semana de cistoclisis. En primates, el colesterol de Lp(a) contribuye a la ascensi´ on del valor m´ aximo de LDL. Con tratamientos progresivos, el valor m´ aximo de LDL se volvi´o m´as sim´etrico, posiblemente reflejando un decrecimiento en la Lp(a). En consecuencia, la Lp (a) fue medida directamente por ELISA (Figura 5). La estimaci´ on de la cantidad directa de Lp (a) demostr´ o una reducci´on en la dependencia de la dosis en los niveles de Lp(a), consiguiendo reducciones del 62 %, 83 %, y 89 % (78 ± 8 % promedio) a la dosis del Ejemplo 1 de 30-mg/kg, independientemente de los niveles basales en tres simios (Figura 5). Despu´es de un periodo de una semana de cistoclisis, la Lp(a) se acercaba o exced´ıa los niveles de antes del tratamiento.

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A diferencia de las ratas, en las que el HDL se elev´o marcadamente durante el tratamiento con el compuesto del Ejemplo 1, el compuesto caus´ o un decrecimiento en el colesterol HDL en el simio cynomolgus. La reducci´on de HDL en el simio cynomolgus puede reflejar un alto nivel de prote´ına de transferencia del colesterilo-´ester (CETP) en estas especies. El plasma de rata tiene poca o ninguna actividad CETP. Unos niveles altos de CETP pueden, en consecuencia, acelerar el nivel de transferencia del colesterol HDL al LDL y precursores del LDL, resultando en la disminuci´ on del nivel de colesterol HDL. Los an´alisis del nivel de actividad CETP en conejos y en varios primates demuestran que los niveles de plasma CETP en los simios cynomolgus son notablemente m´as altos (de 10 a 12 veces) que en los seres humanos (Figura 6). En consecuencia, un resultado esperado para el tratamiento de seres humanos con el compuesto de esta invenci´on incluye la reducci´ on de VLDL, LDL, y el colesterol Lp (a), y la elevaci´on del colesterol HDL.

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Las Figuras 1 a 6 muestran los resultados de la evaluaci´ on biol´ogica de los compuestos de la invenci´on. Se muestran los resultados para el compuesto preferido del Ejemplo 1. La Figura 1 da la estructura del compuesto preferido del Ejemplo 1, y lo identifica como “PD 72953,” que es el t´ermino utilizado en algunas de las figuras para referirse al compuesto del Ejemplo 1. El agente de referencia es gemfibrozil, a veces referido en las figuras como “CI-719.” La Figura 2 muestra los efectos del compuesto del Ejemplo 1 cuando se administra a ratas alimentadas con chow. A las ratas macho Sprague-Dawley se les administr´ o oralmente una dosis diaria con veh´ıculo carboximetilcelulosa/tween, gerrifibrozil, o el compuesto del Ejemplo 1 a las concentraciones indicadas entre las 6 y las 9 AM durante 7 d´ıas. Durante una experimentaci´on de 14 d´ıas se trat´ o a ocho ratas en el grupo de control, ocho ratas en el grupo gemfibrozil, y ocho ratas en cada uno de los grupos del Ejemplo 1 con dosis de 1, 3, 10, 30, y 100 mg/kg/d. Se dej´ o alimentos y agua ad libitum a los animales y se les sacrific´o por inhalaci´ on de ´eter aproximadamente 12 horas despu´es de la u ´ ltima dosis. El colesterol total y los triglic´eridos fueron determinados enz´ımicamente. Los niveles de lipoprote´ına fueron determinados por cromatograf´ıa de gel de alto rendimiento cuantitativo (HPGC). Las a´reas del valor m´aximo de HPGC (ver Figura 3 para el ejemplo) m´ as los datos del colesterol de plasma total fueron usados para determinar el colesterol en las fracciones lipoprote´ınicas. Las apolipoprote´ınas A-I y E fueron determinadas por inmunoelectroforesis. La apolipoprote´ına B fue determinada por un m´etodo immunoturbidom´etrico. En el d´ıa 14 del experimento, la actividad hep´atica carnitina de la aciltransferasa fue determinada como una indicaci´ on de la actividad de la enzima peroxisomal. Esta metodolog´ıa es descrita por Krause, et al., Pharmacol Res., 29:345-357 (1994). Estos datos indican que el Ejemplo 1 causa un aumento de la dependencia a las dosis en esta actividad, teniendo la activaci´ on similar a la del gemfibrozil con dosis de 100-mg/kg/d. Los datos representan el significado ± SEM para valores determinados con respecto al grupo de control de nueve experimentos separados.

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Se trat´ o a las ratas como se ha descrito anteriormente para la Figura 2. El plasma fue sometido a HPGC para determinar la distribuci´ on del colesterol en las lipoprote´ınas. Todos los niveles de cada grupo de ocho ratas fueron extraidos a la misma escala dentro de un grupo y entre los grupos. Se expone un nivel de referencia de la primera rata en el grupo de control en cada grupo de tratamiento de ocho ratas. 30

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Se us´ o HPGC para analizar los niveles de colesterol lipoprote´ınico en 10 µL de plasma de tres simios cynomolgus (Simios 90-98, 90-122, 90-182) antes y durante el tratamiento, y siguiendo una semana de cistoclisis del Ejemplo 1. Durante el aumento de la dosis en per´ıodos de tratamiento semanales, se administraron las dosis indicadas del Ejemplo 1 a una dosis diaria por alimentaci´on forzada oral en un veh´ıculo de carboximetilcelulosa/tween entre las 5 y las 6 AM en ayunas. Se extrajeron las muestras de sangre en las fechas indicadas antes de la dosis y en ayunas. Se aliment´o diariamente a los animales con 20 galletas para simios chow normales, 12 uvas, y 1 pl´atano. Los niveles de las tres muestras basales de cada simio fueron esencialmente id´enticos, y se calcul´o el promedio de estos tres niveles para cada simio para generar un nivel representativo. T´engase en cuenta que el valor m´aximo de LDL se reduce y se vuelve m´as sim´etrico a medida que el tratamiento procede, sugiriendo una reducci´on en Lp (a). Se determin´ o la Lp(a) con un equipo ELISA disponible a la venta. Las muestras de plasma de cada herida fueron repartidas en partes al´ıcuotas en vol´ umenes peque˜ nos (100 µL) y congeladas a -70◦C. La Lp(a) de todas las muestras de plasma fue determinada en la misma evaluaci´ on. Los datos mostrados en la Figura 5 representan el nivel basal absoluto (panel superior) y relativo de los tres simios en la Figura 4 (panel inferior). La actividad de la prote´ına de transferencia del colesterilo-´ester (CETP), como se muestra en la Figura 6, fue determinada en una variedad de una especie de primate y en los conejos alimentados con chow y colesterol. La actividad de la CETP fue determinada en todo el plasma por determinaci´ on del ratio de transferencia de un colesterilo-ester sint´etico fluorescente contenido an´ alogamente en microemulsiones por el m´etodo de Bisgaier, et al., Lipid Res., 34:1625-1634 (1993). Para comparar la eficacia relativa del compuesto del Ejemplo 1 a otros compuestos de esta invenci´ on, se llev´o a cabo un experimento de una semana en ratas alimentadas con chow. A las ratas macho Sprague-Dawley se les administr´ o oralmente un veh´ıculo de carboximetilcelulosa/tween o los compuestos de la invenci´on indicados en la Figura 7 (ver lista dentro de la figura para estructuras) a 30 mg/kg/d entre las 6 y las 9 AM durante 7 d´ıas. Se suministr´ o a los animales alimentos y agua ad libitum y se sacrificaron por inhalaci´ on de ´eter aproximadamente 12 horas despu´es de la u ´ ltima dosis. Se determinaron los triglic´oridos del plasma, el colesterol del plasma total, la distribuci´on de colesterol entre lipoprote´ınas, y las apolipoprote´ınas tal y como se ha descrito anteriormente.

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ES 2 148 733 T3 La Figura 7 muestra los resultados de la prueba anterior. La figura muestra que el compuesto preferido del Ejemplo 1 baja espectacularmente los triglic´eridos del plasma y el colesterol VLDL, y eleva el colesterol HDL. 5

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Tambi´en se ha demostrado que los dialquilo-´eteres aumentan la sensibilidad a la insulina, y, como tal, son u ´ tiles para aumentar la utilizaci´on de glucosa en animales diab´eticos y para tratar la diabetes, particularmente la diabetes mellitus no insulinodependiente. Los compuestos de la invenci´ on en una evaluaci´on est´andar que utiliza adipocitos 3T3-L1, que son particularmente sensibles a la insulina, es decir, la ingesti´ on de az´ ucar puede ser plenamente activada de 15 a 20 veces por la insulina. La metodolog´ıa utilizada para la evaluaci´ on detalle por Frost, et al., J. Biol. Chem., 260:2646-2652 (1985). Espec´ıficamente, las c´elulas fibroblast 3T3-L1 de la de cultivo de tipo americano (ATCC, Rockville, MD). Las c´elulas fueron cultivadas a confluencia y diferen se trataron las c´elulas confluyentes con 167 mm de insulina, 0.25 µM de isobutilmeffixantina en 10 % de suero bovino fetal (FBS) conteniendo Dulbecco’s Eagle’s Medium (DMEM). Dos d´ıas m´as tarde, los medios a DMEM, conteniendo 167 nm de insulina y 10 % de FBS. Los medios entonces cambiados a 10 % DMEM y cambiados cada dos d´ıas hasta la recogida. Los compuestos experimentales fueron solubilizados en dimetilsulf´ oxido, incluidos en los medios del D´ıa 0 y nuevamente cargados con cada cambio de medios. La diferenciaci´on fue constatada para visualizar la acumulaci´on de gotitas de grasa en las c´elulas. El transporte de glucosa fue medido para cuantificar la un la metodolog´ıa descrita incorporaci´ on de deoxiglucosa [14C] en las c´elulas diferenciadas el D´ıa 9, seg´ por Sandouk, et al., Endocrinolog´ıa, 133:352-359 (1993). La Figura 8 muestra los resultados de la evaluaci´ on celular de los compuestos representativos de la invenci´on. El transporte de glucosa fue constatado a niveles basales, indicativo de la expresi´ on del transportador de glucosa Glut 1 en estos adipocitos cultivados. La troglitazona, un compuesto que se desarrolla cl´ınicamente como un agente para aumentar la utilizaci´ on de glucosa en animales y en seres humanos (descrita completamente en el Ejemplo 2, Patente de EEUU N◦ 4,572,912), fue incluido como un compuesto de referencia, produciendo un 70 % del aumento en el transporte de glucosa en estas c´elulas a 5 µM. Esta actividad de la troglitazona es indicativa de sus acciones sobre la insulina. De los compuestos de la invenci´on evaluados, los compuestos de prueba del Ejemplo 1 y del Ejemplo 2 produjeron un aumento notable en la actividad de transporte de la glucosa, con el compuesto del Ejemplo 2 que causa una estimulaci´on doble. Los compuestos de invenci´on fueron valorados a 100 µM. Como se puede ver en los datos anteriores, los dialquilo-´eteres de esta invenci´on son eficaces para reducir la Lp (a), los triglic´eridos, la apolipoprote´ına B, el colesterol VLDL y el colesterol LDL. Los compuestos tambi´en elevan la apolipoprote´ına A-I, la apolipoprote´ına E, el colesterol HDL, y el ratio HDL/(VLDL + LDL). Como tal, los compuestos son u ´tiles para tratar y prevenir las enfermedades vasculares y la diabetes mellitus no insulinodependiente. Otra forma de realizaci´on de esta invenci´on es un m´etodo de tratamiento y prevenci´ on de la enfermedad vascular y la diabetes incluyendo la administraci´ on a un mam´ıfero que necesite de tratamiento de una cantidad eficaz de un compuesto seg´ un la F´ ormula I. Una “cantidad eficaz” es la dosis requerida para tratar o impedir la enfermedad vascular o la diabetes del mam´ıfero. Los compuestos ser´ an administrados generalmente a una dosis de unos 50 a cerca de 5000 mg/d´ıa, m´ as generalmente de unos 50 a cerca de 2000 mg/d´ıa. Un r´egimen de dosificaci´on empleado com´ unmente ser´a de unos 50 a cerca de 300 mg administrado de una a cuatro veces al d´ıa. Estos mismos niveles de dosificaci´on se emplear´ an para el tratamiento y la prevenci´ on de la enfermedad vascular, as´ı como para reducir espec´ıficamente el nivel en el plasma de Lp (a) y elevar el colesterol HDL en el plasma, y para tratar y prevenir la diabetes. Otra forma de realizaci´ on de esta invenci´on son las formulaciones farmac´euticas que incluyen un compuesto seg´ un la F´ ormula I junto a un excipiente, soporte o diluyente farmac´euticamente aceptable. Los compuestos pueden ser formulados para la conveniente administraci´ on en forma oral o parenteral, prefiri´endose la administraci´ on oral. Los soportes y excipientes farmac´euticos t´ıpicos utilizados en las formulaciones orales incluyen lactosa; sucrosa; almidones como el almid´ on de ma´ız y el almid´ on de patata; derivados de celulosa como la metil y etilcelusosa; gelatinas; talco; aceites, como aceites vegetales, aceite de s´esamo, aceite de semilla de algod´on; y glicoles como polietilenoglicol. Las preparaciones orales ser´ an, normalmente, en forma de comprimidos, c´apsulas, emulsiones, soluciones, y similares. Tambi´en se pueden utilizar las formulaciones de liberaci´ on controladas como por ejemplo, aquellas que usan una matriz polim´erica o una bomba osm´ atica, o similar. Las formulaciones t´ıpicas contendr´an de un 5 % a cerca de un 95 % en peso de dialquilo-´eter administrado con el excipiente o soporte. Se pueden incorporar agentes aromatizantes como el aroma de cereza y el aroma de naranja. Para la administraci´ on parenteral y la administraci´ on conveniente intramuscular e intravenosa, los 11

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compuestos pueden ser formulados con diluyentes como salina isot´ onica, glucosa acuosa al 5 %, y similares. Los compuestos tambi´en pueden incluir en su f´ ormula ceras y geles en forma de supositorios. Los compuestos tambi´en son adecuados para la administraci´ on transd´ermica, y pueden ser formulados con penetrantes y similares en forma de parches. El ejemplo siguiente as´ı lo ilustra con formulaciones t´ıpicas de esta invenci´on. Ejemplo 10 Ingrediente

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´cido 2,2-dimetil-6-(3-metil-3-hidroxi-carbonilbutiloxi) a hexanoico Lactosa Magnesio Estearata

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Cantidad

1000 g 960 g 40 g

Se mezclan los ingredientes hasta quedar homog´eneos y se introducen en #4 c´apsulas duras de gelatina. Cada c´ apsula es llenada con 200 mg de la mezcla y contiene 100 mg de dialquilo-´eter activo. Las c´apsulas son administradas a un adulto humano en una proporci´ on de una a tres cada d´ıa para bajar la Lp(a) en el plasma. Ejemplo 11

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Acido 2,2-dimetil-6-(6-metil-6-etoxi-carbonilheptiloxi)hexanoico Lactosa Almid´ on de ma´ız Gelatina Agua Magnesio Estearato

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Cantidad 3000 g 750 g 300 g 120 g 1000 cc 20 g

Dialquilo-´eter, lactosa, y 150 g de almid´on de ma´ız son mezclados con una soluci´ on de la gelatina en el agua. La granulaci´ on mojada es filtrada, secada, y refiltrada. Los gr´ anulos secos son mezclados con el estearato de magnesio y el almid´on de ma´ız que queda, y la mezcla es comprimida en tabletas de 698-mg, para las que usan troqueles c´ oncavos est´andar de 15/32 pulgadas. Cada tableta contiene 500 mg de ´eter de dialquilo. Ejemplo 12 Ingrediente

Cantidad

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Acido 6,6-oxibis(2,2-dimetilhexanoico) Monoestearato de sorbita de polioxietileno Carboximetilcelulosa de sodio Silicato de alumina de magnesio complejo Az´ ucar Glicerina Benzoato de sodio Citrato de sodio Colorante rojo autorizado Aroma de cereza Agua destilada qs

0.4 g 0.1 cc 0.3 g 0.5 g 10 g 2 cc 0.5 g 0.2 g 1 mg 0.02 cc 100 cc

El monoestearato de sorbita de polioxietileno puede ser un producto como polisorbato 60 o Tween 60. El silicato de alumina de magnesio complejo es un agente de formaci´on de gel. Se puede usar un producto como Veegum H.V. Esta sustancia durante la noche en 10 cc de agua destilada. Se obtiene una 12

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mezcla a partir del monoestearato de sorbita de polioxietileno, la imitaci´ on del aroma de cereza, 30 cc de agua destilada, y el dialquilo´eter y se pasa a trav´es de un homogenizador. Se agrega con una agitaci´ on vigorosa az´ ucar, glicerina, citrato de sodio, benzoato de sodio, y carboximetilcelutosa de sodio, seguida de sificato de alumina de magnesio complejo hidratado y una soluci´ on en 2 cc de agua. La suspensi´on resultante es homogenizada, ajustada a pH 5.0 con a´cido c´ıtrico, y diluida a un volumen final de 100 cc con agua destilada. Una unidad de dosificaci´ on oral de 55-cc de esta suspensi´ on contiene 200 mg del dialquilo´eter. Si se desea, y la imitaci´on del aroma de cereza antes y agentes aromatizantes. Una forma de realizaci´ on preferida de esta invenci´ on es aquella que utiliza los dialquilo-´eteres para prevenir y tratar la diabetes mellitus no insulinodependiente y sus condiciones anteriores. La diabetes mellitus no insulinodependiente (NIDDM), o tambi´en denominada diabetes de Tipo II, es la forma de diabetes mellitus que afecta predominantemente a adultos, cuya producci´ on de insulina es adecuada para el uso, pero pose un defecto en la utilizaci´ on de la insulina mediada y en el metabolismo de la glucosa en texturas perif´ericas. NIDDM se caracteriza por tres principales anormalidades metab´ olicas: resistencia a la disposici´on de glucosa mediante la insulina, deterioro en la secreci´on de insulina nutritivoestimulada, y sobreproducci´ on de glucosa por parte del h´ıgado. Las personas que llegan a desarrollar NIDDM aparentemente lo hacen as´ı porque sus c´elulas B no pueden mantener eventualmente una secreci´on de insulina suficiente para compensar la resistencia a la insulina. Los mecanismos responsables del fallo de la c´elula B no han sido identificados, pero se pueden relacionar con las demandas cr´onicas de las c´elulas B por la resistencia a la insuina perif´erica y/o a los efectos de hyperglicemia al la funci´ on de la c´elula B. El fallo de la c´elula B podr´ıa tambi´en ocurrir como una falta independiente e inherente en individuos “pre-diab´eticos”.

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La NIDDM a menudo se desarrolla en poblaciones con cierto riesgo, una de esas poblaciones es la de los individuos con s´ındrome de ovario polic´ıstico (PCOS). El PCOS es el desorden endocrino m´ as com´ un entre las mujeres en edad f´ertil. Este s´ındrome se caracteriza por el hiperandrogenismo y una secreci´on desordenada de gonadotropina que produce oligovulaci´ on o anovulacion. 30

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El PCOS se relaciona con una resistencia profunda a la insulina que resulta en una hiperinsulinemia substancial. Debido a su resistencia a la insulina, las mujeres con PCOS tienen m´ as riesgo de desarrollar NIDDM. El hirsutismo, el acn y la alopecia, sufridos com´ unmente por las mujeres con PCOS, son manifestaciones cl´ınicas de hiperandrogenismo. Los desordenes menstruales y la infertilidad son resultado de una disfunci´ on ovulatoria relacionada con la secreci´on desordenada de gonadotropina. El exceso de andr´ ogenos, probablemente por conversi´ on eventual de andr´ ogenos a estr´ogenos, tambi´en desempe˜ na un papel importante en la interrupci´ on de la liberaci´on de la gonadotropina en PCOS. NIDDM tambi´en se desarrolla en las poblaciones de individuos con riesgo de diabetes mellitus gestacional (GDM). El embarazo normalmente se asocia con la resistencia progresiva a la disposici´ on de glucosa mediante la insulina. De hecho, la sensibilidad a la insulina es m´as baja durante el final del embarazo que en casi todas las otras condiciones fisiol´ ogicas. Se cree que la resistencia a la insulina est´a mediada, en gran parte, por los efectos de las hormonas en circulaci´on como el lact´ageno de placenta, la progesterona, y el cortisol, que aumentan durante el embarazo. Ante la resistencia a la insulina, la capacidad de respuesta a la glucosa de la c´elula B pancre´ atica aumenta normalmente hasta casi 3 veces al final del embarazo, respuesta que sirve para minimizar el efecto de resistencia a la insulina sobre los niveles de glucosa en circulaci´on. As´ı, el embarazo ofrece una mayor determinaci´ on de las tensiones de la capacidad de las c´elulas B para compensar la resistencia a la insulina. Otras poblaciones que se creen que pueden correr el riesgo de desarrollar la NIDDM son las personas con S´ındrome X; las personas con hiperinsulinemia concomitante; personas con resistencia a la insulina caracterizadas por hiperinsulinemia y por falta de respuesta a la insulina ex´ agena; y personas con insulina anormal y/o evidencia de trastornos de glucosa asociados al exceso de glucocorticoides en circulaci´on, hormona de crecimiento, catecolaminas, glucagon, hormona paratiroide, y otras condiciones resistentes a la insulina. Se podr´ıa provocar la mortandad en caso de que no se tratara la NIDDM, debi´endose ´esta a una enfermedad cardiovascular y a otras complicaciones diab´eticas que incluyen retinopat´ıa, nefropat´ıa, y neuropat´ıa perif´erica. Durante muchos a˜ nos el tratamiento de la NIDDM ha implicado un programa cuyo objeto es reducir el az´ ucar en la sangre mediante una combinaci´ on de dieta y ejercicio. Alternativamente, el tratamiento de la NIDDM implicaba agentes hypoglic´emicos orales, como sulfonilureas solas o en combinaci´on con inyecciones de insulina. 13

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En cualquier caso, lo que se precisa es un m´etodo de tratamiento para las poblaciones de riesgo, como aquellas con PCOS y GDM, con el fin de impedir o retrasar de ese modo la aparici´on de la NIDD, aliviando los s´ıntomas, mejorando la calidad de vida, previniendo complicaciones agudas y, a largo plazo, reduciendo la mortandad y tratando los trastornos que los acompa˜ nan de las poblaciones de riesgo de la NIDDM. Los m´etodos de empleo de los compuestos descritos para tratar a las poblaciones de riesgo en condiciones tales como PCOS y GDM con el fin de prevenir o retrasar la aparici´ on de NIDDM, como aqu´ı se se˜ nala, cumplen estos objetivos.

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ES 2 148 733 T3 REIVINDICACIONES 1. Compuesto de la f´ ormula Y2 \ / /\—–( CH2 )n —O—(CH2 )m ——/\ R3 R4 R1 R2

Y1

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I

donde n y m independientemente son n´ umeros enteros de 2 a 9;

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R1 , R2 , R3 , y R4 independientemente, son alquilo C1 -C6 , alquenilo C2 -C6 , alquinilo C2 -C6 y R1 y an unidos, y R3 y R4 junto al carbono al que est´ an unidos, pueden R2 junto al carbono, al que est´ completar independientemente un ciclo carboc´ıclico que tenga de 3 a 6 carbonos; Y1 e Y2 independientemente son COOH, CHO, tetrazol, y COOR5 donde R5 es alquilo C1 -C6 , alquenilo C2 -C6 , alquinilo C2 -C6 ;

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y donde los grupos de alquilo, alquenilo, y alquinilo pueden ser sustituidos con uno o dos grupos seleccionados de halo, hidroxi, alcoxi C1 -C6 , y fenilo, y sus sales derivadas farmac´euticamente aceptables. 2. Compuesto de la Reivindicaci´ on 1 donde R1 , R2 , R3 , y R4 cada uno son alquilo C1 -C6 .

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3. Compuesto de la Reivindicaci´ on 1 donde Y1 e Y2 independientemente son COOH o COOR5 . 4. Compuesto de la Reivindicaci´ on 3 donde Y1 e Y2 independientemente son COOH o COOR5 y R5 es alquilo C1 -C6 .

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5. Compuesto de la Reivindicaci´ on 4 donde R1 , R2 , R3 , y R4 cada uno son el mismo alquilo, e Y1 e Y2 son ambos COOH. 6. Compuesto de la Reivindicaci´ on 5 donde R1 , R2 , R3 , y R4 cada uno, son metilo.

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7. Compuesto de la Reivindicaci´ on 6 donde n y m son el mismo n´ umero entero. 8. Compuesto de la Reivindicaci´ on 7 donde n y m son ambos 4.

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9. Compuesto de la Reivindicaci´ on 8 que es ´acido 6,6’-oxibis-(2,2-dimetilhexanoico). 10. Compuesto de la Reivindicaci´ on 7 donde n y m son seleccionados de 2, 3, 5, o´ 6. 11. Compuesto de la Reivindicaci´ on 10 que es

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Acido Acido Acido Acido

4,4’-oxibis(2,2-dimetilbutanoico); 5,5’-oxibis(2,2-dimetilpentanoico); 7,7’-oxibis(2,2-dimetilheptanoico); o 8,8’-oxibis(2,2-dimetiloctanoico).

12. Compuesto de la Reivindicaci´ on 7 donde Y1 e Y2 son ambos COOR5 . 13. Compuesto de la Reivindicaci´ on 12 donde R5 es metilo. 55

14. Compuesto de la Reivindicaci´ on 13 que es metilo 2,2-dimetil-8-(7-metil-7-metoxicarboniloctiloxi)octanoato. 15. Compuesto de la Reivindicaci´ on 12 donde R5 es etilo.

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16. Compuesto de la Reivindicaci´ on 15 que es etilo 2,2-dimetil-5-(4-metil-4-etoxicarbonil-pentiloxi)pentanoato o etilo 2,2-dimetil-6-(5-metil-5-etoxicarbonilhexiloxi)hexanoato.

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ES 2 148 733 T3 17. Formulaci´on farmac´eutica incluyendo un compuesto de la Reivindicaci´on 1 junto a un diluyente, soporte o excipiente farmac´euticamente aceptable.

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18. Formulaci´on de la Reivindicaci´on 17 empleando un compuesto donde Y1 e Y2 independientemente son COOH o COOR5 donde R5 es alquilo C1 -C6 . 19. Formulaci´on de la Reivindicaci´on 18 empleando un compuesto donde R1 , R2 , R3 , y R4 cada uno son metilo.

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20. Formulaci´on de la Reivindicaci´ on 19 empleando un compuesto donde n y m son lo mismo. 21. Formulaci´on de la Reivindicaci´ on 20 empleando un compuesto donde n y m son ambos 4. 22. Formulaci´on de la Reivindicaci´ on 20 empleando a´cido 6,6’-oxibis-(2,2 -dimetilhexanoico).

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23. Uso de un compuesto seg´ un cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 16 para la producci´ on de una composici´ on farmac´eutica para reducir la Lp (a) en el plasma.

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24. Uso de un compuesto seg´ un cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 16 para la producci´ on de una composici´ on farmac´eutica para prevenir o tratar una enfermedad vascular. 25. Uso de un compuesto seg´ un cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 16 para la producci´ on de una composici´ on farmac´eutica para elevar el colesterol HDL en el plasma.

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26. Uso de un compuesto seg´ un cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 16 para la producci´ on de una composici´ on farmac´eutica para reducir los triglic´ oridos en el plasma. 27. Uso de un compuesto seg´ un cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 16 para la producci´ on de una composici´ on farmac´eutica para prevenir o tratar la diabetes mellitus no insulinodependiente.

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28. Uso de un compuesto seg´ un cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 16 para la producci´ on de una composici´ on farmac´eutica para reducir el colesterol LDL.

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29. Uso de un compuesto seg´ un cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 16 para la producci´ on de una composici´ on farmac´eutica para la reducci´on del colesterol VLDL. 30. Uso de un compuesto seg´ un cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 16 para la producci´ on de una composici´ on farmac´eutica para reducir la apolipoprote´ına B.

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31. Uso de un compuesto seg´ un cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 16 para la producci´ on de una composici´ on farmac´eutica para elevar la apolipoprote´ına A-1 en el plasma. 32. Uso de un compuesto seg´ un cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 16 para la producci´ on de una composici´ on farmac´eutica para elevar la apoliprote´ına E en el plasma.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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