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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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11 N´ umero de publicaci´on: 6

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˜ ESPANA

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C11B 9/00

TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 93302246.9 kFecha de presentaci´on : 24.03.93 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 562 843 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 29.09.93

T3

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54 T´ıtulo: Composiciones de fragancia y otras composiciones que contienen feromonas humanas.

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30 Prioridad: 24.03.92 US 856435

24.06.92 US 907940

4034 Clipper Court Fremont, California 94538, US

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72 Inventor/es: Berliner, David

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74 Agente: D´ıez de Rivera de Elzaburu, Alfonso

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.04.99

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

16.04.99

ES 2 127 247 T3

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73 Titular/es: Human Pheromone Sciences, Inc.

Aviso:

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 127 247 T3 DESCRIPCION Composiciones de fragancia y otras composiciones que contienen feromonas humanas. 5

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Campo de la invenci´ on Esta invenci´on se refiere en general a los campos de productos de cuidado personal, cosm´eticos y fragancias y a composiciones de materias utilizadas en productos de consumo. M´ as espec´ıficamente, la invenci´on pertenece a nuevas composiciones de fragancia y a productos de cuidado personal que contienen tales composiciones de fragancia. Esta invenci´on pertenece tambi´en a la clase de feromonas que son activas en seres humanos, y a la incorporaci´on de feromonas en varias composiciones. T´ ecnica anterior

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La presente invenci´on se refiere a cosm´eticos, particularmente fragancias, y a composiciones de materias que contienen feromonas humanas y que son u ´tiles en la fabricaci´ on de productos de consumo. Las feromonas son productos bioqu´ımicos producidos por un animal o individuo que provoca una respuesta fisiol´ ogica o de comportamiento espec´ıfica en otro miembro de la misma especie. Diferentes feromonas son producidas por los miembros de cada sexo y recibidas por receptores especializados en el paso nasal de miembros del sexo opuesto. Las feromonas humanas referidas en esta invenci´ on son ciertos esteroides de 16-Androsteno y/o Estreno, algunos de los cuales existen por naturaleza en los seres humanos. La clase estero´ıdica de Androstenos est´ an tipificados por testosterona, y se caracterizan por una estructura estero´ıdica de 4 anillos con metilaciones en la posici´on 13 y usualmente en la posici´on 10. Los 16-Androstenos se caracterizan, adem´as, por un enlace doble en la posici´ on 16. Se ha informado que algunos miembros de este grupo act´ uan como feromonas en algunas especies de mam´ıferos -por ejemplo, 5α-Androst-16-en-3α-ol y 5α-Androst-16-en-3-ona en cerdos (Melrose, D. R., y col., Br. vet. J. (1971), 127: 497-502). Estos 16-Androstenos, producidos por el verraco, inducen comportamiento de apareamiento en cerdas en celo (Claus, y col., Experimentia (1979) 35: 1674-1675. Algunos estudios han indicado que, en algunas especies, varias caracter´ısticas de ciertos 16Androstenos (incluyendo 5α-Androst-16-en-3α-ol y 5α-Androst-16-en-3-ona), tales como concentraci´ on en la sangre, metabolismo, y localizaci´on, son sexualmente dimorfas (Brooksbank, y col., J. Endocr. (1972) 52: 239-251; Claus y col. J. Endocr. (1976) 68: 483-484; Kwan y col., Med. Sci. Res. (1987) 15: 1443-1444). Por ejemplo, se han encontrado 5α-Androst-16-en-3α-ol y 5α-Androst-16-en-3-ona, as´ı como 4,16-Androstadien-3-ona, a diferentes concentraciones en la sangre perif´erica, saliva y secreciones axilares de hombres y mujeres (Kwan, T. K. y col. Med. Sci. Res. (1987) 15: 1443-1444). Se ha sugerido la posible funci´ on de algunos 16-Androstenos como feromonas humanas, hasta la extensi´on de afectar a la selecci´on y criterio (Id.; v´ease tambi´en Gower y col., “The Significance of Odorous Steroids in Axillary Odour”, en Perfumery, p´ aginas 68-72, Van Toller and Dodd, Eds., Chapman and Hall, 1988); Kirk-Smith, D. A. y col., Res. Comm. Psychol. Psychiat. Behav. (1978) 3: 379). Se ha reivindicado que el Androstenol (5α-Androst-16-en-3α-ol) muestra una actividad similar a feromonas en una colonia comercial para hombres y en un perfume para mujeres (AndronTM for Men y AndronTM for Women de J¨ovan). El documento de patente japonesa abierto a la inspecci´ on p´ ublica N◦ 2295916 se refiere a composiciones de perfumes que contienen Androstenol y/o su an´ alogo. Tambi´en se ha identificado 5α-Androstadien-3β-ol (y tal vez el 3α-ol) en secreci´on axilar humana (Gower y col., v´ease arriba, en 57-60). Los esteroides de la clase de Estreno est´an tipificados por 17β-Estradiol (1,3,5(10)-Estratrien-3,17βdiol), y est´ an caracterizados por un anillo-A-1,3,5(10) fen´ olico y un hidroxi o derivado hidroxi, tal como un ´eter o ´ester, en la posici´ on 3. Se han descrito las propiedades de feromonas de algunos esteroides de la clase de Estreno para algunas especies de mam´ıferos. Michael, R. P. y col., Nature (1868) 218: 746 se refiere a Estr´ogenos (particulamente Estradiol) como un agente de atracci´ on feromonal de monos Rhesus machos. Parrot, R. F., Hormones and Behavior (1976) 7: 207-215 informa que la inyecci´on de benzoato de estradiol induce comportamiento de apareamiento en ratas ovariectomizadas; y se ha descrito en monos Rhesus el papel del nivel de Estradiol en sangre en la respuesta sexual del macho (Phoenix, C. H., Physiol. and Behavior (1976) 16: 305-310) y en la respuesta sexual de la hembra (Phoenix, C. H., Hormones and Behavior (1977) 8: 356-362). Las feromonas humanas descritas en esta solicitud han sido descritas en los documentos de las patentes internacionales PCT/US92/00219 y PCT/US92/00220.

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El medio de comunicaci´ on m´ as probable de una supuesta feromona humana es la inhalaci´ on de una feromona natural presente en la piel de otro. Varios esteroides de la clase de 16-Androsteno, incluyendo 5α-Androst-16-en-3α-ol y 5α-Androst-16-en-3-ona, 4,16-Androstadien-3-ona, 5,16-Androstadien-3β-ol, y tal vez 5,16-Androstadien-3α-ol, existen por naturaleza en seres humanos y pueden estar presentes en la piel. Se estima que la concentraci´on m´axima de todos los esteroides 16-Androsteno que existe por naturaleza en la piel humana es de 2 a 7 µg/cm2 . Se estima que durante el contacto ´ıntimo un ser humano estar´ıa expuesto a no m´as de 700 µg de un esteroide que existe en la naturaleza. Puesto que estos compuestos son relativamente no vol´atiles, se estima que, incluso durante el contacto ´ıntimo, un sujeto humano inhalar´ıa no m´ as de 0,7 pg de un esteroide que existe en la naturaleza desde la piel de otro. La presente invenci´ on es efectiva porque suministra una cantidad de los esteroides de feromonas activos mucho mayor que el contacto ´ıntimo normal entre individuos. No obstante, existe poco acuerdo en la bibliograf´ıa con relaci´on a si alguna supuesta feromona juega o no realmente un papel en el comportamiento sexual o reproductivo de mam´ıferos, particularmente de humanos. V´ease: Beauchamp, G. K. y col., “The Pheromone Concept in Mammalian Chemical Communication: A Critique”, en: Mammalian Olfaction, Reproductive Processes, and Behavior, Doty, R. L., Ed., Academic Press, 1976. V´ease tambi´en, Gower y col., arriba en 68-73. Los receptores de feromonas se encuentran en el ´organo vomeronasal (VNO), una estructura peque˜ na que se abre al paso nasal en individuos normales (Moran, D. T., y col., J. Steroid Biochem. and Molec. Biol. (1991) 39: 545; Stensaas, L. J., y col., J. Steroid Biochem. and Molec. Biol. (1991) 39: 553; Garc´ıa-Velasco, y col. J. Steroid Biochem. and Molec. Biol. (1991) 39: 561). Un olor no se une a un receptor de VNO - s´ olo una feromona. Un cambio espec´ıfico de feromona en el potencial el´ectrico del epitelio receptor del VNO se puede medir como se describe por Monti-Bloch, L., y col. (J. Steroid on del receptor es una caracter´ıstica Biochem. and Molec. Biol. (1991) 39:573). Esta actividad de uni´ esencial de una feromona activa. Las composiciones de muchos perfumes y fragancias comerciales contienen feromonas mam´ıferas. Puesto que las feromonas son generalmente espec´ıficas de las especies, las feromonas mam´ıferas encontradas en perfumes comerciales no funcionan como una feromona, sino que en su lugar proporcionan una nota fijativa en la composici´ on general de la fragancia. Por lo tanto, los perfumes, productos de cuidado personal y cosm´eticos disponibles actualmente no se unen a receptores de feromonas en el VNO y no estimulan el nervio vomeronasal que comunica con el hipot´ alamo del cerebro. Adem´ as, en algunos casos el uso de feromonas animales, o productos sint´eticos relacionados con feromonas animales, pueden provocar irritaciones de la piel o respuestas al´ergicas en algunos individuos. Adicionalmente todav´ıa, puesto que la fuente de feromonas animales usadas en fragancias son las gl´ andulas anales del animal colaborador, algunas personas consideran cuestionable usar estas substancias. Finalmente, puesto que ninguno de los ingredientes principales encontrados en fragancias comerciales existen por naturaleza en la piel humana, las emanaciones resultantes no son emanaciones humanas naturales.

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Ser´ıa preferible que una fragancia contuviese feromonas humanas que existen en la naturaleza, puesto que esto dar´ıa lugar a estimulaci´ on tanto de receptores olfatorios (emanaci´ on) como receptores de feromonas, reducir´ıa la probabilidad de irritaci´ on o una respuesta al´ergica, proporcionar´ıa una composici´ on m´as atractiva para aplicaci´on personal, y tendr´ıa un emanaci´ on humana m´ as natural. 45

Adem´as, ciertas composiciones de materias tales como tejidos de papel fibroso, pinturas, velas de cera, incienso y similares se pueden mejorar por adici´on de feromonas humanas. Compendio de la invenci´ on 50

De acuerdo con ello, un objeto principal de la invenci´ on es abordar las necesidades mencionadas anteriormente en la t´ecnica proporcionando composiciones de fragancia y otras composiciones de materia, que contienen una feromona humana que existe en la naturaleza. 55

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Tambi´en un objeto de esta invenci´ on es proporcionar composiciones de fragancia, y otras composiciones de materia, que estimulan tanto los receptores olfatorios como los receptores de feromona en el VNO. Otro objeto de esta invenci´ on es proporcionar composiciones de fragancia, y otras composiciones de materia, que no es probable que irriten la piel de individuos y es probable que sean hipoal´ergicas cuando se inhalan. Otro objeto de esta invenci´ on es proporcionar composiciones de fragancia, y otras composiciones de 3

ES 2 127 247 T3 materia, con el atractivo para el consumidor de una feromona humana que existe en la naturaleza. Otro objeto de esta invenci´ on es proporcionar una composici´ on de fragancia, y otras composiciones de materia, con una emanaci´on humana natural. 5

Objetos adicionales, ventajas y nuevas caracter´ısticas de la invenci´on se indicar´an en parte en la descripci´on que sigue, y en parte se pondr´ an de manifiesto para los t´ecnicos en la materia despu´es del examen de lo siguiente, o se pueden aprender por la pr´ actica de la invenci´on. 10

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Los objetos de esta invenci´on se consiguen proporcionando una composici´ on de fragancia, noterap´eutica, que contiene un agente odorante de perfumer´ıa y una feromona humana. La feromona genera un potencial de uni´ on de receptor de ´organo vomeronasal in vivo en un sujeto humano. Otros objetos de esta invenci´on se consiguen tambi´en proporcionando una composici´ on de fragancia que contiene un agente odorante de perfumer´ıa y una composici´ on esteroide seleccionada del grupo que consta de Androsta-4,16-dien-3-ona, Androsta-4,16-dien-3α-ol, Androsta-4,16-dien-3β-ol, 19-nor-4,16-Androstadien-3-ona, 19-nor-10-OH-4,16-Androstadien-3-ona, 19-OH-4,16-Androstadien-3-ona, 5,16-Androstadien-3β-ol, 5,16-Androstadien-3α-ol, 19-nor-16-Androsten-3-ona, 19-nor-16-Androsten-3α-ol, 19-nor16-Androsten-3β-ol, 1,3,5(10)-Estratrien-3,17β-diol, 1,3,5(10)-Estratrien-3,16α,17β-triol, 1,3,5(10)-Estratrien-3-ol-17-ona, ´eter met´ılico de 1,3,5(10),16-Estratetraen-3-ol, acetato de 1,3,5(10),16-Estratetraen-3ilo, propionato de 1,3,5(10),16-Estratetraen-3-ilo, 1,3,5(10),16-Estratetraen-3-ol, y cualquier combinaci´ on de los mismos. Descripci´ on de los dibujos

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La figura 1 ilustra esquem´aticamente la s´ıntesis de 5α-Androst-16-en-3-ona, 5α-Androst-16-en-3α-ol y 5α-Androst-16-en-3β-ol.

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La figura 2 ilustra esquem´aticamente la s´ıntesis de Androsta-∆4,16-dien-3-ona, Androsta-∆4,16 -dien3α-ol, y Androsta-∆4,16 -dien-3β-ol. La figura 3 ilustra esquem´aticamente la s´ıntesis de 19-nor-∆4,16-Androstadien-3-ona, 19-nor-∆16 -Androsten-3-ona, 19-nor-∆16-Androsten-3α-ol, 19-nor-∆16-Androsten-3β-ol y 19-nor-10-OH-∆4,16-Androstadien-3-ona.

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La figura 4 ilustra esquem´aticamente la s´ıntesis de Androsta-∆5,16 -dien-3α-ol y Androsta-∆5,16 -dien3β-ol. La figura 5 ilustra esquem´aticamente la s´ıntesis de 19-OH-Androsta-∆4,16-dien-3-ona.

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La figura 6 ilustra esquem´aticamente una s´ıntesis alternativa de 19-OH-Androsta-∆4,16 -dien-3-ona. La figura 7 ilustra esquem´aticamente la s´ıntesis de 1,3,5(10),16-Estratetraen-3-ol.

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La figura 8 ilustra esquem´aticamente una s´ıntesis alternativa de Androsta-4,16-dien-3-ona. Las figuras 9A-C son representaciones gr´aficas del efecto electrofisiol´ ogico de la administraci´ on localizada de esteroides particulares de la clase del 16-Androsteno al o´rgano vomeronasal y al epitelio olfatorio.

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Las figuras 10A-D son representaciones gr´ aficas del efecto electrofisiol´ ogico de la administraci´ on localizada de esteroides particulares de la clase del Estreno al ´organo vomeronasal y al epitelio olfatorio. La figura 11 es una representaci´ on gr´ afica del cambio de potencial local del VNO y OE inducido por varias fragancias.

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La figura 12 es una representaci´ on gr´ afica que compara los efectos de feromonas humanas, feromonas animales y agentes odorantes comunes sobre el potencial local en el VNO y OE humanos. Descripci´ on detallada 60

Antes de descubrir y describir las presentes composiciones, debe entenderse que esta invenci´on no est´ a limitada a fragancias espec´ıficas, compuestos esteroicos espec´ıficos, o similares, ya que tales componentes 4

ES 2 127 247 T3 pueden variar, naturalmente. Tambi´en debe entenderse que la terminolog´ıa utilizada aqu´ı solamente tiene la finalidad de describir formas de realizaci´ on particulares y no est´ a destinada a limitarlas.

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Hay que indicar que, cuando se usan en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares “uno/una” y “el/la” incluyen referencias plurales, a no ser que el contexto dicte claramente otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a “un agente odorante de perfumer´ıa” incluye mezclas de agentes odorantes de perfumer´ıa, la referencia a “una feromona humana” incluye mezclas de feromonas humanas, y similares. A. Definiciones Una “fragancia ambiental” es una fragancia u olor que se usa para olorizar un volumen de aire en lugar de un individuo u objeto. La fuente de la fragancia ambiental puede ser un objeto, por ejemplo un objeto compuesto para liberar gradualmente una fragancia al aire adyacente.

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Un “olor” es cualquier emanaci´on o aroma ya sea agradable u ofensivo. Un olor es percibido conscientemente por un individuo cuando mol´eculas olorosas se unen al epitelio olfatorio del paso nasal. Un “agente odorante” es una substancia olorosa. Los materiales de perfumer´ıa, ya sean naturales o sint´eticos, se describen como agentes odorantes. Un “agente odorante de perfumer´ıa” es un agente odorante usado para la finalidad principal de proporcionar un olor. Una “emanaci´ on” es un olor dejado detr´ as por un animal o individuo. La gente utiliza perfumes para aumentar su emanaci´ on natural. Un “perfume” o una “composici´ on de fragancia” es una composici´ on cosm´etica espec´ıfica agradablemente olorosa para aplicaci´on t´ opica a un individuo. T´ecnicamente, los perfumes son mezclas de una gama de substancias, y pueden incluir materiales naturales de origen vegetal o animal, compuestos total o parcialmente artificiales, o mezclas de ellos. Disueltas en alcohol, estas mezclas de varias substancias fragantes vol´ atiles desprenden sus emanaciones al aire a temperaturas normales. Para un perfumista, s´olo el extracto -cuya mezcla contiene la m´axima proporci´ on de concentrado de fragancia y la m´ınima cantidad posible de alcohol- se llama perfume. Las mezclas de concentraci´ on inferior incluyen el agua de perfume, las lociones para despu´es del afeitado, el agua de ba˜ no, el agua deportiva, la colonia de salpicadura, el agua de colonia, la colonia, el agua fresca, y similares. Adem´ as de las soluciones de fragancia que est´an diluidas con alcohol, existen tambi´en aqu´ellas que est´an diluidas con aceite. Adem´ as, se producen perfumes compactos o en crema mezclando hasta 25 % de aceite de fragancia con s´olidos tales como parafina u otras ceras. Generalmente todas las composiciones de fragancia descritas anteriormente se denominan perfumes, y as´ı es como se usa aqu´ı el t´ermino. Una “feromona” es un producto bioqu´ımico producido por un animal o individuo que provoca una respuesta fisiol´ogica o de comportamiento, espec´ıfica, en otro miembro de la misma especie. Adem´ as de respuestas fisiol´ ogicas, las feromonas se pueden identificar por su uni´ on espec´ıfica de la especie a receptores en el ´organo vomeronasal (VNO). Por lo tanto, las feromonas humanas se unen a receptores humanos. Esto se puede demostrar midiendo el cambio en el potencial acumulado de tejido neuroepitelial en presencia de la feromona. Las feromonas humanas inducen una despolarizaci´on de al menos aproximadamente 5 milivoltios-segundo en tejido neuroepitelial humano del sexo apropiado (la uni´ on de feromonas es en general sexualmente dimorfa). Las feromonas humanas que existen en la naturaleza inducen cambios sexualmente dimorfos en el potencial de uni´on del receptor in vivo en el VNO humano. Las feromonas que existen naturalmente se pueden extraer y purificar a partir de piel humana y tambi´en se pueden sintetizar, como se describe aqu´ı. Las “feromonas humanas” son feromonas que existen naturalmente en seres humanos y son efectivas como un ligando que se une espec´ıficamente en tejido de VNO humano, independientemente de c´omo se haya obtenido la feromona. Por lo tanto, la mol´ecula tanto sintetizada como purificada se pueden considerar como una feromona humana. “Sexualmente dimorfo” designa una diferencia en el efecto de, o en la respuesta a un compuesto o composici´ on entre machos y hembras de la misma especie.

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“Papel tis´ u” es un papel absorbente, fibroso, blando, tal como el tipo utilizado com´ unmente como un pa˜ nuelo desechable o un papel higi´enico. El “´ organo vomeronasal” es un fondo de saco que se abre al paso nasal en seres humanos y contiene c´elulas receptoras especializadas para feromonas.

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ES 2 127 247 T3 B. Perfumes

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La t´ecnica y ciencia de perfumer´ıa se ha desarrollado durante varios cientos de a˜ nos y ahora est´ a bien establecida. Aqu´ı se proporciona un breve resumen de perfumer´ıa. Este tema est´a tratado m´ as completamente en muchas publicaciones, incluyendo Wells, F. V. y M. Billot, Permufery Technology, Ellis Horwood, Ltd., editor, 2a ¯ edici´on 1981. 1. Tipos de ingredientes

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La diversidad de productos naturales no-animales usados en perfumer´ıa es considerable. Adem´as, los avances en qu´ımica org´ anica en los siglos XIX y XX u ´ ltimos han proporcionado una diversidad igualmente amplia de agentes odorantes artificiales as´ı como la capacidad para sintetizar algunos de los componentes que existen en la naturaleza de los agentes odorantes naturales. La mayor´ıa de los perfumes combinan preparaciones de materiales que existen en la naturaleza con agentes odorantes sint´eticos.

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Los agentes odorantes naturales que se emplean generalmente en perfumer´ıa proceden tanto de materiales animales como vegetales y se pueden asignar a las seis categor´ıas siguientes en base a c´omo se tratan: 20

1) Aceites espesos - extra´ıdos con disolventes hidrocarbonados, sin calor; 2) Aceites absolutos - extra´ıdos en alcohol a partir de aceites espesos, sin calor; 3) Aceites esenciales - destilados a partir de materiales que existen en la naturaleza;

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4) Aceites exprimidos - retirados f´ısicamente directamente del material natural; 5) Productos aislados - obtenidos por destilaci´ on fraccionada a partir de aceites esenciales;

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6) Tintes - obtenidos por extracci´ on prolongada en alcohol a partir de materiales que existen en la naturaleza. Un perfumista tendr´ a t´ıpicamente numerosos aceites, productos aislados y tinturas de una gama de fuentes naturales dentro de cada categor´ıa. El perfumista tendr´ a tambi´en una amplia serie de agentes odorantes artificiales y productos sint´eticos de compuestos que existen en la naturaleza. Cada uno de estos materiales se denomina una “nota”. La t´ecnica de perfumer´ıa implica la mezcla de estas diversas notas para producir una fragancia acabada. Aunque existen muchas aproximaciones subjetivas a la formulaci´ on de un perfume, parece que la mayor´ıa incorporan la noci´ on de notas altas, notas medias y notas bajas. Las notas altas son muy vol´ atiles y carecen de tenacidad, o poder de permanencia. Las notas medias son algo inferiores en volatilidad y se usan como modificadores de las notas altas. Las notas bajas son todav´ıa inferiores en volatilidad y tienen un efecto oloroso persistente. Las notas bajas se denominan tambi´en fijativas de la fragancia. Las notas de origen animal, o los productos artificiales que imitan notas animales, son usualmente notas bajas. 2. Notas animales Muchos perfumes comerciales contienen notas de fuentes animales, usualmente feromonas de la especie de la que se obtiene el material, o productos sint´eticos y notas artificiales que imitan las caracter´ısticas de notas animales. Las principales notas derivadas de animales son las siguientes:

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1) almizcle - obtenido a partir de la gl´andula olorosa de la cabra de almizcle; 2) algalia - obtenida como una secreci´ on glandular del gato de algalia; 3) cast´oreo - obtenida a partir del fol´ıculo prepucial del castor; y

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4) a´mbar gris - un material regurgitado o excretado obtenido a partir de los cachalotes. Las tres primeras son feromonas para la especie de origen, pero puesto que las feromonas son espec´ıficas de la especie, no inducen ning´ un comportamiento relacionado con feromonas en humanos. Las notas animales se usan como un fijativo para la fragancia de perfume. Como un concentrado, el olor de notas animales puede no ser agradable, pero cuando se diluye, contribuyen a la fragancia del producto final.

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ES 2 127 247 T3 3. Feromonas humanas

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En la presente invenci´on, las feromonas humanas que existen en la naturaleza se utilizan en lugar de, o adem´as de las feromonas animales, o sus derivados u hom´ ologos, como un componente en composiciones de materia. Las feromonas humanas que existen naturalmente tienen varias ventajas. Los productos perfumados disponibles anteriormente no estimulaban receptores de VNO, puesto que un agente odorante que no es una feromona para seres humanos estimula solamente los receptores olfatorios de la nariz. Las composiciones de fragancia que tienen un olor agradable y adem´ as contienen feromonas humanas estimular´ an tanto los receptores olfatorios como los receptores de feromonas en el VNO de individuos. Una composici´ on de fragancia de este tipo proporciona una estimulaci´ on olfatoria m´as amplia que la posible anteriormente. Los perfumes se aplican a la piel; no obstante, la piel viva, con sus mecanismos excretor y respiratorio, sus secreciones y temperatura variable, es un medio demasiado cambiante para actuar como un buen veh´ıculo de perfumes y frecuentemente distorsiona el olor del perfume en contacto con ella. Puesto que las feromonas humanas est´an normalmente presentes en la piel humana, una composici´on de fragancia que contiene feromonas humanas proporcionar´ıa una emanaci´ on m´ as estable sobre la piel. Adem´ as, la emanaci´ on resultante oler´ıa de forma m´ as natural a ser humano. Se ha encontrado que algunos ingredientes asociados con notas animales usadas com´ unmente (por ejemplo benzoato de bencilo, paracresol, nitro-almizcles) provocan irritaci´ on de la piel en algunos individuos. Adem´ as, algunos individuos muestran una respuesta al´ergica a algunos perfumes. Ser´ıa menos probable que las composiciones de fragancia que contienen feromonas humanas que existen en la naturaleza provocasen irritaci´ on de la piel o respuesta al´ergica que los componentes relacionados con animales usados com´ unmente.

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Finalmente, un perfume que utilice feromonas humanas que existen en la naturaleza en lugar de material obtenido a partir de las gl´ andulas anales o prepuciales, ser´ıa inherentemente m´as atractivo para muchos consumidores. 30

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Como un concentrado, las feromonas pueden o no tener un olor detectable. Puesto que se unen a receptores que son f´ısica y funcionalmente distintos de receptores olfatorios, pueden llevar o no su propio aroma. No obstante, algunas de las feromonas descritas aqu´ı tienen de hecho un olor. Como un concentrado, el olor de estas feromonas puede que no sea necesariamente agradable. Por lo tanto, cuando se diluye en un perfume, el l´ımite superior de concentraci´ on en la pr´ actica se determina por el agrado de la fragancia resultante. Generalmente, las feromonas humanas est´ an presentes en la composici´on de fragancia de la presente invenci´ on en una concentraci´ on de no m´ as de aproximadamente 200 µg/ml, m´ as com´ unmente no m´as de aproximadamente 100 µg/ml, preferentemente no m´as de aproximadamente 50 µg/ml, y m´ as preferentemente no m´as de aproximadamente 25 µg/ml. Las feromonas tienen un umbral muy bajo de uni´ on detectable con el receptor y son efectivas a bajas concentraciones. Generalmente, las feromonas humanas est´an presentes en la composici´on de fragancia de la presente invenci´ on en una concentraci´ on de al menos aproximadamente 50 ng/ml, m´as com´ unmente al menos aproximadamente 100 ng/ml, preferentemente al menos aproximadamente 500 µg/ml, m´ as preferentemente al menos aproximadamente 1 µg/ml.

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C. Otros productos que contienen feromonas

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Las feromonas se usan com´ unmente por s´ı como un producto de cuidado personal. No obstante, los olores se pueden usar en una variedad de productos de cuidado personal, productos dom´esticos y productos industriales. El uso de feromonas humanas por s´ı, o de perfumes que contienen feromonas que existen naturalmente en estos otros productos cae dentro del alcance de la presente solicitud. 1. Productos de cuidado personal

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Las fragancias que contienen feromonas humanas se pueden usar en la preparaci´ on de cosm´eticos, preparaciones de maquillaje, preparaciones de tocador y de belleza, jabones de ba˜ no y de belleza, aceites de ba˜ no, cremas y aceites para la cara y el cuerpo, desodorantes para las axilas y similares. Las preparaciones de estos productos de cuidado personal son conocidas por los t´ecnicos en la materia. Estos productos contienen frecuentemente una fragancia. Una feromona humana o una fragancia que contiene feromonas humanas se a˜ nade a estos compuestos de la misma manera que se puede a˜ nadir la fragancia por s´ı.

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ES 2 127 247 T3 2. Agentes odorantes ambientales

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Las feromonas o las fragancias que contienen feromonas humanas se pueden utilizar tambi´en como agentes odorantes ambientales, tal como en ambientadores, desodorantes o como promociones comerciales para mercanc´ıas (por ejemplo, coches nuevos, expositores comerciales, etc.) y similares. La fragancia y feromona se pueden distribuir en el aire por el uso de un distribuidor de aerosol, o por preparaciones de composiciones l´ıquidas, en gel o s´olidas que contienen fragancia y feromona que liberan lentamente la feromona, o fragancia y feromona, en el aire por exposici´ on de la composici´on a la atm´ osfera. Para administraci´ on de aerosol, el ingrediente activo se suministra preferentemente en forma l´ıquida o finamente dividida junto con un tensioactivo o un impulsor. Los porcentajes t´ıpicos de ingredientes activos son de 0,001 a 2 % en peso, preferentemente de 0,004 a 0,10 %. Los tensioactivos deben ser, naturalmente, no t´ oxicos, y preferentemente solubles en el impulsor. Representantes de tales agentes son los ´esteres o ´esteres parciales de ´acidos grasos que contienen de 6 a 22 ´atomos de carbono, tales como ´acido caproico, octanoico, l´ aurico, palm´ıtico, este´arico, linoleico, oleste´arico y oleico con un alcohol polih´ıdrico alif´ atico o su anh´ıdrido c´ıclico tales como, por ejemplo, anh´ıdridos de etilenglicol, glicerol, eritritol, arabitol, manitol, sorbitol, y hexitol, derivados de sorbitol (los ´esteres de sorbit´ an vendidos bajo la marca “Spans”) y los derivados polioxietil´enico y polioxipropil´enico de estos ´esteres. Se pueden emplear ´esteres mixtos, tales como glic´eridos mixtos o naturales. Los agentes tensioactivos preferidos son los oleatos de sorbit´ an, por ejemplo los vendidos bajo las marcas “Arlacel C” (sesquioleato de sorbit´ an), “Span 80” (monoleato de sorbit´ an) y “Span 85” (trioleato de sorbit´ an). El tensioactivo puede constituir de 0,1-20 % en peso de la composici´on, preferentemente de 0,25-5 %. El resto de la composici´on es ordinariamente impulsor. Los impulsores licuados son t´ıpicamente gases en condiciones ambientales, y se condensan a presi´ on. Entre los impulsores licuados adecuados est´an los alcanos inferiores que contienen hasta cinco carbonos, tales como butano y propano; alcanos fluorados o fluoroclorados, tales como los vendidos bajo la marca “Freon”. Tambi´en se pueden emplear mezclas de los anteriores.

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En la producci´on del aerosol, un envase equipado con una v´ alvula adecuada se llena con el impulsor adecuado, que contiene el ingrediente activo finamente dividido, y tensioactivo. Los ingredientes se mantienen de esta manera a una presi´on elevada hasta que se liberan por acci´ on de la v´ alvula. 35

Un medio alternativo de liberaci´ on de fragancia y feromona en un espacio de aire designado es por medio de evaporaci´ on y liberaci´ on graduales a la atm´ osfera a partir de una composici´on l´ıquida, semis´olida o s´ olida que contiene una feromona o una fragancia y feromona. Una feromona humana o una fragancia que contiene una feromona humana se pueden incorporar en la composici´ on en una variedad de maneras dependiendo de la naturaleza de la composici´ on.

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Si la composici´ on es un l´ıquido, gel, crema o ung¨ uento, y el ingrediente de feromona es soluble en la composici´on, se puede disolver simplemente en la composici´on. Si el ingrediente de feromona es ligeramente soluble o insoluble en la composici´on, se puede preparar una suspensi´on por adici´ on y mezcla. En algunos casos, tales como agentes odorantes ambientales, agentes odorantes de coches y similares, la composici´ on que contiene feromona se aplica en un estado l´ıquido y permanece l´ıquida durante la evaporaci´on. En otros casos, tales como pinturas y similares, la composici´on que contiene feromona se aplica como un l´ıquido y luego solidifica, dejando que la feromona se evapore lentamente a partir del s´ olido. Si la composici´ on es s´olida, el ingrediente de feromona se puede a˜ nadir fundiendo en primer lugar as preferentemente 50◦ C, el s´olido hasta una temperatura m´ axima de 100◦C, preferentemente 75◦ C, m´ a˜ nadiendo el ingrediente de feromona y luego dejando que la mezcla se enfr´ıe y solidifique. Este m´etodo se puede usar con cera o resina, por ejemplo. Alternativamente, el ingrediente de feromona se puede mezclar en primer lugar en un disolvente vol´atil tal como etanol, sulf´ oxido de dimetilo o similar, y luego mezclar con una composici´on s´ olida absorbente tal como papel tis´ u, tela y similar. El disolvente se evapora entonces dejando el residuo de feromona en la composici´on s´ olida, a partir de la que la feromona se evapora lentamente pasando a la atm´ osfera. Los usos de composiciones de fragancia que contienen feromonas humanas, como se proporcionan aqu´ı, son ejemplos de usos alternativos que caen dentro del alcance pretendido de las reivindicaciones y no limitan el alcance pretendido de uso de esta invenci´ on.

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ES 2 127 247 T3 3. Otros productos

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Esta mezcla incluye otros productos tales como materiales fibrosos que absorber´an feromonas con o sin fragancias. Por ejemplo, tela, papeles (incluyendo papeles tis´ u), prendas, toallas de papel, papeler´ıa y similares. Estos productos no necesitan contener una fragancia. D. Feromonas humanas

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Como se describe aqu´ı, las feromonas humanas generan un cambio en el potencial receptor acumulado del neuroepitelio en el VNO de sujetos humanos. Este cambio es usualmente una despolarizaci´on o despolarizaci´ on parcial del neuroepitelio. Tal despolarizaci´ on es transitoria y se expresa como la integral del cambio en potencial (medido en milivoltios) a lo largo del tiempo (medido en segundos). Esta integral se expresa como milivoltios-segundos (mV X S). Las feromonas humanas que existen en la naturaleza identificadas hasta ahora son esteroides que se clasifican en dos clases - 16-Androstenos y Estrenos. La actividad biol´ ogica de las feromonas humanas es sexualmente dimorfa. Las feromonas de la clase de 16-androsteno generan un cambio mayor en el potencial receptor de las mujeres que en el de los hombres. A la inversa, las feromonas de la clase del estreno generan un cambio mayor en el potencial receptor de los hombres que en el de las mujeres. Los esteroides de la clase del 16-Androsteno son hidrocarburos polic´ıclicos alif´aticos caracterizados por una estructura estero´ıdica de cuatro anillos con una metilaci´ on en la posici´ on 13, y un enlace doble entre las posiciones 16 y 17. Se entiende com´ unmente que un esteroide de la clase del Androsteno significa que el compuesto tiene al menos dos metilaciones, en la posici´on 13 y en la posici´ on 10, creando de esta manera carbonos en la posici´on-18 y en la posici´ on-19, respectivamente. A no ser que un compuesto se describa expl´ıcitamente como “19-nor”, se entiende que el compuesto no tiene un grupo carbono en posici´on 19. No obstante, se pretende que los 19-nor-16-Androstenos se consideren generalmente como esteroides 16-Androsteno para la finalidad de la presente invenci´on. Los esteroides de la clase Estreno son hidrocarburos polic´ıclicos alif´aticos con una estructura estero´ıdica de cuatro anillos, un anillo-A-1,3,5(10) arom´ atico, una metilaci´ on en la posici´ on 13 y un hidroxilo en la posici´on 3. En la descripci´ on de la localizaci´on de grupos y substituyentes de esteroides de la clase del 16Androsteno y del Estreno, se emplear´a el siguiente sistema de numeraci´on.

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1. 16-Androstenos u ´tiles conjuntamente con la invenci´ on

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La invenci´on se refiere a composiciones de fragancia que contienen una feromona humana que se puede incluir en un grupo conocido como esteroides de la clase del Androsteno, de la cual la testosterona (17-hidroxi-∆4-androsten-3-ona) es un ejemplo, y a asociaciones de esteroides de la clase del Androsteno y del Estreno. Se incluyen espec´ıficamente aquellos esteroides descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos (USSN 07/903.604 presentada el 24 de Junio de 1992), cuya integridad se incorpora por referencia. Los 16-Androstenos se caracterizan adicionalmente por un enlace doble en posici´on 16. Los 16-Androstenos de esta invenci´ on tienen la f´ ormula:

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en la que R1 se selecciona del grupo que consta de oxo, α-(β-)hidroxi, α-(β-)acetoxi, α-(β-)propionoxi, α(β-)metoxi, α-(β-)aciloxi inferior, α-(β-)alquiloxi inferior, y α-(β)-benzoiloxi; R2 se selecciona del grupo que consta de hidr´ ogeno, hidroxi, acilo, aciloxi, alcoxi, metilo, hidroximetilo, acilmetilo, aciloximetilo, alcoximetilo, alquilo inferior, hidroxialquilo, acilalquilo, aciloxialquilo, y alcoxialquilo; y “a” y “b” son sitios alternativos para un enlace doble opcional. Formas de realizaci´ on preferidas incluyen 4,16-Androstadien-3-ona (R1 = oxo, a = enlace doble, R2 = metilo, disponible en el comercio a partir de Steraloids, Inc., referida tambi´en como Androstadienona), y 19-hidroxi-4,16androstadien-3-ona (R1 = oxo, a = enlace doble, R2 = hidroximetilo), 4,16 Androstadien3α(β)-ol (R1 = hidroxi, a = enlace doble, R2 = metilo), 19-nor-4,16Androstadien-3-ona (R1 = oxo, a = ogeno), y 19-nor-10-OH-4,16Androstadien-3-ona (R1 -oxo, a = enlace doble, R2 = enlace doble, R2 = hidr´ hidroxi), cuyas s´ıntesis se describen aqu´ı). 2. Estrenos u ´tiles conjuntamente con la invenci´ on La invenci´on se refiere adicionalmente a composiciones de fragancia que contienen una feromona humana que puede estar incluida en un grupo de esteroides de la clase del Estreno, o a asociaciones de esteroides de la clase del Estreno y del 16-Androsteno. Espec´ıficamente est´an incluidos 1,3,5(10)-Estratrieno3,17β-diol; 1,3,5(10)-Estratrieno-3,16α,17β-triol; 1,3,5(10)-Estratrieno-3-ol-17-ona; 1,3,5(10),16-Estratetraen-3-ol; ´eter met´ılico de 1,3,5(10),16-Estratetraen-3-ol; y acetato de 1,3,5(10),16-Estratetraen-3-ilo. Estos Estrenos son estructuralmente similares a Estradiol (denominado tambi´en como 1,3,5(10)-Estratrieno-3,17β-diol), pero se distinguen de Estradiol por el enlace doble en la posici´ on-16. Estos estrenos tienen la f´ ormula

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en la que R4 se selecciona del grupo que consta de hidr´ogeno, alquilo, oxo, α-hidroxi, β-hidroxi, sulfato, cipionato, acetato, y glucuronido; R5 se selecciona del grupo que consta de hidr´ogeno, α-hidroxi, y β-hidroxi; R6 se selecciona del grupo que consta de hidr´ogeno, alquilo inferior, acilo inferior, benzo´ılo, cipionilo, acetilo, glucuronido, propionilo, y sulfato.

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Estos Estrenos se pueden distinguir unos de otros por variaciones en la posici´ on 3, variaciones en la posici´on 17 y variaciones en la posici´on 16, con un enlace doble opcional en la posici´ on-16. Formas de realizaci´on preferidas incluyen 1,3,5(10)-Estratrieno-3,17β-diol; 1,3,5(10)-Estratrieno-3,16α,17β-triol; 1,3,5(10)-Estratrien-3-ol-17-ona; y 1,3,5(10),16-Estratetraen-3-ol. Estos esteroides son compuestos conocidos en la t´ecnica y est´an disponibles en el comercio a partir de Sigma Chemical Co., Aldrich Chemical Co., etc. El 1,3,5(10),16-Estratetraen-3-ol est´ a disponible a partir de Research Plus, Inc. y de Steraloids, Inc.

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ES 2 127 247 T3 E. S´ıntesis de feromonas humanas Como se ha indicado en la Secci´on D1 anterior, algunas de las feromonas de la clase del 16-Androsteno preferidas no est´an disponibles en el comercio. Aqu´ı se proporcionan sus s´ıntesis. 5

1. M´etodos de s´ıntesis a. Preparaci´ on de derivados de posici´ on 3, posici´ on 5, y 19-nor 10

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Como se muestra en la f´ormula I anterior, los compuestos utilizados en los m´etodos de la presente invenci´on son esteroides de la clase del 16-Androsteno substituidos en las posiciones 3, 5 y 19. Muchos de los esteroides substituidos en las posiciones 3 y 5 son compuestos conocidos que se pueden derivar de 17-hidroxi- y 17-oxo-esteroides (disponibles en el comercio, por ejemplo, a partir de Aldrich Chemical Co.) por eliminaci´on o reducci´ on en el compuesto ∆16. Las s´ıntesis de la mayor´ıa de estos compuestos se describen por Ohloff (v´ease arriba). Como se muestra en la figura 1, 17β-hidroxi-5α-androstan-3-ona (I) y cloroformiato de metilo (a) en piridina dan el metilcarbonato de 17β-metoxicarboniloxi-5α-androstan3-ona (II) que proporciona un material de partida para los 5α-androst-16-en-(3-ona y 3-oles) (Ohloff, v´ease arriba, en la p´agina 200). Derivados de alcoxi se preparan a partir de sus hidroxi-esteroides correspondientes por reacci´ on con un agente de alquilaci´ on tal como fluoroborato de trimetiloxonio, fluoroborato de trietiloxonio o metilfluorosulfonato en un disolvente clorocarbonado inerte, tal como cloruro de metileno. Alternativamente, se pueden usar agentes de alquilaci´on tales como haluros de alquilo, tosilatos de alquilo, mesilatos de alquilo y sulfato de dialquilo con una base tal como o´xido de plata u o´xido de bario en disolventes apr´ oticos polares como por ejemplo DMF, DMSO y hexametilfosforamida. Los procedimientos generales para reacciones sint´eticas de esteroides son conocidos por los t´ecnicos en la materia (V´ease por ejemplo, Fieser, L. F. y M. Fieser, Steroids, Reinhold, N. Y. 1959). Cuando deban determinarse el tiempo y la temperatura de las reacciones, ´estos se pueden determinar por una metodolog´ıa de rutina. Despu´es de la adici´ on de los reactivos requeridos, la mezcla se agita bajo una atm´ osfera inerte y se retiran partes al´ıcuotas a intervalos horarios. Las partes al´ıcuotas se analizan por medio de cromatograf´ıa de capa fina para verificar la desaparici´ on del material de partida, en cuyo instante se inicia el procedimiento de aislamiento. Si el material de partida no se consume en veinticuatro horas, la mezcla se calienta a reflujo y se analizan partes al´ıcuotas cada hora, como anteriormente, hasta que no permanece material de partida. En este caso, se deja que la mezcla se enfr´ıe antes de iniciar el procedimiento de aislamiento. La purificaci´ on de los productos se realiza por medio de cromatograf´ıa y/o cristalizaci´ on, como se conoce por los t´ecnicos en la materia.

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(i). S´ıntesis de 10-Hidroxi-∆4,16-Androstadien-3-ona o con Como se representa en la figura 3, 19-nor-∆4,16-androstadien-3-ona en tetrahidrofurano se trat´ un equivalente de isopropilciclohexilamiduro de litio (LICA) (e), seguido por pent´oxido de molibdeno en hexametilfosforamida/piridina (MOOPH) (f). El aislamiento en agua fue seguido por extracci´ on y purio el m´etodo de Vedejs, ficaci´on para obtener 10-Hidroxi-∆4,16-androstadien-3-ona. El procedimiento sigui´ J. Org. Chem. (1978) 43: 188. b. Preparaci´ on de derivados 19-OH

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(i). S´ıntesis de 19-OH-∆4,16-Androstadien-3-ona Este compuesto ha sido descrito como un intermedio en la s´ıntesis de 19-oxo-3-aza-A-homo-5βandrostano (Habermehl y col., Z. Naturforsch. (1970) 25b:191-195). Se proporciona un m´etodo de s´ıntesis de este compuesto. En los Ejemplos 12 y 13 se proporcionan m´etodos adicionales de s´ıntesis. Ejemplos

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Los siguientes ejemplos se proporcionan para fines ilustrativos y no deber´an interpretarse como limitaciones de la invenci´on descrita en esta solicitud. Las abreviaturas utilizadas en los ejemplos son las siguientes: ac. = acuoso; TA = temperatura am11

ES 2 127 247 T3 biente; PE = ´eter de petr´ oleo (p.f. 50-70◦C); DMF = N,N-dimetilformamida; DMSO = sulf´ oxido de dimetilo; THF = tetrahidrofurano. 5

Ejemplo 1 5α-Androst-16-en-3-ona (1)

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Esta s´ıntesis se ilustra en la Figura 1. Una soluci´on del metilcarbonato de 17β-metoxicarboniloxi-5αandrostan-3-ona (II) (9,6 g, 27,6 mmol) en tolueno (200 ml) se piroliz´o (b) en una columna de vidrio Pyrex (1 = 10 m ≤ = 9 mm) a 480◦ C (corriente de N2 , aproximadamente 11 ml/min) a una velocidad de aproximadamente 1 g/h. El producto bruto (recogido en dos colectores refrigerados con N2 l´ıquido) se o. El residuo (7,24 lav´o con soluci´on acuosa saturada de NaHCO3 y NaCl, se sec´o (Na2 SO4 ) y se evapor´ g, 97 %) se recristaliz´o en PE a 0◦ para dar 6,42 g (87 %) de 1. Una muestra anal´ıtica fue recristalizada ◦ en acetonitrilo a TA. p.f. 142-144◦C, [α]D = +35,6◦ (c = 1,15) ([2]: p.f. 140-141◦C, [α]17 D = +38 C (c = 1 2,08)). IR (CDCl3 ): 1710s, 1595w. RMN- H. (360 MHz): 0,79 (s, 3H); 1,05 (s, 3H); 5,70 (m, 1H); 5,84 (m, 1H). Ejemplo 2

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5α-Androst-16-en-3α-ol (2)

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Esta s´ıntesis se ilustra en la Figura 1. A una soluci´on 1 M de tris(1,2-dimetilpropil)hidruroborato de nadi´ o litio (c, disponible en el comercio a partir de Aldrich, 2,5 ml, 2,5 mmoles) a -55◦C, bajo N2 , se a˜ una soluci´ on de cetona 1 (500 mg, 1,84 mmoles) en THF (7 ml) y se dej´o calentar la mezcla hasta TA. o por adici´ on de agua (1 ml), seguida por Despu´es de 3 horas, la mezcla se enfri´o a -55◦C y se hidroliz´ EtOH (3 ml). Los boranos se oxidaron por adici´ on a la mezcla a -55◦C de soluci´on acuosa de NaOH al on durante 3 h a TA. Se a˜ nadi´ o 10 % (5 ml), seguida por soluci´ on acuosa de H2 O2 al 30 % (3 ml), y agitaci´ ciclohexano (100 ml) y la fase org´anica se lav´ o sucesivamente con agua, soluci´ on acuosa saturada de NaHSO3 y soluci´on acuosa saturada de NaCl; despu´es del secado (Na2 SO4 ) y evaporaci´on del disolvente, el residuo se cromatografi´o en gel de s´ılice (60 g) con tolueno/ acetato de etilo 2:1. El alcohol axial 2 se eluy´o en primer lugar (443 mg, 89 %) y la segunda fracci´on conten´ıa el alcohol ecuatorial 3 (24 mg, 4,8 %). Una muestra anal´ıtica de 2 se recristaliz´o en PE a 0◦ C. p.f. 142-144◦C, [α]D = +15◦ (c = 1,33) ([2]: p.f. 143,5-144◦C, [α]D16 = +13,9◦ (c = 0,94)). IR (CDCl3 ): 3625m, 3450w, 1590w. RMN-1 H (360 MHz): 0,77 (s, 3H); 0,82 (s, 3H); 4,03 (m, w1/2 ∼ 8, 1H); 5,70 (m, 1H); 5,83 (m, 1H). Ejemplo 3 5α-Androst-16-en-3β-ol (3)

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Esta s´ıntesis se ilustra en la Figura 1. Se redujo cetona 1 (500 mg, 1,84 mmoles) con borohidruro s´odico (d, 75 mg, 2 mmoles) en THF/MeOH 5:1 (18 ml) a TA. (2 h). El producto bruto se cromatografi´ o en gel de s´ılice (60 g) usando tolueno/acetato de etilo 2:1. Despu´es de trazas del alcohol axial 2 (9 mg, 2 %), se eluy´ o el alcohol ecuatorial puro 3 (338 mg, 77 %). Una muestra anal´ıtica se recristaliz´o ◦ en MeOH/agua. p.f. 124-125◦C, [α]D = +14,2◦C (c = 1,12) ([2]: p.f. 125-127◦C, [α]17 D = +11,2 (c = 1 0,76)). IR (CDCl3 ): 3620m, 3430w, 1590w. RMN- H (360 MHz): 0,77 (s, 3H); 0,85 (s, 3H); 3,60 t x t, J = 11 y 5, 1 H); 5,70 (m, 1H); 5,84 (m, 1H). Ejemplo 4

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Androsta-4,16-dien-3-ona (4)

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Esta s´ıntesis se ilustra en la Figura 2. Se conocen varios m´etodos para la conversi´ on de testosterona en Androsta-4,16-dien-3-ona (Brooksbank y col., Biochem. J. (1950) 47: 36). Alternativamente, la termolisis (460◦ C) del metilcarbonato de testosterona dio Androsta-4,16-dien-3-ona en 90 % de rendimiento. Se prepar´ o 17β-Metoxicarboniloxi-androst-4-en-3-ona (IV) a partir de testosterona (III. Fluka) con cloroformiato de metilo/piridina (a) en 76 % de rendimiento (despu´es de recristalizaci´on en MeOH). p.f. 140-141◦C, [α]D = +95,4◦ C (c = 1,10). IR (CDCl3 ): 1740s, 1665s, 1450s, 1280s RMN-1 H (360 MHz): 0,87 (s, 3H); 1,20 (s, 3H); 3,77 (s, 3H); 4,53 (br. t, J = 8, 1H); 5,75 (s, 1 H). Una soluci´ on del metilcarbonato IV en tolueno se piroliz´ o (b) como se ha descrito para 1. La recristalizaci´on del producto bruto en acetona a TA dio cetona pura 4 en 90 % de rendimiento. p.f. 127-129,5◦C, [α]D = +118,9◦C (c ◦ = 1,32) ([3]: p.f. 131,5-133,5◦C (hexano), [α]16 D = +123±3,5 C (c = 1,03)). IR (CDCl3 ): 3050w, 1660s, 12

ES 2 127 247 T3 1615m. RMN-1 H (360 MHz): 0,82 (s, 3H); 1,22 (s, 3H); 5,70 (m, 1H); 5,73 (s, 1H); 5,84 (m, 1H). Ejemplo 5 5

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Androsta-4,16-dien-3α-ol (5) y -3β-ol (6) Estas s´ıntesis se ilustran en la figura 2. Se redujo Androsta-4,16-dien-3-ona (4) a -55◦C con tris(1,2dimetilpropil)hidruroborato de litio en THF (c) como se ha descrito para la preparaci´ on de 2 (figura 1). La cromatograf´ıa en gel de s´ılice con CH2 Cl2 /acetato de etilo 9:1 dio alcohol axial puro15 (48 % de rendimiento) y alcohol ecuatorial puro 6 (48 % de rendimiento). Las muestras anal´ıticas se purificaron adicionalmente por recristalizaci´on (en PE a -30◦C para 5, en ciclohexano a TA para 6). Datos de 5. p.f. (77-79◦, [α]D = +120,6◦C (c = 1,26) IR (CDCl3 ): 3620m, 3440m br., 1660m, 1595w. RMN-1 H. (360 MHz): 0,79 (s, 3H); 1,02 (s, 3H); 4,07 (m, w1/2 ∼ 10, 1H); 5,48 (d x d, J = 5 y 2, 1H); 5,71 (m, 1H); 5,85 (m, 1H). Datos de 6. p.f. (116-119◦C), [α]D = +53,9◦C (c = 1,28) ([47]: p.f. 116-118◦C, [α]D = +59,3◦C (c = 0,4) IR (CDCl3 ): 3610m, 3420m br., 3050m, 1660m, 1590w. RMN-1 H (360 MHz): 0,78 (s, 3H); 1,08 (s, 3H); 4,15 (m, w1/2 ∼ 20, 1H); 5,30 (m, w1/2 ∼ 5, 1H); 5,71 (m, 1H); 5,85 (m, 1H).

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Ejemplo 6 Androsta-∆5,16-dien-3α-ol (7) 25

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Esta s´ıntesis se ilustra en la Figura 4. A una soluci´on de alcohol 8 (545 mg, 2,0 mmoles) en acetona nadi´ o r´ apidamente reactivo de Jones (i, 1,5 ml, aproximadamente 4 mmoles). (100 ml) a 0◦ C bajo N2 se a˜ Despu´es de 5 min., la mezcla se verti´o en un tamp´ on fosfato diluido (pH 7,2, 1200 ml) y se extrajo con ´eter. Los extractos se lavaron con soluci´on acuosa saturada de NaCl, se secaron (Na2 SO4 ) y se evaporaron para dar principalmente Androsta-5,16-dien-3-ona como un aceite (567 mg). El producto bruto se disolvi´o en THF (7 ml) y se redujo con tris(1,2-dimetilpropil)hidruroborato de litio (c) a -55◦ C como se ha descrito para la preparaci´ on de 2. El producto bruto (530 mg) se cromatografi´ o en gel de s´ılice (100 g) con CH2 Cl2 /acetato de etilo 4:1 para dar 280 mg (51 %) de α-alcohol puro 7 (elu´ıdo primero) y 13 mg de alcohol de partida 8. Una muestra peque˜ na de 7 se recristaliz´o en acetona/agua a TA. p.f. 138◦ C, ◦ [α]D = -77,5 C (c = 1,2). IR (CDCl3 ): 3580m, 3430m, 1665w, 1590w, - RMN-1 H. (360 MHz): 0,80 (s, 3H); 1,06 (s, 3H); 4,02 (m, w1/2 8, 1H); 5,44 (m, 1H); 5,72 (m, 1H); 5,86 (m, 1H). Ejemplo 7 ∆5,16-Androstadien-3β-ol (8)

40

45

Este compuesto se prepar´ o en 73 % de rendimiento por un procedimiento conocido (Marx, A.F., y col., documento de patente Ger. Offen. 2.631.915; Che. Abst. 87:23614p (1977)) a partir de 3β-hidroxiandrost-5-en-17-ona comercial (VII) (Fluka). p.f. 137◦C, [α]D = -71,9◦C (c = 1,5) ([48]: p.f. 140-141◦C, [α]D = -68◦ C. IR (CDCl3 ): 3600m, 3420m br., 1670w, 1590w. RMN-1 H. (360 MHz): 0,80 (s, 3H); 1,05 (s, 3H); 3,53 (m, w1/2 22, 1H); 5,38 (m, 1H); 5,72 (m, 1H); 5,86 (m, 1H). Esta s´ıntesis se ilustra en la Figura 4. Ejemplo 8

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55

60

19-nor-Androsta-4,16-dien-3-ona (9) Esta s´ıntesis se ilustra en la Figura 3. La 19-nor-testosterona (XIX) est´a disponible en el comercio, por ejemplo a partir de Chemical Dynamics Corp. Proporciona el material de partida para derivados de 19-nor-16-androsteno. La 19-nor-testosterona (XIX) (Chemical Dynamics Corp.) se convirti´o en el acetato conocido (Hartman, J.A. y col., J. Am. Chem. Soc. (1956) 78:5662) con anh´ıdrido ac´etico y piridina (a). Una soluci´ on de este acetato (4,8 g, 15,17 mmoles) en tolueno (10 ml) se piroliz´o (b) a 540◦C (200 Torr, corriente lenta de N2 ) en un tubo de vidrio cargado con trozos de cuarzo. La cromatograf´ıa del material pirolizato bruto (3,1 g) en gel de s´ılice (150 g) con CH2 Cl2 dio 1,1 g (28 %) de la cetona oleosa homog´enea 9; [α]D = +57,9◦C (c = 1) ([27]: p.f. 71-73◦C). IR (CHCl3 ): 1660s, 1615m, 1585w. RMN-1 H (90 MHz): 0,84 (s, 3H); 5,82 (m, 2H); 5,87 (br. s, 1H).

13

ES 2 127 247 T3 Ejemplo 9 19-nor-∆16 Androsten-3-ona (10) 5

10

15

Esta s´ıntesis se ilustra en la Figura 3. Se redujo 19-nortestosterona en 19-Nor-5α-androstan-17-ol3-ona (XX) con litio y amon´ıaco (c) de acuerdo con el m´etodo de Villotti, T., y col. (J. Am. Chem. o Androsta-5α-17-diol-3-ona (XX) en el acetato conocido (Hartman, Soc. (1960) 82:5693). Se convirti´ on J. A. y col., J. Am. Chem. Soc. (1956) 78: 5662) con anh´ıdrido ac´etico y piridina (a). Una soluci´ de 17β-acetoxi-5α-Estrano-3-ona (8,0 g, 25,1 mmoles) en octano/acetona 10:1 (22 ml) se piroliz´ o (b) a 550◦C (200 Torr, corriente lenta de N2 ). La cromatograf´ıa del producto bruto (5,4 g) en gel de s´ılice (600 g) con CH2 Cl2 y recristalizaci´on de las fracciones homog´eneas en PE dieron 3,13 g (48,3 %) de la cetona pura 10. p.f. 51-54◦C, [α]D = +72,8◦ (c = 1,0). IR (CHCl3 ): 1705s, 1585w, RMN-1 H (90 MHz); 0,79 (s, 3 H); 5,71 (m, 1 H); 5,87 (m, 1 H). Ejemplo 10 19-nor-∆16 -Androsten-3α-ol (11)

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25

Esta s´ıntesis se ilustra en la Figura 3. Se a˜ nadi´ o L-Selectruro (d, tri(sec-butil)hidruroborato de litio, on de cetona 10 (800 mg, 4 ml de una soluci´ on 1 M en THF, 4 mmoles) gota a gota a 0◦ C a una soluci´ nadi´ o agua (10 ml). Los 3,10 mmoles) en ´eter seco (5 ml). Despu´es de agitar durante 1 h a 0◦C, se a˜ boranos se oxidaron por adici´ on de soluci´ on acuosa de NaOH al 10 % (5 ml), seguida por soluci´ on acuosa on durante 3 h a TA. Despu´es del aislamiento (´eter), el producto bruto de H2 O2 al 30 % (3 ml) y agitaci´ (790 mg, mezcla aproximadamente 9:1 de 11 y 12) se cromatografi´o en gel de s´ılice con CH2 Cl2 para dar 700 mg (87 %) de alcohol puro 11. p.f. 119-120◦→123-124◦C (en PE), [α]D = +40,6◦C (c = 1,0). IR (CHCl3 ): 3640m, 3500 br., 1585w. RMN-1 H (90 MHz): 0,78 (s, 3 H); 4,09 (m, w1/2 ∼ 8, 1H); 5,71 (m, 1H), 5,87 (m, 1H). Ejemplo 11

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19-nor-∆16 -Androsten-3β-ol (12)

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Esta s´ıntesis se ilustra en la Figura 3. Una soluci´on de cetona 10 (800 mg, 3,10 mmoles) en ´eter seco (5 ml) se a˜ nadi´ o gota a gota a TA a una suspensi´on de LiAlH4 (38 mg, 1 mmol) en ´eter (3 ml) (e). Despu´es de 1 h, la mezcla se hidroliz´o con H2 SO4 acuoso al 10 %. Despu´es del aislamiento (´eter), el producto bruto (802 mg, mezcla 9:1 de 12 y 11) se cromatografi´ o en gel de s´ılice con CH2 Cl2 . Primero se eluy´o una fracci´ on peque˜ na de 11 (70 mg), seguido por la fracci´ on principal de 12 (705 mg, 87 %). p.f. 113-115◦C, [α]D = +36,3◦C (c = 1,0). IR (CHCl3 ): 3640m, 3500 br., 1585w. RMN-1 H (90 MHz): 0,78 (s, 3H); 3,60 (m, w1/2 ∼20, 1H); 5,71 (m, 1H), 5,87 (m, 1H).

40

Ejemplo 12 S´ıntesis de 19-OH-∆4,16-Androstadien-3-ona (18) 45

Los tres m´etodos siguientes de s´ıntesis de 19-OH-∆4,16-androstadien-3-ona se ilustran en la Figura 5. Androst-4-en-17,19-diol-3-ona (12)

50

Tambi´en conocido como 19-Hidroxitestosterona, este compuesto est´a disponible en el comercio a partir de Steraloids, Inc. Alternativamente, se trat´ o 19-hidroxiandrost-4-en-3,17-diona (11) con borohidruro pot´ asico (KBH4 , a) en etanol a una temperatura de -10◦ a 0◦ C. El aislamiento en agua fue seguido por extracci´on y purificaci´ on para producir 19-hidroxitestosterona (12). 19-Acetoxiandrost-4-en-3,17-diona (14)

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Se trat´ o Androst-4-en-19-ol-3,17-diona (11) con anh´ıdrido ac´etico (Ac2 O, b) en piridina. El aislamiento en agua fue seguido por extracci´on y purificaci´ on para producir el acetato (14). Acetato de 19-Acetoxitestosterona (13) 60

Se trat´ o 19-Hidroxitestosterona (12) con Ac2 O en piridina (c) con catalizador 4,4-dimetilaminopiridina. El aislamiento en agua fue seguido por extracci´ on y purificaci´ on para producir el acetato (13). 14

ES 2 127 247 T3

19-Acetoxitestosterona (15) (m´etodo 1)

5

Se trat´ o 19-Hidroxitestosterona (12) con Ac2 O en piridina (c). El aislamiento en agua fue seguido por extracci´on y purificaci´ on para producir el acetato (15). 19-Acetoxitestosterona (15) (m´etodo 2)

10

Se trat´ o 19-Acetoxiandrost-4-eno-3,17-diona (14) con KBH4 (e) en etanol a -10◦ a 0◦ C. El aislamiento en agua fue seguido por extracci´ on y purificaci´ on para producir acetato el (15). Tosilato de 19-Acetoxitestosterona (16,R=Ts)

15

Se trat´ o 19-Acetoxitestosterona (15) con cloruro de p-toluenosulfonil (TsCl, f) en piridina. El aislamiento en agua fue seguido por extracci´on y purificaci´ on para producir el tosilato (16,R=Ts). Metilcarbonato de 19-Acetoxitestosterona (16,R=COOCH3)

20

Se trat´ o 19-Acetoxitestosterona (15) con cloroformiato de metilo (ClCOOCH3 , g) en piridina. El aislamiento en agua fue seguido por extracci´ on y purificaci´ on para producir el metilcarbonato (16,R=COOCH3 ). 19-Acetoxiandrosta-4,16-dien-3-ona (17) (m´etodo 1)

25

Acetato de 19-acetoxitestosterona (13) se someti´o a pir´ olisis. El material pirolizado bruto se purific´ o para dar el acetato (17). 19-Acetoxiandrosta-4,16-dien-3-ona (17) (m´etodo 2)

30

Se calent´o tosilato de 19-Acetoxiandrona (16,R=Ts) en 2,4,6-colidina (h). Despu´es de enfriar, el aislamiento en agua fue seguido por extracci´on y purificaci´ on para producir el acetato (17). 19-Acetoxiandrosta-4,16-dien-3-ona (17) (m´etodo 3)

35

olisis. El material piroMetil carbonato de 19-Acetoxitestosterona (16,R=COOCH3 ) se someti´o a pir´ lizado bruto se purific´ o para dar el acetato (17). 19-Hidroxiandrosta-4,16-dien-3-ona (18)

40

Se trat´ o 19-Acetoxiandrosta-4,16-dien-3-ona (17) con hidr´oxido pot´ asico en metanol (i). El aislamiento en agua fue seguido por extracci´on y purificaci´ on para producir el alcohol (18). Ejemplo 13

45

S´ıntesis alternativa de 19-OH-∆4,16-Androstadien-3-ona (22) El siguiente m´etodo de s´ıntesis se ilustra en la figura 6: Tosilhidrazona de 3,19-Dihidroxiandrost-4-en-17-ona (20)

50

Se calent´o 3,19-Dihidroxiandrost-4-en-17-ona (19) a reflujo en metanol con un equivalente de po para toluenosulfonilhidrazida (TsNHNH2,a ) durante 16 horas. Despu´es de enfriar, la mezcla se evapor´ dar el producto bruto. La purificaci´ on produjo tosilhidrazona (20). 55

3,19-Dihidroxiandrosta-4,16-dieno (21) La tosilhidrazona (20) en tetrahidrofurano se trat´ o con n-butil-litio (BuLi, b) en hexano y la mezcla se agit´ o a temperatura ambiente durante 16 horas. La preparaci´ on acuosa fue seguida por extracci´on y purificaci´ on para producir el dieno (21).

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15

ES 2 127 247 T3 19-Hidroxiandrosta-4,16-dien-3-ona (22) Se trat´ o 3,19-Dihidroxiandrosta-4,16-dieno (21) con di´ oxido de manganeso (MnO2 , c) en hexano. La mezcla se filtr´ o y se evapor´o para dar el producto bruto. La purificaci´ on produjo la enona (22). 5

Ejemplo 14 S´ıntesis alternativa de Androsta-4,16-dien-3-ona (25) 10

El siguiente m´etodo de s´ıntesis se ilustra en la Figura 8: p-Toluenosulfonilhidrazona de deshidroepiandrosterona (23)

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Deshidroepiandrosterona (VII) (14,4 g, 50,0 mmoles) y p-toluenosulfonilhidrazida (12,75 g, 68,5 mmoles) en metanol seco (300 ml) se calentaron a reflujo durante 20 horas. La mezcla se transfiri´ o a un matraz c´onico y se dej´o enfriar. El producto cristalino se separ´ o por filtraci´ on bajo succi´ on y se lav´o con metanol (50 ml). Se obtuvieron cosechas adicionales de producto evaporando secuencialmente el filtrado a 75 ml y 20 ml, y dejando cristalizar cada vez. El rendimiento total fue 21,6 g(95 %). Androsta-5,16-dien-3β-ol (24) p-toluenosulfonilhidrazona de deshidroepiandrosterona (23) (22,8 g, 50,0 mmoles) en tetrahidrofurano seco (1,0 litros) se enfri´o en un ba˜ no de hielo seco/isopropanol. La mezcla se agit´o mientras se a˜ nadi´ o n-butil-litio (125 ml de soluci´ on 1,6 M en hexano, 200 mmoles). La mezcla se dej´o calentar a temperatura ambiente y se agit´o durante 24 horas. Se a˜ nadi´ o agua (50 ml) con enfriamiento en hielo. La mezcla se verti´o en soluci´on saturada de cloruro am´ onico/hielo (500 ml) y se extrajo con ´eter (x2). Las capas org´ anicas se lavaron con soluci´ on saturada de bicarbonato s´ odico (500 ml) y soluci´ on saturada de cloruro s´odico (500 ml), se secaron (MgSO4 ) y se evaporaron a vac´ıo para dar el producto bruto. Este se purific´ o por cromatograf´ıa instant´ anea en 190 g de gel de s´ılice 60, malla 230-400, eluyendo con acetato de etilo/hexano (20:80→50:50) para dar material cristalino. El producto se recristaliz´o en metanol (45 ml) de per´ oxido de hidr´ ogeno al 3 % (8 ml), lavando con metanol (30 ml)/agua (8 ml) para dar producto puro (6,75 g, 50 %). Androsta-4,16-dien-3-ona (25)

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Una soluci´on de 10 g de Androsta-5,16-dien-3β-ol (24) en 475 cm3 de tolueno y 75 cm3 de ciclohexanona se destil´ o (se recogieron aproximadamente 50 cm3 de destilado) para eliminar la humedad, se on se someti´o a reflujo durante 1 hora. Luego a˜ nadieron 5 g de Al(OPri )3 en 50 cm3 de tolueno y la soluci´ se a˜ nadi´ o agua, se eliminaron los componentes vol´atiles por destilaci´ on de vapor y el residuo se extrajo con cloroformo. La evaporaci´on del extracto seco, seguida por cristalizaci´ on del residuo en cloroformohexano, produjo 7,53 g de Androsta-4,16-dien-3-ona (25). Se obtuvieron otros 0,97 g (total, 8,5 g, 86 %) por cromatograf´ıa del licor madre sobre al´ umina neutra. Ejemplo 15

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S´ıntesis de estra-1,3,5(10),16-tetraen-3-ol (28) El siguiente m´etodo de s´ıntesis se ilustra en la Figura 7: 50

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p-Toluenosulfonilhidrazona de estrona (27) Se calentaron Estrona (26) (270 g, 1,00 mol) y p-toluenosulfonilhidrazida (232,8 g, 1,25 mol) en metanol seco (2,5 litros) a reflujo durante 20 horas. La mezcla se transfiri´ o a un matraz c´ onico y se dej´o enfriar. El producto cristalino se separ´ o por succi´ on bajo aspiraci´ on y se lav´ o con metanol (300 ml). Se obtuvieron cosechas adicionales de producto evaporando secuencialmente el filtrado a 2000 ml, 800 ml y 400 ml, y dej´ andolo cristalizar cada vez. El rendimiento total fue 433,5 g (99 %). 1,3,5(10),16-Estratetraen-3-ol (28)

60

Se enfri´ o p-toluenosulfonilhidrazona de estrona (27) (219,0 g, 500 mmoles) en tetrahidrofurano seco (8,0 litros) en un ba˜ no de cloruro s´ odico/hielo. La mezcla se agit´o mec´anicamente mientras se a˜ nadia n-butil-litio (800 ml de una soluci´ on 2,5 M en hexano, 2,00 moles) a trav´es de una aguja de doble punta. 16

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La mezcla se agit´o a temperatura ambiente durante 3 d´ıas. Se a˜ nadi´ o hielo (250 g), seguido por soluci´ on saturada de cloruro am´ onico (500 ml). Las fases se mezclaron mediante agitaci´on y se dejaron reposar. La fase acuosa se retir´ o mediante aspiraci´ on con tubo de teflon y se extrajo con ´eter (500 ml). Las dos fases org´ anicas se lavaron secuencialmente con el mismo lote de soluci´ on saturada de bicarbonato s´ odico (500 ml) seguido por soluci´ on saturada de cloruro s´ odico (500 ml). Las capas org´ anicas se secaron (MgSO4 ) y se evaporaron a vac´ıo para dar producto bruto. Este se someti´ o a filtraci´ on instant´ anea sobre 500 g de gel de s´ılice 60, malla 230-400, eluyendo con acetato de etilo/hexano (25:75, 2,5 litros). El filtrado se evapor´ o a vac´ıo para dar material cristalino. El producto se recristaliz´ o en metanol (300 ml)/agua (75 ml) lavando con metanol (80 ml)/agua (20 ml). La recristalizaci´ on adicional en acetato de etilo/hexano (12,5:87,5) dio producto puro (88,9 g, 70 %). Ejemplo 16 Electrofisiolog´ıa de la estimulaci´ on por 16-Androsteno del VNO y del epitelio olfatorio humanos

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Se emple´o un m´etodo no invasivo para registrar potenciales el´ectricos locales del ´organo vomeronasal humano (VNO) y del epitelio olfatorio (OE). Se aplic´ o estimulaci´on gaseosa localizada a ambas estructuras nasales en diferentes casos usando cat´eteres/electrodos especialmente dise˜ nados conectados a un sistema de suministro de substancia de canales m´ ultiples. La respuesta local del VNO y del OE mostr´ o una correclaci´on con la concentraci´on del est´ımulo. El estudio se realiz´o en diez voluntarios (seleccionados) cl´ınicamente normales, 2 hombres y 8 mujeres, que oscilaban entre 18 y 85 a˜ nos de edad. Los estudios se realizaron sin anestesia general o local.

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Los cat´eteres/electrodos se dise˜ naron para suministrar un est´ımulo localizado y registrar simult´ aneamente la respuesta. En el caso del registro de VNO, la fosa nasal derecha del sujeto se explor´o usando un nasoscopio (esp´eculo nasal) y la abertura vomerosanal se localiz´ o cerca de la intersecci´on del borde anterior del v´ omero y del fondo nasal. El cat´eter/electrodo se impuls´ o suavemente a trav´es de la abertura del VNO y la punta del electrodo se coloc´o en el lumen del o´rgano a 1 a 3 mm de la abertura. Entonces se retir´o el nasoscopio. En el caso del OE, el procedimiento de registro fue similar excepto que el posicionamiento del cat´eter/electrodo se coloc´o suavemente profundo en la parte lateral del conducto nasal medio, llegando a la mucosa olfatoria. La estimulaci´on gaseosa localizada se realiz´o a trav´es del cat´eter/electrodo. Una corriente constante de aire humidificado, no-oloroso, limpio a temperatura ambiente se hizo pasar continuamente a trav´es de un canal del sistema estimulador. Las substancias estimuladoras se diluyeron en propilenglicol, se mezclaron con aire humidificado, y se soplaron durante 1 a 2 segundos a trav´es del cat´eter/electrodo. Se estim´o que esta administraci´on proporciona aproximadamente 25 picogramos de esteroide a la cavidad nasal.

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Los resultados de este estudio se presentan en la Figura 9. La respuesta es un cambio negativo en el potencial local (despolarizaci´on) medido en milivoltios-segundos (mV X S). La ∆4,16-androstadien-3-ona muestra una respuesta del VNO significativamente m´ as fuerte en mujeres que los otros compuestos sometidos a ensayo (Figura 9A). Adem´as, la respuesta del VNO a ∆4,16-androstadien-3-ona es sexualmente dimorfa -dos veces m´ as fuerte en mujeres que en hombres (Figura 9B). En contraste, la respuesta del OE tanto en hombres como en mujeres es baja comparada con un agente odorante fuerte tal como clavo (Figura 9C). Ejemplo 17

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Electrofisiolog´ıa de la estimulaci´ on por Estreno del VNO y del epitelio olfatorio humanos

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Se emple´o un m´etodo no-invasivo para registrar potenciales el´ectricos locales del ´organo vomeronasal humano (VNO) y del epitelio olfatorio (OE). Se aplic´ o estimulaci´on gaseosa localizada a ambas estructuras nasales en diferentes casos usando cat´eteres/electrodos especialmente dise˜ nados conectados a un sistema de suministro de substancia de canales m´ ultiples. La respuesta local del VNO y del OE mostr´ o una correclaci´on con la concentraci´on del est´ımulo. El estudio se realiz´o en diez voluntarios (seleccionados) cl´ınicamente normales 2 hombres y 8 mujeres, que oscilaban entre 18 y 85 a˜ nos de edad. Los estudios se realizaron sin anestesia general o local. Los cat´eteres/electrodos se dise˜ naron para suministrar un est´ımulo localizado y registrar simult´anea17

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mente la respuesta. En el caso del registro de VNO, la fosa nasal derecha del sujeto se explor´o usando un nasoscopio (esp´eculo nasal) y la abertura vomerosanal se localiz´ o cerca de la intersecci´on del borde anterior del v´ omero y del fondo nasal. El cat´eter/electrodo se impuls´ o suavemente a trav´es de la abertura del VNO y la punta del electrodo se coloc´ o en el lumen del o´rgano a 1 a 3 mm de la abertura. Entonces se retir´o el nasoscopio. En el caso del OE, el procedimiento de registro fue similar excepto que el posicionamiento del cat´eter/electrodo se coloc´o suavemente profundo en la parte lateral del conducto nasal medio, llegando a la mucosa olfatoria. La estimulaci´on gaseosa localizada se realiz´o a trav´es del cat´eter/electrodo. Una corriente constante de aire humidificado, no oloroso, limpio a temperatura ambiente se hizo pasar continuamente a trav´es de un canal del sistema estimulador. Las substancias estimuladoras se diluyeron en propilenglicol, se mezclaron con aire humidificado, y se soplaron durante 1 a 2 segundos a trav´es del cat´eter/electrodo. Se estim´o que esta administraci´on proporciona aproximadamente 25 picogramos de esteroide a la cavidad nasal.

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Los resultados de este estudio se presentan en la Figura 10. La respuesta es un cambio negativo en el potencial local (despolarizaci´on) medido en milivoltios-segundos (mV X S). El 1,3,5(10),16-Estratetraen3-ol muestra una respuesta del VNO significativamente m´ as fuerte en machos que los otros compuestos sometidos a ensayo (Figura 10A). El 1,3,5(10)-Estratrieno-3,16α,17β-triol muestra tambi´en una respuesta de VNO fuerte. Adem´as, la respuesta del VNO de estos dos estrenos es sexualmente dimorfa -aproximadamente cuatro veces m´ as fuerte en hombres que en mujeres (Figura 10B). En contraste, la respuesta del OE tanto en hombres como en mujeres es baja comparada con un odor´ıfero fuerte tal como clavo (Figura 10C). Ejemplo 18 Comparaci´ on del cambio en el potencial local inducido por una fragancia que contiene Androsta-4,16dien-3-ona y una fragancia que contiene Androstenol

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Una fragancia formulada con Androstadienona (4 microgramos/ml) y una fragancia comercial (Lydia fabricada por Dinely of London, San Francisco, California) que conten´ıa feromona de cerdo, Androstenol, (2 miligramos/ml) se administraron por separado al VNO y al epitelio olfatorio de 6 mujeres voluntarias. Estas fragancias se administraron utilizando el dispositivo de cat´eter-electrodo y los m´etodos descritos en los Ejemplos 16 y 17 anteriores. El volumen administrado de ambas fragancias fue aproximadamente 10 nanolitros. Por lo tanto, las cantidades administradas de Androstadienona y Androstenol eran aproximadamente 30 picogramos y 15 mililitros, respectivamente. El cambio en el potencial local resultante de cada administraci´on se registr´o por separado desde el neuroepitelio olfatorio (electroolfatograma - “EOG”) o del neuroepitelio de NVO (electrovomeronasograma - “EVG”). La figura 11 muestra la desviaci´ on media y est´andar de estos cambios (despolarizaciones presentadas como cambio absoluto).

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La Figura 11A muestra que la fragancia que contiene Androstadienona tiene un efecto significativo sobre los receptores neuroepiteliales del VNO en todos los sujetos sometidos a ensayo, mientras que la fragancia que contiene Androstenol tiene poco efecto. En contraste, la Figura 11B muestra que ambas fragancias estimulan los receptores neuroepiteliales del epitelio olfatorio hasta un grado similar. Esto demuestra que una fragancia que contiene un odor´ıfero y una feromona humana estimula tanto el o´rgano del sentido olfatorio como el ´organo del sentido vomeronasal, mientras que una fragancia que contiene una feromona animal solamente estimula el sentido olfatorio. Ejemplo 19

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Efectos de feromonas humanas y animales y agentes odorantes comunes sobre los receptores neuroepiteliales del o ´rgano vomeronasal y del epitelio olfatorio humanos

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Las feromonas humanas Androsta-4,16-dien-3-ona y 1,3,5(10),16-Estratetraen-3-ol se compararon con varias feromonas animales, por ejemplo Civetona (gato de algalia), muscona (cabra de almizcle), y Androstenona y Androstenol (cerdo), y varios agentes odorantes primarios comunes, por ejemplo tonalida, escatol y 1-carvona, para ver su capacidad para inducir una despolarizaci´on acumulativa del neuroepitelio receptor del VNO humano y del epitelio olfatorio (OE) en 6 mujeres voluntarias y 9 hombres voluntarios). Cada substancia se administr´ o usando el cat´eter-electrodo combinado descrito en los Ejemplos 16 y 17. Todas las substancias se diluyeron en concentraciones equimolares y se suministr´ o aproximadamente 0,1 picomol en cada administraci´ on. La Figura 12 ilustra la desviaci´on media y est´andar de estos cambios de despolarizaci´ on (presentados como cambio absoluto). 18

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La Figura 12A muestra que de todas las substancias administradas, s´ olo Androsta-4,16-dien-3-ol muestra una respuesta mayor de 5 mV X S en mujeres. La Figura 12B muestra que de todas las substancias administradas, s´ olo 1,3,5(10), 16-Estratetraen-3-ol muestra una respuesta mayor de 5 mV X S en hombres. En contraste, las Figuras 12C y 12D muestran que las feromonas animales y agentes odorantes muestran respuesta olfatoria mientras que las dos feromonas humanas no la muestran. Adem´as, no existe dimorfismo sexual en la respuesta olfatoria de hombres y mujeres voluntarios. Esto demuestra que, mientras las feromonas animales pueden ser agentes olfatorios en seres humanos, s´olo las feromonas humanas pueden estimular el sentido vomeronasal humano.

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En los compuestos de la f´ ormulas (I) y (II) anteriores, los grupos aciloxi, alquiloxi, acilo, alcoxi, acilmetilo, acilalquilo, aciloximetilo, alcoximetilo, alquilo, hidroxialquilo, y similares, ya est´en o no calificados por el t´ermino “inferior”, contienen preferentemente de 1 a 6, por ejemplo de 1 a 4 ´atomos de carbono. Los grupos aciloxialquilo y alcoxialquilo son preferentemente grupos acil C1-6 oxi alquilo C1-6- y alcoxi C1-6 alquilo C1-6, o m´ as preferentemente grupos aciloxi C1-4 alquilo C1-4 y alcoxi C1-4 alquilo C1-4. El t´ermino “inferior” indica que se prefieren especialmente (aunque no exclusivamente) de 1 a 4 ´atomos de carbono.

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ES 2 127 247 T3 REIVINDICACIONES 1. Una composici´on de fragancia, que comprende un agente odorante y al menos una feromona que es un esteroide de la clase del 16-Androsteno de la f´ ormula (I): 5

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en la que R1 es oxo, α-(β-)hidroxi, α-(β-)acetoxi, α-(β-)-propionoxi, α-(β-)metoxi, α-(β-)aciloxi C1−6 , y ogeno, hidroxi, acilo, aciloxi, alcoxi, metilo, hidroxiα-(β-)-alquiloxi C1−6 , o α-(β-)benzoiloxi; R2 es hidr´ metilo, acilmetilo, aciloximetilo, alcoximetilo, alquilo de C1−6 , hidroxialquilo, acilalquilo, aciloxialquilo, y alcoxialquilo; y “a” y “b” son sitios alternativos para un enlace doble; y/o al menos un esteroide de la clase del Estreno, que tiene la f´ormula (II):

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en la que R4 es hidr´ ogeno, alquilo, oxo, α-hidroxi, β-hidroxi, sulfato, cipionato, acetato o glucuronido; ogeno, α-hidroxi o β-hidroxi; R6 es hidr´ ogeno, alquilo C1−6 , benzo´ılo, cipionilo, acetilo, glucuR5 es hidr´ ronido, acilo C1−6 o sulfato; y “c” es un enlace doble opcional; generando dicha feromona una despolarizaci´on in vivo del neuroepitelio en un o´rgano vomeronasal en un sujeto humano. 2. La composici´ on de la reivindicaci´ on 1, en la que dicha feromona es un esteroide de la clase del 16-Androsteno de la f´ ormula (I), en la que R1 se selecciona del grupo que consta de oxo, α-hidroxi y ogeno, hidroxi, acilo, aciloxi, alcoxi, alquilo β-hidroxi; y R2 se selecciona del grupo que consta de hidr´ C1−6 , metilo, hidroxialquilo, hidroximetilo, aciloxialquilo, aciloximetilo y alcoxialquilo, y en la que “a” y “b” son sitios alternativos para un enlace doble. 3. La composici´ on de la reivindicaci´ on 1, en la que dicha feromona es un esteroide de la clase del Estreno, de la f´ ormula (II). 4. La composici´ on de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha despolarizaci´ on no es inferior a aproximadamente 5 mV X S. 5. La composici´ on de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha despolarizaci´ on no es inferior a aproximadamente 10 mV X S.

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6. La composici´ on de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha feromona es 4,16Androstadien-3-ona, 1,3,5(10),16-Estratetraen-3-ol o mezclas de ellos. 7. La composici´ on de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la concentraci´ on de feromona en la composici´ on de fragancia es al menos 100 µg/ml, pero no m´ as de 100 µg/ml.

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8. La composici´ on de la reivindicaci´ on 7, en la que la concentraci´ on de dicha feromona en la fragancia es al menos 1 µg/ml, pero no m´ as de 25 µg/ml.

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ES 2 127 247 T3 9. La composici´ on de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, formulada para aplicaci´on externa a la piel. 10. La composici´on de la reivindicaci´ on 9, en forma de un perfume. 5

11. Una composici´on que contiene materiales fibrosos y al menos una feromona seleccionada a partir de un esteroide de la clase de 16-Androsteno y un esteroide de la clase del Estreno como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6. 10

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12. Una composici´on de producto de cuidado personal, que comprende al menos una feromona seleccionada a partir de un esteroide de la clase del 16-Androsteno y un esteroide de la clase del Estreno seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6. 13. Una composici´on que comprende un impulsor aerosol y al menos una feromona seleccionada a partir de un esteroide de la clase del 16-Androsteno y un esteroide de la clase del Estreno seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6. 14. Una composici´on que comprende al menos una feromona seleccionada a partir de un esteroide de la clase del 16-Androsteno y un esteroide de la clase del Estreno seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, estando formulada dicha composici´ on para la liberaci´on de una cantidad efectiva de dicha feromona en un espacio predeterminado de aire. 15. La composici´on de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 que comprende adicionalmente un agente odorante.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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