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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 219 517

51 Int. Cl. : A61K 39/00

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A61P 9/10

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

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86 Número de solicitud europea: 01919363 .0

86 Fecha de presentación: 01.03.2001

87 Número de publicación de la solicitud: 1267908

87 Fecha de publicación de la solicitud: 02.01.2003

54 Título: Vacuna para el tratamiento de la aterosclerosis.

30 Prioridad: 03.03.2000 GB 0005240

07.09.2000 GB 0022005

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

01.12.2004

73 Titular/es: GlaxoSmithKline Biologicals S.A.

rue de l’Institut 89 1330 Rixensart, BE

72 Inventor/es: Fruchart, Jean-Charles;

Monteyne, Philippe; Palmantier, Remi y Van Mechelen, Marcelle, Paulette

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Carpintero López, Francisco

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01.12.2004

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 219 517 T3 DESCRIPCIÓN Vacuna para el tratamiento de la aterosclerosis. 5

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La presente invención se refiere a nuevas terapias de vacuna y tratamientos profilácticos de enfermedades ateroscleróticas. Por lo tanto, se proporcionan inmunógenos que comprenden apoliproteínas, o fragmentos o derivados de éstas, que, en su forma nativa, la apolipoproteína completa tiene al menos una de las siguientes actividades: (a) la inhibición de la unión de la apolipoproteína B a su receptor, y/o, (b) la inhibición de la lipoproteína-lipasa. Un ejemplo preferido de una lipoproteína es la apolipoproteína C-III (ApoCIII). Las vacunas de la presente invención comprenden dichos inmunógenos, son potentes en la prevención o la reducción de la formación de la placa aterosclerótica, durante periodos prolongados de tiempo, reduciendo por ello el potencial de la aterosclerosis a desencadenar una enfermedad coronaria o cerebrovascular. Consecuentemente, se proporciona un método novedoso para el tratamiento de la aterosclerosis mediante la inhibición selectiva de la actividad de apolipoproteínas específicas en un hospedador humano, y en un aspecto preferido de la invención la apolipoproteína es la ApoCIII, comprendiendo la administración de una sustancia que dé lugar a la inhibición selectiva de la actividad de la lipoproteína en un humano. También se proporcionan métodos de tratamiento o de prevención mediante la vacunación activa o la vacunación pasiva mediante la administración a un paciente de un anticuerpo que sea capaz de unirse a una apolipoproteína que tenga al menos una de las siguientes actividades: (a) la inhibición de la unión de la apolipoproteína B a su receptor, y/o, (b) la inhibición de la lipoproteína-lipasa; y en este aspecto de la presente invención el anticuerpo se une preferiblemente a, y anula la actividad de la ApoCIII. Se proporciona además el uso de los inmunógenos o las vacunas de la presente invención en medicina, y los métodos de su producción. La aterosclerosis es la causa principal de muerte e incapacidad en el mundo desarrollado, y es la causa más importante de muerte coronaria y cerebrovascular, con aproximadamente 7,2 y 4,6 millones de muertes por año en todo el mundo, respectivamente (la aterosclerosis se describe de manera general en Harrison’s Principles of Internal Medicine (14ª Edición, McGraw Hill, págs. 1345-1352), Berliner, J. y col., 1995, Circulation, 91:2488-2496; Ross, R., 1993; Nature, 362:801). El nombre en griego se refiere al engrosamiento (esclerosis) de la capa íntima arterial y la acumulación de lípido (atero) en las lesiones. Aunque muchos factores de riesgo sistémicos o generalizados predisponen a su desarrollo, como fumar y una dieta rica en colesterol, esta enfermedad puede afectar a diferentes regiones de la circulación. Por ejemplo, la aterosclerosis de las arterias coronarias causa comúnmente angina de pecho e infarto de miocardio. Por otro lado, la aterosclerosis de las arterias que irrigan el sistema nervioso central provoca frecuentemente isquemia cerebral transitoria y derrames cerebrales. En la circulación periférica, la aterosclerosis puede causar claudicación intermitente y gangrena y puede poner en peligro la viabilidad de las extremidades. La complicación de la circulación esplácnica puede causar isquemia mesentérica e infarto intestinal. La aterosclerosis puede afectar directamente al riñón (causando por ejemplo estenosis de la arteria renal), y además, el riñón es un sitio frecuente de enfermedad ateroembólica. La aterogénesis en humanos ocurre típicamente a lo largo de muchos años, normalmente muchas décadas. La lenta formación de las placas aterógenas en el recubrimiento de la vasculatura puede llevar a expresiones clínicas crónicas a través de la restricción del flujo sanguíneo (tales como la angina de pecho estable e inducida por esfuerzo o la claudicación intermitente predictible y reproducible). De manera alternativa, puede ocurrir un evento clínico agudo mucho más dramático, tal como un infarto de miocardio o un accidente cerebrovascular, después de la ruptura de la placa. La manera en la que la aterosclerosis afecta a un segmento arterial también varía, una característica adicional de la heterogeneidad y complejidad de esta enfermedad. Se piensa que los ateromas son como lesiones estenóticas, o placas, que pueden limitar el flujo sanguíneo; sin embargo, la aterosclerosis también puede causar ectasia y desarrollo de la enfermedad aneurismática con un aumento del calibre del lumen. Esta expresión de la aterosclerosis ocurre frecuentemente en la aorta, creando una predisposición a la ruptura o la disección más que estenosis u oclusión. La génesis de las placas aterógenas se ha estudiado en profundidad. En adultos humanos normales, la capa íntima de las arterias contiene algunas células residentes de músculo liso embebidas en la matriz extracelular y cubiertas por una monocapa de células endoteliales vasculares. Los estados iniciales de la aterogénesis implican el desarrollo de “depósitos grasos” en las paredes del vaso sanguíneo, derivadas de la acumulación y el depósito de lipoproteínas en regiones de la capa íntima de la arteria. Las partículas de lipoproteína de baja densidad (LDL), ricas en colesterol, son un ejemplo de una lipoproteína aterógena que es capaz de depositarse en las paredes de los vasos para formar dichos depósitos grasos. Una vez depositadas en la pared vascular, las partículas de lipoproteína experimentan una modificación química, incluyendo tanto la oxidación como la glicación no enzimática. Estas lipoproteínas oxidadas y glicadas contribuyen entonces a muchos de los eventos posteriores en el desarrollo de la lesión. Las modificaciones químicas atraen a los macrófagos residentes de las paredes vasculares, que internalizan las LDL oxidadas y se convierten en células espumosas que inician las lesiones denominadas placas. Las placas ateroscleróticas son las responsables de las manifestaciones clínicas de la aterosclerosis, ya sea limitando el flujo sanguíneo, o dando lugar a un aneurisma, o incluso su ruptura puede provocar los ataques coronarios o cerebrovasculares.

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El desarrollo de la aterosclerosis es un proceso largo que puede ocurrir a lo largo de décadas, que se inicia por un desequilibrio entre las lipoproteínas aterógenas y protectoras. Por ejemplo, se piensa que el colesterol asociado con las concentraciones en la circulación de las lipoproteínas de alta densidad o HDL (denominado colesterol “bueno”) 2

ES 2 219 517 T3 y de las lipoproteínas de baja densidad o LDL (denominado colesterol “malo”) son marcadores de una probabilidad elevada de aterosclerosis (Harrison’s Principles of Internal Medicine (14ª Edición, McGraw Hill, págs. 1345-1352)). 5

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El colesterol, los ésteres de colesterol, los triacilgliceroles y otros lípidos se transportan en los fluidos corporales mediante una serie de lipoproteínas clasificadas de acuerdo con su densidad creciente: quilomicrones, lipoproteínas de muy baja, baja, intermedia y alta densidad (CM, VLDL, LDL, IDL y HDL, respectivamente). Estos complejos de lipoproteínas consisten en un núcleo de lípidos hidrofóbicos rodeado por lípidos polares y todo ello por una capa de apolipoproteínas. Actualmente existen diez tipos de apolipoproteínas conocidos, A-I, A-II, C, CI, CII, CIII, D, E, H y J. Existen al menos dos funciones de estas apolipoproteínas que son comunes a todos los complejos de lipoproteínas, en primer lugar son responsables de la solubilización de los núcleos lipídicos hidrofóbicos que transportan, y en segundo lugar están implicados también en la regulación de la captación de lipoproteína de colesterol por células específicas. Los diferentes tipos de lipoproteínas pueden tener diferentes funciones, por ejemplo, las LDL son ricas en ésteres de colesterol y se piensa que están asociadas con el transporte del colesterol hacia los tejidos periféricos para la síntesis de membrana nueva.

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Una de estas apolipoproteínas, la apolipoproteína C-III (ApoCIII), es una proteína de 79 aminoácidos producida en el hígado y el intestino (Brewer y col., J. Biol. Chem. (1974), 249:4975-4984; Protter, A.A., et al., 1984, DNA, 3:449-456; Fruchart, J.C. y col, 1996, Drugs Affecting Lipid Metabolism, (Eds, Gotto, A.M. y col.), Kluwer Academic Publishers and Fordazione Giovanni Lorenzini, Netherlands, págs. 631-638; Claveny, V. y col., Arteriosclerosis, Trombosis and Vascular Biology, 15, 7, 963-971; Patente de los Estados Unidos nº 4.801.531; McConathy, W.J. y col. 1992, Journal of Lipid Research, 33, 995-1003). Apo CIII es un componente de CM, VLDL y LDL (Lenich y col., C., J. Lip. Res. (1988) 29, 755-764) que existe como tres isoformas: apo CIII0, apo CIII1 y apo CIII2. Apo CIII no está glucosilado, sin embargo apo CIII1 y apo CIII2 están glucosilados y tienen respectivamente uno y dos residuos de ácido siálico (Ito y col., 1989 J. Lipd. Res. Nov 30:11 1781-1787). El dominio azúcar consta de un disacárido βD galactosil (1-3) α-N-acetil-D-galactosamina unido a la treonina 74 de la cadena proteica mediante un enlace O-glucosídico (Assman y col., 1989, BBA 541:234-240). En plasma normolipidémico humano, apo CIII0, apo CIII1 y apo CIII2 representan el 14%, 59% y 27% del total de apo CIII, respectivamente. La mutagénesis del sitio de glucosilación de la apo CIII humana no afecta a su secreción y a la unión a lípidos (Roghani y col., 1988, JBC 34:17925-32). La Apo CIII humana tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: SEAEDASLLSFMQGYMKHATKTAKDALSSVQESQVAQQARGWVTDGFSSLK DYWSTVKDKFSEFWDL DPEVRPTSAVAA (ID. SEC. Nº1)

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La concentración en plasma de apoCIII se correlaciona positivamente con las concentraciones de los triglicéridos en el plasma (Schonfeld y col., Metabolism (1979) 28: 1001-1010; Kaslyap y col., J. Lip. Res. (1981) 22 : 800810). Los estudios de perfusión del hígado demuestran que apoCIII inhibe la captación hepática de lipoproteínas ricas en triglicéridos (LRT) y sus residuos (Shelbume y col., J. Clin. Inves., (1980) 65: 652-658, Windler y col., J. Lip. Res. (1985) 26: 556-563). También los experimentos in vitro muestran que apoCIII inhibe la actividad tanto de la lipoproteína-lipasa (LPL) como de la lipasa hepática (Brown and Bakinsky, Biochim. Biophs. Acta. (1972) 46: 375382; Krauss y col., Circ. Res. (1973) 33: 403-411; Wang y col., J. Clin. Inves. (1985) 75: 384-390; Mc Conathy y col., J. Lip. Res. (1972) 33: 995-1003; Kinnemen and Enholm, FEBS (1976) 65: 354-357). Además, se dice que ApoCIII está implicada en la inhibición de la unión de LDL a los receptores de LDL (Fruchart y col. supra), a través de ApoB. El papel de apoCIII en el metabolismo de las LRT plasmáticas se ha definido mejor con los resultados de estudios recientes en animales transgénicos (Aalto-Setälä y col., J. Clin. Invest. (1992) 90:5 1889-1900.). Se ha mostrado que la acumulación plasmática de LRT en ratones que sobreexpresan apoCIII estaría asociada con un aclaramiento reducido de VLDL y quilomicrones en plasma (Harrold y col., J. Lip. Res. (1996) 37 : 754-760) También se demostró el efecto inhibitorio de las apolipoproteínas sobre el receptor LDL de lipoproteínas que contienen apoB (Clavey y col., Arth. Thromb. and Vasc. Biol. (1995) 15: 963-971). Las vacunas previas en el campo de la inmunoterapia de la aterosclerosis se han centrado en el uso del colesterol como immunógeno para reducir las concentraciones plasmáticas de colesterol (Bailey, J.M. y col., 1994, Biochemical Society Transactions, 22, 433S; Alving, C. and Swartz, G.M., 1991, Crit. Rev. Immunol., 10, 441-453; Alving, C. and Wassef, N.M., 1999, Immunology Today, 20, 8, 362-366). Otros han intentado alterar la actividad de la proteína transferidora del éster de colesterol (PTEC) mediante vacunación (documento WO 99/15655). De manera alternativa, algunos autores han descritos vacunas utilizando LDL oxidadas como inmunógeno, con el fin de inhibir la formación de la placa tras daño por globo en ratones hipercolesterolémicos (Nilsson, J. y col., 1997, JACC, 30, 7, 1886-1891). Sorprendentemente se ha descubierto que la aterosclerosis se puede prevenir o mejorar mediante inmunoterapia activa o pasiva, reduciendo o bloqueando la función de determinadas apolipoproteínas que promueven aterosclerosis. La presente invención proporciona inmunógenos efectivos en la profilaxis o la terapia de la aterosclerosis, y también tiene previsto métodos de tratamiento de la aterosclerosis mediante la administración de los inmunógenos de la presente invención a individuos que lo necesiten. Los inmunógenos de la presente invención comprenden apolipoproteínas seleccionadas de aquellas apolipoproteínas que promueven la formación de placas ateroscleróticas en individuos que padecen o están predispuestos a padecer 3

ES 2 219 517 T3 aterosclerosis. Las apolipoproteínas que se seleccionan para formar la base de los inmunógenos preferidos de la presente invención son apolipoproteínas que tienen al menos uno de las dos siguientes propiedades: la apolipoproteína nativa es capaz de (a) inhibir la unión de la apolipoproteína B a su receptor, y/o (b) la inhibición de la enzima lipoproteína-lipasa. 5

Las apolipoproteínas que se pueden usar como inmunógenos de la presente invención pueden tener cualquiera de las actividades anteriores, pero más preferiblemente tienen ambas actividades. El inmunógeno más preferido que tiene ambas actividades comprende la apolipoproteína CIII (ApoCIII). 10

Usando métodos que son conocidos en la técnica se puede investigar la actividad de cualquier apolipoproteína dada en la inhibición de la unión de lipoproteínas que contienen apo B a su receptor, o en la actividad enzimática de la lipoproteína-lipasa,. En Fruchart y col., supra; McConathy y col., supra; Shelburne y col., supra y Windler y col., supra, se describen ejemplos de estos métodos.

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Los inmunógenos de la presente invención pueden comprender toda la longitud de la apolipoproteína nativa, o pueden comprenden alternativamente fragmentos, péptidos o mimótopos de éstos, que retienen la actividad funcional de la terapia o la profilaxis de la aterosclerosis.

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Por ejemplo, el inmunógeno puede ser de cadena completa, o puede comprender fragmentos de la apolipoproteína nativa que sean menores de la longitud total de la apolipoproteína nativa. Preferiblemente los fragmentos de las proteínas de cadena completa son menores de 80 aminoácidos de longitud, más preferiblemente menores de 50 aminoácidos más preferiblemente menores de 40 aminoácidos y lo más preferiblemente dentro del intervalo de 4 a 25 aminoácidos de longitud. Los fragmentos de apolipoproteína que se pueden usar como inmunógenos de la presente invención comparten la función de la apolipoproteína de cadena completa de ser capaz (cuando se presenta apropiadamente al sistema inmune) de inducir anticuerpos anti-apolipoproteína. Además, los anticuerpos inducidos por los fragmentos son funcionales en el tratamiento de la aterosclerosis, y en un forma preferida de la presente invención anulan la inhibición ejercida por la apolipoproteína sobre la unión de ApoB a su receptor, y/o la actividad de la lipoproteína-lipasa.

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Los péptidos que se pueden formular en inmunógenos de la presente invención se pueden aislar a partir de los epítopos expuestos en la superficie de las apolipoproteínas. Los presentes inventores han descubierto que los péptidos útiles en la presente invención, son también epítopos muy expuestos en la superficie. A partir de esta observación los presentes inventores han diseñado un método para proporcionar otros epítopos adecuados, con regiones muy accesibles calculadas sobre un marco de cinco residuos. Usando el programa Molecular Simulation (MSI), los inventores han descubierto que las regiones preferidas de las apolipoproteínas tienen una superficie accesible, calculada sobre un ˚ 2 , y preferiblemente mayor de 80 A ˚ 2. marco de 5 residuos, mayor de 50 A Los péptidos que incorporan la secuencia de aminoácidos de dichos epítopos expuestos en superficie constituyen un aspecto de la presente invención. Los mimótopos que tienen las mismas características que estos péptidos, y los inmunógenos que comprenden dichos mimótopos, y que generan una respuesta inmune reaccionando de manera cruzada con la apolipoproteína, también conforman un aspecto de la presente invención. Por lo tanto, los inmunógenos de la presente invención pueden comprender los péptidos aislados que incluyen los propios epítopos de la apolipoproteína, y cualquier mimótopo de éstos. El significado de mimótopo se define como una entidad que es suficientemente similar al epítopo de la apolipoproteína, de manera que sea capaz de ser reconocida por anticuerpos que reconozcan a la apolipoproteína; (Gheysen, H.M., y col., 1986, Synthetic peptides as antigens. Wiley, Chichester, Ciba foundation symposium 119, págs. 130-149; Gheysen, H.M., y col., 1986, Molecular Immunology, 23, 7, 709-715); o son capaces de estimular anticuerpos, cuando se acoplan a un transportador adecuado, que reaccionan de manera cruzada con la apolipoproteína nativa. Los mimótopos peptídicos de los epítopos de la apolipoproteína identificados antes se pueden diseñar para un propósito particular mediante la adición, la supresión, o la sustitución de los aminoácidos elegidos. Así, los péptidos de la presente invención se pueden modificar con la finalidad de facilitar la conjugación con una proteína transportadora. Por ejemplo, puede ser deseable para algunos métodos de conjugación química, incluir una cisteína terminal al epítopo de la apolipoproteína. Además, sería deseable para los péptidos conjugados con una proteína transportadora incluir un residuo terminal hidrofóbico en posición distal de la región terminal conjugada del péptido, de manera que la parte final libre no conjugada del péptido permanezca asociada a la superficie de la proteína transportadora. Esto reduce los grados conformacionales de libertad del péptido, y aumenta así la probabilidad de que el péptido se presente en una conformación que sea lo más parecida al péptido de la apolipoproteína encontrado en el contexto de la apolipoproteína completa. Por ejemplo, los péptidos se pueden modificar para tener una cisteína N-terminal y una cola amidada hidrofóbica en la posición C-terminal. Alternativamente, se puede realizar la adición o la sustitución de una forma Destereoisómero de uno o más aminoácidos para crear un derivado beneficioso, por ejemplo para aumentar la estabilidad del péptido. Aquellos expertos en la técnica se darán cuenta de que dichos péptidos o mimótopos modificados, podrían ser un mimótopo completa o parcialmente no peptídico en el que los residuos constituyentes no se restringen necesariamente a los 20 aminoácidos naturales. Además, se pueden ciclar mediante métodos conocidos en la técnica para forzar al péptido hacia una conformación que se asemeje en detalle a su forma cuando la secuencia del péptido está en el contexto de la apolipoproteína completa. 4

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Los mimótopos del péptido también pueden ser retrosecuencias de las secuencias del péptido de la apolipoproteína natural, en las que se invierte la orientación de la secuencia; o alternativamente, las secuencias pueden constar completamente o al menos en parte, de los D-isómeros de los aminoácidos (secuencias inversas). También, las secuencias de los péptidos pueden ser de carácter retroinverso, en la que las secuencia de orientación se invierte y los aminoácidos son del tipo D-estereoisómero. Dichos péptidos retro o retro-inversos tienen la ventaja de no ser propios, y pueden superar por sí mismos problemas de auto-tolerancia por el sistema inmune. De manera alternativa, los mimótopos del péptido se pueden identificar utilizando anticuerpos que son capaces por sí mismos de unirse a la apolipoproteína, empleando técnicas tales como la tecnología de exposición en fago (documento EP 0 552 267 B1). Esta técnica genera un gran número de secuencias de péptidos que imitan la estructura de los péptidos nativos y son, por lo tanto, capaces de unirse a anticuerpos frente a péptidos nativos, pero no tienen que compartir necesariamente por sí mismos una homología de secuencia significativa con la apolipoproteína nativa. Los inmunógenos más preferidos de la presente invención comprenden ApoCIII o un fragmento, un péptido o un mimótopo de ésta. El inmunógeno ApoCIII puede ser la proteína nativa de cadena completa: ApoCIII humana 1-79,

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SEAEDASLLSFMQGYMKHATKTAKDALSSVQESQVAQQARGWVTDGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWDL DPEVRPTSAVAA (ID. SEC. Nº. 1). Alternativamente, el inmunógeno puede comprender fragmentos de la ApoCIII completa que son 78 aminoácidos de longitud o menos, preferiblemente 50 aminoácidos de longitud o menos, más preferiblemente 40 aminoácidos de longitud o menos, y lo más preferiblemente dentro del intervalo de 4 a 25 aminoácidos de longitud. Los fragmentos particularmente preferidos o los péptidos incluirán la región definida por los aminoácidos 1-17, 1-40,12-35, 41-79, 4565, o 45-76 en la ApoCIII madura. Las secuencias peptídicas para algunos de los péptidos preferidos son: ApoCIII 1-17 humana, SEAEDASLLSFMQGYMK (ID. SEC. Nº 2)

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ApoCIII 1-40 humana, SEAEDASLLSFMQGYMKHATKTAKDALSSVQESQVAQQAR (ID. SEC. Nº 3) ApoCIII 12-35 humana, MQGYMKHATKTAKDALSSVQESQV (ID. SEC. Nº 4) ApoCIII 41-79 humana, GWVTDGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWDLDPEVRPTSAVAA (ID. SEC. Nº 5)

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ApoCIII 45-65 humana, DGFSSLKDYWSTVKDKFSEFW (ID. SEC. Nº 6) ApoCIII 45-76 humana, DGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWDLDPEVRPTSA (ID. SEC. Nº 7) 40

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Un fragmento inmunológicamente equivalente de ApoCIII se puede definir como un polipéptido menor de la propia ApoCIII, que sea capaz de generar respuestas inmunes que reconozcan a la ApoCIII nativa, y que funcione en la terapia o la profilaxis de la aterosclerosis. Otras apolipoproteínas que se pueden usar en los inmunógenos de la presente invención son la apolipoproteína CII o la apolipoproteína E. En una realización particularmente preferida de la presente invención la apolipoproteína o el fragmento de ésta se une a una molécula transportadora para aumentar la capacidad inmunógena de la apolipoproteína o del fragmento de ésta. Por consiguiente, los péptidos o los mimótopos se pueden unir mediante conjugación química covalente o mediante la expresión de adyuvantes de fusión diseñados genéticamente, y opcionalmente mediante una secuencia de unión. Los péptidos pueden tener dos o más residuos de glicina como una secuencia de unión, y frecuentemente tienen un residuo de cisteína terminal expuesto para realizar la unión. Por ejemplo, algunos de estos péptidos preferidos se enumeran a continuación: MQGYMKHATKTAKDALSSVQESQVGGC CGGMQGYMKHATKTAKDALSSVQESQV DGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWGGC CGGDGFSSLKDYWSTVKDKFSEFW

(ID. SEC. Nº 8) (ID. SEC. Nº 9) (ID. SEC. Nº 10) (ID. SEC. Nº 11)

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El acoplamiento covalente de la apolipoproteína, tal como la ApoCIII, a una proteína transportadora se puede llevar a cabo de un modo bien conocido en la técnica. Así, por ejemplo, para el acoplamiento covalente directo es posible utilizar una carbodiimida, el glutaraldehído o el éster de (N-[γ-maleimidobutiriloxi]) succinimida, utilizando grupos de unión heterobifuncionales comunes y disponibles comercialmente tales como el CDAP y el SPDP (siguiendo las instrucciones del fabricante). Después de la reacción de acoplamiento, el inmunógeno se puede aislar fácilmente y purificar por medio de un método de diálisis, un método de filtración en gel, un método de fraccionamiento, etc.

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Los tipos de transportadores empleados en los inmunógenos de la presente invención se conocerán fácilmente por las personas expertas en la técnica. La función del transportador es proporcionar una ayuda de tipo citoquina con el fin de aumentar la respuesta inmune frente a la apolipoproteína o el péptido de apolipoproteína. Una lista no exhaustiva de transportadores que se pueden utilizar en la presente invención incluye: hemocianina de la lapa de bocallave (siglas en inglés, KLH), albúminas séricas tales como la albúmina sérica bovina (BSA), las toxinas bacterianas inactivadas tales como las toxinas del tétanos o de la difteria (TT y DT), o los fragmentos recombinantes de éstas (por ejemplo, el dominio 1 del fragmento C de la TT, o el dominio de translocación de la DT), o el derivado proteico purificado de la tuberculina (siglas en inglés, PPD). De manera alternativa, la apolipoproteína o los mimótopos o los epítopos se puede unir al transportador de un modo no covalente tal como la asociación a través un liposoma transportador o mediante la co-adsorción en un sal de aluminio, que pueda comprender adicionalmente inmunógenos capaces de proporcionar ayuda de tipo linfocito T o inmunoestimuladores adyuvantes adicionales. La relación entre el número de apolipoproteína, o el fragmento o el péptido de ésta y la proteína transportadora es preferiblemente del orden de 1:1 a 20:1, y preferiblemente cada transportador debería transportar entre 3-15 apolipoproteínas, o péptidos o fragmentos de ésta.

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En una realización de la invención el transportador es la proteína D de Haemophilus influenzae (documento EP 0 594 610 B1). La proteína D es una proteína de unión a la IgD de Haemophilus influenzae y ha sido patentada por Forsgren (documento WO 91/18926, documento concedido EP 0 594 610 B1). En algunas circunstancias, por ejemplo en los sistemas de expresión de inmunógeno recombinante sería deseable utilizar fragmentos de proteína D, por ejemplo un tercio de la proteína D (comprendiendo los aminoácidos 100-110 N-terminales de la proteína D (documento WO 99/10375; documento WO 00/50077)). Otro método preferido de presentar la apolipoproteína, tal como la ApoCIII, o los péptidos de la presente invención, se encuentra dentro del contexto de una molécula de fusión recombinante. Por ejemplo, documento EP 0 421 635 B describe el uso de partículas quiméricas del antígeno de la nucleocápside del hepadnavirus para presentar secuencias de péptidos extraños en una partícula similar a un virus. Como tales, los inmunógenos de la presente invención pueden comprender la apolipoproteína o los péptidos de la apolipoproteína presentados en partículas quiméricas que constan del antígeno de la nucleocápside de la hepatitis B (centro HepB). Además, las proteínas de fusión recombinante pueden comprender los mimótopos de la presente invención y una proteína transportadora, tal como NS1 del virus de la gripe. Para cualquier proteína expresada de manera recombinante que forme parte de la presente invención, el ácido nucleico que codifica para dicho inmunógeno también integra un aspecto de la presente invención. Por lo tanto, los inmunógenos preferidos de la presente invención comprenden el péptido ID. SEC. nº 1 o ID. SEC. nº 2-7, presentado en un sistema de expresión recombinante (tal como el centro HepB) o conjugado con una proteína transportadora, de manera que el sistema de expresión recombinante o la proteína transportadora proporcionen ayuda de tipo linfocito T para la generación de una respuesta inmune a ID. SEC. nº 1 o ID. SEC. nº 2-7. Concretamente los inmunógenos preferidos comprenden la ID. SEC. nº 4 sola, o conjugada o fusionada con una proteína transportadora para proporcionar ayuda de tipo linfocito T para la generación de una respuesta inmune a la ID. SEC. nº 4. En una realización alternativa de la presente invención la capacidad inmunógena de los péptidos se incrementa mediante la adición de epítopos de linfocitos T cooperadores (Th). Por lo tanto, los inmunógenos de la presente invención pueden comprender los péptidos descritos previamente y los epítopos-Th promiscuos ya sea como conjugados químicos o como construcciones de péptidos puramente sintéticos. Los péptidos de apolipoproteína se unen preferiblemente a los epítopos Th mediante un espaciador (por ejemplo, Gly-Gly) a cualquier extremo N-terminal o C-terminal del péptido de apolipoproteína. Los inmunógenos pueden comprender 1 o más epítopos-Th promiscuos, y más preferiblemente entre 2 a 5 epítopos-Th. Un epítopo de Th es una secuencia de aminoácidos que comprende un epítopo de Th. Un epítopo de Th puede constar de un epítopo continuo o discontinuo. Así pues, no todos los aminoácidos de Th son parte necesariamente del epítopo. Los epítopos-Th que son promiscuos son amplia y elevadamente reactivos en poblaciones humanas y animales con tipos de MHC muy divergentes (Partidos y col. (1991) “Immune Responses in Mice Following Immunization with Chimeric Synthetic Peptides Representing B and T Cell Epitopes of Measles Virus Proteins” J. of Gen. Virol. 72: 1293-1299, US 5.759.511). Los dominios Th que se pueden usar de acuerdo con la presente invención tienen desde aproximadamente 10 aminoácidos a aproximadamente 50 aminoácidos, y preferiblemente de aproximadamente 10 aminoácidos a aproximadamente 30 aminoácidos. Si se presentan múltiples epítoposTh, cada epítopo de Th es independientemente el mismo u otro.

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Los epítopos-Th incluyen como ejemplos a los epítopos derivados de patógenos tales como los epítopos-Th del antígeno de la nucleocápside (péptido 50-69, Ferrari y col., J. Clin. Invest, 1991, 88, 214-222) o de la superficie del virus de la hepatitis, los epítopos-Th de la toxina de Bacillus pertussis, los epítopos-Th de la toxina del tétanos (tales como P2 (documento EP 0 378 881 B1) y P30 (documento WO 96/34888, documento WO 95/31480, documento WO 95/26365)), los epítopos-Th de la proteína F del virus del sarampión, los epítopos-Th de la proteína de la membrana externa principal de Chlamidia trachomatis (tales como P11, Stagg y col., Immunology, 1993, 79, 1-9), los epítoposTh de invasina de Yersinia y de la toxina de la difteria. Otros epítopos-Th se describen en el documento US 5.759.551 y Cease y col., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 4249-4253; y Partidos y col., J. Gen. Virol, 1991, 72, 1293-1299; documento WO 95/26365 y documento EP 0 752 886 B.

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Los péptidos usados en la presente invención se puede sintetizar fácilmente mediante procedimientos en fase sólida bien conocidos en la técnica. La síntesis adecuada se puede realizar mediante el empleo de procedimientos “T-boc” o “F-moc”. Los péptidos cíclicos se pueden sintetizar mediante el procedimiento en fase sólida empleando el método 6

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bien conocido “F-moc” y una resina de poliamida, en un aparato totalmente automatizado. Alternativamente, aquellos expertos en la técnica conocerán las técnicas de laboratorio necesarias para realizar el proceso de manera manual. Las técnicas y los procedimientos para la síntesis en fase sólida se describen en “Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach” por E. Atherton y R.C. Sheppard, publicado por IRL en Oxford University Press (1989). Como alternativa, los péptidos se pueden producir por métodos recombinantes, incluyendo la expresión de moléculas de ácidos nucleicos que codifican para los mimótopos en una bacteria o una línea celular humana, seguido de la purificación del mimótopo expresado. Las técnicas para la expresión recombinante de los péptidos y las proteínas son conocidas en la técnica, y se describen en Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook y col., Molecular cloning, a laboratory manual, 2ª ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989).

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También forman parte de la presente invención las partes del ácido nucleido que codifican para los inmunógenos de la presente invención o los péptidos, los mimótopos o los derivados de éste, o las proteínas de fusión recombinantes que comprenden los inmunógenos. En particular, se suministran las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican la ID. SEC. nº 1-7, o los inmunógenos que comprenden las secuencias ID. SEC. nº 1-7. 15

Los inmunógenos de la presente invención se suministran para su uso en medicina, para el uso en el tratamiento de la aterosclerosis, y para la formulación en composiciones inmunogénas o vacunas de la presente invención.

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Los inmunógenos de la presente invención se pueden formular en composiciones inmunógenas o vacunas, que son efectivas en la profilaxis o la terapia de la aterosclerosis. Las composiciones inmunógenas y las vacunas comprenden uno o más inmunógenos de la presente invención como se ha descrito antes. Por lo tanto, las vacunas comprenden apolipoproteínas seleccionadas de aquellas apolipoproteínas que facilitan la formación de las placas ateroscleróticas. Las vacunas preferidas comprenden inmunógenos que contienen apolipoproteínas, con al menos una de las dos siguientes propiedades: la apolipoproteína nativa es activa en la supresión del enlace de ApoB con su receptor, y/o es capaz de inhibir la actividad enzimática de la lipoproteína-lipasa.

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Las vacunas o las composiciones inmunógenas más preferidas de la presente invención comprenden ApoCIII, o un fragmento o un péptido de ésta. Lo más preferiblemente, la vacuna comprende ApoCIII o un fragmento de ésta, conjugada o fusionada a una proteína transportadora para proporcionar ayuda de tipo linfocito T para la generación de una respuesta inmune frente a la ApoCIII o un fragmento de ésta.

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Las vacunas o las composiciones inmunógenas de la presente invención pueden incluir también de forma favorable un adyuvante. Las adyuvantes adecuados para las vacunas de la presente invención comprenden aquellos adyuvantes que son capaces de aumentar la respuesta del anticuerpo frente al inmunógeno de apolipoproteína. Los adyuvantes son bien conocidos en la técnica (Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Eds. Powell, M.F., and Newman, M.J., Plenum Press, New York and London, ISBN 0-30644867-X). Los adyuvantes preferidos para su uso con inmunógenos de la presente invención incluyen sales de calcio o aluminio (por ejemplo hidróxidos o sales fosfato). Los adyuvantes preferidos para su uso con inmunógenos de la presente invención incluyen: sales de aluminio o calcio (hidróxido o fosfato), emulsiones de aceite en agua (documento WO 95/17210, documento EP 0 399 843), o transportadores particulares tales como liposomas (documento WO 96/33739). Se prefieren particularmente las fracciones de saponina inmunológicamente activas (por ejemplo Quil A) con una actividad adyuvante derivada de la corteza del árbol sudamericano Quillaja saponaria Molina. Los derivados de Quil A, por ejemplo QS21 (una fracción purificada por HPLC derivada de Quil A) y el método de su producción se describen en la Patente de los Estados Unidos nº 5.057.540. Además de QS21 (conocida como QA21), se describen también otras fracciones tales como QA17. El monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) es un adyuvante bastante conocido, fabricado por Ribi Immunochem, Montana. Se puede preparar mediante métodos mostrados en el documento GB 21222204B. Una forma preferida de 3D-MPL está en forma de una emulsión en la que el 3D MPL tiene un pequeño tamaño de partícula menor de 0,2 µm de diámetro (documento EP 0 689 454 B1). Los adyuvantes también incluyen, pero no se limitan al dipéptido de muramilo y las saponinas tales como la Quil A, los lipopolisacáridos bacterianos tales como el 3D-MPL (monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado), o el TDM. Como una alternativa adicional a modo de ejemplo, la proteína se puede encapsular dentro de micropartículas tales como los liposomas, o en suspensiones no particuladas de polioxietilén éter (documento WO 99/52549). Los adyuvantes particularmente preferidos son combinaciones de 3D-MPL y QS21 (documento EP 0 671 948 B1), aceite en emulsiones de agua que comprenden 3D-MPL y QS21 (documento WO 95/17210, documento PCT/EP98/05714), 3D-MPL formulados junto a otros transportadores (documento EP 0 689 454 B1), o QS21 formulado en liposomas que contienen colesterol (documento WO 96/33739), u oligonucleótidos inmunoestimuladores (documento WO 96/02555). Las vacunas de la presente invención se administran por lo general tanto como dosis inicial como de refuerzo. Se prevé que las dosis de refuerzo estén separadas adecuadamente, o aplicadas preferiblemente cada año o a tales tiempos para que las concentraciones del anticuerpo circulante disminuyan por debajo de un nivel deseado. Las dosis de refuerzo pueden constar del péptido en ausencia de la molécula transportadora original. Dichas construcciones de refuerzo pueden comprender un transportador alternativo o pueden existir en ausencia de cualquier transportador.

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En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una vacuna o una composición inmunógena como se describe aquí para su uso en medicina. 7

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Las preparaciones de la composición inmunógena o de la vacuna de la presente invención se pueden usar para proteger o tratar a un mamífero susceptible de, o que padezca aterosclerosis, mediante métodos para administrar dicha vacuna mediante una vía sistémica o mucosal. Estas administraciones pueden incluir la inyección a través de las vías intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o mediante administración mucosal en los tractos oral/alimentario, respiratorio y genitourinario. La cantidad de proteína en cada dosis de vacuna o de composición inmunógena se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos significativos en las vacunas típicas. Dicha cantidad variará dependiendo del anticuerpo específico que se utilice y cómo se presente. Por lo general, se prevé que cada dosis comprenda 1-1000 µg de proteína, preferiblemente 1-500 µg, preferiblemente 1-100 µg, de las que el intervalo más preferido es 1 µg a 50 µg. Se puede determinar una cantidad óptima para una vacuna concreta mediante estudios estándar que implican la observación de las respuestas inmunes apropiadas en los individuos. Tras una vacunación inicial, los individuos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo separadas adecuadamente.

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La preparación de la vacuna se describe de forma general en New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller y col., University Park Press, Baltimore, Maryland, EEUU, 1978. La conjugación de proteínas con macromoléculas se muestra en Likhite, Patente de los Estados Unidos 4.372.945 y en Armor y col., Patente de los Estados Unidos 4.474.757.

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Los ligandos que son capaces de unirse a las mismas apolipoproteínas que forman la base para los inmunógenos de la presente invención integran una importante realización de la presente invención. Dichos ligandos son capaces de ser usados en la profilaxis o la terapia pasiva, mediante la administración de los ligandos a un paciente, para la mejora de la enfermedad aterógena.

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Por lo tanto, los ligandos preferidos de la presente invención son capaces de unirse a, y limitar la actividad de las apolipoproteínas que tienen al menos una de las dos siguientes propiedades: la apolipoproteína nativa es capaz de suprimir la unión de la apolipoproteína B a su receptor, y/o es capaz de inhibir la actividad enzimática de la lipoproteína-lipasa.

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Los ligandos de la presente invención se unen preferiblemente a las apolipoproteínas que pueden tener cualquiera de las actividades anteriores, pero más preferiblemente tienen ambas actividades. Un ligando particularmente preferido es aquél que se une a la apolipoproteína CIII (ApoCIII).

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Los ejemplos preferidos de tales ligandos útiles incluyen anticuerpos monoclonales o policlonales. Por ejemplo, los anticuerpos inducidos en un animal se pueden purificar y administrar de forma pasiva a otro animal para la profilaxis o la terapia de la aterosclerosis. Los inmunógenos de la presente invención se pueden usar también para la generación de hibridomas de anticuerpos monoclonales (usando técnicas conocidas, por ejemplo, Köhler and Milstein, Nature, 1975, 256, pág. 495), anticuerpos monoclonales humanizados o monoclonales con injerto de CDR, mediante métodos conocidas en la técnica.

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El término “anticuerpo” se usa aquí para referirse a una molécula con una especificidad útil de unión al antígeno. Aquellos expertos en la técnica apreciarán fácilmente que este término puede también abarcar a los polipéptidos que son fragmentos o derivados de anticuerpos pero que pueden mostrar la misma funcionalidad o muy parecida. Se pretende que tales fragmentos o derivados de anticuerpo se incluyan en el término anticuerpo como se usa aquí. 45

Por consiguiente, mediante la presente invención se proporciona un anticuerpo aislado generado contra los inmunógenos aislados de la presente invención. 50

También se proporciona por la presente invención una preparación de un anticuerpo poli- o monoclonal, que se una a ApoCIII. Los anticuerpos poli- o monoclonales particularmente preferidos reconocen fragmentos de ApoCIII nativa completa, tales como la ApoCIII 1-17 humana, SEAEDASLLSFMQGYMK (ID. SEC. Nº 2) ApoCIII 1-40 humana, SEAEDASLLSFMQGYMKHATKTAKDALSSVQESQVAQQAR (ID. SEC. Nº 3).

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ApoCIII 12-35 humana, MQGYMKHATKTAKDALSSVQESQV (ID. SEC. Nº 4). ApoCIII 41-79 humana, GWVTDGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWDLDPEVRPTSAVAA (ID. SEC. Nº 5). ApoCIII 45-65 humana, DGFSSLKDYWSTVKDKFSEFW (ID. SEC. Nº 6).

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ApoCIII 45-76 humana, DGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWDLDPEVRPTSA (ID. SEC. Nº 7). También se proporcionan los hibridomas que segregan los ligandos del anticuerpo monoclonal de la presente invención. 65

Las composiciones farmacéuticas que contienen los ligandos descritos antes, también integran un aspecto de la presente invención. También se proporciona el uso de los ligandos en medicina, y en la fabricación de medicamentos para el tratamiento de la aterosclerosis. 8

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En los tratamientos pasivos de la aterosclerosis como se proporcionan aquí, la administración de los ligandos o los anticuerpos de la presente invención se administrará por vía intravenosa a los pacientes que lo necesiten. La frecuencia de administración se puede determinar clínicamente siguiendo el descenso en el tiempo de los valores de anticuerpo en el suero de pacientes, pero en cualquier caso puede ser una frecuencia de 1 a 52 veces al año, y más preferiblemente entre 1 y 12 veces al año. Las cantidades de anticuerpo o de ligando pueden variar de acuerdo con la severidad de la enfermedad, o la semivida del anticuerpo en el suero, pero preferiblemente estará en el intervalo de 1 a 10 mg/kg de paciente, y preferiblemente dentro del intervalo de 1 a 5 mg/kg de paciente, y lo más preferiblemente de 1 a 2 mg/kg de paciente. Los inmunógenos, las composiciones inmunógenas, las vacunas o los ligandos de la presente invención se pueden administrar a un paciente que padezca, o tenga riesgo de padecer una enfermedad aterosclerótica, y son efectivos en el restablecimiento del correcto equilibrio en el balance de las lipoproteínas “malas” (lipoproteínas que contienen apoB) hacia las lipoproteínas “buenas” (lipoproteínas que contienen apoA-1), y minimizar el tiempo de circulación de las lipoproteínas que contienen apoB. Sin desear estar limitados por la teoría, los inventores creen que estas funciones minimizan la posibilidad de depósito y oxidación de las lipoproteínas que contienen apoB en las paredes de los vasos sanguíneos, y por tanto, reducen el riesgo la formación o el crecimiento de la placa aterosclerótica. Por ello, la presente invención proporciona el uso de los inmunógenos de apolipoproteína de la presente invención (como se ha definido antes), en la fabricación de composiciones farmacéuticas para la profilaxis o la terapia de la aterosclerosis. También se proporcionan los inmunógenos que comprenden apolipoproteína o péptidos de la presente invención, y las moléculas transportadoras para su uso en la fabricación de vacunas para la inmunoprofilaxis o la terapia de la aterosclerosis. Por lo tanto, los inmunógenos de apolipoproteína de la presente invención se proporcionan para su uso en medicina, y en el tratamiento médico o la profilaxis de la aterosclerosis. También se proporciona un método de tratamiento o de profilaxis de la aterosclerosis que comprende la administración de una composición inmunógena o una vacuna o un ligando de la presente invención, a un paciente que padece o que es susceptible de padecer aterosclerosis. Se proporciona un método de profilaxis o tratamiento de la aterosclerosis que comprende una reducción de las concentraciones de triglicéridos circulantes totales en un paciente, mediante la administración de una vacuna de la presente invención al paciente. En concreto se proporciona un método para reducir la cantidad de VLDL y LDL circulantes en un paciente, mediante la administración de la vacuna o los ligandos de la presente invención al paciente. También se proporciona un método de profilaxis o tratamiento de la aterosclerosis mediante la administración a un paciente de una vacuna que sea capaz de reducir el tiempo medio de circulación de las lipoproteínas que contienen ApoB. A este respecto, el tiempo medio de circulación de las lipoproteínas que contienen ApoB se puede investigar en un modelo animal in vivo mediante la medida de la tasa de aclaramiento de lipoproteínas marcadas que contienen ApoB, a partir de plasma de mamífero (semivida de las lipoproteínas marcadas que contienen ApoB). Un inmunógeno preferido para este método de los aspectos del tratamiento de la presente invención comprende ApoCIII. Sorprendentemente, el marcado de ApoCIII por la vacuna o el ligando regula por disminución los efectos negativos del colesterol “malo” (LDL), mientras que no tiene un efecto negativo sobre el colesterol “bueno” (HDL). La presente invención proporciona un método de tratamiento o profilaxis de la aterosclerosis mediante la inhibición selectiva de la actividad de una apolipoproteína aterógena en un hospedador humano, que comprende la administración de una sustancia que produzca la inhibición de al menos una de las siguientes actividades de dicha apolipoproteína aterógena en el hospedador humano, en necesidad de tratamiento o profilaxis: (a) la inhibición de la unión de la apolipoproteína B a su receptor, y/o (b) la inhibición de la lipoproteína-lipasa. En un aspecto relacionado de la presente invención se proporciona un método de tratamiento o profilaxis mediante la inhibición selectiva de la actividad de ApoCIII en un hospedador humano, comprendiendo la administración de una sustancia que produzca la inhibición selectiva de la actividad de ApoCIII a un hospedador humano con necesidad de tal tratamiento o profilaxis. A este respecto, la sustancia puede ser una composición inmunógena o una vacuna que comprende ApoCIII, o un fragmento de ésta, así como el inmunógeno, o alternativamente la sustancia puede ser un ligando que sea capaz de bloquear la actividad de ApoCIII (en el que anula la inhibición mediada por ApoCIII de la lipoproteína-lipasa y la unión de ApoB a su receptor). Los ligandos preferidos en este aspecto de la presente invención son anticuerpos poli- o monoclonales. Los métodos preferidos de tratamiento de individuos que padecen aterosclerosis con concentraciones elevadas de ApoCIII circulante en su plasma comprenden la reducción de las concentraciones de ApoCIII circulante, mediante la administración de una vacuna que comprende ApoCIII, o un fragmento de ésta, como un inmunógeno a dicho individuo. Alternativamente, en un aspecto relacionado de la presente invención se proporciona un método de tratamiento o profilaxis de la aterosclerosis al reducir las concentraciones de ApoCIII circulante en el plasma de un paciente, mediante la administración a dicho paciente de un ligando que sea capaz de bloquear la actividad de ApoCIII, en la que anula la inhibición mediada por ApoCIII de la lipoproteína-lipasa y la unión de ApoB con su receptor. Los ligandos preferidos en este aspecto de las presente invención son anticuerpos poli- o monoclonales.

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La presente invención proporciona también un método de tratamiento o profilaxis de la aterosclerosis al reducir el número de moléculas de ApoCIII que están asociadas con una molécula de ApoB in situ en el contexto de una lipoproteína. En un individuo normal hay aproximadamente una ApoB presente en una partícula de LDL, con la 9

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ApoB asociada con 1 a 5 moléculas de ApoCIII. En individuos enfermos, el número de moléculas de ApoCIII puede aumentar hasta más de 25. Por lo tanto, la presente invención proporciona un método de tratamiento o profilaxis de la aterosclerosis mediante la reducción de la relación de moléculas de ApoCIII por moléculas de ApoB en las LDL de un individuo con aterosclerosis, desde un nivel elevado de enfermedad (aproximadamente 20 a 25:1) hasta un nivel terapéutico reducido preferiblemente menor de 15:1, más preferiblemente menor de 10:1 y más preferiblemente menor de 5:1, preferiblemente menor de 3:1, y lo más preferiblemente de aproximadamente 1:1, ApoC:ApoB. Las concentraciones de ApoCIII contenidas dentro de las lipoproteínas que contienen ApoB se puede medir mediante nefelometría o electroinmunodifusión (el intervalo normal es de 2 mg/dl a 3 mg/dl). La presente invención también proporciona ApoCIII producida de forma sintética o recombinante para su uso en medicina. La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos:

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Ejemplo 1 Síntesis de péptidos

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Los péptidos de ApoCIII (1-79, 1-17, 12-35, 45-65 y 45-76 (ID. SEC. nº 1, 2, 4, 6 y 7 respectivamente)) se sintetizaron mediante el método en fase sólida (Merrifiel, 1986) en un sintetizador automatizado ABI 433A (Applied Biosystems Inc.) usando la estrategia Boc/Bzl sobre una resina Boc-Ala-PAM para ApoCIII total y una resina MBHA para los otros fragmentos. Cada aminoácido se combinó dos veces con diciclohexilcarbodiimida/hidroxibenzotriazol sin tapar. Los grupos protectores de las cadenas laterales fueron los siguientes: Arg(Ts), Asp (Ochex), Glu (Ochex), Lys (2-Cl-Z), His (Dnp), Ser (Bzl), Thr (Bzl), Met(O) y Tyr(Br-z). De acuerdo con la secuencia, el grupo Dnp sobre His se eliminó del péptido, antes de la escisión desde su soporte, mediante el tratamiento con β-mercaptoetanol 10%, diisopropiletilamina 5% en DCM durante 2 horas y en NMP durante 2 horas. Después se trató la peptidil-resina con TFA al 50% en DCM durante 20 minutos para eliminar el Boc amino-terminal. El péptido se escindió de la resina y simultáneamente se desprotegió según un método de HF a baja y alta concentración: se trató la resina (1 g) con HF anhidro (2,5 ml) en presencia de p-cresol (0,75 g), p-tiocresol (0,25 g) y dimetilsulfuro (6,5 ml) a 0ºC. Después de 3 horas se eliminaron el fluoruro de hidrógeno y el dimetilsulfuro mediante evaporación en vacío y los desechos residuales y subproductos se extrajeron con dietiléter. El recipiente de reacción se recargó con p-cresol (0,75 g), ptiocresol (0,25 g) y 10 ml de HF anhidro, y la mezcla se dejó reaccionar a 0 durante 1 hora y 30 minutos. El fluoruro de hidrógeno se eliminó mediante la evaporación y el residuo se trituró en presencia de dietiléter. El residuo se filtró, se lavó con dietiléter y se extrajo con 200 ml de una disolución acuosa de ácido acético al 10%, y se liofilizó. El producto crudo se analizó mediante HPLC en fase inversa en una columna Vydac C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm, 100 A) usando gradiente lineal de 3,5 µl, desde 0% a 100% de tampón B (tampón A: TFA 0,05% en H2 O y Tampón B: TFA0,05%, CH3 CN 60% en H2 O) con una velocidad de flujo de 0,7 ml/minuto y se realizó la detección a 215 nm. El péptido sintético se purificó mediante RP-HPLC y se caracterizó y analizó mediante HPLC, y la masa molecular se determinó mediante espectrometría.

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Ejemplo 2 Producción de anticuerpos 45

La ApoCIII completa sintética, sintetizada en el ejemplo 1, se usó para generar anticuerpos policlonales en ratones. A continuación se analizó la reactividad de este antisuero policlonal anti-ApoCIII completa frente a otros péptidos sintéticos más pequeños, y a partir del antisuero se purificaron las fracciones de anticuerpo específicas para cada péptido.

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Inmunización: el péptido ApoCIII (1-79) se emulsionó en el adyuvante completo de Freund (ACF) y se inyectó por vía intradérmica utilizando 500 µg de péptido por inyección durante las dos primeras inyección seguido de inyecciones de refuerzo a intervalos de 15 días, con el mismo adyuvante pero utilizando 250 µg de péptido. La respuesta inmune se monitorizó tomando muestras de sangre y se empleó el sistema ELISA para detectar la actividad anti-péptido.

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Aislamiento de los anticuerpos del suero: se combinaron las muestras de sangre positivas y se aislaron los anticuerpos policlonales mediante la precipitación sulfato sódico al 27%. Los anticuerpos específicos frente al péptido se purificaron a partir de esta mezcla de anticuerpos mediante cromatografía de afinidad. Los péptidos producidos en el ejemplo 1 se asociaron a una columna de cromatografía de afinidad de CH-sefarosa 4B activada (Pharmacia, Uppsala, Suecia) (Axen y col., 1967) y la mezcla de anticuerpos purificados totales se pasó a través de está columna. Las proteínas no retenidas en el gel de antígeno se lavaron con solución salina isotónica tamponada con fosfato (PBS: fosfato 50 mmol/l, pH 7,2, NaCl 150 mmol/l). Las fracciones unidas de manera inespecífica en el gel de péptidos se eliminaron con PBS 25 mmol/l) La elución de IgG policlonal específica se realizó utilizando glicina 0,2 M, pH 2,8. Los anticuerpos purificados se dializaron inmediatamente en PBS 10 mmol/l y se concentraron mediante ultrafiltración utilizando el sistema Amicon (límite 100 kDa) (Amicon, Beverly, EEUU), se analizó en términos de contenido proteico (Lowry y col., 1951), y se almacenó después en alícuotas de 1 ml (0,5 mg) a -30ºC.

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ES 2 219 517 T3 Ejemplo 3 Cartografía de epítopos de ApoCIII 5

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ELISA: Se lavaron las placas de microvaloración (fondo plano, 96 pocillos EIA; Costar, Dutscher) con 0,1 mol/l de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,2) antes de recubrirse con 100 µl/pocillo de péptido libre (5 µg/ml) (1-17, 12-35, 45-65, 45-76 y ApoCIII (1-79)) y se incubó durante la noche a temperatura ambiente. Las placas se lavaron cuatro veces con tampón y para minimizar la unión inespecífica a los pocillos de microvaloración, las placas se saturaron con 250µl/pocillo de albúmina sérica bovina al 3% en tampón PBS 0,1 M y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavaron cuatro veces de nuevo y se incubaron durante 2 horas a 37ºC con 100 µl del anticuerpo purificado anti-ApoCIII completa (producido en el ejemplo 2), diluido en una disolución de albúmina sérica bovina al 1% en tampón PBS 0,1 M, y se lavó después tres-cuatro veces con PBS. Para evaluar la reacción inmunológica, se añadieron a cada pocillo 100 µl de IgG anti-conejo diluida 10000 veces y marcada con peroxidasa, en BSA al 0,1% en tampón PBS (Sanofi-Diagnostics Pasteur, Marnes-La-Coquette, Francia). Después de un incubación durante 2 horas a 37ºC, las placas se lavaron cuatro veces con PBS y se añadieron 100 µl de solución de sustrato. La solución de sustrato se preparó como sigue: se disolvieron 30 mg de dihidrocloruro de o-fenilendiamina en 20 ml de tampón citrato-fosfato 0,1 mmol/l, a pH 5,5 conteniendo 20 µl de peróxido de hidrógeno al 30%. Tras 30 minutos a temperatura ambiente en oscuridad, la reacción se paró mediante la adición a cada pocillo de 100 µl de HCl 1 mmol/l. La absorbancia se midió a 492 nm.

20

Resultados

25

El anticuerpo policlonal purificado generado frente a la apoCIII sintética total se usó para analizar su reactividad con los péptidos en el ELISA, y también frente a la ApoCIII completa (“ApoCIII total”). Para los resultados, véase la figura 1. Los resultados mostraban que el anticuerpo generado frente a la ApoCIII total reconoce todos los péptidos 117, 12-35, 45-65 y 45-76. Ejemplo 4

30

Afinidad de los anticuerpos por la ApoCIII presente en lipoproteínas El objetivo era comprobar si los diferentes epítopos correspondientes a los péptidos eran accesibles en las lipoproteínas y determinar la afinidad de cada fracción de anticuerpo respecto a las lipoproteínas purificadas en el plasma humano (HDL, VLDL) y frente a ApoCIII completa.

35

Materiales y métodos Las fracciones de anticuerpo específicas para el péptido se prepararon mediante inmunoafinidad frente a diferentes péptidos asociados a CH sefarosa, como se describe en el ejemplo 2. 40

45

50

ELISA en sándwich: Se lavaron las placas de microvaloración (fondo plano, 96 pocillos EIA; Costar, Dutscher) con 0,1 mol/l de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,2) antes de recubrirse con 100 µl/pocillo de anticuerpos específicos frente al péptido purificado por afinidad (10 mg/l) y se incubó durante la noche a temperatura ambiente. A continuación se lavaron las placas cuatro veces con tampón y se incubaron durante 2 horas a 37ºC con 100 µl de diluciones de una muestra (se sembraron 4 muestras diferentes: 1. una proteína patrón de ApoCIII purificada de plasma humano, 2. HDL humana, 3. VLDL humana y 4. ApoCIII sintética (1-79)). Para minimizar la unión inespecífica a los pocillos de microvaloración, las diluciones de antígeno se realizaron en albúmina sérica bovina al 1% en tampón PBS 0,1 M. Para evaluar la reacción inmunológica, se añadieron a cada pocillo 100 µl de anticuerpo policlonal anti-ApoCIII completa, diluida 2500 veces y marcada con peroxidasa, en BSA al 0,1% en tampón PBS. Después de un incubación durante 2 horas a 37ºC, las palcas se lavaron cuatro veces con PBS y se añadieron 100 µl de solución de sustrato. La solución de sustrato se preparó como sigue: se disolvieron 30 mg de dihidrocloruro de o-fenilendiamina (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) en 20 ml de tampón citrato-fosfato 0,1 mmol/l, a pH 5,5 conteniendo 20 µl de peróxido de hidrógeno al 30%. Tras 30 minutos a temperatura ambiente en oscuridad, la reacción se paró mediante la adición a cada pocillo de 100 µl de HCl 1 mol/l. La absorbancia se midió a 492 nm.

55

Resultados

60

Los resultados muestran que todos los anticuerpo anti-12-35 (figura 2), anti 45-65 (figura 3) y anti 45-76 (figura 4) reconocen la ApoCIII sintética libre en disolución (gráfica A) con aproximadamente la misma afinidad que el anticuerpo policlonal generado frente a la ApoCIII total (“Ac total” - inmunoglobulina completa de conejo). La gráfica B muestra el reconocimiento de ApoCIII (1-79). De los anticuerpos específicos del péptido, el anticuerpo anti-12-35 tiene la mayor afinidad por ApoCIII en el patrón de plasma y HDL. También la reactividad de anti(12-35) con VLDL es similar a la obtenida con el anticuerpo completo policlonal anti-ApoCIII de conejo.

65

11

ES 2 219 517 T3 Ejemplo 5 Efecto de diferentes anticuerpos en la incorporación de apoCIII en VLDL 5

El objetivo es determinar la capacidad de cada anticuerpo para inhibir la asociación de ApoCIII con VLDL. Las fracciones de VLDL se prepararon mediante ultracentrifugación a partir de pacientes normotrigliceridémicos (NTG) y hipertrigliceridémicos (HTG) utilizando técnicas convencionales. Se preparó una tercera fracción de VLDL a partir del grupo NTG, en el que se cargó ApoCIII adicional in vitro dentro de partículas VLDL (VLDL enriquecida o VLDL E-CIII).

10

15

20

Radiomarcado: La ApoCIII purificada se marcó con yodo radioactivo mediante la modificación de Bilheimer del método McFarlane (Bilheimer y col., 1972, Biochim. Biophys. Acta, 260, 212-221). La resina AG 2-X8 se regeneró con NaOH 1M (5 minutos), se lavó con agua destilada, y se saturó después con BSA al 1% en PBS 0,01 M (peso / volumen). Se dializó ApoCIII en PBS-EDTA 0,01 M. Se añadieron 0,5 mCi de 125 I a 0,1 ml de tampón radiomarcado (glicina 1M, NaCl 1M) que contenía 5 µl de una solución de ICl 0,033 M. La cantidad de la solución preparada se mezcla con 50 µl de la resina lavada. La resina con 125 I libre se eliminó después mediante centrifugación (1 minuto a 62.200 rpm), y la ApoCIII recuperada se dializó a continuación en PBS-EDTA 0,01M. Incorporación de apoCIII en VLDL (en presencia o no de anti-apoCIII): se incubaron 20 µg de cada anticuerpo anti-apoCIII durante 2 h a 37ºC con una cantidad equivalente de apoCIII marcada con 125 I. Se mezclaron (peso / peso) las lipoproteínas (VLDL NTG, VLDL HTG o VLDL E-CIII) y el complejo anticuerpo-125 I-apoCIII; se incubó durante 1 h a 37ºC, y se dializó la apoCIII marcada con 125 I no unida. Para tener la proporción de la capacidad con la que los anticuerpos inhiben la asociación entre apoCIII y las lipoproteínas se realizaron las medidas de la radioactividad de 125 I en apoCIII marcada con 125 I unida a lipopartículas y de la apoCIII marcada con 125 I no unida.

25

Resultados Los resultados en la figura 5 muestran que todos los anticuerpos (anti-ApoCIII completa o específica de péptido) tienen un efecto sobre la incorporación de apoCIII en las VLDL comparable con el anticuerpo policlonal anti-ApoCIII. 30

Ejemplo 6 El efecto de los anticuerpos específicos para ApoCIII sobre la actividad de la lipoproteína-lipasa 35

El objetivo es analizar la capacidad de los anticuerpos para proteger la lipoproteína-lipasa del efecto inhibitorio de la ApoCIII. Análisis de la lipólisis con lipoproteína-lipasa unida a proteoglucano de heparán sulfato

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60

El ensayo se realizó en placas de microvaloración de 96 pocillos. Los pocillos se incubaron con 0,5 µg de proteoglucano de heparán sulfato (siglas en inglés, HSPG) en 100 µl de PBS 0,1 M, NaCl 0,15 M, pH 7,2-7,4 durante 18 h a 4ºC, se lavó 3 veces con PBS y más tarde se bloqueó durante 1 hora a 37ºC con PBS conteniendo albúmina sérica bovina (BSA), esencialmente libre de ácidos grasos, al 1% (peso / volumen). Después, los pocillos se incubaron con 2 µg de lipoproteína-lipasa (LPL) en 100 µl de Tris 0,1 M, glicerol 20% (volumen / volumen), pH 8,5 durante 2 horas a 4ºC. Las LPL no unidas se lavaron 3 veces con tampón Tris (Tris 0,1 M, pH 8,5). A continuación se prepararon 4 fracciones de VLDL: P1, que comprendía VLDL purificada de plasma humano, enriquecida in vitro con ApoB; P2, que comprendía VLDL purificada de plasma humano, enriquecida in vitro con ApoB y ApoE. Otras fracciones se prepararon a partir de P1 y P2 por enriquecimiento con ApoCIII (P1/ApoCIII enriquecida y P2/ApoCIII enriquecida). Algunas de estas 4 fracciones se incubaron después con el anticuerpo antiApoCIII completa de conejo. A continuación se comenzó la lipólisis mediante la adición de 100 µl de las fracciones de lipoproteínas a las placas recubiertas con LPL (0,055 a 0,5 mg/ml de Tris 0,1 M, pH 8,4 y BSA 1,5% (peso / volumen)), y la incubación se realizó a 37ºC. La reacción se paró después de 20 minutos mediante la adición de 100 µl de tampón Tris, Triton X100 (2% (v/v), concentración final). De cada pocillo se recogieron 100 µl de lipoproteínas lipolizadas, se enfriaron a -20ºC, y luego se midió la concentración de ácidos grasos no esterificados utilizando el equipo de reactivos NEFA-C (Wako Chemicals, Neuss, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Resultados Los resultados se muestran en la figura 6; en todos los casos la actividad de la lipoproteína-lipasa aumentó en presencia de anticuerpos anti-ApoCIII.

65

12

ES 2 219 517 T3 Ejemplo 7 Efecto de los anticuerpos en la salida de colesterol 5

El objetivo es analizar los posibles efectos negativos de los anticuerpos anti-ApoCIII en las HDL. 1. Aislamiento de lipoproteínas: El HDL se aisló a partir de plasma humano normolipémico reciente a una densidad de 1,063-1,21 mediante ultracentrifugación secuencial usando KBr para los ajustes de densidad, se lavó mediante reflotación a d=1,21 y se dializó en solución salina tamponada con fosfato 0,1 M, pH 7,4.

10

2. Aislamiento de lipoproteínas que contienen ApoCIII mediante cromatografía de inmunoafinidad

15

20

Mediante cromatografía de inmunoafinidad se prepararon HDL conteniendo ApoCIII y HDL sin ApoCIII, utilizando anticuerpos anti-CIII acoplados a sefarosa 4B activada. Las HDL que contienen ApoCIII se eluyeron usando solución salina tamponada con fosfato 0,01M, pH 7,4, EDTA 0,1 g/l y las HDL sin ApoCIII se eluyeron usando tiocianato sódico 3 M. Las HDL que contienen ApoCIII se dializaron en solución salina tamponada con fosfato 0,01M, pH 7,4, EDTA 0,1 g/l. La fracción pura de HDL se denominó HDLt, la fracción retenida de HDL conteniendo ApoCIII se denominó HDL CIII, y la fracción de HDL no adsorbida se denominó “HDL sin CIII”. 3. Condiciones de sembrado: se sembraron células hepáticas de rata, Fu5AH, en placas de 12 pocillos a una concentración de 25000 células/ml y 2 ml por pocillo, y se cultivaron en medio esencial mínimo al 95% (GIBCOBRL) suplementado con penicilina (100 µg/ml), estreptomicina (100g/ml), glutamina (2 mM) y suero fetal bovino al 5% (vol/vol). Las células crecieron durante 2 días a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO2 al 5%, antes del radiomarcado de lípidos celulares.

25

Empleamos 3 pocillos por muestra y para controlar la validez de la salida usamos: - un control negativo: 1 ml de medio esencial mínimo 30

- un control positivo: HDL3 a 100 µg/ml - un control interno: mezcla de plasmas normolipémicos humanos almacenado a -20ºC y utilizado al 2,5% (vol/vol)

35

- un control de carga de colesterol marcado: la radioactividad de las células se midió antes de la incubación con las muestras. 4. Radiomarcado de las células Fu5AH: se añadió [1α,2α,(n)-3 H]colesterol radiomarcado a las células para tener una concentración final de 1 µCi/pocillo:

40

- Evaporar X µCi bajo N2 - Añadir 1 ml de etanol e incubar 45 a 60 minutos a 60ºC. - Evaporar bajo N2

45

- Añadir 50 ml de etanol e incubar 15 a 30 minutos a 60ºC. - Añadir un volumen igual de medio esencial mínimo (MEM) y de suero fetal bovino para tener una concentración final de 5% en MEM e incubar 30 minutos a 37ºC. 50

- Añadir MEM para tener el volumen final. - Se crecieron las células durante 3 días en presencia de radiomarcaje (2 ml/pocillo). 55

60

5. Salida de colesterol: para asegurarse que el marcaje se distribuye equitativamente entre los grupos celulares, el medio de marcaje se repuso con MEM conteniendo albúmina sérica bovina al 0,5% durante 24 horas antes de la salida. - Se lavó una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron las HDL durante 3 horas a 37ºC, 5% de CO2 , hasta una concentración final de 50 µg/ml (500 µl/pocillo). Antes de la incubación con las células, las HDL se preincubaron con los diferentes anticuerpos a 15 µg/ml durante 2 horas a 37ºC. - La fase de salida se finalizó eliminando el medio con suero de cada pocillo y lavando las células después 3 veces con PBS. Las células se retiraron en 500 µl de hidróxido sódico (0,1 mol/l) por pocillo.

65

- El conteo se realizó en 250 µl de medio o suspensión celular a la que se añadió 4 ml de una mezcla de centelleo (Optiphase “Hisafe” 3, WALLAC); con un contador de centelleo líquido (WALLAC 1410) durante un minuto. El porcentaje de salida se calculó como sigue: 13

ES 2 219 517 T3 [dpm en el medio/(dpm en el medio + dpm en las células)] ∗ 100 Resultados 5

10

Mediante inmunoafinidad se separaron las HDL que contienen ApoCIII de las HDL que no contenían ApoCIII. La salida de colesterol se midió en diferentes fracciones (HDL total, HDL-CIII y HDL sin CIII) con y sin el anticuerpo anti-ApoCIII completa o anti-12-35, a diferentes concentraciones. Los resultados se muestran en las figuras 7 y 8. Con todos los experimentos se confirmó que los anticuerpos no afectan a la función de las HDL en cuanto a salida de colesterol. Ejemplo 8 Fabricación e inmunogenia de los conjugados peptídicos

15

20

25

30

Se prepararon los inmunógenos que comprenden los péptidos 12-35 y 45-65 conjugados a albúmina sérica bovina (BSA), formulados en vacunas, y administrados por vía intramuscular en ratones. Se sintetizaron cuatro péptidos, una pareja de péptidos basados en la secuencia 12-35 y otra pareja basada en la secuencia 45-65 de ApoCIII. Cada pareja de péptidos tenía un péptido de unión GGC incorporado tanto en el extremo N-terminal como C-terminal del péptido: 12-35COOH 12-35NH2 45-62COOH 45-62NH2

MQGYMKHATKTAKDALSSVQESQVGGC CGGMQGYMKHATKTAKDALSSVQESQV DGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWGGC CGGDGFSSLKDYWSTVKDKFSEFW

(ID. SEC. Nº 8) (ID. SEC. Nº 9) (ID. SEC. Nº 10) (ID. SEC. Nº 11)

Los péptidos se conjugaron a BSA como proteína transportadora mediante la química de la maleimida. La BSA se obtuvo de Pierce, la cual estaba preactivada con un agente de unión de 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (siglas en inglés, SMCC). SMCC también se puede obtener de cualquier fabricante importante y utilizado según las instrucciones de los fabricantes. El acoplamiento de la BSA al transportador a través de SMCC se realizó durante 2 horas a temperatura ambiente con un exceso de péptido, antes de neutralizar la reacción con exceso de cisteína, seguido de diálisis en tampón fosfato.

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El análisis de los inmunógenos conjugados solubles resultantes mostró que alrededor de 19 péptidos se conjugaron con cada molécula transportadora de BSA. 14

ES 2 219 517 T3

5

Todos los inmunógenos se formularon en vacunas mediante la mezcla con un sistema adyuvante que comprendía a la saponina QS21, el monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) y una emulsión de aceite en agua (con escualeno y α-tocoferol en la fase oleosa) como se describe en el documento WO 95/17210. Las vacunas se administraron entonces a grupos de 10 ratones BalbC, conteniendo 25 µg de inmunógeno, por vía intramuscular a días 0, 14 y 28; y las muestras de suero se recogieron el día 28 y el día 42. Después se analizaron los sueros para los valores de anticuerpos anti-ApoCIII completa y anticuerpos anti-péptido mediante ELISA (en el que las placas se recubrieron tanto con ApoCIII entera como con el péptido correspondiente), y los resultados se expresaron como valores de punto medio. Resultados

10

Los resultados muestran que los inmunógenos de los péptidos producidos son muy inmunógenos, e inducen anticuerpos que reaccionan fuertemente de manera cruzada con ApoCIII nativa completa. Los resultados obtenidos en los grupos fueron muy homogéneos, y mostraban un fuerte aumento después de la tercera administración. Los resultados para cada ratón en los grupos de 10 se muestran en la tabla 1. 15

TABLA 1 Valores de IgG anti-péptido de ratón post II (día 28) 20

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45

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15

ES 2 219 517 T3 TABLA 2 Valores de IgG anti-péptido de ratón post III (día 42) 5

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ES 2 219 517 T3 TABLA 3 Valores de IgG anti-ApoCIII completa de ratón post II (día 28) 5

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ES 2 219 517 T3 TABLA 4 Valores de IgG anti-ApoCIII completa de ratón post III (día 42) 5

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ES 2 219 517 T3 REIVINDICACIONES 5

10

1. Una composición inmunógena adecuada para la administración a un hospedador humano para el tratamiento o la prevención de la aterosclerosis, con un inmunógeno que comprende una apolipoproteína o un péptido o un fragmento de ésta, que en su forma nativa de cadena completa de la apolipoproteína tenga al menos una de las siguientes actividades (a) la inhibición de la unión de la apolipoproteína B a su receptor, y/o (b) la inhibición de la lipoproteínalipasa, y en la que la composición inmunógena es capaz de inducir una respuesta inmune en un hospedador humano. 2. La composición inmunógena como la reivindicada en la reivindicación 1, en la que la forma nativa de cadena completa de la apolipoproteína tiene ambas actividades. 3. La composición inmunógena como la reivindicada en la reivindicación 1, en la que la apolipoproteína es ApoCIII o un fragmento, un péptido o un mimótopo de ésta.

15

4. La composición inmunógena como la reivindicada en la reivindicación 3, en la que la ApoCIII o el fragmento, el péptido o el mimótopo de ésta se conjuga o se fusiona a una proteína transportadora. 20

5. La composición inmunógena como la reivindicada en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el inmunógeno es una cualquiera de las secuencias seleccionadas de ID SEC. Nº 1-7. 6. Una vacuna que comprende la composición inmunógena como la reivindicada en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y un adyuvante.

25

7. El uso de un agente que da como resultado la inhibición de al menos una de las siguientes actividades de una apolipoproteína aterógena en un hospedador humano en necesidad de dicho tratamiento o profilaxis, (a) la inhibición de la unión de la apolipoproteína B a su receptor, y/o (b) la inhibición de la lipoproteína-lipasa, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de la aterosclerosis al inhibir selectivamente la actividad de una apolipoproteína aterógena en un hospedador humano.

30

8. El uso de un agente que da como resultado la inhibición selectiva de la actividad de ApoCIII en un hospedador humano en necesidad de dicho tratamiento o profilaxis, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de la aterosclerosis al inhibir selectivamente la actividad de ApoCIII en un hospedador humano. 35

9. Un uso como el reivindicado en la reivindicación 7 u 8, en el que el agente es una vacuna que comprende ApoCIII, o un fragmento de ésta, como inmunógeno. 10. Un uso como el reivindicado en la reivindicación 7 u 8, en el que el agente es un ligando de ApoCIII.

40

11. Un uso como el reivindicado en la reivindicación 10, en el que el ligando es un anticuerpo. 12. Un uso como el reivindicado en las reivindicaciones 7 a 11, en que el agente bloquea la inhibición mediada por ApoCIII de la lipoproteína-lipasa y la unión de ApoB a su receptor.

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19

ES 2 219 517 T3

20

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ES 2 219 517 T3 LISTA DE SECUENCIAS

5

SmithKline Beecham Biologicals S.A. Vacuna B45212

10

11 FastSEQ for Windows Version 3.0 15

20

1 79 PRT Péptidos de ApoCIII humana 1

25

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35

40

45

50

55

2 17 PRT Péptidos de ApoCIII humana 2 Ser Glu Ala Glu Asp Ala Ser Leu Leu Ser Phe Met Gln Gly Tyr Met 1 5 10 15 Lys 3 40 PRT Péptidos de ApoCIII humana 3

60

65

Ser Glu Ala Glu Asp Ala Ser Leu Leu Ser Phe Met Gln Gly Tyr Met 1 5 10 15 Lys His Ala Thr Lys Thr Ala Lys Asp Ala Leu Ser Ser Val Gln Glu 20 25 30 Ser Gln Val Ala Gln Gln Ala Arg 35 40 4 1

ES 2 219 517 T3 24 PRT Péptidos de ApoCIII humana 5

4

10

15

20

25

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35

40

45

Met Gln Gly Tyr Met Lys His Ala Thr Lys Thr Ala Lys Asp Ala Leu 1 5 10 15 Ser Ser Val Gln Glu Ser Gln Val 20 5 39 PRT Péptidos de ApoCIII humana 5 Gly Trp Val Thr Asp Gly Phe Ser Ser Leu Lys Asp Tyr Trp Ser Thr 1 5 10 15 Val Lys Asp Lys Phe Ser Glu Phe Trp Asp Leu Asp Pro Glu Val Arg 20 25 30 Pro Thr Ser Ala Val Ala Ala 35 6 21 PRT Péptidos de ApoCIII humana 6 Asp Gly Phe Ser Ser Leu Lys Asp Tyr Trp Ser Thr Val Lys Asp Lys 1 5 10 15 Phe Ser Glu Phe Trp 20 7 32 PRT Péptidos de ApoCIII humana 7

50

55

60

Asp Gly Phe Ser Ser Leu Lys Asp Tyr Trp Ser Thr Val Lys Asp Lys 1 5 10 15 Phe Ser Glu Phe Trp Asp Leu Asp Pro Glu Val Arg Pro Thr Ser Ala 20 25 30 8 27 PRT Péptidos de ApoCIII humana 8

65

Met Gln Gly Tyr Met Lys His Ala Thr Lys Thr Ala Lys Asp Ala Leu 1 5 10 15 Ser Ser Val Gln Glu Ser Gln Val Gly Gly Cys 20 25 2

ES 2 219 517 T3

5

9 27 PRT Péptidos de ApoCIII humana 9

10

15

Cys Gly Gly Met Gln Gly Tyr Met Lys His Ala Thr Lys Thr Ala Lys 1 5 10 15 Asp Ala Leu Ser Ser Val Gln Glu Ser Gln Val 20 25 10 24 PRT Péptidos de ApoCIII humana

20

10

25

30

35

40

Asp Gly Phe Ser Ser Leu Lys Asp Tyr Trp Ser Thr Val Lys Asp Lys 1 5 10 15 Phe Ser Glu Phe Trp Gly Gly Cys 20 11 24 PRT Péptidos de ApoCIII humana 11 Cys Gly Gly Asp Gly Phe Ser Ser Leu Lys Asp Tyr Trp Ser Thr Val 1 5 10 15 Lys Asp Lys Phe Ser Glu Phe Trp 20

45

50

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3