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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 252 812

51 Int. Cl. : C12N 15/12, C07K 14/47

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C12N 5/10, C07K 16/18 G01N 33/50, G01N 33/563 A61K 48/00, A61K 38/17

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 98202876 .3

86 Fecha de presentación : 27.08.1998

87 Número de publicación de la solicitud: 0982399

87 Fecha de publicación de la solicitud: 01.03.2000

54 Título: Transportadores de hormona tiroidea, agonistas y antagonistas de los mismos.

73 Titular/es: Stichting tot bevordering van de

wetenschap der Endocrinologie Dr. Molewaterplein 40 3015 GD Rotterdam, NL

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.05.2006

72 Inventor/es: Krenning, Eric Paul;

Hennemann, George; Docter, Roelof y Visser, Theofilus Johannes

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Carpintero López, Francisco

ES 2 252 812 T3

16.05.2006

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid

ES 2 252 812 T3 DESCRIPCIÓN Transportadores de hormona tiroidea, agonistas y antagonistas de los mismos. 5

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La invención se refiere al campo de la endocrinología, más específicamente, al campo de la regulación de la biodisponibilidad y actividad de la hormona tiroidea. La hormona tiroidea es esencial para el desarrollo y homeostasis de diferentes órganos, particularmente para la regulación del metabolismo energético. Las células foliculares de la glándula tiroides producen predominantemente la prohormona tiroxina (3,3’,5,5’-tetrayodotironina, T4) que tiene una actividad biológica pequeña o nula. La T4 se activa por una desyodación enzimática del anillo externo para dar 3,3’,5-triyodotironina (T3), que es la forma mas bioactiva, si no la única, de la hormona tiroidea (1-4). Tanto la T4 como la T3 se inactivan por una desyodación enzimática del anillo interno para dar los metabolitos 3,3’,5’-triyodotironina (T3 inversa, rT3) y 3,3’-diyodotironina (3,3’-T2), respectivamente (1-4).

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Las tres desyodasas implicadas en estos procedimientos muestran diferentes perfiles catalíticos, distribuciones en tejidos y funciones reguladoras. Recientemente se han identificado como selenoproteínas transmembrana homólogas con su sitio activo expuesto al citoplasma (1-4). 20

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Otras rutas del metabolismo de las hormonas tiroideas incluyen la sulfatación y glucuronidación del grupo hidroxilo fenólico por transferasas localizadas en el citoplasma y retículo endoplásmico de diferentes tejidos (2,4). La hormona tiroidea es esencial para el desarrollo de diferentes tejidos, por ejemplo el cerebro, y para la regulación del metabolismo energético de una amplia serie, si no todos los tejidos, a lo largo de la vida (5) y la regulación de su biodisponibilidad o actividad en diversos tejidos podría regular, influir o interferir con enfermedades (metabólicas) en esos tejidos. La mayoría de las acciones de la hormona tiroidea se inician por la unión de T3 a receptores nucleares, lo cual cambia la interacción de esos receptores con elementos reguladores de genes que responden a la hormona tiroidea y, de esta manera, la expresión de esos genes (5). Aunque se han identificado tres isoformas del receptor de T3 (TR) (TRα1, TRβ1 Y TRβ2) con diferentes distribuciones en los tejidos, sus especificidades de ligando son muy similares, lo cual no permite una regulación específica de tejido. Además, no se han identificado antagonistas de TR con la posible excepción del fármaco antiarrítmico amiodarona. Por consiguiente, los TR no parecen ser dianas útiles para el desarrollo de agonistas o antagonistas de la hormona tiroidea (específicos de tejido).

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Sin embargo, considerando el papel central que juega la hormona tiroidea en el metabolismo básico de una amplia diversidad de células en una amplia serie de tejidos, el uso de fármacos que comprenden agonistas y/o antagonistas de la hormona tiroidea tendrá efectos beneficiosos en muchas enfermedades. 40

Por consiguiente, existe la necesidad de poder ensayar fármacos en bioensayos que puedan medir el efecto sobre la biodisponibilidad y actividad de hormonas tiroideas. Por ejemplo, los agonistas dirigidos al tejido hepático o adiposo serían fármacos potencialmente importantes para el tratamiento de la obesidad, los agonistas dirigidos al miocardio serían muy útiles para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca y los antagonistas dirigidos al corazón poseerían una actividad antiarrítmica importante y proporcionarían un alivio agudo de efectos tirotóxicos sobre el corazón.

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La invención proporciona un ácido nucleico aislado y/o recombinante o un fragmento funcional, homólogo, ortólogo o derivado del mismo, correspondiente a un gen que codifica un polipéptido de transporte de la membrana plasmática de la hormona tiroidea. En una realización preferida, dicho polipéptido es capaz al menos de transportar 3,3’,5-triyodotironina (T3), que es la hormona activa transportada y requerida por la mayoría de los tejidos. Sin embargo, el transporte de T4 es importante, por ejemplo, en el tejido cerebral. El acceso de la hormona tiroidea plasmática a receptores intracelulares y enzimas requiere el transporte a través de la membrana celular. Basándose en la naturaleza lipófila de las yodotironinas, durante mucho tiempo se supuso que atravesaban la membrana celular por simple difusión. Sin embargo, esto ignoraba la naturaleza altamente polar de la cadena lateral de la alanina, que es un obstáculo tremendo para el paso de las yodotironinas a través de la membrana. Durante las dos últimas décadas, aunque no se ha encontrado ninguna, se han acumulado pruebas aplastantes que indican la implicación de transportadores de la membrana plasmática en la captación de la hormona tiroidea por los tejidos (4,6). Ahora se proporcionan por la presente invención. Ciertos estudios realizados usando hepatocitos de rata aislados han sugerido antes la implicación de transportadores separados para la captación de T4 y rT3 y para la captación de T3 en células hepáticas (4,6). Se ha demostrado que la captación de las diferentes yodotironinas depende de la energía (ATP), pero modestas reducciones en los niveles de ATP celular reducen la captación de T4 y rT3 en una mayor medida que la captación de T3. La preincubación de hepatocitos con el inhibidor de Na/K-ATPasa ouabaína produce una fuerte inhibición de la captación de hormonas tiroideas, sugiriendo que éste puede ser un proceso dependiente de Na+ . Sin embargo, no se han demostrado los efectos directos de la concentración de Na+ extracelular sobre la captación de yodotironina por las células hepáticas. Cuando en esta solicitud se usa la definición de “ácido nucleico”, se hace referencia tanto al ARN como al ADN, en forma mono o bicatenaria, y a la hibridación de ácidos nucleicos. “Homólogo” en este documento significa un 2

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ácido nucleico relacionado que puede encontrarse con la misma especie, “ortólogo” en este documento significa un ácido nucleico relacionado que puede encontrarse con otra especie. “Derivado” en este documento significa un ácido nucleico que se ha alterado por modificaciones genéticas tales como deleciones, inserciones y mutaciones a partir de un ácido nucleico distinto o un fragmento del mismo. “Correspondiente” en este documento significa que tiene una homología en la secuencia de ácido nucleico de al menos un 30%, más preferiblemente de al menos un 50% o incluso de un 90%. “Fragmento funcional”, cuando hace relación a un ácido nucleico, en este documento significa un ácido nucleico o parte del mismo que está funcional o estructuralmente relacionado o que hibrida con un ácido nucleico distinto o un fragmento del mismo. En una realización preferida, la invención proporciona un ácido nucleico aislado y/o recombinante o fragmento funcional, homólogo, ortólogo o derivado del mismo, que corresponde a un gen que codifica un polipéptido de transporte de la membrana plasmática de la hormona tiroidea, por ejemplo, capaz de transportar 3,3’,5-triyodotironina, donde dicho polipéptido está relacionado con un péptido transportador de aniones orgánicos tal como el péptido transportador de aniones orgánicos independiente de sodio.

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La invención también proporciona una proteína codificada por un ácido nucleico proporcionado por la invención capaz de transportar una hormona tiroidea a través de la membrana plasmática. 20

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Un ejemplo es oatp1 de rata que es una proteína de 670-aminoácidos con 12 dominios transmembrana y 2 sitios de glicosilación con una masa molecular aparente de 80 kDa (14-16). Oatp1 no solo se expresa en el hígado, sino también en riñón y cerebro. Oatp1 se localiza en la membrana de las células hepáticas basolaterales. Oatp1 es un transportador multiespecífico que media la captación de una amplia diversidad de ligandos anfipáticos (15,16,25-28), incluyendo ácidos biliares conjugados y no conjugados, esteroides conjugados (por ejemplo, sulfato de estrona, estradiol, 17βglucurónido y sulfato de DHEA) y otros aniones orgánicos (por ejemplo, la bromosulfoftaleína prototípica), pero también esteroides neutros (por ejemplo aldosterona y cortisol), glucósidos cardíacos (por ejemplo, ouabaína) e incluso cationes orgánicos (por ejemplo, ajmalinium). Los valores de Km aparentes del taurocolato y la bromosulfoftaleína para oatp1 de rata son 50 y 1,5 mM, respectivamente (16). El transporte a través de oatp1 no está acoplado a Na+ . Hay indicios que sugieren que oatp1 media el intercambio de aniones intra- y extracelulares (29). Se ha notificado que la albúmina estimula la captación de ligandos a través de oatp1, pero esto es polémico (16). Recientemente también se ha caracterizado la OATP humana (30), así como 2 transportadores con fuerte homología expresados en hígado de rata, riñón y cerebro (oatp2; Ref. 31) o exclusivamente en riñón (OAT-K1; Ref: 32). Recientemente se han identificado proteínas menos homólogas como transportadores de prostaglandina en el hígado de rata y humano (33,34).

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La invención además proporciona una proteína recombinante o sintética o un fragmento funcional de la misma codificado por un ácido nucleico de acuerdo con la invención capaz de transportar una hormona tiroidea. Dicho fragmento funcional, por ejemplo, comprende un sitio de unión a la hormona tiroidea o al menos una parte de tal sitio, que a menudo comprende uno o más péptidos dentro del polipéptido grande. Es una práctica disponible en la técnica la expresión de una proteína recombinante y el aislamiento y la purificación de la proteína resultante o de sus fragmentos. Por ejemplo, la invención proporciona una célula que comprende un ácido nucleico recombinante o un fragmento del mismo, que codifica un transportador de la hormona tiroidea de la membrana plasmática, siendo capaz dicha célula de expresar una proteína de acuerdo con la invención. En una realización preferida de la invención, tal célula que comprende un ácido nucleico recombinante o un fragmento del mismo, que codifica un transportador de la hormona tiroidea de la membrana plasmática, comprende por ejemplo una célula madre no humana, que permite la generación de un animal transgénico no humano, preferiblemente un animal experimental, preferiblemente un ratón o rata, al que se le ha proporcionado un genoma que comprende un ácido nucleico modificado que codifica un polipéptido transportador de la hormona tiroidea de la membrana plasmática (específico de tejido). La generación de animales transgénicos no humanos por sí misma es una práctica conocida en la técnica.

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La invención también proporciona un péptido derivado de una molécula de ácido nucleico que codifica un transportador de la hormona tiroidea de la membrana plasmática como se proporciona por la invención. En una realización preferida, dicho péptido es un péptido sintético derivado de la secuencia de dicho ácido nucleico. La preparación de péptidos sintéticos en general es una práctica disponible en la técnica. Además, la localización de sitios activos de péptidos en general es una práctica conocida en la técnica, por ejemplo, se pueden usar técnicas Pepscan o técnicas de localización de reemplazo, que permiten la identificación de sitios activos. Es bien conocido que estos péptidos pueden imitar configuraciones lineales o conformacionales de sitios activos tales como sitios de unión, y no necesitan proceder de una secuencia lineal sola. En particular, la invención proporciona un péptido que comprende al menos (por ejemplo, imita) un sitio de unión a la hormona tiroidea o partes del mismo, y como puede determinarse fácilmente ahora se proporcionan diversos polipéptidos transportadores de la hormona tiroidea y ácidos nucleicos que los codifican. La identificación de transportadores implicados en la captación de hormona tiroidea en diferentes tejidos no sólo es importante en el estudio de la regulación de estos procesos en estados de salud y enfermedad, sino que también proporciona el desarrollo de agonistas y antagonistas de hormona tiroidea específicos de tejido que son beneficiosos en el tratamiento de afecciones tales como la obesidad y enfermedades cardiovasculares. En resumen, la invención proporciona una amplia serie de transportadores de hormona tiroidea específicos de tejido, por ejemplo, específicos para el hígado, riñón, cerebro y otros tejidos, donde los homólogos de oatp funcionan como transportadores de la 3

ES 2 252 812 T3 membrana plasmática. Los ligandos o bloqueantes de estos diversos transportadores de hormona tiroidea específicos de tejido son fármacos candidatos importantes para el desarrollo de compuestos farmacéuticos que actúan como agonistas o antagonistas (específicos de tejido) de la actividad de la hormona tiroidea, que se proporcionan en la presente invención. 5

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En una realización preferida, tales ligandos o bloqueantes comprenden un péptido derivado de un ácido nucleico o fragmento del mismo que codifica un transportador de la hormona tiroidea como se proporciona por la invención. La obtención de péptidos que actúan como ligando (agonista) o bloqueante (antagonista) es una práctica conocida en la técnica, por ejemplo, se pueden usar técnicas Pepscan o técnicas de localización de reemplazo así como, por ejemplo, técnicas de presentación en fagos y selección de bibliotecas combinatorias, que permiten la identificación de sitios activos en una secuencia polipeptídica. En particular, la invención proporciona un péptido que comprende al menos un sitio activo capaz de unirse o de influir o interferir con la unión y/o transporte de un ligando (tal como un ligando anfipático, esteroide neutro, anión orgánico o incluso catión orgánico, preferiblemente de la naturaleza de una hormona tiroidea o un equivalente funcional de la misma) de un sitio de unión a la hormona tiroidea o una parte del mismo, de un polipéptido de transporte de la hormona tiroidea de la membrana plasmática como se proporciona por la invención. Además, la invención proporciona un anticuerpo (sintético) u otra molécula de unión dirigida específicamente contra un polipéptido de transporte de la hormona tiroidea de la membrana plasmática como se proporciona por la invención, o al menos moléculas que se unen o interfieren con la unión de un ligando de un sitio de unión de hormona tiroidea o partes del mismo, de un polipéptido de transporte de la membrana plasmática de hormona tiroidea como se proporciona por la invención. La generación de anticuerpos u otras moléculas de unión es una práctica disponible en la técnica y puede realizarse con técnicas inmunológicas clásicas así como, por ejemplo, con técnicas de presentación en fagos.

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La invención proporciona un bioensayo o procedimiento para identificar dichos agonistas o antagonistas de fármacos candidatos, por ejemplo, para uso en un compuesto farmacéutico para tratar la obesidad, insuficiencia cardiaca o hipo- o hipertiroidismo (específico de tejidos). Los fármacos candidatos, a menudo primero seleccionados o generados a través de química combinatoria o que comprenden un péptido proporcionado por la invención, después pueden ensayarse e identificarse usando un procedimiento proporcionado por la invención. Tal fármaco o compuesto candidato puede ensayarse, por ejemplo, y seleccionarse por su efecto sobre la captación de T3 en los hepatocitos u otras células, dependiendo de la especificidad del transportador deseado. Para uso en células cerebrales, donde T3 se produce autónomamente, un fármaco o compuesto candidato puede ensayarse, por ejemplo, y seleccionarse por su efecto sobre la captación de T4 como precursor de T3. Como puede verse, por ejemplo, en varias de las figuras de la descripción, la invención proporciona procedimientos y medios para medir la captación celular de hormona tiroidea y su regulación. La invención proporciona el uso de un ácido nucleico de acuerdo con la invención o de una proteína, péptidos de anticuerpo, células o animales derivados del mismo en un procedimiento para detectar un compuesto farmacéutico para tratar un trastorno relacionado con la hormona tiroidea u otras enfermedades. En una realización preferida, la invención proporciona un bioensayo que emplea medios y procedimientos proporcionados en este documento, tales como un ácido nucleico o un fragmento del mismo que codifica un polipéptido de transporte de hormona tiroidea de la membrana plasmática o la proteína relacionada o péptido (sintético), o un anticuerpo dirigido contra dicho (poli) péptido o su sitio activo o partes del mismo, o células o animales transgénicos no humanos que comprenden dicho ácido nucleico o proteínas recombinantes o péptidos, o un péptido sintético relacionado derivado de un ácido nucleico o fragmento del mismo que codifica un polipéptido de hormona tiroidea de la membrana plasmática. Un compuesto farmacéutico, como se proporciona por la invención, encuentra utilidad en un procedimiento para tratar una amplia serie de trastornos, tales como trastornos del metabolismo del tiroides, por ejemplo relacionados con trastornos cerebrales vistos con enfermedades psiquiátricas, para restaurar o ayudar a desarrollar el metabolismo en tejidos o el desarrollo en niños prematuros, para ayudar a restaurar la función de la hormona tiroidea en pacientes en los que se ha extirpado el tiroides o no funciona correctamente, por ejemplo, debido a un malignidad, para ayudar a aliviar enfermedades no relacionadas con el tiroides, para tratar la obesidad o enfermedades cardiovasculares, por nombrar algunas. De hecho, todos los trastornos o enfermedades donde está afectado el metabolismo (básico) de una célula o tejido pueden tratarse con un compuesto farmacéutico como el proporcionado por la invención, con lo que un agonista principalmente actúa regulando positivamente el metabolismo y un antagonista principalmente actúa regulando negativamente el metabolismo. En una realización preferida, tal compuesto farmacéutico comprende un péptido, preferiblemente un péptido sintético como el proporcionado por la invención, o un anticuerpo u otra molécula de unión o análogo de hormona tiroidea como se proporciona por la invención capaz de unirse o influir o interferir con la unión o transporte de un ligando de un polipéptido transportador de la membrana plasmática de hormona tiroidea. En una realización preferida, dicho compuesto puede unirse o influir o interferir con la unión o transporte de un ligando (por ejemplo T3) de un polipéptido que es capaz de transportar 3,3’,5-triyodotironina. Son ejemplos de dicho polipéptido cuando dicho polipéptido está relacionado con un péptido transportador de aniones orgánicos tal como el péptido transportador de aniones orgánicos independiente de sodio. Opcionalmente, se ha proporcionado un compuesto farmacéutico como el proporcionado por la invención con un excipiente o diluyente conocido en la técnica.

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Los compuestos farmacéuticos que comprenden agonistas/antagonistas de hormona tiroidea específicos de tejido como se proporcionan por la invención pueden usarse, por ejemplo, en el tratamiento de la obesidad, insuficiencia cardiaca o hipo- o hipertiroidismo (específico de tejido). Otro ejemplo es cuando malignidades específicas de tejido 4

ES 2 252 812 T3 tales como tumores requieren una regulación positiva o negativa. Esto requiere determinar el transportador de hormona tiroidea que se usa por las células en el tejido o malignidad (por ejemplo, por biopsia e histoquímica usando detección inmunológica o detección de la expresión de ARNm) y después tratar al paciente con un agonista/antagonista como el proporcionado por la invención que actúe específicamente a través del transportador determinado. 5

Además, los compuestos farmacéuticos que comprenden agonistas/antagonistas de hormona tiroidea específicos de tejido como los proporcionados por la invención pueden usarse para la producción de un medicamento para el tratamiento de un trastorno del metabolismo del tiroides, una enfermedad no relacionada con el tiroides, obesidad o enfermedades cardiovasculares. 10

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La invención también proporciona el uso de un ácido nucleico o una proteína de acuerdo con la invención para la producción de un medicamento para tratar un trastorno relacionado con la hormona tiroidea tal como un trastorno del metabolismo del tiroides, una enfermedad no relacionada con el tiroides, obesidad o una enfermedad cardiovascular u otras enfermedades, por ejemplo, dicho medicamento es adecuado para terapia génica donde el gen o las proteínas transportadoras de hormona tiroidea en tejidos específicos se dirigen por vehículos de liberación de genes a células o tejidos enfermos. La invención se explica adicionalmente en los dibujos y en la parte experimental sin limitarse.

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Leyendas de las figuras Fig 1. Captación de T3NS por oocitos en los que se han inyectado 0-2,3 ng de ARNc de Ntcp u oatp1. Dos días después de la inyección, los oocitos se incubaron durante 1 hora a 25ºC con [125 I]T3NS 0,1 mM en medio de Na+ o Ch+ . Los datos se presentan como medias ± ETM de 7-10 oocitos.

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Fig 2. Captación de T4NS por oocitos no inyectados y oocitos en los que se han inyectado 23 ng de ARNm de hígado de rata o 2,3 ng de ARNc de Ntcp u oatp1. Tres días después de la inyección, los oocitos se incubaron durante 1 hora a 25ºC con [125 I]T4NS 14 nM en medio de Na+ o Ch+ . Los datos se presentan como medias ± ETM de 18-20 oocitos. *) p> 3,3’-T2S > T4S > rT3S. Discusión

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Los estudios previos de la captación de yodotironinas por hepatocitos de rata y humano han sugerido la implicación de al menos 2 transportadores activos, mediando uno la captación de T4 y rT3 y mediando el otro la captación de T3 (4,6). Esto se basó en observaciones de que la captación de T4 y rT3 se inhibía por reducciones relativamente pequeñas en el ATP celular, mientras que la inhibición de T3 requería mayores reducciones en el contenido de ATP (7). También se descubrió que la captación de todas las yodotironinas se inhibía en presencia de ouabaína 0,5 mM, lo cual se consideró que reflejaba la dependencia de los transportadores del Na+ (8). La dependencia del ATP del transporte de las diferentes yodotironinas entonces podría reflejar la necesidad de ATP para mantener el gradiente de Na+ a través de la membrana celular. También se demostró que la captación de las yodotironinas por hepatocitos de rata era dependiente de la presencia de albúmina en el medio, quizás facilitando la difusión de las hormonas lipófilas a través de la capa de agua no agitada alrededor de la células (35). Basándose en las concentraciones de hormona no unida a proteína, se estimó que los valores de Km aparentes de las diferentes yodotironinas para los transportadores de la membrana de células hepáticas de rata estaba en el intervalo nanomolar (35). Aunque T3 era un inhibidor competitivo de la captación de T4 y viceversa, los valores de Ki y Km fueron diferentes para cada hormona (35). Esto está de acuerdo con la implicación de múltiples transportadores (4,6).

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Los descubrimientos de los presentes solicitantes demuestran una notable estimulación de la captación de yodotironinas nativas así como sus derivados Na-sulfonados (sulfamato) y 4’-OH-sulfonados (sulfato) después de la inyección de oocitos con ARNc que codificaba Ntcp u oatp1. La dependencia de Na+ de Ntcp y la independencia de Na+ de oatp1 7

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se confirmó con todos estos ligandos. La mayor estimulación se observó con los sulfamatos que mostraron mayores velocidades de transporte en oocitos inyectados con ARNc de Ntcp que en oocitos inyectados ARNc de oatp1, con una ligera preferencia de T4NS sobre T3NS. Se observó una captación máxima tanto para Ntcp como para oatp1 después de la inyección de >> 1,5 ng de ARNc por oocito. Como no se conoce la eficacia de la traducción de los ARNc y el procesamiento de las proteínas, las diferencias en las proporciones de captación inducidas por estos mensajeros no pueden interpretarse en términos de proporciones de transporte molar. Aunque es más pequeña en magnitud, la estimulación de la captación de los diferentes sulfatos de yodotironina en oocitos inyectados con ARNc de Ntcp u oatp1 fue tan espectacular como la observada con los sulfamatos. En general, la captación de los sulfatos se indujo en una mayor medida por ARNc de oatp1 que por ARNc de Ntcp. T3S mostró las mayores proporciones de captación, aunque las diferencias con los otros sulfoconjugados fueron menores de 2 veces. A diferencia de los sulfamatos, los sulfatos de yodotironina son metabolitos de hormona tiroidea naturales. La sulfatación juega un papel importante en el metabolismo de la hormona tiroidea (41,36). Facilita la desyodación del anillo interno catalizada por desyodasa de tipo 1 (degradación) de la prohormona T4 y la hormona activa T3, mientras que bloquea la desyodación del anillo externo (activación) de T4 a T3 por la misma enzima (4,36). Los resultados sugieren que tanto Ntcp como oatp1 contribuyen de manera importante a la captación de T4S y T3S por los hepatocitos de rata, permitiendo de esta manera su degradación por la desyodasa de tipo 1 localizada en el retículo endoplásmico (1-4). Un descubrimiento particular del presente estudio es la estimulación de la captación de las diferentes yodotironinas nativas por inyección de ARNc de Ntcp u oatp1. Aunque el aumento relativo en la captación de las yodotironinas por ARNc fue menos impresionante que el observado con los sulfamatos y los sulfatos, esto se debió principalmente a la captación endógena mucho mayor por los oocitos no inyectados. De hecho el aumento en la captación de las diferentes yodotironinas inducido por el ARNc de Ntcp u oatp1 fue similar en magnitud al observado con los sulfatos. El grado de estimulación de la captación de yodotironina por ARNc de oatp1 fue igual o mayor que el aumento inducido por ARNc de Ntcp. Con mucho, la mayor estimulación se produjo después de la inyección de ARNc de oatp1 usando rT3 como ligando. Se descubrió que la captación de los diferentes derivados de yodotironina en oocitos inyectados con ARNc de Ntcp u oatp1 no mostró ningún signo de saturación a una concentración de ligando de 0,1 mM (no mostrado), que es mayor que los valores de Km aparentes determinados para la captación de T4 y T3 en hepatocitos aislados (35). Ciertos estudios previos también han sugerido que en la captación de T4 y T3 por hepatocitos de rata es muy dependiente de Na+ , basándose en el mayor efecto del inhibidor de Na/K-ATPasa ouabaína (4,8). Sin embargo, está claro que la ouabaína también puede inhibir la captación de yodotironinas directamente por competición por los transportadores de tipo oatp (25, 26, 31). Hay muchas pruebas que sugieren que el transporte a través de la membrana plasmática juega un papel limitante de la velocidad en el metabolismo y acción de la hormona tiroidea en hígado y otros tejidos (6). En ayunas y en caso de enfermedades no tiroideas, la conversión periférica de T4 en T3 está disminuida dando como resultado mayores concentraciones de T3 en suero (37). Se cree que esto representa un mecanismo de adaptación beneficioso que tiene como resultado un menor gasto de energía y degradación de proteínas y, de esta manera, la conservación de la función del tejido (37). Fuertes pruebas indican una captación reducida de T4 en tejidos productores de T3 tales como el hígado como un mecanismo importante para la reducción de la producción de T3 en estados de ayuno y en enfermedades no tiroideas (6,37). Esto puede deberse a la menor expresión de los transportadores o a un contenido reducido de ATP en el tejido, pero también puede deberse a la inhibición de la captación hepática de T4 por factores circulantes tales como bilirrubina, ácidos grasos libres, ácido 3-carboxi-4-metil-5-propil-2-furanpropanoico (CMPF) e indoxil sulfato, cuyas concentraciones están aumentadas en estado de ayunas y/o en caso de enfermedad (6,37-39). La captación hepática de T4 también se inhibe por agentes farmacéuticos tales como el fármaco antiarrítmico amiodarona y el agente de contraste de rayos X ácido iopanoico, que se sabe que inducen una reducción en la T3 en suero (6,40-42). Se ha postulado que una reducción en el glutatión reducido celular (GSH), que puede ser un cofactor fisiológico de la desyodasa de tipo I, también podría contribuir a la reducción de la producción de T3 periférica durante estados de enfermedad y el estado de ayunas (43). Curiosamente, la captación de aniones orgánicos por oatp1, como se ha mostrado recientemente, tiene lugar en el intercambio de GSH intracelular (44). Bibliografía 1. Larsen, P.R. and M.J. Berry. 1995. Nutritional and hormonal regulation of thyroid hormone deiodinases. Annu. Rev. Nutr. 15: 323-352.

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4. Hennemann, G. and T.J. Visser. 1997. Thyroid hormone synthesis, plasma membrane transport and metabolism. In Handbook of Experimental Pharmacology, Vol 128; Pharmacotherapeutics of the Thyroid Gland, A.P. Weetman and A. Grossman, editors. Springer, Berlin, 75-117. 8

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39. Lim, C.F., R. Docter, T.J. Visser, E.P. Krenning, B. Bernard, H. van Toor, M. de Jong and G. Hennemann. 1993. Inhibition of thyroxine transport into cultured rat hepatocytes by serum of nonuremic critically ill patients: effects of bilirubin and nonesterified fatty acids. J. Clin. Endocrinol. Metab. 76: 1165-1172. 40. De Jong, M., R. Docter, H. van der Hoek, E. Krenning, D. van der Heide, C. Quero, P. Plaisier, R. Vos and G. Hennemann. 1994. Different effects of amiodarone on transport of T4 and T3 into the perfuse rat liver. Am. J. Physiol. 266: E44-E49. 41. Wiersinga, W.M. 1997. Amiodarone and the thyroid. In Handbook of Experimental Pharmacology, Vol 128; Pharmacotherapeutics of the Thyroid Gland, A.P. Weetman and A. Grossman, editors. Springer, Berlin, 225-287.

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Las abreviaturas usadas en este documento son: Ch+ , colina; GSH, glutatión reducido; Ntcp, polipéptido cotransportador de Na+ /taurocolato; oatp, polipéptido transportador de aniones orgánicos; T4, tiroxina; T4S, sulfato de T4; T4NS, sulfamato de T4; T3, 3,3’,5-triyodotironina; T3S, sulfato de T3; T3NS, sulfamato de T3; rT3 (T3 inversa), 3,3’,5’-triyodotironina; rT3S, sulfato de rT3; 3,3’-T2, 3,3’-diyodotironina; 3,3’-T2S, sulfato de 3,3’-T2. 10

ES 2 252 812 T3 REIVINDICACIONES

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1. Uso in vitro de un polipéptido transportador de aniones orgánicos independiente de Na+ (oatp) o un fragmento funcional del mismo para proporcionar captación en una célula de una yodotironina nativa o un derivado 4’-OHsulfonado (sulfato) de la misma. 2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha yodotironina nativa es 3,3’,5,5’-tetrayodotironina (T4) o 3,3’,5-triyodotironina (T3) ó 3,3’,5’-triyodotironina (rT3) o 3,3’-diyodotironina (3,3’-T2).

10

15

3. Un uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde dicha célula se proporciona con un ácido nucleico aislado y/o recombinante o un fragmento funcional del mismo que codifica dicho oatp. 4. Un uso de acuerdo con la reivindicación 3, donde dicho ácido nucleico aislado y/o recombinante o fragmento funcional del mismo es ARNc. 5. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicha célula es un oocito no humano.

20

6. Un bioensayo para identificar o detectar un fármaco candidato capaz de influir sobre la captación en una célula de una yodotironina nativa o un derivado 4’-OH-sulfonado (sulfato) de la misma, que comprende proporcionar a dicha célula un oatp o un fragmento funcional del mismo y determinar si dicho fármaco candidato influye sobre la captación en dicha célula de una yodotironina nativa o un derivado 4’-OH-sulfonado (sulfato) de la misma. 7. Un bioensayo de acuerdo con la reivindicación 6, donde dicha yodotironina nativa es T4 o T3 o rT3 ó 3,3’-T2.

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30

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8. Un bioensayo de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, donde dicha célula se proporciona con un ácido nucleico aislado y/o recombinante o fragmento funcional del mismo que codifica dicho oatp. 9. Un bioensayo de acuerdo con la reivindicación 8, donde dicho ácido nucleico aislado y/o recombinante o fragmento funcional del mismo es ARNc. 10. Un compuesto farmacéutico capaz de influir sobre el transporte por oatp de una yodotironina nativa o un derivado 4’-OH-sulfonado (sulfato) de la misma, donde dicho compuesto es un polipéptido oatp o un fragmento funcional del mismo o donde dicho compuesto es un anticuerpo dirigido contra una proteína oatp o dirigido contra un fragmento funcional de dicha proteína. 11. Un compuesto farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 10, donde dicha yodotironina nativa es 3,3’,5,5’tetrayodotironina (T4) ó 3,3’,5-triyodotironina (T3) ó 3,3’,5’-triyodotironina (rT3) o 3,3’-diyodotironina (3,3’-T2).

40

12. Uso de un compuesto farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11 para la producción de un medicamento para tratar un trastorno relacionado con la hormona tiroidea. 13. Uso de un compuesto farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11 para la producción de un medicamento para tratar la obesidad.

45

50

14. Uso de un compuesto farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11 para la producción de un medicamento para tratar enfermedades cardiovasculares. 15. Uso de un ácido nucleico aislado y/o recombinante o un fragmento funcional del mismo que codifica oatp, para la producción de un medicamento para tratar un trastorno relacionado con la hormona tiroidea. 16. Uso de un ácido nucleico aislado y/o recombinante o un fragmento funcional del mismo que codifica oatp, para la producción de un medicamento para tratar la obesidad.

55

60

17. Uso de un ácido nucleico aislado y/o recombinante o un fragmento funcional del mismo que codifica oatp, para la producción de un medicamento para tratar enfermedades cardiovasculares. 18. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, donde dicho medicamento es adecuado para terapia génica, donde los genes o proteínas transportadoras de hormonas tiroideas específicas de tejidos se dirigen por vehículos de liberación de genes a células o tejidos enfermos.

65

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