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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 203 889

51 Int. Cl. : A61K 31/166

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A61K 31/423 A61P 33/02

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud: 98303230 .1

86 Fecha de presentación: 27.04.1998

87 Número de presentación de la solicitud: 0878192

87 Fecha de publicación de la solicitud: 18.11.1998

54 Título: Tratamiento de infecciones protozoarias.

30 Prioridad: 01.05.1997 US 45267 P

73 Titular/es:

Allegheny University of The Health Sciences Broad And Vine Streets Philadelphia, Pennsylvania 19102-1192, US

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.04.2004

72 Inventor/es: Young, David Hamilton;

Michelotti, Enrique Luis; Edlind, Thomas David y Katiyar, Santosh Kumar

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Carpintero López, Francisco

ES 2 203 889 T3

16.04.2004

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 203 889 T3 DESCRIPCIÓN Tratamiento de infecciones protozoarias. 5

La presente invención se refiere al tratamiento o profilaxis de infecciones protozoarias en el hombre o en animales. En particular, la presente invención se refiere al tratamiento de infecciones protozoarias usando ciertos derivados de N-acetonilarilamida que se sabe que inhiben el crecimiento de hongos, véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos 3.661.991; 4.822.902; 4.863.940; 5.254.584 y 5.304.572.

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Los protozoos son microorganismos eucariotas unicelulares que carecen de paredes celulares y normalmente son móviles e incoloros. Se distinguen de las algas por su falta de clorofila, de los hongos por su ausencia de pared celular y la presencia de motilidad y de los mohos del fango por su falta de formación de cuerpo fructífero.

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Los protozoos se clasifican, en general, en cuatro grupos principales basándose en sus mecanismos de motilidad o ciclos de vida. Los flagelados son protozoos que utilizan de uno a ocho flagelos para moverse. Los ciliados utilizan cilios, que son más cortos que los flagelos y están presentes en grandes cantidades. Los protozoos que se mueven extendiendo pseudópodos se llaman amebas. El cuarto grupo principal son los esporozoos o apicomplejos, que son parásitos intracelulares no móviles (excepto durante su etapa sexual) y que penetran en las células huésped mediante un mecanismo que implica su complejo apical característico. Algunos protozoos no se ajustan a ninguno de estos grupos, como los microporidios intracelulares no móviles, que penetran en las células huésped mediante un mecanismo de inyección. Representantes clínicamente importantes del grupo de los flagelados incluyen Giardia lamblia, Trichomonas vaginalis, Leishmania spp. y Trypanosoma spp. G. lamblia es un parásito intestinal de origen hídrico que se presenta en todo el mundo, provocando diarrea y otros síntomas intestinales. Los fármacos usados más comúnmente para tratar la giardiasis son el metronidazol y otros miembros de los 5-nitroimidazoles. El metronidazol es un mutagénico en el ensayo de Ames {Vogd et al., Mutation Research, vol. 26, 483-490 (1974)} y tiene diversos efectos secundarios tóxicos. El desarrollo de resistencia a estos fármacos en Giardia y otros parásitos protozoarios como por ejemplo Entamoeba histolytica y Trichomonas vaginalis limita también su efectividad. La leishmaniasis, una enfermedad con peligro para la vida provocada por Leishmania spp., es un problema de salud importante en todo el mundo, estimándose en 1015 millones de personas infectadas y 400.000 nuevos casos cada año. En la actualidad no hay un tratamiento satisfactorio para la leishmaniasis. El tratamiento elegido es antimonio pentavalente en forma de estibogluconato sódico o antimonato de meglumina. Ambos fármacos se administran intravenosamente, tienen efectos secundarios adversos graves, requieren hospitalización durante el tratamiento y no siempre no eficaces. {M. Ouelette y B. Papadopoulou, Parasitology Today, vol. 9, pp. 150-153 (1993)}. Trypanosoma spp. provoca enfermedades con peligro para la vida en los seres humanos, incluyendo la enfermedad del sueño africano y la enfermedad de Chagas, así como un buen número de enfermedades importantes en animales domésticos. Leishmania y Trypanosoma son géneros muy relacionados, y representan los patógenos principales en el grupo de los cinetoplástidos de los protozoos. Los ciliados, en general, no son patógenos, excepto el Balantidium coli, que es un parásito intestinal de los animales domésticos, en particular, de los cerdos. Ocasionalmente, B. coli infecta a los seres humanos, produciendo una disentería grave. El grupo ameba incluye el parásito intestinal Entanoeba histolytica, que provoca la disentería amébica y los abscesos extraintestinales de órganos como el hígado y el pulmón. El fármaco usado más habitualmente para tratar la infección por E.histolytica es el metronidazol. Otras amebas libres que ocasionalmente provocan infecciones en los seres humanos incluyen Acanthamoeba y Naegleria spp.: estas infecciones son, típicamente, difíciles de tratar. Los Esporozoos comprenden un gran grupo de protozoos, siendo todos ellos parásitos obligatoriamente. Esporozoos representativos son Plasmodium spp. (que provoca malaria), Toxoplasma gondii, Cryptosporidium spp., Theileria spp. y Eimeria spp. (que provoca coccidiosis en aves y en animales domésticos). Toxoplasma gondii es un patógeno importante en pacientes inmunocomprometidos y provoca encefalitis, una peligrosa enfermedad con peligro para la vida. La terapia estándar para la encefalitis toxoplásmica es una combinación de pirimetamina y sulfadiazina, sin embargo, los efectos secundarios de este tratamiento son frecuentemente tan severos que se hace necesario no continuar con el tratamiento. Cruptosporidum parvum es una causa habitual de infección intestinal que conduce a diarrea autolimitada, aunque en los individuos inmunocomprometidos la infección por C. parvum es crónica y con peligro para la vida. En la actualidad no hay un tratamiento eficaz para la criptosporidiosis. Los microsporidianos son patógenos intracelulares obligatoriamente, que provocan infecciones intestinales y sistémicas en pacientes inmunocomprometidos, así como infecciones, económicamente importantes, en peces e invertebrados. La microsporidiosis en los pacientes que padecen el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) se relaciona, fundamentalmente, con las especies de Encephalitozoon (incluyendo E.intestinalis, E. cuniculi y E. hellem) y Enterocytozoon bieneusi. La microesporidiosis es una causa frecuente de la diarrea crónica en pacientes con SIDA y puede encontrarse también fuera del intestino, en los ojos, en el tracto biliar, en los senos nasales, en el tracto urinario y en el respiratorio.

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ES 2 203 889 T3 La mayoría de los fármacos utilizados actualmente para el tratamiento de infecciones protozoarias no son suficientemente eficaces, tienen efectos secundarios perjudiciales y son difíciles o caros de administrar. En consecuencia, existe una necesidad urgente de nuevos agentes quimioterapéuticos para combatir los parásitos protozoarios. 5

Se ha descubierto, sorprendentemente, que los derivados de N-acetonilarilamida inhiben el crecimiento de los parásitos protozoarios. Un primer aspecto de la presente invención es el uso de un compuesto de fórmula I:

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en la que: 20

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A se selecciona entre fenilo, piridilo, furilo, tienilo, isoxazolilo, oxazolilo, pirrolilo, isotiazolilo, tiazolilo, pirazolilo, imidazolilo, pirimidinilo, quinolilo, isoquinolilo, naftilo, piridazinilo, pirazinilo, benzotienilo, indolilo, benzofuranilo, bencilo, cicloalquilo (C3 -C7 ), alquilo (C1 -C6 ), haloalquilo (C1 -C6 ), alquenilo (C2 -C6 ), haloalquenilo (C2 -C6 ), alquinilo (C2 -C6 ) y haloalquinilo (C2 -C6 ) sustituidos e insustituidos, seleccionándose los sustituyentes, independientemente, entre: a) de uno a cuatro halo, ciano, alquilo (C1 -C6 ), haloalquilo (C1 -C6 ), alquenilo (C2 -C6 ), haloalquenilo (C2 -C6 ), alquinilo (C2 -C6 ), haloalquinilo (C2 -C6 ), alcoxi (C1 -C6 ), haloalcoxi (C1 -C6 ), alquiltio (C1 -C6 ), haloalquiltio (C1 C6 ), nitro, -NR6 R7 , -CR8 =NOR9 , NHCOOR10 , -CONR11 R12 , -COOR13 ; b) anillos condensados de cinco, seis y siete miembros formados a partir de dos de dichos sustituyentes, y c) un anillo carbocíclico condensado de 5, 6 ó 7 miembros que puede contener hasta dos heteroátomos seleccionados del grupo constituido por: O, S, N y P;

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R1 y R2 se seleccionan, cada uno independientemente, entre H, alquilo (C1 -C6 ), haloalquilo (C1 -C6 ), alquenilo (C2 C6 ), haloalquenilo (C2 -C6 ), alquinilo (C2 -C6 ) o haloalquinilo (C2 -C6 ), con tal que al menos uno de R1 y R2 sea distinto de H; R6 y R7 se seleccionan, cada uno independientemente, entre H, alquilo (C1 -C6 ), y alquil (C1 -C6 )carbonilo;

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R8 se selecciona entre H, alquilo (C1 -C6 ), alquenilo (C2 -C6 ), alquinilo (C2 -C6 ); R9 se selecciona entre H, alquilo (C1 -C6 ), alquenilo (C2 -C6 ), alquinilo (C2 -C6 ) y alquil (C1 -C4 )carbonilo;

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R10 , R11 , R12 y R13 se seleccionan, cada uno independientemente, entre H, alquilo (C1 -C6 ), alquenilo (C2 -C6 ) y alquinilo (C2 -C6 ); y X, Y y Z se seleccionan, cada uno independientemente, entre H, halo, ciano, tiociano, isotiociano y alquil (C1 -C6 )sulfoniloxi, con tal que al menos uno de X, Y y Z sea halo, ciano, tiociano, isotiociano o alquil (C1 C6 )sulfoniloxi; enantiómeros y estereoisómeros de los mismos; y las sales de adición de ácido fisiológicamente aceptables de los mismos en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infecciones protozoarias.

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Tal y como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “halo” significa flúor, bromo, cloro o yodo. El término “alquilo (C1 -C6 )” significa un grupo hidrocarburo saturado lineal o ramificado de 1 a 6 carbonos por grupo e incluye, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, t-butilo, pentilo y hexilo. Grupos alquilo halosustituidos, denominados como haloalquilos incluyen, por ejemplo, clorometilo, trifluorometilo, bromoetilo, pentafluoroetilo, yodopropilo y clorobutilo. El término “alquenilo (C2 -C6 )” significa un grupo lineal o ramificado que tiene al menos un doble enlace y de 2 a 6 carbonos por grupo, e incluye, por ejemplo, etenilo, 2-propenilo, 2-butenilo y 2-metil-2-propenilo.

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El término “alquinilo (C2 -C6 )” significa un grupo alquinilo lineal o ramificado que tiene al menos un triple enlace y de 2 a 6 carbonos por grupo, e incluye, por ejemplo, etinilo, 2-propinilo y 2-butinilo.

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ES 2 203 889 T3 El término “alcoxi (C1 -C6 )” significa un alcoxi lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 carbonos por grupo, e incluye, por ejemplo, metoxi, propoxi, n-butoxi y t-butoxi. 5

El término “alquiltio (C1 -C6 )” significa un grupo alquiltio lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 carbonos por grupo, e incluye, por ejemplo, metiltio y propiltio. Los grupos “haloalquilo”, “haloalquenilo”, “haloalquinilo”, “haloalcoxi” y “haloalquiltio” son grupos “alquilo”, “alquenilo”, “alquinilo”, “alcoxi” y “alquiltio”, respectivamente, que tienen de 1 a 5 sustituyentes halógeno.

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El término “cicloalquilo (C3 -C7 )” incluye, por ejemplo, ciclopropilo y ciclohexilo. El término “alquilcarbonilo (C1 -C6 )” incluye grupos alquilo lineales o ramificados que tienen de 1 a 6 carbonos por grupo que están unidos a un grupo carbonilo, por ejemplo, metilcarbonilo y butilcarbonilo.

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El término “alquilsulfoniloxi (C1 -C6 )” incluye grupos alquilo lineales o ramificados que tienen de 1 a 6 átomos de carbono por grupo que están unidos a un grupo sulfoniloxi, por ejemplo, metilsulfoniloxi y propilsulfoniloxi. Los restos –NR6 R7 adecuados incluyen amino, amino monosustituido y amino disustituido, como por ejemplo, amino, metilamino, etilamino, acetilamino y dietilamino.

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El término “nitro” significa un grupo que tiene la fórmula estructural –NO2 . El término “ciano” significa un grupo que tiene la fórmula estructural -CN. 25

El término “tiociano” significa un grupo que tiene la fórmula estructural -SCN. El término “isotiociano” significa un grupo que tiene la fórmula estructural -NCS.

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Los restos –CR8 =NOR9 adecuados incluyen, por ejemplo, hidroximinometilo, metoxiiminometilo, etoxiiminometilo, metoxiiminoetilo y metilcarboniloxiiminometilo. Los sustituyentes -CONR11 R12 adecuados incluyen amido (-CONH2 ), amido monosustituido y amido disustituido, como por ejemplo metilamido (-CONHCH3 ), dimetilamido (-CON(CH3 )2 ), propilamido y dibutilamido.

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Los sustituyentes NHCOOR10 adecuados incluyen, por ejemplo, metilcarbamato e isopropilcarbamato. En la presente invención también se contempla el uso de compuestos que tienen la fórmula estructural (II) en la que R4 y R5 conjuntamente forman un anillo condensado de 5, 6 ó 7 miembros, que puede contener hasta dos heteroátomos seleccionados del grupo constituido por O, S, N y P; R1 y R2 son H, alquilo (C1 -C6 ), haloalquilo (C1 -C6 ), alquenilo (C2 -C6 ) y alquinilo (C2 -C6 ), con tal que al menos uno de R1 y R2 no sea H; R3 se selecciona entre H, halo, ciano, alquilo (C1 -C6 ), haloalquilo (C1 -C6 ), alquenilo (C2 -C6 ), alquinilo (C2 -C6 ), alcoxi (C1 -C6 ), alquiltio (C1 -C6 ), haloalcoxi (C1 -C6 ), nitro, carboxilo, -NR6 R7 , -CR8 =NOR9 , NHCOOR10 , -CONR11 R12 y -COOR13 , R6 , R7 , R8 , R9 , R10 , R11 , R12 y R13 son H o alquilo (C1 -C6 ), y X e Y se seleccionan, cada uno independientemente, entre H, halo, ciano, tiociano, isotiociano y alquil (C1 -C6 )sulfoniloxi, con tal que al menos uno de X e Y no sea H.

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Preferiblemente, A se selecciona entre fenilo, piridilo, furilo, tienilo, isoxazolilo, oxazolilo, pirrolilo, isotiazolilo, tiazolilo, pirazolilo, imidazolilo, pirimidinilo, quinolilo, isoquinolilo, naftilo, piridazinilo, pirazinilo, benzotienilo, indolilo, benzofuranilo, bencilo y cicloalquilo (C3 -C7 ) sustituidos e insustituidos. 50

En una realización preferida de la presente invención, usando compuestos que tienen la fórmula estructural (I), A es fenilo y los compuestos tienen la fórmula estructural:

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en la que: R1 y R2 se seleccionan, cada uno independientemente, entre H, alquilo (C1 -C6 ), haloalquilo (C1 -C6 ), alquenilo (C2 C6 ) y alquinilo (C2 -C6 ), con tal que al menos uno de R1 y R2 sea distinto de H; 4

ES 2 203 889 T3 R3 , R4 y R5 se seleccionan, cada uno independientemente, del grupo constituido por H, halo, ciano, alquilo (C1 C6 ), haloalquilo (C1 -C6 ), alquenilo (C2 -C6 ), alquinilo (C2 -C6 ), alcoxi (C1 -C6 ), alquiltio (C1 -C6 ), haloalcoxi (C1 -C6 ), nitro, -NR6 R7 , -CR8 =NOR9 , NHCOOR10 , -CONR11 R12 y -COOR13 ; 5

R6 , R7 , R8 , R9 , R10 , R11 , R12 y R13 se seleccionan, cada uno independientemente, entre H y alquilo (C1 -C6 ); y X e Y se seleccionan, cada uno independientemente, entre H, halo, ciano, tiociano, isotiociano y alquil (C1 -C6 ) sulfoniloxi, con tal que al menos uno de X e Y sea distinto de H.

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En una realización particularmente preferida de la presente invención, los compuestos usados tienen la fórmula estructural (II), en la que X es cloro; Y es H; R1 es metilo; R2 se selecciona entre metilo y etilo; R3 y R5 se seleccionan, cada uno independientemente, entre H, halo, metilo, nitro, ciano, amino, -CH=NOCH3 y -NHCOOCH3 y R4 se selecciona entre H, halo, amino, ciano, -CH=NOCH3 , -NHCOOCH3 , COOCH3 y alquilo (C1 -C4 ).

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En una realización aún más preferida de la presente invención, los compuestos tienen la fórmula estructural (II), en la que X es cloro, Y es H, R1 es metilo, R2 es etilo, R3 y R5 se seleccionan, cada uno independientemente, entre halo, metilo, ciano y -CH=NOCH3 y R4 es H, amino, metilo o -CH=NOCH3 .

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En otra realización preferida de la presente invención, los compuestos tienen la fórmula estructural (I) en la que A es 3-piridilo y los compuestos tienen la fórmula estructural:

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en la que 35

R1 y R2 se seleccionan independientemente entre H, alquilo (C1 -C6 ), haloalquilo (C1 -C6 ), alquenilo (C2 -C6 ) y alquinilo (C2 -C6 ), con tal que al menos uno de R1 y R2 sea distinto de H; R3 y R4 se seleccionan, cada uno independientemente, entre H, halo, ciano, alquilo (C1 -C6 ), haloalquilo (C1 -C6 ), alquenilo (C2 -C6 ), alquinilo (C2 -C6 ), alcoxi (C1 -C6 ), alquiltio (C1 -C6 ), haloalcoxi (C1 -C6 ), nitro, -NR6 R7 , -CR8 =NOR9 , NHCOOR10 , -CONR11 R12 y -COOR13 ;

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R6 , R7 , R8 , R9 , R10 , R11 , R12 y R13 son H o alquilo (C1 -C6 ); y X e Y se seleccionan, cada uno independientemente, entre H, halo, ciano, tiociano, isotiociano y alquil (C1 -C6 ) sulfoniloxi, con tal que al menos uno de X e Y sea distinto de H. 45

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Cuando R1 y R2 son diferentes, es posible la presencia de enantiómeros ópticos de los compuestos que se usan en la presente invención, debido a la presencia de un átomo de carbono asimétrico que une R1 y R2 . Se sabe que la mayoría de compuestos biológicamente activos tienen enantiómeros ópticos, siendo más activo uno de ellos que el otro. De manera similar, para los compuestos usados en la presente invención, la actividad biológica de uno de los enantiómeros puede ser mayor que la del otro enantiómero. En dichos casos, en el alcance de la invención se contempla el uso de ambos enantiómeros. Los enantiómeros se conocen como enantiómeros “S” y enantiómeros “R”. El término “enantiómero S” significa que los cuatro grupos sobre el carbono al que están unidos R1 y R2 , cuando se clasifican según el conjunto de reglas de secuencia del sistema de Cahn-Ingold-Prelog (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 5, 385-415 (1966)), define el carbono como que tiene una configuración S. El término “enantiómero R” significa que los cuatro grupos forman una configuración R. La presente invención se refiere al tratamiento de infecciones protozoarias. Los protozoos que se pueden controlar mediante la presente invención incluyen, pero no se limitan a, especies de Giardia, especies de Leishmania, especies de Entamoeba, especies de Toxoplasma, especies de Cryptosporidium y especies de microsporidia. La presente invención se puede utilizar para tratar enfermedades provocadas por protozoos en animales, incluyendo seres humanos, animales domésticos como por ejemplo ganado, cerdos y aves de corral. La presente invención incluye administrar los compuestos eficaces descritos en la presente memoria descriptiva a animales por cualquier vía apropiada para la afección a tratar. También son útiles las sales de adición de ácido fisiológicamente aceptables de los compuestos descritos en la presente memoria descriptiva para tratar enfermedades. El término “sales de adición de ácido fisiológicamente aceptables” pretende incluir cualquier sal de adición de ácido inocua, orgánica o inorgánica, de las formas básicas de los compuestos descritos en la presente memoria descriptiva. En general, los compuestos que tienen grupos básicos pueden formar sales de adición de ácido. Cuando hay presentes 5

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varios grupos básicos, se pueden formar mono- o polisales. Por ejemplo, los compuestos como los que contienen un anillo de piridina o un sustituyente amino, se pueden hacer reaccionar con un ácido fisiológicamente aceptable, y se puede administrar la sal de adición de ácido resultante. Los ácidos inorgánicos adecuados para usar en la preparación de las sales de adición de ácido se conocen bien en la técnica de la formulación farmacéutica e incluyen ácido clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, sulfúrico, nítrico y fosfórico, y las sales ácidas de metales como por ejemplo monohidrógeno ortofosfato sódico y hidrógeno sulfato potásico. Ejemplos de ácidos orgánicos que formas sales adecuadas incluyen ácidos mono, di y tricarboxílicos, como por ejemplo los ácidos acético, glicólico, láctico, pirúvico, malónico, fumárico, benzoico, cítrico, maleico, tartárico, succínico, glucónico, ascórbico, sulfámico, oxálico, pamoico, hidroximaleico, hidroxibenzoico, fenilacético, salicílico, metanosulfónico, etanosulfónico, 2-hidroxietanosulfónico, bencenosulfónico, o 2-fenoxibenzoico, o mezclas de los mismos. (Véase, por ejemplo, Berge, et al., “Pharmaceutical Salts” en J. Pharm. Sci., 66: 1-19 (1977)). Las sales de adición de ácido se pueden preparar mediante técnicas estándar como disolver la base libre en una disolución acuosa o acuosa-alcohólica u otro disolvente adecuado que contiene el ácido apropiado y aislarlo evaporando la disolución o haciendo reaccionar la base libre en un disolvente orgánico en cuyo caso la sal se separa directamente o se puede obtener concentrando la disolución. En general, las sales de adición de ácido son materiales cristalinos que son más solubles en agua que la base libre. Como ejemplo específico, se puede preparar la sal clorhidrato del compuesto 11 (descrito en la Tabla X, más adelante) disolviendo el compuesto en etiléter anhidro, burbujeando en su interior cloruro de hidrógeno gaseoso seco, filtrando y secando el precipitado resultante. Para uso farmacéutico, los compuestos descritos en la presente memoria descriptiva se pueden recoger en vehículos farmacéuticamente aceptables, como por ejemplo disoluciones, suspensiones, comprimidos, cápsulas, ungüentos, elixires y composiciones inyectables. Las preparaciones farmacéuticas pueden contener del 0,1% al 99% en peso de ingrediente activo. Las preparaciones que están en forma de una sola dosis, “forma de dosificación unitaria” contienen, preferiblemente, del 20% al 90% de ingrediente activo, y las preparaciones que no están en forma de una sola dosis contienen, preferiblemente, del 5% al 20% en peso de ingrediente activo. Tal y como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “ingrediente activo” se refiere a los compuestos descritos en la presente memoria descriptiva, a las sales de los mismos y a las mezclas de los compuestos descritos en la presente memoria descriptiva con otros compuestos farmacéuticamente activos. Las formas de dosificación unitaria, como por ejemplo comprimidos o cápsulas, contienen, típicamente, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 1,0 g del ingrediente activo.

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Las vías adecuadas para administrar las preparaciones farmacéuticas incluyen la oral, rectal, tópica (incluyendo dérmica, bucal y sublingual), vaginal, parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal y epidural) y por el tubo naso-gástrico. Los expertos en la técnica entenderán que la vía de administración preferida dependerá de la afección a tratar y que puede variar con factores como el estado del receptor.

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Según la presente invención, los compuestos eficaces descritos en la presente memoria descriptiva se pueden administrar en solitario o junto con otros compuestos farmacéuticamente activos. Los expertos en la técnica entenderán que los compuestos farmacéuticamente activos que se pueden usar junto con los compuestos descritos en la presente memoria descriptiva se seleccionarán para evitar efectos negativos sobre el receptor o interacciones indeseables entre los compuestos. Tal y como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “ingrediente activo” pretende incluir los compuestos descritos en la presente memoria descriptiva cuando se usan en solitario o junto con uno o más compuestos farmacéuticamente activos adicionales.

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La cantidad de los compuestos descritos en la presente memoria descriptiva requerida para ser usada en el tratamiento o profilaxis de las infecciones protozoarias dependerá, entre otros, de la vía de administración, de la edad y el peso del animal (por ejemplo un ser humano) que se va a tratar y de la gravedad de la afección que se va a tratar. En general, una dosis adecuada para administrar a un hombre para el tratamiento de infecciones protozoarias varía en el intervalo de 1,0 mg a 200,0 mg por kilogramo de masa corporal por día, por ejemplo de 5 mg/kg a 100 mg/kg, particularmente de 25 a 100 mg/kg. Se entenderá que para administración a neonatos, se necesitan dosis menores. Para el tratamiento profiláctico, pueden darse también, aunque con menor frecuencia, el compuesto de fórmula I o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, por ejemplo como una sola dosis en días alternos, una o dos veces a la semana o una o dos veces al mes. La dosificación para el tratamiento profiláctico dependerá, entre otros, de la frecuencia de administración y, cuando se use una preparación de liberación prolongada o una formulación de liberación controlada, de la velocidad de liberación del ingrediente activo. Por lo tanto, para una administración una sola vez a la semana, una dosis profiláctica adecuada varía en el intervalo de 0,5 a 100 mg/kg, por ejemplo, de 1,0 a 50 mg/kg, particularmente de 5 a 50 mg/kg. Aunque los compuestos descritos en la presente memoria descriptiva se pueden administrar en solitario para tratar infecciones protozoarias, es preferible administrarlos como formulaciones farmacéuticas. Las formulaciones útiles comprenden uno o más ingredientes activos y uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. El término “farmacéuticamente aceptable” significa que es compatible con los otros ingredientes de la formulación y que es inocuo para el receptor. Las formulaciones farmacéuticas útiles incluyen las que son adecuadas para administración oral, rectal, nasal, tópica, vaginal o parenteral, así como para administración por el tubo naso-gástrico. Las formulaciones se pueden preparar, convenientemente, en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar por cualquier procedimiento conocido en la técnica farmacéutica. Dichos procedimientos incluyen la etapa de poner en contacto el ingrediente activo con el vehículo, que puede constituir uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan poniendo en contacto uniformemente los ingredientes activos con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y después, si fuera necesario, se da forma al producto. 6

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Las formulaciones adecuadas para administración oral se pueden usar en unidades discretas como por ejemplo cápsulas, pastillas o comprimidos, conteniendo cada uno de ellos una cantidad predeterminada del ingrediente activo; como polvo o gránulos; como una disolución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o de agua en aceite. El ingrediente activo se puede administrar también como bolo o pasta o puede estar contenido en liposomas. Se puede preparar un comprimido por compresión o moldeo, y puede incluir uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos comprimidos se pueden preparar comprimiendo el ingrediente activo en una máquina adecuada en una forma de fluidez libre, como por ejemplo polvo o gránulos. Los ingredientes accesorios con los que se puede mezclar el ingrediente activo incluyen uno o más de los siguientes: un aglutinante como por ejemplo povidona, gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa; un lubricante, un diluyente inerte, un conservante, un disgregante como por ejemplo almidón glicolato sódico, povidona reticulada o carboximetilcelulosa sódica reticulada; agentes tensioactivos o agentes dispersantes. Los comprimidos moldeados se pueden preparar moldeando en una máquina adecuada una mezcla del ingrediente activo en polvo humedecida con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos se pueden recubrir o ranurar y se pueden formular de manera que proporcionen un ingrediente activo en su interior de liberación lenta o controlada, usando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en proporciones que proporcionen el perfil de liberación deseado. Se puede rellenar una cápsula con polvo suelto o comprimido del ingrediente activo en una máquina de llenado adecuada, opcionalmente con uno o más aditivos. Los ejemplos de aditivos adecuados incluyen aglutinantes como por ejemplo povidona, gelatina, lubricantes, diluyentes inertes y disgregantes, tal y como se ha descrito anteriormente para los comprimidos. Las cápsulas se pueden formular también de manera que contengan gránulos o subunidades discretas para proporcionar una liberación controlada o lenta del ingrediente activo. Esto puede lograrse, por ejemplo, extruyendo y esferonizando una mezcla húmeda del ingrediente activo con un agente de extrusión como por ejemplo celulosa microcristalina. Los esferoides producidos de esta manera se pueden recubrir con una membrana semipermeable de, por ejemplo, etilcelulosa, para producir propiedades de liberación sostenida. Para administración tópica, los compuestos se aplican, preferiblemente, como ungüento o crema que contiene el ingrediente activo en una cantidad de, por ejemplo, el 0,075 al 20% en peso, preferiblemente del 0,2 al 15% en peso, y más preferiblemente del 0,5 al 10% en peso. Cuando lo formulado es un ungüento, el ingrediente activo se puede incorporar en una base de ungüento parafínica o miscible en agua. Alternativamente, el ingrediente activo se puede formular como crema con una base de crema de aceite en agua o de agua en aceite. La fase acuosa de la base de crema puede incluir un alcohol polihídrico. Un alcohol polihídrico es un alcohol que tiene dos o más grupos hidroxilo, como por ejemplo propilenglicol, butano-1,3-diol, manitol, sorbitol, glicerol y polietilenglicol y mezclas de los mismos. La cantidad de alcohol polihídrico es, típicamente, de aproximadamente el 30% en peso. Las formulaciones tópicas pueden incluir uno o más compuestos para potenciar la absorción o la penetración del ingrediente activo a través de la piel o de otras zonas afectadas. Ejemplos de dichos potenciadores de la penetración dérmica incluyen dimetilsulfóxido y análogos relacionados.

45

La fase oleosa de la base de crema puede incluir otros ingredientes usados habitualmente en la técnica, como por ejemplo uno o más emulgentes, una grasa o un aceite o ambos grasa y aceite. Preferiblemente, se incluye un emulgente hidrófilo junto con un emulgente lipófilo, que actúa como estabilizante. También es preferible incluir un aceite y una grasa. Junto con el emulgente, con o sin el estabilizante, se prepara una cera emulgente, y la cera emulgente, junto con el aceite o la grasa dan lugar a una base de ungüento emulgente que forma la fase oleosa dispersa de la formulación en crema.

50

Los emulgentes y los estabilizantes de la emulsión adecuados para usar en las formulaciones de los compuestos usados en la presente invención incluyen alcohol cetoestearílico, alcohol miristílico, monoestearato de glicerol y lauril sulfato sódico. Ejemplos de emulgentes adecuados disponibles en el mercado incluyen monoestearato de polioxietilen (20) sorbitano Tween ® 60 y un monooleato de sorbitano Span ® 80.

40

55

La elección de aceites o grasas adecuados para la formulación depende de las propiedades deseadas. La crema debería ser, preferiblemente, no grasa, que no manche y el producto debería ser lavable con una consistencia adecuada para evitar el goteo en las tuberías u otros recipientes. Se pueden usar ésteres alquílicos mono- o dibásicos de cadena lineal o ramificada, como por ejemplo diisoadipato, isocetilestearato, diéster de propilenglicol de ácidos grasos de coco, miristato de isopropilo, deciloleato, palmitato de isopropilo, butilestearato o palmitato de 2-etilhexilo. Los ésteres se pueden usar en solitario o combinados, dependiendo de las propiedades deseadas. Alternativamente, se pueden usar lípidos de punto de fusión relativamente alto como por ejemplo parafina blanda blanca o parafina líquida u otros aceites minerales.

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Las formulaciones adecuadas para administración tópica a los ojos incluyen también gotas para los ojos en las que el ingrediente activo está disuelto o suspendido en un vehículo adecuado, como por ejemplo un disolvente acuoso para el ingrediente activo. La concentración del ingrediente activo es, preferiblemente, del 0,5% al 20% en peso, más preferiblemente del 0,5% al 10% en peso, más preferiblemente de aproximadamente el 1,5% en peso. 65

Las formulaciones adecuadas para administración rectal pueden estar en forma de un supositorio con una base adecuada que comprende, por ejemplo, manteca de cacao o alcohol graso superior, triglicéridos o ácidos grasos saturados. 7

ES 2 203 889 T3 Las formulaciones adecuadas para administración vaginal se pueden administrar como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de pulverización que contienen los vehículos apropiados. 5

10

15

El ingrediente activo se puede formular, también, como disolución o suspensión adecuada para la administración por el tubo naso-gástrico. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen disoluciones para inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostatos y solutos que dan lugar a formulaciones isotónicas con la sangre del receptor; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes, liposomas u otros sistemas microparticuados diseñados para dirigir el ingrediente activo hacia los componentes sanguíneos o hacia uno o más órganos. Las formulaciones pueden estar en dosis unitarias o en envases multidosis, como por ejemplo ampollas y viales sellados y se pueden almacenar en condiciones de liofilización, necesitando sólo añadir un vehículo líquido estéril, como por ejemplo agua adecuada para inyección, inmediatamente antes de su uso. Las disoluciones y suspensiones para inyección se pueden preparar, extemporáneamente, a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles de los tipos descritos en la presente memoria descriptiva. Las formulaciones de dosificación unitaria preferidas son las que contienen una dosis o unidad diaria, una subdosis diaria o una fracción apropiada de la misma, del ingrediente activo.

20

Los compuestos descritos en la presente memoria descriptiva se pueden formular también como preparaciones de liberación prolongada de actuación a largo plazo, que se pueden administrar por inyección intramuscular o mediante implantación, por ejemplo subcutánea o intramuscularmente. Las preparaciones de liberación prolongada pueden incluir, por ejemplo, materiales poliméricos o hidrófobos apropiados, o resinas de intercambio iónico. Dichas formulaciones de actuación a largo plazo son particularmente útiles para el uso profiláctico.

25

Debe entenderse que además de los ingredientes que se han mencionado, particularmente, anteriormente, las formulaciones que se usan en la presente invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica, dependiendo del modo de administración. Por ejemplo, las formulaciones adecuadas para administración oral pueden incluir agentes aromatizantes. 30

35

40

Los compuestos descritos en la presente memoria descriptiva se pueden usar también según la presente invención junto con otros agentes terapéuticos, por ejemplo, agentes usados en el tratamiento de pacientes inmunocomprometidos, incluyendo agentes antibacterianos; agentes antifúngicos; agentes anticancerígenos como por ejemplo interferones como el interferón alfa; agentes antivíricos como por ejemplo azidotimidina; inmunoestimulantes e inmunomoduladores. El compuesto de fórmula I se puede administrar también junto con o simultáneamente con agentes antidiarreicos como por ejemplo clorhidrato de loperamida y/o clorhidrato de difenoxilato, o con sulfato de morfina. También se puede llevar a cabo, simultáneamente, la terapia de rehidratación oral. Las composiciones adecuadas para uso veterinario incluyen las concebidas para administración oral, parenteral e intrarumenal. Las composiciones adecuadas para administración oral incluyen pociones (dosificación líquida oral), que pueden ser disoluciones o suspensiones; comprimidos, bolos, pasta o preparaciones alimentarias en forma de polvos, gránulos o aglomerados.

45

Alternativamente, las composiciones veterinarias se pueden adaptar para administrarlas parenteralmente mediante inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa de una disolución o suspensión estéril, por implantación o como inyección intramamaria en la que se introduce una disolución o suspensión en la ubre por la tetilla. 50

Para inyección intrarumenal, las composiciones de la invención pueden ser disoluciones o suspensiones sólidas o de microcápsulas. Típicamente, las composiciones son similares a las preparaciones líquidas orales o a las preparaciones parenterales descritas en la presente memoria descriptiva. Dichas composiciones se inyectan directamente en el rumen, habitualmente a través del costado del animal, por ejemplo mediante una jeringa y aguja hipodérmicas o mediante un dispositivo de inyección automática capa de administrar dosis sencillas o múltiples.

55

Para administración veterinaria, el compuesto de fórmula I o una sal fisiológicamente aceptable del mismo se formula, preferiblemente, con uno o más vehículos veterinariamente aceptables. 60

65

Para administración oral, los polvos finos o gránulos pueden contener agentes de dilución, por ejemplo lactosa, carbonato cálcico, fosfato cálcico, vehículos minerales, etc., agentes dispersantes y/o tensioactivos, por ejemplo polisorbatos como los Tween o los Span, y se pueden presentar en una poción, en agua o en un jarabe, en un bolo, pasta o en una preparación alimentaria, en cápsulas o bolsitas en estado seco o en una suspensión no acuosa, o en una suspensión en agua o jarabe. Cuando sea deseable o necesario, se pueden incluir agentes conservantes, de suspensión, espesantes o emulgentes. Si se pretende el uso oral, se proporcionará un bolo con medios de retención para inhibir la regurgitación, por ejemplo, se puede hacer pesado con un material de alta densidad como hierro o volframio o similar o se puede retener por su forma, por ejemplo, con alas que surgen después de su administración. Los bolos pueden contener agentes disgregantes 8

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5

10

como por ejemplo almidón de maíz o metilcelulosas de calcio o de sodio, hidroxipropilmetilcelulosa, gomas vegetales con base guar, alginatos sódicos o almidón glicolatos sódicos; agentes de granulación o de unión como por ejemplo almidón en forma de mucílago, derivados de almidón, como por ejemplo “Copo de Nieve”, derivados de celulosa como por ejemplo talco, estearato cálcico, metilcelulosa, gelatina o polivinilpirrolidona; y/o agentes de lubricación, como por ejemplo estearato magnésico o ácido esteárico. Para administración parenteral, los compuestos se pueden presentar en disoluciones de inyección estériles que pueden contener antioxidantes o tampones, o como suspensiones inyectables. Los disolventes adecuados incluyen agua, en el caso de suspensiones, y disolventes orgánicos como por ejemplo dimetilformamida, dimetilacetamida, dietilacetamida, lactato de etilo, dimetilsulfóxido, alcoholes, por ejemplo, etanol, glicoles, por ejemplo etilenglicol, propilenglicol, butilenglicol y hexametilenglicol, polietilenglicoles que tiene pesos moleculares medios de aproximadamente 90 a 7.500, formalglicerina, glicofural, glicerol, isopropilmiristato, N-metilpirrolidona, polietilenglicoéteres de 2-pirrolidona del alcohol tetrahidrofurfurílico y dietilenglicol, y aceites fijos y neutros, por ejemplo aceite de coco fraccionado. Las formulaciones parenterales pueden incluir también agentes isotónicos.

15

Para uso veterinario, se puede utilizar el compuesto de fórmula I o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, junto con otros agentes terapéuticos usados en el campo de la salud animal, por ejemplo con agentes anticoccidianos o antiteileriales. 20

Los compuestos particulares útiles en el procedimiento de la presente invención incluyen los compuestos enumerados en las Tablas 1-3. En la Tabla 1 se muestran compuestos que tienen la fórmula estructural (II). TABLA 1

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Compuesto

R1

R2

R3

R4

R5

x

y

1

CH3

C2 H5

Cl

NH2

Cl

Cl

H

2

CH3

C2 H5

CH = NOCH3

H

Cl

Cl

H

3

CH3

C2 H5

Br

H

CH3

Cl

H

4

CH3

C2 H5

Cl

H

Cl

Br

Br

5

CH3

C2 H5

Cl

H

Cl

Cl

H

6

CH3

C2 H5

CH = NOCH3

NH2

Cl

Cl

H

7

CH3

C2 H5

Cl

H

Cl

SCN

H

8

CH3

CH3

Cl

H

Cl

NCS

H

9

CH3

C2 H5

Cl

F

Cl

Cl

H

10

CH3

C2 H5

Cl

CH3

Cl

Cl

H

11

CH3

C2 H5

F

F

F

Cl

H

12

CH3

C2 H5

F

H

F

Cl

H

13

CH3

CH3

Cl

H

Cl

Cl

H

14

CH3

C2 H5

Br

NH2

Br

Cl

H

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55

La Tabla 2 enumera compuestos que tienen la fórmula estructural (III). 60

TABLA 2 Compuesto

R1

R2

R3

R4

x

y

15

CH3

C2 H5

Br

H

Cl

H

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9

ES 2 203 889 T3 La Tabla 3 enumera compuestos que tienen la fórmula estructural (II), en los que R4 y R5 forman, conjuntamente, un anillo condensado. TABLA 3 5

Compuesto

R1

R2

R3

R4R5

x

y

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CH3

C2 H5

Cl

-N=CH-O-

Cl

H

10

Procedimientos usados en la preparación de los compuestos enumerados en las Tablas 1-3 Compuestos 3, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 12 y 13 de la Tabla 1 15

Los compuestos 3, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 12 y 13 de la Tabla 1 se prepararon según los procedimientos de síntesis descritos en la patente de los Estados Unidos 4.822.902, columnas 5-8 y 11-17. Compuesto 2 de la Tabla 1

20

El compuesto 2 de la Tabla 1 se preparó según los procedimientos de síntesis descritos en la patente de los Estados Unidos 5.254.584, columnas 10-14. Compuesto 10 de la Tabla 1

25

El compuesto 10 de la Tabla 1 se preparó según los procedimientos de síntesis descritos en la patente de los Estados Unidos 5.304.572, columnas 4-8. Compuestos 1 y 14 de la Tabla 1

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35

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Los compuestos 1 y 14 de la Tabla 1 se prepararon usando técnicas convencionales de síntesis, según se describe, por ejemplo en la patente de los Estados Unidos 4.863.940, columnas 5-7, a partir de los ácidos benzoicos o cloruros de benzoílo apropiados. Por lo tanto, los compuestos 1 y 14 se prepararon a partir de cloruro de 4-amino-3,5diclorobenzoílo y cloruro de 4-amino-3,5-dibromobenzoílo, respectivamente. Compuesto 6 de la Tabla 1 El compuesto 6 se preparó por reacción del cloruro de benzoílo IV, en el que R3 es Cl, R4 es NH2 y R5 es CHNOCH3 , con el derivado de α-amino-α’-clorocetona V, en el que R1 es metilo y R2 es etilo, tal y como se ilustra en el Esquema A: Esquema A

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El cloruro de benzoílo de partida usado para preparar el compuesto 6 se preparó como se indica a continuación en el esquema B

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ES 2 203 889 T3 Esquema B

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El compuesto V se preparó tratando la amina acetilénica (VII) con anhídrido trifluoroacético en presencia de un disolvente como por ejemplo cloruro de metileno, cloroformo, etiléter o agua y una base como por ejemplo trietilamina, carbonato sódico, bicarbonato sódico o hidróxido sódico dando la amida acetilénica VIII: 25

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El tratamiento de la amida acetilénica VIII con cloro o una fuente de cloro a una temperatura de -78ºC a 0ºC en presencia de un disolvente como por ejemplo cloruro de metileno o cloroformo proporcionó la oxazolina intermedia (IX). La oxazolina IX se hidrolizó fácilmente en condiciones ácidas usando un ácido como por ejemplo ácido clorhídrico o ácido sulfúrico con un disolvente como por ejemplo metanol o tetrahidrofurano a una temperatura de 40ºC a 60ºC, dando la α-amino-α’,α’-diclorocetona (X).

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50

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La deshalogenación catalítica selectiva de X dio el derivado α-amino-α’-clorocetona V respectivo: 60

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a) Preparación de 3-metil-4-nitrobenzoato de metilo 15

En un matraz de 5 litros de tres bocas y fondo redondo equipado con un condensador de reflujo, agitador superior y entrada de gas, se pusieron 300 g de ácido 3-metil-4-nitrobenzoico y 3 l de metanol. A la disolución bien agitada resultante se burbujearon 20,8 g de cloruro de hidrógeno y la mezcla resultante se sometió a reflujo durante 3 horas. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se dejó reposar durante toda la noche. El 3-metil-4nitrobenzoato de metilo esperado precipitó en forma de cristales amarillo claro, que se recogieron mediante filtración por succión dando, después del secado, 259,3 g. Este sólido se usó como tal en la siguiente etapa.

20

b) Preparación de 3-bromometil-4-nitrobenzoato de metilo

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En un matraz de 5 litros de tres bocas y fondo redondo equipado con un condensador de reflujo, agitador superior, embudo de adición y entrada de gas nitrógeno, se pusieron 220 g de 3-metil-4-nitrobenzoato de metilo, 2 l de tetracloruro de carbono anhidro y 4 g de peróxido de benzoílo. A la disolución resultante, irradiada con 275 vatios de luz UV, se añadieron 198 g de bromo, gota a gota, durante un periodo de 2 horas a reflujo. Después de que finalizara la adición, la mezcla de reacción se sometió a reflujo durante 60 horas más. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente. El sólido formado se separó mediante filtración por succión. Este sólido (159,1 g) estaba constituido por el 3-bromometil-4-nitrobenzoato de metilo esperado con cantidades minoritarias del material de partida. Las aguas madres junto con otros 220 g de 3-metil-4-nitrobenzoato de metilo y 4 g de peróxido de benzoílo se devolvieron al matraz y se trataron con 198 g de bromo, tal y como se ha descrito anteriormente. Después de que finalizara la adición, la mezcla de reacción se sometió a reflujo durante 96 horas más, se enfrió a temperatura ambiente y el sólido resultante se separó por filtración dando otros 252 g de 3-bromometil-4-nitrobenzoato de metilo. Los sólidos se combinaron dando un total de 411,1 g de 3-bromometil-4-nitrobenzoato de metilo con cantidades minoritarias de 3-metil-4-nitrobenzoato de metilo y 3-dibromometil-4-nitrobenzoato de metilo de partida. Este sólido se usó tal cual en la siguiente etapa. c) Preparación de 3-acetoximetil-4-nitrobenzoato de metilo

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En un matraz de 5 litros de tres bocas y fondo redondo equipado con un condensador de reflujo, agitador superior y entrada de gas nitrógeno, se pusieron 411 g del 3-bromometil-4-nitrobenzoato de metilo preparado anteriormente, 441 g de acetato de potasio anhidro y 2 l de ácido acético glacial. La mezcla resultante se sometió a reflujo durante 4 horas, se enfrió a temperatura ambiente y se agitó durante toda la noche. El disolvente se eliminó en un rotavapor y el sólido amarillo claro resultante se trató con una mezcla de 2 l de acetato de etilo y 1 l de agua. La fase orgánica se separó, se lavó con agua (3 x 400 ml), salmuera (1 x 400 ml), se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y el disolvente se eliminó usando un rotavapor. La mezcla de reacción bruta se trituró con hexano y se filtró dando 318 g del 3-acetoximetil-4nitrobenzoato de metilo esperado. Este compuesto se usó tal cual en la siguiente etapa. d) Preparación de 3-hidroximetil-4-nitrobenzoato de metilo

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En un matraz de 5 litros de tres bocas y fondo redondo equipado con un condensador de reflujo, agitador superior y entrada de gas nitrógeno, se pusieron 318 g del 3-acetoximetil-4-nitrobenzoato de metilo preparado anteriormente y 3,2 l de metanol anhidro. A la disolución resultante se burbujearon 40 g de cloruro de hidrógeno y la mezcla resultante se sometió a reflujo durante 3 horas. Después de enfriar hasta temperatura ambiente el disolvente se eliminó usando un rotavapor dando 273 g de 3-hidroximetil-4-nitrobenzoato de metilo como un sólido amarillo que contenía trazas de metanol, que se usó tal cual en la siguiente etapa. e) Preparación de 3-formil-4-nitrobenzoato de metilo

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En un matraz de 5 litros de cuatro bocas de fondo redondo se enfriaron 1,5 l de cloruro de metileno hasta -78ºC. Se añadió lentamente cloruro de oxalilo (164 g, 1,29 moles), seguidos de la adición, gota a gota, de 202 g (2,59 moles) de dimetilfulfóxido seco en 125 ml de cloruro de metileno, manteniendo la temperatura por debajo de -70ºC. Después de que finalizara la adición, la mezcla de reacción se agitó a -78ºC durante 30 minutos y se añadieron, gota a gota, 273 g (1,29 moles) del 3-hidroximetil-4-nitrobenzoato de metilo preparado anteriormente disuelto en 250 ml de cloruro de metileno. La mezcla de reacción se agitó 30 minutos más. Se añadió trietilamina (392 g, 3,88 moles) en 125 ml de cloruro de metileno, gota a gota, manteniendo la temperatura por debajo de -65ºC. La mezcla de reacción se calentó lentamente hasta temperatura ambiente y se agitó durante toda la noche. El disolvente se eliminó usando un rotavapor y el sólido resultante se trató con una mezcla de 2 l de acetato de etilo y 1 l de agua. La fase orgánica se separó, se 12

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filtró a través de tierras de diatomeas, y se lavó, secuencialmente, con ácido clorhídrico acuoso diluido (2 x 250 ml), agua (2 x 250 ml), bicarbonato sódico acuoso saturado (2 x 250 ml), agua (2 x 200 ml), salmuera (1 x 200 ml) y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. El disolvente se eliminó usando un rotavapor. La mezcla de reacción bruta se trituró con hexano y se filtró, dando 234,1 g de 3-formil-4-nitrobenzoato de metilo esperado como un sólido amarillo. Este compuesto se usó tal cual en la siguiente etapa. f) Preparación de 3-metoxiiminometil-4-nitrobenzoato de metilo

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A una mezcla bien agitada de 195 g de 3-formil-4-nitrobenzoato de metilo, 1 l de cloruro de metileno y 370 ml de agua se añadió, secuencialmente, 77,6 g de clorohidrato de metoxilamina, 76,2 g de acetato sódico y 6,8 g de hidrogenosulfato de tetra-n-butilamonio. La mezcla resultante se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente, después se diluyó con 2 l de etiléter. La fase orgánica se separó y se lavó, secuencialmente, con agua (1 x 500 ml), ácido clorhídrico acuoso al 2% (2 x 500 ml), agua (2 x 250 ml) y salmuera (1 x 250 ml); después se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. El disolvente se eliminó usando un rotavapor, dando 218,6 g del 3-metoxiiminometil-4nitrobenzoato de metilo esperado como un aceite rojizo que solidificó durante el reposo, y que se usó tal cual en la siguiente etapa. g) Preparación de 4-amino-3-metoxiiminometilbenzoato de metilo

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En un matraz de 5 litros de tres bocas y fondo redondo se pusieron 0,9 l de ácido acético acuoso al 5% y 157 g (2,8 moles) de hierro. A la mezcla bien agitada resultante se añadieron 166,6 g (0,7 moles) del 3-metoxiiminometil4-nitrobenzoato de metilo preparado anteriormente disuelto en 0,9 l de acetato de etilo seguido de la adición gota a gota de 0,9 l de ácido acético, manteniendo la temperatura por debajo de 35ºC. La mezcla resultante se agitó a 35ºC durante 30 minutos y se filtró a través de tierra de diatomeas. El filtrado se vertió en 5 l de agua. La fase acuosa se separó y se lavó con etiléter (2 x 500 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron, secuencialmente, con agua (4 x 500 ml), bicarbonato sódico acuoso saturado (2 x 500 ml), agua (2 x 500 ml) y salmuera (1 x 400 ml). La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y el disolvente se eliminó usando un rotavapor dando 130 g del 4amino-3-metoxiiminometilbenzoato de metilo esperado. h) Preparación de 4-amino-3-cloro-5-metoxiiminometilbenzoato de metilo En un matraz de 2 litros de tres bocas y fondo redondo se pusieron 106 g (0,51 moles) del 4-amino-3-metoxiiminometilbenzoato de metilo preparado anteriormente y 500 ml de acetonitrilo. La mezcla resultante se calentó a 70ºC y se añadieron 75,2 g (0,56 moles) de N-clorosuccinimida en las porciones adecuadas, manteniendo la temperatura por debajo de 80ºC. Después de que finalizara la adición, la mezcla de reacción se sometió a reflujo durante 1 hora. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y el disolvente se eliminó en un rotavapor. El producto bruto se disolvió en 5 l de acetato de etilo. La disolución orgánica se lavó con agua (3 x 500 ml) y después con salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio. La mezcla de reacción se concentró en un rotavapor hasta dar una pasta; se trituró con hexano y se filtró dando el 4-amino-3-cloro-5-metoxiiminometilbenzoato de metilo esperado como un sólido amarillo. Esta reacción se repitió usando las mismas cantidades dando un total de 210,5 g de 4-amino-3-cloro5-metoxiiminometilbenzoato de metilo, que se usó tal cual en la siguiente etapa. i) Preparación de ácido 4-amino-3-cloro-5-metoxiiminometilbenzoico

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En un matraz de 5 litros de tres bocas y fondo redondo se pusieron 210 g (0,86 moles) del 4-amino-3-cloro-5metoxiiminometilbenzoato de metilo preparado anteriormente, 1,7 l de metanol y 462 g (1,73 moles) de hidróxido sódico acuoso al 15%. La mezcla resultante se sometió a reflujo durante 3 horas, después de las cuales la mezcla de reacción se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró usando un rotavapor. La mezcla de reacción bruta se disolvió en 2 l de agua. La disolución acuosa resultante se lavó una vez con 500 ml de acetato de etilo, se enfrió en un baño de hielo y se acidificó hasta pH 2 con ácido clorhídrico concentrado. El ácido 4-amino-3-cloro-5-metoxiiminometilbenzoico esperado precipitado como un sólido amarillo claro se separó mediante filtración por succión. La torta de filtrado se lavó con una mezcla 1:2 de etiléter y hexano dando, después del secado, 185,2 g (rendimiento del 94%).

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j) Preparación de cloruro de 4-amino-3-cloro-5-metoxiiminometilbenzoílo

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En un matraz de 5 litros de tres bocas y fondo redondo se pusieron 180 g del ácido 4-amino-3-cloro-5-metoxiiminometilbenzoico preparado anteriormente, 2 l de tolueno, 3 ml de dimetilformamida y 104 g (64 ml) de cloruro de tionilo. La mezcla resultante se calentó a 70ºC durante 2 horas, se filtró mientras estaba caliente y el disolvente se eliminó usando un rotavapor dando 178,1 g del cloruro de 4-amino-3-cloro-5-metoxiiminometilbenzoilo esperado. k) Preparación de clorhidrato de 3-amino-1-cloro-3-metil-2-pentanona (Compuesto V, en el que R1 es metilo y R2 es etilo)

65

i) Preparación de N-[3-(3-metil-1-pentinil)]trifluoroacetamida En un matraz de 3 litros, de cuatro bocas y fondo redondo dotado con un agitador magnético, entrada de nitrógeno y termómetro, se pusieron 234 gramos (g) (1,75 moles) de clorhidrato de 3-amino-3-metil-1-pentino y 1.000 ml de 13

ES 2 203 889 T3

5

10

cloruro de metileno. A la mezcla bien agitada resultante se añadieron lentamente 354 g (3, 51 moles) de trietilamina (TEA) gota a gota, manteniendo la temperatura por debajo de 30ºC. Después de que finalizara la adición, la mezcla de reacción se agitó 120 minutos seguida de la adición, gota a gota de 334,5 g (1,59 moles) de anhídrido trifluoroacético disuelto en 500 ml de cloruro de metileno a la velocidad adecuada para mantener la temperatura de la reacción a 0ºC. Después de que finalizara la adición, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche y se concentró a vacío. La pasta resultante se lavó con etiléter. La fase de etiléter se lavó, secuencialmente, con agua, bicarbonato sódico acuoso saturado y salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se trató con carbón vegetal activado y se filtró a través del agente de filtrado Celita ® (disponible en Aldrich Chemical Company, St. Louis, MO). El disolvente se eliminó a presión reducida. El producto bruto resultante se trató con pentano frío, se filtró y se secó, dando 255,5 g (83%) del N-[3-(3-metil-1-pentinil)]trifluoroacetamida esperado como un sólido blanco. ii) Preparación de clorhidrato de 5-cloro-5-(diclorometil)-4-etil-4-metil-2-trifluorometiloxazolina

15

En un matraz de 5 litros, de cuatro bocas y fondo redondo equipado con agitador mecánico, termómetro y una entrada de gas, se disolvieron 255,5 g (1,32 moles) de N-[3-(3-metil-1-pentinil)]trifluoroacetamida en 4.000 ml de cloruro de metileno. La mezcla resultante se enfrió a -30ºC y se burbujearon 235 g de cloro en su interior durante un periodo de 2 horas. Cuando finalizó la adición, la mezcla de reacción se agitó a -30ºC durante 30 minutos y se calentó hasta temperatura ambiente. La mezcla de reacción bruta se evaporó en el rotavapor dando el clorhidrato de 5-cloro5-(diclorometil)-4-etil-4-metil-2-trifluorometiloxazolina esperado, que se usó tal cual en la siguiente etapa.

20

iii) Preparación de clorhidrato de 3-amino-1,1-dicloro-3-metil-2-pentanona

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30

35

Se disolvió el clorhidrato de 5-cloro-5-(diclorometil)-4-etil-4-metil-2-trifluorometiloxazolina preparado en la etapa anterior en 1800 ml de metanol, 72 ml de agua y 190 ml de ácido clorhídrico concentrado, se calentó a 50ºC y se agitó a esta temperatura durante toda la noche. La mezcla de reacción bruta se enfrió y se vertió en una mezcla hielo/agua/etiléter. Se separaron las fases y la fase de éter se extrajo una vez con agua. El éter se reservó (extracto orgánico I). Las fases acuosas combinadas se lavaron una vez con etiléter y la fase orgánica se combinó con el extracto orgánico I (extracto orgánico II). La fase acuosa se neutralizó con bicarbonato sódico acuoso saturado y se extrajo dos veces con etiléter. Las fases de éter combinadas se lavaron con agua, salmuera, se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro, se trataron con carbono activado y se filtraron a través de un agente de filtrado Celita®. A la disolución incolora resultante se burbujeó cloruro de hidrógeno anhidro manteniendo la temperatura por debajo de 20ºC. El sólido blanco resultante se filtró y se secó dando 124,8 g del clorhidrato de 3-amino-1,1-dicloro-3-metil-2-pentanona esperado como un sólido blanco. El filtrado de etiléter se combinó con el extracto orgánico II y se concentró a vacío; el residuo resultante (150 g) se introdujo en una mezcla de metanol/agua/ácido clorhídrico concentrado y se calentó a 50ºC durante el fin de semana. El tratamiento descrito anteriormente dio otros 51 g de clorhidrato de 3-amino-1,1dicloro-3-metil-2-pentanona. La cantidad total obtenida fue de 175,8 g (rendimiento del 61%). (iv) Preparación de clorhidrato de 3-amino-1-cloro-3-metil-2-pentanona

40

45

En una botella ParrTM de 2 litros se pusieron 41 g de clorhidrato de 3-amino-1,1-dicloro-3-metil-2-pentanona, 0,8 g de paladio al 10% sobre carbono y 400 ml de etanol. La mezcla resultante se agitó en un aparato ParrTM a 344,75 kPa (50 psi) durante 3 horas. La mezcla de reacción bruta se filtró a través de un agente de filtrado Celita® y se evaporó a vacío dando un aceite viscoso, que se introdujo en 300 a 400 ml de acetato de etilo y se agitó a temperatura ambiente durante varias horas. El clorhidrato de 3-amino-1-cloro-3-metil-2-pentanona esperado cristalizó como un sólido blanco: se añadieron 300 ml de hexano a la suspensión resultante y se filtraron dando 34 g (98%) del clorhidrato de 3-amino-1-cloro-3-metil-2-pentanona esperado. La reacción se repitió comenzando con 41 g; 41 g y 51 g de clorhidrato de 3-amino-1,1-dicloro-3-metil-2-pentanona dando un total de 132,1 g (rendimiento global del 90%) de clorhidrato de 3-amino-1-cloro-3-metil-2-pentanona.

50

l) Preparación de 4-amino-3-cloro-5-metoxiiminometil-N-(3-cloro-1-etil-1-metil-2-oxopropil)benzamida (compuesto 6) 55

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65

En un matraz de 5 litros de tres bocas y fondo redondo se pusieron 93 g de clorhidrato de 3-amino-1-cloro-3-metil2-pentanona y 885 ml de agua. A la disolución resultante se añadieron 138,6 g de bicarbonato sódico seguidos de 500 ml de acetato de etilo. A la mezcla bien agitada resultante se añadieron 123,5 g de cloruro de 4-amino-3-cloro5-metoxiiminoetilbenzoilo disuelto en 1000 ml de acetato de etilo a temperatura ambiente durante un periodo de 50 minutos. Después de que finalizara la adición, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se separaron las dos fases y la fase orgánica se lavó con agua (2 x 500 ml), salmuera (1 x 500 ml), se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y el disolvente se eliminó en un rotavapor dando el producto bruto como un aceite marrón. Este aceite se hizo pasar a través de una pequeña columna de gel de sílice usando cloruro de metileno como disolvente de elución. La evaporación del disolvente dio 133,3 g de la 4-amino-3-cloro-5-metoxiiminometil-N-(3-cloro-1-etil-1metil-2-oxopropil)benzamida espera como un sólido blanquecino (pf 140-141ºC). Compuesto 15 de la Tabla 2 El compuesto 15 de la Tabla 2 se preparó según los procedimientos de síntesis descritos en la patente de los Estados Unidos 4.863.940. 14

ES 2 203 889 T3 Compuesto 16 de la Tabla 3

5

10

El compuesto 16 se preparó por reacción del derivado aromático (IV) correspondiente, en el que R3 es cloro y R4 y R5 forman, conjuntamente, un anillo condensado, con clorhidrato de 3-amino-1-cloro-3-metil-2-pentanona (compuesto V en el que R1 es metilo y R2 es etilo) tal y como se ha ilustrado anteriormente en el Esquema A: Para preparar la parte aromática del compuesto 16, se preparó el derivado 6-carboxibenzoxazol XI a partir del derivado 2-aminofenol correspondiente mediante procedimientos conocidos en la técnica y descritos en, por ejemplo, E.C. Taylor, ed., The Chemistry of Heterocyclic Compounds, vol. 47, John Wiley & Sons, 1987 “Synthesis of Fused Heterocycles”, editado por G.P. Ellis; p. 50, parte I y pp. 713-714, parte II). Este procedimiento se explica a continuación:

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Para preparar el compuesto 16, se preparó 6-carboxi-4-cloro-1,3-benzoxazol a partir de ácido 4-amino-5-cloro3-hidroxibenzoico por tratamiento con trimetilortoformiato. El 6-carboxi-4-cloro-1,3-benzoxazol se trató, en primer lugar, con cloruro de tionilo dando el cloruro de ácido. El cloruro de ácido se trató con clorhidrato de 3-amino-1-cloro3-metil-2-pentanona en presencia de trietilamina dando el compuesto 16. Se proporcionan los siguientes ejemplos para ilustrar la presente invención.

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Ejemplo 1 Ensayo contra el flagelado intestinal Giardia lamblia

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Se ensayó la actividad de inhibición de crecimiento de los compuestos in vitro contra G. lamblia usando los procedimientos descritos en Katiyar, S.K. y Edlind, T.D., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, vol. 35, pp. 2198-2202 (1991). Los valores de CE50 para los compuestos de ensayo se expresaron en partes por millón (ppm), se calcularon a partir de curvas de respuesta a dosis y se presentaron en la Tabla 4. Tal y como se usa en la presente memoria descriptiva, la terminología “CE50” significa la concentración del compuesto de ensayo necesaria para inhibir el crecimiento en un 50% si se compara con una muestra de control que no tenía el compuesto de ensayo. Se incluyó metronidazol como patrón en los ensayos con propósitos de comparación. TABLA 4 Actividad de inhibición del crecimiento frente a Giardia lamblia

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Compuesto

CE50 (ppm) Giardia lamblia

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15

0,06 0,03 0,06 0,3 0,02 0,009 0,05 0,2 0,03 0,06 0,2

15

ES 2 203 889 T3 (Continuación)

5

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Compuesto

CE50 (ppm) Giardia lamblia

16 Metronidazol

2,0 0,7

Ejemplo 2 Ensayo contra el flagelado Leishmania major que habita en sangre o en tejido

15

Se ensayó la actividad de inhibición de crecimiento de los compuestos in vitro contra promastigotes de L. major usando los procedimientos en Katiyar, S.K. y Edlind, T.D., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, vol. 35, pp. 2198-2202 (1991). Los valores de CE50 para los compuestos de ensayo se calcularon a partir de curvas de respuesta a dosis y se presentaron en la Tabla 5. TABLA 5

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Actividad de inhibición del crecimiento frente a Leishmania major

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35

Compuesto

CE50 (ppm) Leishmania major

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15 16

0,2 0,3 0,2 0,2 0,06 0,6 0,6 0,7 0,1 0,2 0,7 7

40

Ejemplo 3 Ensayo contra la ameba intestinal Entanoeba histolytica 45

Se ensayó la actividad de inhibición de crecimiento de los compuestos in vitro contra E. hystolitica usando los procedimientos en Katiyar, S.K. y Edlind, T.D., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, vol. 35, pp. 2198-2202 (1991). Los valores de CE50 para los compuestos de ensayo se calcularon a partir de curvas de respuesta a dosis y se presentaron en la Tabla 6. Se incluyó metronidazol como patrón en los ensayos con propósitos de comparación.

50

TABLA 6 Actividad de inhibición del crecimiento frente a Entanoeba histolytica

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Compuesto

CE50 (ppm) Entanoeba histolytica

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1 2 3 10 15 Metronidazol

38 12 16 6 20 0,5

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16

ES 2 203 889 T3 Ejemplo 4 Ensayo contra el ciliado Tetrahymena pyriformis y el apicomplejo Toxoplasma gondii y Cryptosporidium parvum 5

10

15

Se ensayó la actividad de inhibición de crecimiento de los compuestos in vitro contra el ciliado Tetrahymena pyriformis, que se usó como organismo indicador para el Apicomplejo, ya que según diversos criterios, ciliados y Apicomplejos están muy relacionados (Edlind T.D. et al., Mol. Phylogenet. Evol. Vol. 5, pp. 359-367, 1996). Se desarrolló T. pyriformis (cepa ATCC 30005) en 1 ml de medio ATCC 357 a 25ºC en tubos de 4 ml de cultivo polialómero, sin agitación. Los compuestos se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) y se añadieron a los cultivos (que contenían 3.000 células/ml) de manera que la concentración final de DMSO era de 0,1-0,3%. Después de 24 horas, se determinó el número de células con un hemocitómetro, y se estimaron los valores de CE50 a partir de las curvas de dosis-respuesta. Los resultados se presentan en la Tabla 7. Para comparar, se hizo el ensayo con las dinitroanilinas trifluralina, pendimetalina y orizalina, que tienen actividad in vitro contra el Apicomplejo Toxoplasma gondii (Stokkermans et al., Exp. Parasitol. vol. 84, pp. 355-370, 1996) y Cryptosporidiumm parvum (Arrowood et al., FEMS Microbiol. Lett., vol. 136, pp. 245-249, 1996) TABLA 7 Actividad de inhibición del crecimiento frente a Tetrahymena pyriformis

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Compuesto

CE50 (ppm) Tetrahymena pyriformis

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15 16 orizalina pendimetalina trifluralina

0,02 < 0,01 < 0,01 0,1 0,003 0,02 0,07 0,07 0,004 0,004 < 0,01 0,6 0,4 2 >6

Las altas actividades de los compuestos de ensayo contra T. Pyriformis (Tabla 7) animaron al ensayo de los compuestos de ensayo seleccionados contra Toxoplasma gondii y Cryptosporidium parvum. Se ensayó la actividad de inhibición de crecimiento de los compuestos in vitro contra la replicación de Toxoplasma gondii en células huésped L929 (L929-ATCC CCL 1, tejido conectivo de ratón) o HFF (fibroblastos de prepucio humano) usando la técnica de incorporación de [3 H]-uracilo de la siguiente manera. Las células huésped se desarrollaron en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano a 37ºC en una atmósfera con un 5% de dióxido de carbono en un medio de Eagle modificado que contenía penicilina, estreptomicina y un 10% de suero equino fetal. Los pocillos que contenían una monocapa confluyente homogénea de células huésped se infectaron con taquizoitos de T. Gondii en una proporción de 3 parásitos por célula (aproximadamente 6 x 104 taquizoitos por pocillo que contiene 100 µl de medio). Las disoluciones de los compuestos de ensayo se prepararon en DMSO y se diluyeron en el medio de desarrollo dando una serie de concentraciones de manera que la concentración final de DMSO fue menor del 1%. Dos horas después de la infección, los cultivos se lavaron para eliminar los parásitos libres y se añadieron las diversas diluciones de los compuestos de ensayo. Posteriormente, las células se recogieron a las 24, 48 y 72 horas. Cuatro horas antes de cada recolección, se añadieron 50 µl de [3 H]-uracilo (1 µCi). Las células se recogieron usando un recolector celular y la radiactividad incorporada se midió usando un contador de centelleo. Se determinó la citotoxicidad de los compuestos de ensayo hacia las células huésped usando el kit de titulación celular 96™ (Promega Corporation, Madison, WI) de la siguiente manera. Las células se sembraron a una concentración de 5 x 103 células por pocillo que contenían 100 µl del medio en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano, y se incubaron a 37ºC en una atmósfera con un 5% de dióxido de carbono durante 4 horas. Después se añadieron las disoluciones de los compuestos de ensayo, preparadas como se ha descrito anteriormente y la incubación continuó durante 24, 48 ó 72 horas. Cuatro horas antes de cada uno de estos tiempos, se sustituyó el medio de desarrollo que contenía el compuesto de ensayo por 100 µl de medio fresco seguido de la adición de 16 µl de la disolución del kit de tinción. Después de la incubación a 37ºC durante otras 4 horas, se añadieron a cada pocillo 100 µl de la disolución del 17

ES 2 203 889 T3

5

kit de solubilización/detención. El contenido de los pocillos se mezcló y las placas se mantuvieron 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se leyeron entonces espectrofotométricamente en un lector de placas a una longitud de onda de 570 nm. En las Tablas 8 y 9 se presentan los efectos de los compuestos de ensayo sobre el desarrollo de T. gondii y sobre del desarrollo de las células huésped (valores entre paréntesis), expresando el alcance del desarrollo en presencia del compuesto de ensayo como porcentaje de los de control sin el compuesto de ensayo. Se incluyó atovacuona en el ensayo como patrón. Los compuestos de ensayo mostraron una mayor actividad inhibidora del desarrollo hacia T. gondii que hacia las células huésped. TABLA 8

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Actividad de inhibición del crecimiento frente a T. gondii en células huésped L929

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ES 2 203 889 T3 TABLA 9 Actividad de inhibición del crecimiento frente a T. gondii en células huésped HFF 5

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Se ensayó la actividad de inhibición de crecimiento de los compuestos in vitro contra el desarrollo de C. parvum en células huésped MDBKF5D2 y la toxicidad hacia las células huésped, de la siguiente manera. Se prepararon disoluciones de los compuestos de ensayo en DMSO a 50, 5, 0,5 y 0,05 mM y se diluyeron en un medio de Eagle modificado según Dulbecco dando concentraciones de 100, 10, 1 y 0,1 µM y una concentración de DMSO del 0,2%. Para el ensayo de toxicidad hacia las células huésped, los medios que contenían el compuesto de ensayo (200 µl) se introdujeron en dos pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos que contenía monocapas confluentes de células MDBKF5D2 y dos pocillos sin monocapas y se incubaron a 37ºC en una atmósfera con un 8% de dióxido de carbono. Después de 48 horas se añadieron la sal de tetrazolio MTS (disolución de Owen) y metosulfato de fenazina a cada pocillo a concentraciones de 333 µg/ml y 25 µM, respectivamente. Se volvió a introducir la placa en la incubadora en la oscuridad para que se desarrollara durante 2 horas, entonces se transfirieron 100 µl de cada sobrenadante a una nueva placa de microtitulación y se leyó espectrofotométricamente en un lector de placas a una longitud de onda de 490 nm. Se calculó el porcentaje de toxicidad restando la densidad óptica media (DO) de los sobrenadantes del fármaco de la DO de los sobrenadantes del medio de control (sin fármaco), dividiendo por la DO del medio de control y multiplicando por 100. Para ensayar la actividad de inhibición de crecimiento frente a C. parvum, se incubaron 3 x 104 oocitos por pocillo en las concentraciones mencionadas anteriormente de cada fármaco a 37ºC (8% CO2 ) en monocapas celulares confluyentes de MDBKF5D2 en placas de microtitulación de 96 pocillos. Después de 48 horas, se determinó el nivel de infección en cada pocillo mediante un ensayo de inmunofluorescencia. El porcentaje de inhibición del desarrollo se calculó restando el conteo de parásitos medio en los pocillos que contenían el compuesto de ensayo del conteo de parásitos medio en los pocillos con el medio de control (sin el compuesto de ensayo), dividiendo por el conteo de parásitos medio en los pocillos con el medio de control y multiplicando por 100. En la Tabla 10 se presentan los efectos de los compuestos de ensayo sobre el desarrollo de C. parvum y su toxicidad hacia las células huésped. Se incluyó paromomicina en el ensayo, como patrón. 19

ES 2 203 889 T3 TABLA 10 Actividad de inhibición del crecimiento frente a Cryptosporidum parvum 5

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Ejemplo 5 Ensayo contra el microsporidiano Encephalitozoon (septata) intestinalis 65

Se ensayó la actividad de inhibición de crecimiento de los compuestos 2, 10 y 15 in vitro contra E. Intestinalis, desarrollado en células de riñón de mono verde africano (células Vero). Las células Vero se desarrollaron en matraces de cultivo de 25 cm2 a 37ºC en una incubadora humidificada con un 5% de dióxido de carbono. Los cultivos se 20

ES 2 203 889 T3

5

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mantuvieron en un medio esencial mínimo (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland, EE.UU.), complementado con Lglutamina, sales de Earle, un 5% de suero fetal de ternero inactivado térmicamente (Hyclone Labs. Inc., EE.UU.), fungizona (2 µg/ml, Gibco BRL) y gentamicina (50 µg/ml, Gibco BRL). Se recogieron esporas de E. Intestinalis del sobrenadante de un cultivo de células Vero infectado y se usaron para infectar células normales para producir una preparación reciente de esporas para los ensayos de inhibición del desarrollo. Los ensayos de inhibición del desarrollo se llevaron a cabo en placas de cultivo de 24 pocillos. Se puso 1 ml de células Vero (5 x 104 células por ml) en cada pocillo, y las células se incubaron durante 12-15 horas a 37ºC. Después, se eliminó el medio sobrenadante y se sustituyó con 1 ml del medio que contenía 1,5-2,0 x 104 esporas de E. Intestinalis por ml junto con 1 µl del compuesto de ensayo disuelto en dimetilsulfóxido (DMSO) o DMSO en solitario para los tratamientos de control sin el compuesto de ensayo. Las placas se incubaron a 37ºC y el medio se cambió cada 72 horas junto con compuesto de ensayo recién preparado en DMSO o DMSO en solitario (controles). Después de 2 semanas, el sobrenadante se transfirió de cada pocillo a un tubo de microcentrifugación, después se concentró por centrifugación, resuspendiendo los gránulos de esporas de E. intestinalis resultantes en 300-500 µl de medio recién preparado. Entonces se determinó el número de esporas en cada muestra, contando en un hemocitómetro. Los resultados de la Tabla 11 muestran los efectos de los compuestos de ensayo sobre el número de esporas y se expresan como porcentaje del número de esporas en el tratamiento de control sin compuesto de ensayo. TABLA 11

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Actividad de inhibición del crecimiento de los compuestos frente a E. intestinalis Tratamiento

Concentración (µg/ml)*

Desarrollo (% de control)

Control Compuesto 2 Compuesto 10 Compuesto 15

0,1 1,0 0,1

100 29 20 13

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Los compuestos de ensayo no mostraron citotoxicidad hacia las células Vero a estas concentraciones. 35

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ES 2 203 889 T3 REIVINDICACIONES 1. Uso de un compuesto de fórmula 5

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en la que 15

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A se selecciona entre fenilo, piridilo, furilo, tienilo, isoxazolilo, oxazolilo, pirrolilo, isotiazolilo, tiazolilo, pirazolilo, imidazolilo, pirimidinilo, quinolilo, isoquinolilo, naftilo, piridazinilo, pirazinilo, benzotienilo, indolilo, benzofuranilo, bencilo, cicloalquilo (C3 -C7 ), alquilo (C1 -C6 ), haloalquilo (C1 -C6 ), alquenilo (C2 -C6 ), haloalquenilo (C2 -C6 ), alquinilo (C2 -C6 ) y haloalquinilo (C2 -C6 ) sustituidos e insustituidos, seleccionándose los sustituyentes, independientemente, entre: a) de uno a cuatro halo, ciano, alquilo (C1 -C6 ), haloalquilo (C1 -C6 ), alquenilo (C2 -C6 ), haloalquenilo (C2 -C6 ), alquinilo (C2 -C6 ), haloalquinilo (C2 -C6 ), alcoxi (C1 -C6 ), haloalcoxi (C1 -C6 ), alquiltio (C1 -C6 ), haloalquiltio (C1 C6 ), nitro, -NR6 R7 , -CR8 =NOR9 , NHCOOR10 , -CONR11 R12 , -COOR13 ;

25

b) anillos condensados de cinco, seis y siete miembros formados a partir de dos de dichos sustituyentes, y c) un anillo carbocíclico condensado de 5, 6 ó 7 miembros que puede contener hasta dos heteroátomos seleccionados del grupo constituido por: O, S, N y P;

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35

R1 y R2 se seleccionan, cada uno independientemente, entre H, alquilo (C1 -C6 ), haloalquilo (C1 -C6 ), alquenilo (C2 C6 ), haloalquenilo (C2 -C6 ), alquinilo (C2 -C6 ) o haloalquinilo (C2 -C6 ), con tal que al menos uno de R1 y R2 sea distinto de H; R6 y R7 se seleccionan, cada uno independientemente, entre H, alquilo (C1 -C6 ), y alquil (C1 -C6 )carbonilo; R8 se selecciona entre H, alquilo (C1 -C6 ), alquenilo (C2 -C6 ), alquinilo (C2 -C6 ); R9 se selecciona entre H, alquilo (C1 -C6 ), alquenilo (C2 -C6 ), alquinilo (C2 -C6 ) y alquil (C1 -C4 )carbonilo;

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R10 , R11 , R12 y R13 se seleccionan, cada uno independientemente, entre H, alquilo (C1 -C6 ), alquenilo (C2 -C6 ) y alquinilo (C2 -C6 ); y X, Y y Z se seleccionan, cada uno independientemente, entre H, halo, ciano, tiociano, isotiociano y alquil (C1 -C6 )sulfoniloxi, con tal que al menos un X, Y y Z sea halo, ciano, tiociano, isotiociano o alquil (C1 -C6 ) sulfoniloxi; enantiómeros y estereoisómeros de los mismos; y las sales de adición de ácido fisiológicamente aceptables de los mismos en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infecciones protozoarias.

50

2. El uso de la reivindicación 1 en el que el compuesto es de fórmula

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en la que 65

R1 y R2 se seleccionan, cada uno independientemente, entre H, alquilo (C1 -C6 ), haloalquilo (C1 -C6 ), alquenilo (C2 C6 ) y alquinilo (C2 -C6 ), con tal que al menos uno de R1 y R2 sea distinto de H; R3 , R4 y R5 se seleccionan, cada uno independientemente, del grupo constituido por H, halo, ciano, alquilo 22

ES 2 203 889 T3 (C1 -C6 ), haloalquilo (C1 -C6 ), alquenilo (C2 -C6 ), alquinilo (C2 -C6 ), alcoxi (C1 -C6 ), alquiltio (C1 -C6 ), haloalcoxi (C1 C6 ), nitro, -NR6 R7 , -CR8 =NOR9 , NHCOOR10 , -CONR11 R12 y -COOR13 , y un anillo carbocíclico condensado de 5,6 ó 7 miembros que puede contener hasta dos heteroátomos seleccionados del grupo constituido por: O, S, N y P; 5

R6 , R7 , R8 , R9 , R10 , R11 , R12 y R13 se seleccionan, cada uno independientemente, entre H y alquilo (C1 -C6 ); y X e Y se seleccionan, cada uno independientemente, entre H, halo, ciano, tiociano, isotiociano y alquil (C1 -C6 ) sulfoniloxi, con tal que al menos uno de X e Y sea distinto de H.

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3. El uso de la reivindicación 2 en el que X es cloro; Y es H; R1 es metilo; R2 se selecciona entre metilo y etilo; R3 y R5 se seleccionan, cada uno independientemente, entre H, halo, metilo, nitro, ciano, amino, -CH=NOCH3 y NHCOOCH3 ; y R4 se selecciona entre H, halo, amino, ciano, -CH=NOCH3 , -NHCOOCH3 , COOCH3 y alquilo (C1 C4 ).

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4. El uso de la reivindicación 3 en el que X es cloro; Y es H; R1 es metilo; R2 es etilo, R3 y R5 se seleccionan, cada uno independientemente, entre halo, metilo, ciano y -CH=NOCH3 ; y R4 se selecciona entre H, amino, metilo y -CH=NOCH3 . 5. El uso de la reivindicación 1 en el que el compuesto es de fórmula

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en la que R1 y R2 se seleccionan independientemente entre H, alquilo (C1 -C6 ), haloalquilo (C1 -C6 ), alquenilo (C2 -C6 ) y alquinilo (C2 -C6 ), con tal que al menos uno de R1 y R2 sea distinto de H;

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R3 y R4 se seleccionan, cada uno independientemente, entre H, halo, ciano, alquilo (C1 -C6 ), haloalquilo (C1 -C6 ), alquenilo (C2 -C6 ), alquinilo (C2 -C6 ), alcoxi (C1 -C6 ), alquiltio (C1 -C6 ), haloalcoxi (C1 -C6 ), nitro, -NR6 R7 , -CR8 =NOR9 , NHCOOR10 , -CONR11 R12 y -COOR13 ; R6 , R7 , R8 , R9 , R10 , R11 , R12 y R13 son H o alquilo (C1 -C6 ); y X e Y se seleccionan, cada uno independientemente, entre H, halo, ciano, tiociano, isotiociano y alquil (C1 -C6 ) sulfoniloxi, con tal que al menos uno de X e Y sea distinto de H.

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6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto es para aplicarlo en una dosis de 1,0 mg a 200,0 mg por kilogramo de peso corporal por día. 7. El uso de la reivindicación 1 en el que el protozoo se elige entre uno o más especies de Giardia, especies de Leishmania, especies de Toxoplasma, especies de Cryptosporidium, especies de Entamoeba y especies de microsporidianos.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluida en la mencionada reserva. 23