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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 208 736

51 Int. Cl. : A61K 38/37

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A61K 38/36 A61K 47/26 A61P 7/00

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 96909444 .0

86 Fecha de presentación: 29.03.1996

87 Número de publicación de la solicitud: 0819010

87 Fecha de publicación de la solicitud: 21.01.1998

54 Título: Formulación proteínica que comprende factor VIII o factor IX de coagulación en una solución acuosa.

30 Prioridad: 31.03.1995 SE 9501189

73 Titular/es: BIOVITRUM AB.

112 76 Stockholm, SE

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.06.2004

72 Inventor/es: Österberg, Thomas y

Fatouros, Angelica

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Dávila Baz, Ángel

ES 2 208 736 T3

16.06.2004

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 208 736 T3 DESCRIPCIÓN Formulación proteínica que comprende factor VIII o factor IX de coagulación en una solución acuosa. 5

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Campo de la invención La presente invención se refiere a un producto farmacológico final de una proteína plasmática seleccionada del grupo que consiste en factor VIII y factor IX de coagulación, en una solución acuosa, en el que la concentración de oxígeno en la solución se ha reducido sometiendo la solución a un gas inerte y/o la solución contiene un antioxidante, y en el que la solución contiene además sacarosa en una concentración de al menos 550 mg/ml. De este modo, la actividad proteínica puede retenerse esencialmente después del almacenamiento durante al menos 6 meses. La presente invención también se refiere a un método para mejorar la estabilidad a largo plazo de factor VIII y factor IX de coagulación en una solución acuosa, en el que la solución contiene un carbohidrato en una concentración de al menos 550 mg/ml, y en el que la solución se almacena en su recipiente final bajo una atmósfera reducida en oxígeno.

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Antecedentes de la invención

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La estabilidad de las proteínas es generalmente un problema en la industria farmacéutica. A menudo se ha solucionado secando la proteína en diversos procedimientos de secado, tales como liofilización. La proteína se ha distribuido y almacenado a continuación en forma secada. La solución antes del secado o la liofilización, el material secado y el producto reconstituido deben ser todos estables, para evitar una pérdida substancial de actividad en un procedimiento de secado, así como durante el almacenamiento o el manejo. El procedimiento de liofilización es una etapa de procedimiento costosa y prolongada, que reduce el rendimiento del producto. Por lo tanto, sería una gran ventaja que pudiera evitarse esta etapa cuando se prepara un producto comercial. Por otra parte, el paciente necesariamente tiene que reconstituir la proteína secada en un disolvente antes de usar, lo que sería incómodo para el paciente. La hemofilia es una enfermedad hereditaria que se conoce desde hace siglos pero solo en las últimas cuatro décadas ha sido posible diferenciar entre las diversas formas; hemofilia A y hemofilia B. La hemofilia A es la forma más frecuente. Afecta solo a varones con una incidencia de uno o dos individuos por 10.000 varones nacidos vivos. La enfermedad está provocada por un nivel fuertemente disminuido o una ausencia del factor VIII de coagulación biológicamente activo (factor antihemofílico), que es una proteína normalmente presente en el plasma. La manifestación clínica de la hemofilia es una fuerte tendencia a la hemorragia y, antes de que se introdujera el tratamiento con concentrados de factor VIII, la edad media de los pacientes implicados era menor que 20 años. Concentrados de factor VIII obtenidos de plasma han estado disponibles durante aproximadamente tres décadas. Esto ha mejorado considerablemente la situación para el tratamiento de pacientes con hemofilia y les ha ofrecido la posibilidad de vivir una vida normal. Una formulación con una concentración baja de una proteína, tal como factor VIII, generalmente perderá actividad durante la purificación, la fabricación estéril, en el envase y durante la administración. Este problema se soluciona habitualmente mediante la adición de albúmina de suero humano (HSA) que reduce considerablemente la pérdida de la proteína activa. La HSA funciona como un estabilizante general durante la purificación, la fabricación estéril y la liofilización (véase la revisión de Wang y otros, J. of Parenteral Sci. and Tech. Vol. 42, Número 2S, suplemento 1988). El uso de HSA para la estabilización del factor VIII es conocido y se usa actualmente en todos los productos de factor VIII altamente purificados del mercado. Sin embargo, el uso de HSA es costoso y es deseable evitar la adición de HSA a una proteína terapéutica fabricada mediante la tecnología del DNA recombinante. Además, el uso de HSA como un excipiente de la formulación a menudo limita el uso de muchos de los métodos analíticos más potentes y sensibles para la caracterización de proteínas. Se han propuesto varias soluciones para estabilizar diversas proteínas sin usar HSA. Por ejemplo, WO-A-94/26286 de Pharmacia propone reducir la concentración de oxígeno como un medio para mejorar la estabilidad de soluciones de factor VIII listas para usar. Por otra parte, se han usado previamente carbohidratos, tales como disacáridos o alcoholes sacáricos, para estabilizar soluciones que contienen productos de factor VIII convencionales con baja pureza. Así, la memoria descriptiva de patente WO-A-91/10439 de Octapharma describe soluciones inyectables que contienen factor VIII o factor IX, que comprenden disacáridos naturales o sintéticos en una concentración de 0,1 a 0,9 moles/l.

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Carbohidratos tales como disacáridos o alcoholes sacáridos se han usado previamente también para estabilizar composiciones de factor VIII durante el tratamiento térmico para inactivar virus. Así, la memoria descriptiva de Patente EP-B-0 117 064 de Green Cross describe la presencia de al menos 1500 mg/ml de un alcohol sacárico o un estabilizante de disacáridos, preferiblemente sorbitol o sacarosa. El procedimiento puede llevarse a cabo durante de 3 a 24 horas a de 30 a 80ºC, o durante 1 minuto a 90ºC. El alcohol sacárico o el disacárido se retiran después del tratamiento térmico, por ejemplo mediante ultrafiltración. La memoria descriptiva de Patente EP-A-0 018 561 de Behringwerke describe la presencia de un aminoácido y de 20 a 60% (p/p) de un monosacárido, un oligosacárido o un alcohol sacárico. Esto corresponde a de 500 a 1500 mg/ml de sacárido o alcohol suponiendo que el peso específico de la solución sea 1. El procedimiento puede llevarse a cabo durante de 1 minuto a 48 horas, a de 30 a 100ºC. La memoria descriptiva de Patente WO-A-94/17834 de Octapharma describe composiciones de tratamiento térmico que contienen una proteína y un fosfato de dialquilo o fosfato de trialquilo durante de 5 a 30 horas a de 55 a 67ºC para inactivar virus carentes de envueltas lipídicas. La composición puede contener además agentes estabilizantes, tales como sacarosa, sorbitol o aminoácidos neutros de cadena corta. 2

ES 2 208 736 T3

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WO-A-87/00196 de Quadrant Bioresources describe el uso de trehalosa para proteger proteínas y otras macromoléculas de la desnaturalización durante el secado a temperatura ambiente. Los ejemplos revelan que los compuestos probados, principalmente anticuerpos y enzimas, no sólo se estabilizan durante el procedimiento de secado sino que también se estabilizan frente al almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente relativamente alta. No existe información acerca del factor VIII o el factor IX, ni acerca de soluciones acuosas con concentración reducida de oxígeno. En WO-A-91/18091 de Quadrant Holdings Cambridge se indica que los azúcares en general son de uso limitado para estabilizar substancias biológicas o compuestos orgánicos. Específicamente, se indica que los azúcares no reductores, tales como la sacarosa, proporcionan una estabilización a largo plazo muy inferior. Para vencer este problema, WO-A-91/18091 describe el uso de cierto azúcar o derivados de azúcar que pueden usarse sin cristalizar y son compuestos polihidroxilados no reductores capaces de replicar el efecto de la trehalosa. Más particularmente, el azúcar o los derivados de azúcar se seleccionan de (i) un glicósido no reductor de un compuesto polihidroxilado seleccionado de alcoholes sacáricos y otros polialcoholes de cadena lineal o (ii) un oligosacárido no reductor seleccionado de rafinosa, estaquiosa y melecitosa. No existe información acerca de factor VIII o factor IX, ni acerca de soluciones acuosas con una concentración reducida de oxígeno. Se facilitaría el uso y la fabricación de proteínas plasmáticas si la proteína pudiera formularse y distribuirse a los pacientes como una solución estable sin la adición de albúmina y con una vida de almacenamiento prolongada. Además, para el paciente, tal solución facilitaría el manejo del producto farmacológico final. El paciente podría así administrar, por ejemplo inyectar, el contenido del producto farmacológico final directamente sin reconstitución. Sumario de la invención

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Las soluciones de factor VIII se inactivan así respecto a los virus tratando térmicamente las soluciones que contienen diversos estabilizantes durante un período de tiempo que es menor que aproximadamente dos días. Las técnicas para estabilizar proteínas sometidas a una temperatura alta durante un período de tiempo corto, sin embargo, no pueden transferirse directamente a la estabilidad durante el almacenamiento a una temperatura baja o ambiental durante varios meses o años. Esto es especialmente cierto ya que, en general, los sacáridos o alcoholes sacáricos añadidos se retiran, intencionadamente o inevitablemente, en las etapas de procedimiento que siguen al tratamiento térmico. Se hace aquí referencia a Schwinn y otros, Arzneim.-Forsch/Drug Res., Vol. 39(II), 10, p. 1302-1305 (1989). Además, debe considerarse la viabilidad de la formulación en la fabricación estéril.

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Los inventores de la presente invención han encontrado sorprendentemente que la estabilidad al almacenamiento de soluciones acuosas listas para usar que contienen factor VIII o factor IX de coagulación pueden mejorarse drásticamente mediante la presencia de una alta proporción de sacarosa.

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Así, la presente invención se refiere a un producto farmacológico final de una proteína plasmática seleccionada del grupo que consiste en factor VIII factor IX de coagulación en una solución acuosa, en el que la concentración de oxígeno en la solución se ha reducido sometiendo la solución a un gas inerte y/o la solución contiene un antioxidante, y en el que la solución contiene además un carbohidrato en una concentración de al menos 550 mg/ml, para retener esencialmente la actividad proteínica después de un almacenamiento durante al menos 6 meses.

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La actividad proteínica se retiene hasta un grado superior cuando la concentración de sacarosa está en el intervalo de 550 mg/ml hasta la saturación en las condiciones imperantes en el producto farmacológico final. La concentración de saturación para la sacarosa está influenciada, por ejemplo, por la temperatura, la intensidad iónica, el pH y otros excipientes, si están presentes. La alta concentración de sacarosa en la solución de proteína plasmática da un producto farmacológico final con una estabilidad al almacenamiento notablemente mejorada, en comparación con productos de proteína plasmática previamente conocidos. Así, el producto farmacológico final de la presente invención se almacena durante al menos 6 meses con una actividad proteínica esencialmente retenida. El último intervalo está de acuerdo con los requisitos de la prueba para la potencia para Factor VIII de Coagulación Humano Liofilizado. Así, en la Farmacopea Europea, 1994, p. 275, se indica que la actividad debe retenerse dentro del intervalo de 80 hasta 120% del valor marcado. Adecuadamente, los presentes productos farmacológicos finales se almacenan durante al menos 12 meses, y preferiblemente durante al menos 18 meses, con la actividad del factor VIII esencialmente retenida. Más preferiblemente, los presentes productos farmacológicos finales se almacenan durante al menos 24 meses. La alta concentración de sacarosa en la solución de proteína plasmática también permite el almacenamiento a una temperatura superior que la considerada previamente posible para evitar una caída en la actividad proteínica. Así, el presente producto farmacológico final puede almacenarse a una temperatura en el intervalo de 0 a 40ºC. El presente producto farmacológico final se almacena adecuadamente a una temperatura en el intervalo de 2 a 30ºC, y preferiblemente a una temperatura en el intervalo de 4 a 20ºC. Incluso es bastante posible almacenar el presente producto farmacológico final durante un período a largo plazo a una temperatura en el intervalo de 10 a 25ºC.

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Producto farmacológico final se refiere a una solución acuosa estable, generalmente inyectable, en su recipiente final. El producto farmacológico final comprende así una solución acuosa estable lista para usar. El producto farmacológico final se obtiene después de la purificación que incluye una o más etapas de filtración estériles y, opcionalmente, 3

ES 2 208 736 T3 una o más etapas de inactivación de virus. Recipientes adecuados en la presente invención son, por ejemplo, viales, jeringas y dispositivos de inyección. Descripción detallada de la invención 5

Para preparar el producto farmacológico final, la proteína plasmática se mezcla con una solución acuosa o la proteína plasmática se eluye de la última etapa de purificación con una solución tamponadora acuosa. A continuación, se añade sacarosa a la solución acuosa obtenida que contiene la proteína plasmática. Se añade sacarosa hasta una concentración de al menos 550 mg/ml en el producto farmacológico final. 10

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La solución acuosa que contiene la proteína plasmática y un carbohidrato se filtra a continuación estérilmente. A continuación, la solución de proteína plasmática estéril que contiene carbohidrato se distribuye en su recipiente final después de lo cual la concentración de oxígeno de la solución de proteína plasmática se reduce. Las dos etapas después de la filtración estéril también pueden llevarse a cabo en orden inverso, es decir, la concentración de oxígeno de la solución de proteína plasmática estéril que contiene carbohidrato se reduce en primer lugar, después de lo cual la solución de proteína plasmática se distribuye en su recipiente final. La concentración de oxígeno se reduce sometiendo la solución acuosa a una atmósfera de gas inerte, reduciendo la presión o reduciendo en primer lugar la presión y a continuación introduciendo un gas inerte. El último procedimiento se repite preferiblemente en varios ciclos. Mediante este método, la concentración resultante de oxígeno en la solución será substancialmente inferior de lo que sería el caso si la atmósfera circundante consistiera en aire. Así, mediante este método, la concentración de oxígeno en la solución puede reducirse hasta un nivel bajo, sin una pérdida substancial en la actividad de la proteína plasmática. El contenido de oxígeno en la solución puede estar por debajo de 200 ppm, adecuadamente por debajo de 50 ppm, preferiblemente por debajo de 10 ppm y más preferiblemente por debajo de 2 ppm. El contenido de oxígeno en el recipiente usado puede reducirse y mantenerse a un nivel bajo del mismo modo, sometiendo el recipiente a una atmósfera de gas inerte.

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La solución acuosa que contiene una proteína plasmática y sacarosa se almacena adecuadamente bajo un gas inerte tal como nitrógeno, argón o helio, para mantener esencialmente el bajo contenido de oxígeno. El gas inerte es preferiblemente un gas inerte no noble, y más preferiblemente nitrógeno.

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El bajo contenido de oxígeno también puede mantenerse esencialmente añadiendo un antioxidante a la solución acuosa. Así, en otra modalidad, se añade un antioxidante antes de la etapa de filtración estéril y la concentración de oxígeno se reduce sometiendo la solución acuosa a una atmósfera de gas inerte, reduciendo la presión o reduciendo en primer lugar la presión y a continuación introduciendo un gas inerte, preferiblemente repetido en varios ciclos. En otra modalidad más, y menos preferida, se añade un antioxidante a la solución acuosa antes de la etapa de filtración estéril, sin reducir la concentración de oxígeno por otro medios.

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El antioxidante puede seleccionarse de glutationa, acetilcisteína, metionina, tocoferol, butilhidroxitolueno, butilhidroxianisol o compuestos fenólicos. Preferiblemente, el antioxidante es al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en glutationa, acetilcisteína y metionina. La concentración y la cantidad total del antioxidante depende del compuesto usado. Por lo tanto, no puede darse generalmente una concentración o cantidad. Sin embargo, es importante que la cantidad total de antioxidante, si se usa, sea una cantidad farmacéuticamente aceptable. Agentes complejantes tales como EDTA y ácido cítrico también pueden estar presentes en concentraciones pequeñas para estabilizar la formulación, si exhiben una afinidad más fuerte para iones metálicos desestabilizantes que para los iones metálicos que asocian las cadenas de, por ejemplo, el factor VIII.

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La invención también se refiere a un método para mejorar la estabilidad a largo plazo de proteínas plasmáticas en una solución acuosa, en donde la solución contiene además sacarosa en una concentración de al menos 550 mg/ml, y la solución se almacena en su recipiente final bajo una atmósfera reducida en oxígeno, bajo una atmósfera de gas inerte. Adecuadamente, la proteína plasmática es factor VIII y la concentración de carbohidrato de la solución acuosa almacenada en su recipiente final está en el intervalo de 550 mg/ml hasta la saturación. La invención es aplicable principalmente a proteínas plasmáticas seleccionadas del grupo que consiste en factor VIII y factor IX de coagulación. La invención se describirá en lo siguiente con más detalle con referencia al factor VIII.

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El pH de la solución está adecuadamente en el intervalo de 6,0 a 8,0, preferiblemente de 6,5 a 7,5.

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Un tensioactivo no iónico está presente preferiblemente en la solución. El tensioactivo no iónico, si está presente, se elige preferiblemente de copolímeros de bloques tales como poloxámero o éster de ácido graso de polioxietilensorbitán, tal como polisorbato 20 o polisorbato 80. El tensioactivo no iónico, si está presente, debe usarse en una concentración por encima de la concentración mi4

ES 2 208 736 T3 celar crítica (CMC). Véase Wan and Lee, Journal of Pharm Sci, 63, p. 136-137, 1974. El éster de ácido graso de polioxietilensorbitán se usa así preferiblemente en una concentración de al menos 0,01 mg/ml. 5

La solución acuosa puede contener además cloruro sódico o potásico, adecuadamente en una concentración de más de 0,1 M, preferiblemente más de 0,25 M.

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La solución acuosa contiene adecuadamente un agente tamponador, en una concentración de más de 1 mM, preferiblemente de 10 a 95 mM. El agente tamponador es preferiblemente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L-histidina, lisina y arginina o mezclas de las mismas. Más preferiblemente, el agente tamponador es L-histidina. El producto farmacológico final comprende preferiblemente una solución acuosa que contiene i) 10-50.000 UI/ml de factor VIII de coagulación recombinante

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ii) al menos 0,01 mg/ml de un éster de ácido graso de polioxietilensorbitán iii) cloruro sódico, adecuadamente en una concentración de más de 0,1 M, y preferiblemente más de 0,25 M 20

iv) sal cálcica, tal como cloruro cálcico o gluconato cálcico, preferiblemente en una concentración de más de 0,5 mM v) un agente tamponador, tal como L-histidina, en una concentración de más de 1 mM

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vi) sacarosa en una concentración de al menos 550 mg/ml. Los concentrados de factor VIII derivados de plasma humano contienen varias formas de factor VIII completamente activas fragmentadas como las descritas por Andersson y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, p. 2979-83 (Mayo de 1986). La forma activa más pequeña tiene una masa molecular de 170 kDa y consiste en dos cadenas de 90 kDa y 80 kDa unidas por un puente de ion metálico. Se hace aquí referencia a EP-A-0 197 901. Pharmacia AB de Estocolmo, Suecia, ha desarrollado un producto de factor VIII recombinante que corresponde a la forma de factor VIII plasmático de 170 kDa en concentrados de factor VIII terapéuticos. La molécula de factor VIII recombinante truncada se denomina r-VIII SQ y es producida por células de ovario de hámster chino (CHO) en un procedimiento de cultivo celular en medio libre de suero. La actividad específica de r-VIII SQ es aproximadamente 15.000 UI de VIII:C por mg de proteína total. La estructura y la bioquímica de r-VIII SQ se han descrito en WO-A91/09122 concedida a Pharmacia AB. En la presente invención, el factor VIII puede ser factor VIII plasmático o factor VIII recombinante. Cuando el factor VIII es recombinante puede ser factor VIII de longitud completa o, preferiblemente, un derivado de supresión de factor VIII de longitud completa. Más preferiblemente, el derivado de supresión es factor VIII SQ recombinante (r-VIII SQ). En este contexto, un derivado de supresión se define como un factor VIII de coagulación en el que se pierde la totalidad o parte del dominio B.

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La asociación de las cadenas pesada y ligera del factor VIII depende de la presencia de calcio (u otros iones metálicos divalentes). Aquí, se añadió calcio como cloruro cálcico (CaCl2 ), pero también pueden usarse otras sales tales como gluconato cálcico, glubionato cálcico o gluceptato cálcico, preferiblemente en una concentración de más de 0,5 mM.

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La presente invención puede usarse ventajosamente para una amplia variedad de productos de factor VIII. Así, la presente invención puede usarse para estabilizar adicionalmente factor VIII plasmático que ya está estabilizado mediante la asociación con su proteína portadora, el factor de Willebrand (vWf). La ventaja de la presente invención, sin embargo, se hace más pronunciada con productos de factor VIII altamente purificados, ya que estos productos son más inestables que los productos menos purificados que contienen, por ejemplo, el vWf. Así, los productos de factor VIII que contienen pequeñas cantidades del vWf o no contienen vWf en absoluto son mucho más propensos a la degradación. Por lo tanto, la presente invención se usa adecuadamente con productos de factor VIII que exhiben una relación de factor VIII:C (UI) a vWf:Ag (UI) de al menos 2:1, más adecuadamente de al menos 10:1 y preferiblemente de al menos 100:1. Más preferiblemente, el producto de factor VIII de la presente invención no contiene vWf.

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La actividad del factor VIII específico en el producto farmacológico final de la presente invención es adecuadamente al menos 1.000 UI/mg de proteína total, más adecuadamente al menos 3.000 UI/mg de proteína total. La actividad del factor VIII específico en el producto farmacológico final de la presente invención es preferiblemente al menos 5.000 UI/mg de proteína total y más preferiblemente al menos 10.000 UI/mg de proteína total.

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La actividad del factor VIII en el producto farmacológico final puede estar en el intervalo de 10 a 50.000 UI/ml, adecuadamente de 50 a 25.000 UI/ml, preferiblemente de 100 a 10.000 UI/ml.

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ES 2 208 736 T3 La presente invención se usa ventajosamente para productos farmacológicos finales de factor VIII y factor IX que se han estabilizado sin la adición de albúmina. 5

Los siguientes Ejemplos están destinados a ilustrar adicionalmente la invención mostrando datos de estabilidad para soluciones acuosas que contienen sacarosa. Parte experimental Preparación de factor VIII SQ recombinante

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La preparación de factor SQ recombinante (r-VIII SQ) se realizó esencialmente como se describe en la Patente WO-A-91/09122, Ejemplos 1-3. Una línea celular de CHO deficiente en DHFR (DG44N.Y.) se sometió a electroporación con un vector de expresión que contenía el gen de r-VIII SQ y un vector de expresión que contenía el gen de dihidrofolato reductasa. Después de la selección sobre medios selectivos, las colonias supervivientes se amplificaron a través de crecimiento en cantidades de metotrexato crecientes por etapas. Los sobrenadantes de las colonias resultantes se rastrearon individualmente con respecto a la actividad del factor VIII. Se eligió un clon de producción y este se adaptó subsiguientemente a crecimiento en suspensión libre de suero en un medio definido y finalmente se desarrolló un procedimiento de fermentación a gran escala. El sobrenadante se recoge después de ciertos períodos de tiempo y se purifica adicionalmente como se describe más adelante.

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El medio acondicionado clarificado se ajustó en cuanto al pH y se aplicó a una columna S-Sepharose FF. Después de lavar, el factor VIII se eluyó con un tampón salino que contenía CaCl2 5 mM. 25

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Se llevó a cabo inmunoadsorción sobre una resina de inmunoafinidad donde el ligando era un anticuerpo monoclonal (8A4) dirigido hacia la cadena pesada del Factor VIII. Antes de cargar a la columna el eluato S se trató con TNBP al 0,3% y Octoxynol 9 al 1%. La columna se equilibró, se lavó y el factor VIII se eluyó con un tampón que contenía CaCl2 0,05 M y etilenglicol al 50%. El eluato de mAb se cargó sobre una columna Q-Sepharose FF, equilibrada con el tampón de elución en la etapa de inmunoafinidad. Después de lavar, el factor VIII se eluyó con L-histidina 0,05 M, CaCl2 4 mM, NaCl 0,6 M, pH 6,8.

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El eluato Q se aplicó a una columna de filtración en gel (Superdex 200 p.g.). La equilibración y la elución se llevaron a cabo con un tampón de formulación que contenía L-histidina, cloruro sódico, cloruro cálcico y polisorbato 80 (véase el ejemplo 1 más adelante), dando la composición de acuerdo con los ejemplos ulteriores.

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Material a granel de r-VIII SQ se recibió de la etapa de purificación final. La actividad del factor VIII y la concentración de los componentes inactivos se ajustaron diluyendo con un tampón apropiado que contenía un carbohidrato. La solución se filtró a continuación estérilmente (0,22 µm) y se distribuyó y se desoxigenó sometiendo la solución a presión reducida y más adelante introduciendo el gas inerte en varios ciclos.

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La actividad del factor de coagulación VIII (factor VIII:C) se determinó mediante un ensayo de substrato cromogénico (Coatest Factor VIII, Chromogenix AB, Mölndal, Suecia). Se genera factor X activado (Xa) a través de la ruta intrínseca en la que el factor VIII actúa como co-factor. El factor Xa se determina a continuación mediante el uso de un substrato cromogénico sintético, S-2222, en presencia de un inhibidor de trombina I-2581 para prevenir la hidrólisis del substrato por trombina. La reacción se detiene con ácido, y el VIII:C, que es proporcional a la liberación de pNA (para-nitroanilina), se determina fotométricamente a 450 nm frente a un blanco de reactivo. La unidad de factor VIII:C se expresa como unidades internacionales (UI) según se define por el actual International Concentrate Standard (IS) establecido por la WHO. La desviación estándar relativa (RSD) del método es 7%.

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Ejemplo 1

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Se preparó factor VIII recombinante (r-VIII SQ) de acuerdo con el método descrito bajo la Parte Experimental. El factor VIII usado en los Ejemplos está altamente purificado, es decir tiene una actividad específica de más de 5.000 UI/mg de proteína total, y se estabiliza sin la adición de albúmina. Todas las composiciones en este Ejemplo contenían:

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r-VIII SQ UI/ml L-Histidina, mg/ml Cloruro sódico, mg/ml Cloruro cálcico, mg/ml Polisorbato 80, mg/ml

125 3 18 3,4 0,2

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El volumen aportado a los viales era 1 ml, el espacio vacío contenía nitrógeno y el pH era aproximadamente 7.

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ES 2 208 736 T3 Los estabilizantes usados en las pruebas de almacenamiento del Ejemplo 1 eran de la calidad de la Farmacopea Europea. TABLA I 5

Las composiciones acuosas de factor VIII usadas en las pruebas de almacenamiento del Ejemplo 1

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TABLA II 35

Actividad de factor VIII inicialmente (antes del almacenamiento)

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ES 2 208 736 T3 TABLA III Actividad del factor VIII después de un mes de almacenamiento a 25 y 37ºC, respectivamente. El porcentaje se calcula a partir de la actividad inicial media para cada composición 5

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TABLA IV 30

Actividad del factor VIII después de dos meses de almacenamiento a 37ºC El porcentaje se calcula a partir de la actividad inicial media para cada composición

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ES 2 208 736 T3 TABLA V Actividad del factor VIII después de tres meses de almacenamiento a 25ºC El porcentaje se calcula a partir de la actividad inicial media para cada composición 5

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TABLA VI 30

Actividad del factor VIII después de seis meses de almacenamiento a 7 y 25ºC, respectivamente. Media de dos muestras por composición a 7ºC. El porcentaje se calcula a partir de la actividad inicial media para cada composición 35

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ES 2 208 736 T3 TABLA VII Actividad del factor VIII después de nueve meses de almacenamiento a 7 y 25ºC, respectivamente. El porcentaje se calcula a partir de la actividad inicial media para cada composición 5

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TABLA VIII 30

Actividad del factor VIII después de doce meses de almacenamiento a 7 y 25ºC, respectivamente. Media de dos muestras por composición a 7ºC. El porcentaje se calcula a partir de la actividad inicial media para cada composición 35

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ES 2 208 736 T3 TABLA IX Actividad del factor VIII después de dieciocho meses de almacenamiento a 7ºC. El porcentaje se calcula a partir de la actividad inicial media para cada composición 5

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Ejemplo 2 30

Se preparó factor VIII recombinante (r-VIII SQ) de acuerdo con el método descrito bajo la Parte Experimental. El factor VIII usado en los Ejemplos está altamente purificado, es decir, tiene una actividad específica de más de 5.000 UI/mg de proteína total, y se estabiliza sin la adición de albúmina. 35

40

Todas las composiciones en este Ejemplo contenían: r-VIII SQ UI/ml L-Histidina, mg/ml Cloruro sódico, mg/ml Cloruro cálcico, mg/ml Polisorbato 80, mg/ml

500 3 18 3,4 0,2

El volumen distribuido en los viales era 1 ml,. 45

Los estabilizantes usados en las pruebas de almacenamiento del Ejemplo 2 eran de la calidad de la Farmacopea Europea. TABLA X 50

Composiciones acuosas de factor VIII usadas en las pruebas de almacenamiento del Ejemplo 2

55

60

65

11

ES 2 208 736 T3 TABLA XI Actividad de factor VIII inicialmente (antes del almacenamiento) 5

10

15

20

25

TABLA XII Actividad del factor VIII después de un mes de almacenamiento a 37ºC. El porcentaje se calcula a partir de la actividad inicial media para cada composición

30

35

40

45

50

(Tabla pasa a página siguiente)

55

60

65

12

ES 2 208 736 T3 TABLA XIII Actividad del factor VIII después de dos meses de almacenamiento a 25 y 37ºC,respectivamente. El porcentaje se calcula a partir de la actividad inicial media para cada composición 5

10

15

20

25

TABLA XIV Actividad del factor VIII después de tres meses de almacenamiento a 25 y 37ºC, respectivamente. El porcentaje se calcula a partir de la actividad inicial media para cada composición 30

35

40

45

50

(Tabla pasa a página siguiente)

55

60

65

13

ES 2 208 736 T3 TABLA XV Actividad del factor VIII después de doce meses de almacenamiento a 7 y 25ºC, respectivamente. El porcentaje se calcula a partir de la actividad inicial media para cada composición 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

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14

ES 2 208 736 T3 REIVINDICACIONES 5

1. Un producto farmacológico final de una proteína plasmática seleccionada del grupo que consiste en factor VIII y factor IX de coagulación, en una solución acuosa, en el que la concentración de oxígeno en la solución se ha reducido sometiendo la solución a un gas inerte y/o la solución contiene un antioxidante, y en el que la solución contiene además sacarosa en una concentración de al menos 550 mg/ml. 2. Un producto farmacológico final de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende un gas inerte.

10

3. Un producto farmacológico final de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el gas inerte es nitrógeno. 4. Un producto farmacológico final de acuerdo con cualquier reivindicación previa, en el que el antioxidante es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en glutationa, acetilcisteína y metionina, y mezclas de las mismas. 15

5. Un producto farmacológico final de acuerdo con cualquier reivindicación previa, en el que la proteína plasmática es un factor VIII recombinante seleccionado del grupo que consiste en factor VIII de longitud completa y derivados de supresión de factor VIII de longitud completa. 20

6. Un producto farmacológico final de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la actividad del factor VIII está en el intervalo de 50 a 25.000 UI/ml. 7. Un producto farmacológico final de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la actividad del factor VIII específico es al menos 1.000 UI/mg de proteína total.

25

8. Método para mejorar la estabilidad a largo plazo de una proteína plasmática seleccionada del grupo que consiste en factor VIII y factor IX de coagulación, en una solución acuosa, caracterizado porque la solución contiene además sacarosa en una concentración de al menos 550 mg/ml y porque la solución se almacena en su recipiente final bajo una atmósfera reducida en oxígeno. 30

35

40

45

50

55

60

65

NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluida en la mencionada reserva. 15