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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 251 982

51 Int. Cl. : A61K 38/34

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A61K 38/06 A61K 38/08 A61P 13/00 A61P 15/00

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 00916651 .3

86 Fecha de presentación : 23.03.2000

87 Número de publicación de la solicitud: 1165120

87 Fecha de publicación de la solicitud: 02.01.2002

54 Título: Polipéptidos dímeros KPV, C-terminales, y su utilización para el tratamiento de patologías uro-genitales.

30 Prioridad: 24.03.1999 US 126233 P

73 Titular/es: Zengen, Inc.

Suite 980, 21800 Oxnard Street Woodland Hills, California 91367, US

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.05.2006

72 Inventor/es: Lipton, James y

Catania, Anna

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Isern Jara, Jorge

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16.05.2006

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid

ES 2 251 982 T3 DESCRIPCIÓN Polipéptidos dímeros KPV, C-terminales, y su utilización para el tratamiento de patologías uro-genitales. 5

Sector de la invención La presente invención, se refiere al sector de los polipéptidos dímeros. Antecedentes y trasfondo de la invención

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Las patologías o enfermedades uro-genitales, afectan comúnmente, tanto a los hombres como a las mujeres. Estas patologías, incluyen a las infecciones y / o inflamación del sistema urinario y el sistema genital. Así, por ejemplo, según el National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), “la mayoría de las mujeres, tendrán por lo menos una forma de vaginitis durante el transcurso de su vida”. Vaginitis, National Institute of Child Health and Human Development - Publications On-line (última modificación, 12 de Junio del 2000, . Las causas para la vaginitis, abarcan desde las infecciones bacterianas, fúngicas, o víricas, hasta las irritaciones procedentes de los productos químicos existentes en las cremas, proyecciones de pulverización (sprays), o incluso, de la ropa que se encuentra en contacto con esta área. Id. Para las mujeres con infecciones bacterianas y fúngicas, estos agentes infecciosos, se originan, a menudo, a partir del área rectal y migran a través del perineo, para alcanzar la vagina o la uretra. Un tipo común de vaginitis, es la candidiasis o infección por levadura, la cual viene causada, de la forma más común, por Candida albicans. Las especies de Candida, son parte una flora normal del individuo, de organismos microbianos, presentes en la piel, la boca, y el tracto gastrointestinal. Robbins Pathologic Basis of Diseasa 5th ed., -Bases patológicas de enfermedad, según Robbins, 5ª edición-, Saunders Co., Philadelphia (1994), p. 354. Éstos viven, también, en reducido número, en la vagina de la mujer. Éstos crecen mejor en un entorno medioambiantal caliente, en superficies húmedas, tales como la vagina o la cavidad oral. Éstos son, normalmente, no patógenos, pero, cuando acontece un cambio en su entorno medioambiental, tal como en la respuesta a un cambio hormonal en la mujer, en la menopausia, en el embarazo, o en respuesta al estrés, éstos pueden sobrecrecer, para provocar una infección de levaduras. Estos cambios, pueden también acontecer en individuos inmunosuprimidos o comprometidos, tales como las personas que están experimentando quimioterapia, que están tomando inmunosupresivos, o que están afectados de SIDA. El tratamiento usual para la candidiasis, incluye, sobre todo, fármacos con ingredientes activos, tales como el nitrato de butoconazol (Femsat®, clotrimazol (Gyne-lotrimin®, y otros), miconazol (Monistat® y otros), y tioconazol (Vaginat®). Estos fármacos, se aplican típicamente en la vagina, y descomponen la pared de la célula de Cándida. Otros tratamientos similares, incluyen fármacos de prescripción con ingredientes activos, en la misma familia, tal como fluconazol (Diflucan®), terconazol (Terazol®), y ketoconazol (Nizoral®).

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Si bien la vaginitis se ha asociado usualmente con Candida, la vaginosis bacteriana, es actualmente la infección vaginal más común en las mujeres de edad reproductiva, en concordancia con el NICHD. Vaginitis, véase más arriba. El sobrecrecimiento de las bacterias en la vagina, provoca la vaginosis bacteriana, tal como Candida pero, los fármacos utilizados para su tratamiento, son diferentes.

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Por otro lado, los hombres, pueden también contraer infecciones en su pene, que involucren las glándulas y el prepucio. La balanopostitis, una infección no específica de las glándulas y el prepucio, viene provocada por una amplia variedad de organismos, incluyendo a los hongos, tal como la Candida, y bacterias pirogénicas, tales como los estafilococos. Robbins Pathologic Basis of Diseasa 5th ed., -Bases patológicas de enfermedad, según Robbins, 5ª edición-, Saunders Co., Philadelphia (1994), p. 1008.

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Los estafilococos, son bacterias gram positivas, las cuales se encuentran normalmente presentes en la piel, y otras membranas mucosas de la piel. El Staphylococcus aureus, de una forma particular, es un patógeno virulento, el cual provoca una miríada de patologías y enfermedades que van desde las lesiones cutáneas, endocarditis, infección respiratoria, envenenamientos por alimentos, hasta el síndrome del shock tóxico. Para la mujeres que utilizan tampones altamente absorbentes, se conoce que, el S. aureas, puede colonizar la vagina y secretar una toxina denominada toxina del síndrome del shock tóxico. (TSST-1). En concordancia con la Food and Drug Administration, aproximadamente la mitad de los casos de síndrome del shock tóxico, reportados hoy en día, se encuentran asociados con la utilización de tampones durante la menstruación y, usualmente, en mujeres jóvenes. Tampons and Asbestos. Dioxin & Toxic Shock Síndrome, -Tampones y asbestos. Dioxina. & Síndrome del shock tóxico-, FDA Center for Devices and Radiological Health (July 23, 1999), . Las infecciones por S. aureas, se tratan usualmente con meticilina. Si bien ésta es muy efectiva, algunas cepas de S.aureus, han desarrollado resistencia a la meticilina y, únicamente unos pocos antibióticos, pueden tratar con éxito este staphylococcus aureas resistente a la meticilina (MRSA). Uno de estos antibióticos usualmente utilizado para el MRSA, es la vancomicina. Se ha identificado ya, no obstante, una cepa de S. aureas, con reducida susceptibilidad a la vancomicina (VISA). Khurshid, M.A., et al., Staphylococcus aureus with Reduced Susceptibility to Vancomycin - Illinois, 1999, Staphilococcus aureus con reducida susceptibilidad a la vancomicina - Illinois 1999-, Morbidity and Mortality Wekly Report, 48 (51): 1165 - 1176 (2000). . 2

ES 2 251 982 T3 La emergencia de cepas bacterianas resistentes a los antibióticos, ha creado la necesidad para vías alternativas para combatir las infecciones bacterianas. 5

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Adicionalmente a la infección por hongos y bacterias, es también común la vaginitis. Estas infecciones, se transmiten, lo más a menudo, a través de la cohabitación sexual. La vaginitis vírica, incluye a la infecciones por virus del herpes simple (HSV), o del papilomavirus humano (HPV). Los virus HSV, por ejemplo, se reproducen en el área genital, el cual es el sitio de entrada, e infectan también las neuronas que se inervan en los genitales. Con objeto de evitar el sistema inmunitario del cuerpo, los virus HSV, pueden permanecer latentes en estas neuronas, y convertirse en reactivados, en respuesta a condiciones medioambientales, tales como el estrés, la inmunosupresión, la irradiación, o las infecciones víricas. Los tratamientos usuales para el HSV, incluyen a los fármacos tales como el aciclovir, famciclovir o valaciclovir. En cuanto a lo referente al sistema urinario, en concordancia con la American Medical Association, las infecciones del tracto urinario (UTIs), son uno de los trastornos más usuales que provocan la visita urgente a un médico. Women’s Health. Urinary Tract Infecctions: A patient’s guide to Tratment, -Salud en la mujer. Infecciones del tracto urinario: Una guía del paciente para el tratamiento-, AMA Health Insight, On Line Health Information for Everyone (última fecha de actualización, 30 de octubre de 1998) Estas infecciones, vienen causadas, la mayoría de la veces, por Escherichia coli, pero pueden también involucrar organismos tales como Candida y estafilococos. Id. Estas infecciones, pueden iniciarse en la uretra y avanzar hasta la vejiga, provocando cistitis. A la larga, éstas pueden incluso ascender hasta los riñones, a través de los ureters, y provocar pielonefritis. Ambos sistemas urinarios, el sistema urinario de los hombres, y el sistema urinario de las mujeres, pueden infectarse con estos microorganismos.

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Puesto que, las patologías uro-genitales no se confinan a una causa individual, los tratamientos usuales, requieren diferentes fármacos, para tratar las causas específicas. Estas causas, en primer lugar, deben ser identificadas. La identificación, requiere tiempo, pero, además, requiere un examen ginecológico, para las mujeres, con objeto de determinar los agentes infecciosos específicos o la ausencia de éstos.

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Con el uso incrementado de antibióticos y otros fármacos, los microorganismos tales como el Staphylococcus aureus meticilina-resistente, están desarrollando resis-tencia, de una forma incrementada, a los fármacos que se encuentran usualmente a disposición. Así, de esta forma, existe una necesidad continuada para nuevas clases de fármacos, que puedan combatir el amplio espectro de los agentes infecciosos.

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La patente estadounidense U.S. 3.247.182, da a conocer un heneicosapéptido que tiene una secuencia de aminoácidos SYSMQHFRWGKPVGKKRRPVK, así como también, variantes y derivados de éste, los cuales pueden ser adreno-corticotrópicos y, por lo tanto, pensados para su uso como medicamentos.

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La patente estadounidense U.S. 300.468, da a conocer un procedimiento para la fabricación de la hormona pituitaria β-MSH, que tiene la secuencia de aminoácidos DSGPYKMEHFRWGSPPKD así como también derivados y sales de ésta. Finalmente, la patente estadounidense U.S. 4.918.055, da a conocer un procedimiento para estimular la producción de melanina en vertebrados, mediante la administración tópica de ciertos análogos de la α-MSH (hormona estimulante del α-melanocito, la cual tiene la secuencia de aminoácidos SYSMEHFRWGKPV), así como también composiciones farmacéuticas que comprenden la misma. Resumen de la invención

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La presente invención, está dirigida a un dímero, tal y como se define en la reivindicación 1, que comprende dos polipéptidos ligados conjuntamente, en donde, el polipéptido, comprende, en sus términos C, una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo consistente en KPV (SEQ ID NO: 1), MEHFRWG (SEQ ID NO: 2), HFRWGKPV (SEQ ID NO: 3), y SYSMEHFRWGKPV (SEQ ID NO: 4). La invención, se refiere, también, a una composición que comprende el citado dímero. En una forma de presentación de la invención, la composición, comprende adicionalmente un portador o vehículo. En otra forma de presentación de la invención, la composición, comprende adicionalmente un aplicador. Los dímeros de la invención, pueden utilizarse para el tratamiento de patologías uro-genitales. Los trastornos uro-genitales, pueden incluir a las infecciones, a las inflamaciones, o a ambas, de una forma particular, la infección y / o la inflamación de la vagina, vulva, tracto urinario, pene y / o el recto. Los dímeros, pueden disolverse en un portador o vehículo. Los dímeros, pueden también estar asociados con un tampón, para prevenir el síndrome del shock tóxico, con un contraceptivo para la prevención de enfermedades o infecciones sexualmente transmitidas, o con un supositorio, para su inserción en el interior de la vagina o del recto. Los dímeros, pueden también disolverse en un portador o vehículo líquido, para duchar la vagina. Descripción resumida de los dibujos La figura 1, muestra los efectos inhibitorios de la α-MSH, y / o sus derivados, en el crecimiento del S. aureus. 3

ES 2 251 982 T3 La figura 2, muestra los efectos de la α-MSH, y / o sus derivados, en el crecimiento uroquinasa-inducido del S. aureus. (No pertenece a la invención). 5

La figura 3, muestra los efectos inhibitorios de la α-MSH, y / o sus derivados, en el crecimiento de la C. albicans. (No pertenece a la invención). La figura 4, compara las actividades anti-fúngicas muestra los efectos inhibitorios de la α-MSH, y / o sus derivados, con fluconazol. (No pertenece a la invención).

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Las figuras 5A a 5D, muestran los efectos inhibitorios de la α-MSH, y / o sus derivados, en la formación tubular de gérmenes de C. albicans. (No pertenece a la invención). La figura 6, muestra los efectos neutrófilo-agresivos mejorados de la α-MSH, y / o sus derivados, contra la C. albicans. (No pertenece a la invención).

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La figuras 7, 8 y 9, muestran el mecanismo, mediante el cual, la α-MSH, y / o sus derivados, inhiben el crecimiento de la C. albicans. (No pertenece a la invención). Las figuras 10 - 13, muestran los efectos inhibitorios de la α-MSH, y / o sus derivados, en la replicación vírica, expresión en células infectadas de forma crónica. (No pertenece a la invención). La figura 14, muestra los mecanismos mediante los cuales, la α-MSH, y / o sus derivados, inhiben la replicación vírica, expresión y reactivación. (No pertenece a la invención).

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La figura 15, muestra los efectos inhibitorios de la α-MSH, y / o sus derivados, en la replicación vírica, expresión en células infectadas de forma aguda. (No pertenece a la invención). La figura 16, muestra una representación de la estructura química de una forma de dímero KPV, para su uso en uno de los aspectos de la presente invención.

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Descripción general de la invención

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La presente invención, se refiere a un dímero, tal y como se define en la reivindicación 1, en donde, los polipéptidos, comprenden, en sus términos-C, la hormona estimulante del alfa-melanocito (“α-MSH”), o sus derivados. La αMSH, es un antiguo péptido de trece aminoácidos (SEQ ID. NO 4), producida mediante procesado post-traslacional (post-traducción) de la mayor molécula precursora propio-melanocortina. Ésta cizalla a la secuencia de aminoácidos 1 -13, con hormona adrencorticoide (“ACTH”), también derivada de la propiomelanocortina. Se conoce que, la αMSH, se secreta mediante muchos tipos de células, incluyendo a las células pituitarias, monocitos, melanocitos, y queratinocitos. Ésta puede encontrarse en la piel de las ratas, en la epidermis humana, o en la barrera mucosa del tracto gastrointestinal, en ratas intactas y que han sido objeto de una hipofisectomía. Véase, por ejemplo, Eberie. A.N., The Melantrophins, -Melanotropinas-, Karger, Basel, Suiza (1998); Liton J.M. et. al., Anti-inflammatory Influence of the Neuroinmmunomodulator α-MSH, -Influencia anti-inflamatoria del neuroinmunomodulador α-MSH-, Immunol. Today 18, 140 - 145 (1997); Thody, A.J. et al., MSH Peptides are Present in Mammalian Skin, -Los Péptidos MSH se encuentran presentes en la piel de los mamíferos-, Peptides 4, 813 - 815 (1983); Fox J.A. et al., Immunoreactive αMelanocyte Stimulting Hormone. Its Distribution in the Gastrointestinal Tract of Intact and Hypophisectomized Rats, -Hormona inmunoreactiva estimulante del α-melanocito. Su distribución en el tracto gastrointestinal de ratas intactas y que han experimentado hipofisectomía-, Life Sci. 18, 2127-2132 (1981). Se conoce que, la α-MSH y sus derivados, tienen potentes propiedades antipiréticas y antiinflamatorias pero, sin embargo, éstos tienen una toxicidad extremadamente baja. Éstos, pueden reducir la producción de los mediadores proinflamatorios de las células huésped, in vitro, y pueden reducir la producción de reacciones locales y sistémicas, en modelos animales, para la inflamación. La secuencia α-MSH, “núcleo” (4-10) (SEQ. ID. NO. 2), por ejemplo, tiene efectos de comportamiento del aprendizaje y de la memoria, pero poca actividad antipirética y antiinflamatoria. Como contraste de ello, la secuencia mensajera activa para las actividades antipiréticas y antiinflamatorias, reside en la secuencia de aminoácidos C-terminal de la α-MSH, es decir, lisina-prolina-valina (“Lys-Pro-Val” ó “KPV”) (SEQ ID. NO. 1). Este tripéptido, tiene actividades in vitro e in vivo, las cuales son paralelas a la de molécula progenitora. Esta actividad anti-inflamatoria de α-MSH, y / o sus derivados, se dan a conocer en las dos siguientes patentes: Patente estadounidense US nº 5.028.592, publicada en fecha 2 de Julio de 1991, concedida a Lipton J.M. y titulada Antipyretic and Anti-inflammatory Lis Pro Val Compositions and Method of Use, Composiciones antipiréticas y antiinflamatorias Lys Pro Val, y Procedimiento para su uso; Patente estadounidense US nº 5.157.023, publicada en fecha 20 de Octubre de 1992, concedida a Lipton J.M. y titulada Antipyretic and Anti-inflammatory Lis Pro Val Compositions and Method of Use, Composiciones antipiréticas y antiinflamatorias Lys Pro Val, y Procedimiento para su uso; véase, también, Catania, A. et al., α-Melanocyte Stimulating Hormone in the Modulation of Host Reactions, -Hormona estimulante de los α-melanocitos en la modulación de reacciones de huéspedes-, Endocr. Rev. 14, 564 576 (1973); Lipton J.M., et al., Anti-inflammatory Influence of the Neuroimmunomodulator of α-MSH, -Influencia antiinflamatoria del neuroinmunomodulador de la α-MSH-, Immunol. Today 18, 140-145 (1997); Rajora N. et. al., αMSH Production Receptors and Influence on Neopterin, in a Human Monocyte / macrophage Cell Line, -Receptores 4

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de producción de α-MSH e influencia en la neopterina, en una línea de células de monocitos / macrófagos. J-Leukoc. Bil. 59, 248-253 (1996); Star, R.A. et. al., Evidance of Autocrine Modulation of Macrophage Nitric Oxide Synthasa by α-MSH, -Evidencia de modulación autocrina de sintasa macrófaga de óxido nítrico, mediante α-MSH-, Proc. Nat’l. Acad. Sci. (USA) 92, 8015 - 8020 (1995); Litpon, J. M. et. al., Anti-inflammatory Effects of the Neuropeptide α-MSH in Acute Chronic and Systemic inflammation-, Efectos antiinflamatorios del Neuropéptido α-MSH en inflamación crónica y sistémica, Ann N-Y. Acad. Sci. 741, 137 -148 (1994); Fajora, N., et al., α-MSH Modulates Local and Circulating tumor Necrosis α en Experimental Brain Inflammation, -La α-MSH, modula el factor de necrosis tumoral α, local y circulante, en la inflamación experimental de cerebro-, J. Neuroosci, 17, 2181-2186 (1995); Richards, D.B., et. al., Effect of α-MSH (11-13) (lysine-proline-valine) on Fever in the Rabbit, -Efecto de la α-MSH (11-13) (lisina-prolinavalina) en la fiebre, en el conejo-, Peptides, 5, 815 - 817 (1984); Hilz, M.E. et. al., Anti-inflammatory Activity of a COOH-terminal Fragment of the Neuropeptide α-MSH, -Actividad antiinflamatoria de un fragmento COOH-terminal del neuropéptido α-MSH-, FASEB H. 3, 2282 - 2284 (1989).

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Adicionalmente a esta función antiinflamatoria y antipirética, la α-MSH y / o sus derivados, involucran la actividad antimicrobiana o antiinfección. Tal y como se describe más abajo, a continuación, la α-MSH y / o sus derivados, tienen unos significativos usos anti-infecciosos, incluyendo, por ejemplo, el uso en la reducción de la viabilidad de microbios, reduciendo la germinación de las levaduras, matando microbios, sin reducir la supresión de microbios mediante neutrófilos humanos, para tratar la inflamación asociada con la infección microbiana, sin reducir la eliminación microbiana, incrementando la acumulación de cAMP en microbios, e inhibiendo la replicación y expresión de patógenos víricos.

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Estas actividades antimicrobianas o antiinfección, se encuentra mayormente asociadas con la KPV de secuencia de aminoácidos C-terminal. Este tripéptido, conjuntamente con la α-MSH y sus derivados, son efectivos en una amplia gama de concentraciones, incluyendo las concentraciones picomolares que acontecen de una forma natural en el plasma humano.

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Tal y como se revela en la sección de los antecedentes y trasfondo, las patologías o condiciones uro-genitales, no se encuentran confinadas a una causa individual. Múltiples organismos y agentes infecciosos, desde las bacterias y hongos hasta los virus, individualmente o en combinación, pueden provocar una amplia variedad de patologías o condiciones, incluyendo la vaginitis, vulvitis, uretritis, balanopostitis, candidiasis, enfermedades de transmisión sexual, y síndrome del shock tóxico. Para tratar estas patologías, los dímeros de la invención, pueden aplicarse localmente, al sitio de la infección y / o inflamación, mediante procedimientos conocidos en el arte de esta técnica especializada. Así, por ejemplo, los dímeros de la presente invención, pueden disolverse en soluciones tales como el suero salino de tampón fosfato, hialurinato, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, ó etanol. Los vehículos o portadores usuales, tales como los ungüentos, cremas, geles, píldoras solubles, proyecciones pulverizables (sprays), supositorios, soluciones líquidas para duchas, o el material absorbente de tampones, pueden portar los dímeros de la invención. Estos vehículos o portadores, pueden aplicarse al sitio de la infección o inflamación, mediante un aplicador, tal como jeringas o aparatos semejantes a las jeringas, vendajes, catéteres, tubos provistos de un émbolo, espátula, u otros tipos de aplicadores de superficie plana, condones, esponjas, diafragmas, aplicadores tampones, o dedos.

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De una forma más específica, una forma preferida de presentación de la presente invención, es la de disolver los dímeros de la invención, en un vehículo o portador basado en líquidos. Este portador o vehículo que porta los dímeros solvatados, se almacenan en un recipiente (lata) presurizado. Después de liberar el vehículo mediante una válvula de descarga u otro tipo de mecanismos, a partir del recipiente presurizado, se forma un aerosol de espuma, y se captura en una jeringa o en un aparato de tipo jeringa. A continuación, la jeringa, se inserta en la vagina y, sus contenidos, se suministran al interior del canal vaginal. La jeringa o el aparato de tipo jeringa y su apertura, puede también moldearse a diferentes tamaños, formas y longitudes, para acomodar la inserción en diferentes áreas uro-genitales, tales como la uretra o el recto.

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Además, un supositorio, puede comprender un portador o vehículo, tal como un gel o glicerina que sean sólidos, o semi-sólidos, a la temperatura ambiente, pero que fundan a la temperatura corporal, cuando se insertan en la vagina o en el recto. Este vehículo o portador, el cual porta los dímeros de la invención, solvatados, se suministran al interior del sitio de la patología o condición uro-genital, cuando el vehículo o portador funde.

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El suministro de los dímeros de la invención, al área exterior del área uro-genital, tal como la vulva o las glándulas o el prepucio del pene, puede lograrse mediante la aplicación tópica de una crema, un ungüento, un gel, una proyección pulverizada (spray), o un bálsamo, cuyas composiciones, son bien conocidas en el arte de la técnica especializada.

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Los tampones, pueden también tratarse con los dímeros de la presente invención, durante el proceso de fabricación. La presencia de tales tipos de dímeros, en los tampones, puede inhibir el crecimiento de microorganismos tales como el Staphylococcus aureus, el cual secreta la toxina del síndrome del shock térmico (TSST-1). Los procedimientos para fabricar tampones, son ya bien conocidos en el arte de la técnica especializada. El tratamiento del material absorbente del tampón, con tales tipos de dímeros, puede realizarse procediendo, en primer lugar, a remojar o empapar el material absorbente, en una solución de los dímeros de la invención. A continuación, puede dejarse secar el material absorbente. De una forma alternativa, los dímeros, pueden esparcirse mediante rociado, en el material absorbente del tampón, como una materia secante en forma de polvo.

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Los dímeros de la invención, pueden también suministrarse al sitio de la infección, mediante la utilización de contraceptivos tales como los condones, diafragmas, esponjas, u otros mecanismos del tipo barrera, utilizados para la prevención del embarazo o de las enfermedades de transmisión sexual. Los dímeros de la invención, pueden disolverse en el lubricante utilizado en los condones, en el gel o la espuma utilizados conjuntamente con los diafragmas, o en cualquier otro tipo de solución espermicida utilizada conjuntamente con los condones, diafragmas o esponjas. Los dímeros de la presente invención, pueden también disolverse en un líquido, para uso con una ducha. El líquido, puede suministrarse mediante la ducha, al interior de la vagina, para tratar la infección y / o inflamación.

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Los ejemplos que se facilitan a continuación, demuestran la capacidad y aplicación de los dímeros de la presente invención, para combatir la infección. Los procedimientos en microbiología, biología molecular, y cultivo celular utilizados, pero no explícitamente descritos en esta revelación, han sido ya reportados en la literatura científica. Estos procedimientos, se encuentran bien dentro la capacidad inherente a las personas especializadas en el arte de esta técnica especializada. Los péptidos utilizados en los ejemplos que se facilitan a continuación, incluyen: α-MSH(1-13) (SEQ. ID. NO. 4), (4-10) (SEQ. ID. 002), (6-13) (SEQ. ID. 003), y (11-13) (SEQ. ID. NO. 1), todos los cuales, se N-acetilaron y C-amidaron, y ACTH (1-39) y (18-39) (CLIP). Estos péptidos, se prepararon mediante síntesis de péptidos en fase sólida, y se purificaron mediante cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa. Algunos ejemplos, incluyen también un dímero de la secuencia de aminoácidos CKPV) (SEQ. ID. NO. 8), el cual también se N-acetiló y C-amidó (el “dímero KPV”). La figura 16, muestra una representación de la estructura química de este dímero KPV. Los dímeros, se forman procediendo a añadir cisteínas en los N-terminales de cualquiera de los polipéptidos anteriormente citados, y permitiendo el que dos polipéptidos, formen un enlace disulfuro. Utilizando este procedimiento, pueden formarse ambos, homo-dímeros y hetero-dímeros.

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La trascendencia significativa estadística dada a conocer en los ejemplos que se facilitan a continuación, se analizó utilizando un análisis de varianza de una sola ruta y el test de ensayo del investigador. Los valores de probabilidad mayores a 0,05, se consideraron de una forma significativa. 30

Ejemplo I Este ejemplo, ilustra las propiedades anti-microbianas de una α-MSH y / o sus derivados, contra el Staphylococcus aureus.

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Se obtuvieron cultivos de S. aureus (ATCC 29213), procedentes de la colección del Departament of Microbiology, Ospedale Maggiori di Milano. Se procedió a incubar S. aureus (1 x 106 / ml en una solución de sal equilibrada, de Hank), en presencia o ausencia de α-MSH (1-13) (SEQ. ID. NO. 4), α-MSH (11-13) (SEQ. ID. NO. 1), o el dímero de KPV, a unas concentraciones correspondientes a una gama comprendida dentro de unos márgenes que van de 10−15 a 10−4 M, durante un transcurso de tiempo de dos horas, a una temperatura de 37◦ C. Se procedió, a continuación, a lavar las células, en agua destilada fría, y se diluyeron con HBSS, a una concentración de 100 organismos/ml. Se dispensaron alícuotos de un mililitro, en placas de agar, de sangre, y se incubaron durante un transcurso de tiempo de 24 horas, a una temperatura de 37◦ C. Se procedió a estimar la viabilidad de los microorganismos, a partir de las colonias formadas. En otro juego de experiencias, se procedió también a incubar 500 unidades de uroquinasa, un mejorador del crecimiento de S. aureus, con las bacterias (105 /100 ml), durante un transcurso de tiempo de cuatro horas, a una temperatura de 37◦ C, en una baño de agua agitada, conjuntamente con los péptidos. La figura 1, muestra el hecho de que, la α-MSH (1-13) (SEQ. ID. NO. 4), la α-MSH (11-13) (SEQ. ID. NO. 1), y el dímero de KPV, inhiben, todos, ellos, la formación de colonias de S. aureus. Estos efectos inhibitorios, acontecen en una amplia gama de concentraciones, y fueron significativos (p > 0,01), con concentraciones de péptidos de 10−12 a 10−4 M. La figura 2, muestra el hecho de que, la α-MSH (1-13) (SEQ. ID. NO. 4), y la α-MSH (11-13) (SEQ. ID. NO. 1), a concentraciones de 10−6 M, contrarrestan, de una forma significativa, el efecto mejorador de la uroquinasa. Así, de este modo, la α-MSH, ó sus derivados, pueden inhibir el crecimiento de Staphylococcus aureus, un agente que se conoce que causa el síndrome del shock, asociado con el uso del tampón, vaginitis, UTIs, uretritis y balanopsotitis.

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Ejemplo II Este ejemplo, ilustra las propiedades antifúngicas de un la α-MSH y / o sus derivados, contra la Candida albicans. 60

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Se obtuvieron, también, aislamientos de C. albicans, a partir de la colección del Departament of Microbiology, Ospedale Maggiori di Milano. Los cultivos de C. albicans, se mantuvieron en inclinaciones de agar, de Sabouraud, y se transfirieron periódicamente a placas de Sabouraud, y incubaron durante un transcurso de tiempo de 48 horas, a una temperatura de 28◦ C. Para preparar levadura en fase estacionaria, se recogió una colonia procedente de la placa de agar, se transfirió a 30 ml de caldo de Sabouraud-dextrosa, y se incubó durante 72 horas a una temperatura de 32◦ C. Las células, se centrifugaron a 1000 x g, durante 10 minutos y, el gránulo (pellet), se lavó dos veces con agua destilada. Se contaron las células, y se suspendieron en solución de sal equilibrada de Hank (“HBSS”), a la concentración deseada. La viabilidad, determinada por exclusión de azul de metileno al 0,01%, permaneció mayor del 98%. 6

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Se procedió a incubar estos hongos, en presencia o ausencia de α-MSH (1-13) (SEQ. ID. NO. 4), α-MSH (11-13) (SEQ. ID. NO. 1), o el dímero de KPV, a unas concentraciones correspondientes a una gama comprendida dentro de unos márgenes que van de 10−15 a 10−4 M, durante un tiempo de dos horas, a una temperatura de 37◦ C. Se procedió, a continuación, a lavar las células, en agua destilada fría, y se diluyeron con HBSS, a una concentración de 100 organismos/ml. Se dispensaron alícuotos de un mililitro, en placas de agar, de sangre, y se incubaron durante un tiempo de 48 horas, a una temperatura de 37◦ C. Se procedió a estimar la viabilidad de los microorganismos, a partir de las colonias formadas. La figura 3, muestra el hecho de que, la α-MSH (1-13) (SEQ. ID. NO. 4), la α-MSH (11-13) (SEQ. ID. NO. 1), y el dímero de KPV, reducen fuertemente la capacidad del S. albicans, para formar una colonia, a unas concentraciones correspondientes a una gama comprendida dentro de unos márgenes de 10−12 a 10−4 M (p< 0.01 vs. control). Así, de este modo, esto demuestra el hecho de que, la α-MSH, o sus derivados, pueden inhibir el crecimiento de Candida albicans, un agente que se conoce que puede provocar candidiasis, vaginitis, uretritis, y balanopostitis, Ejemplo III (No perteneciente a la invención)

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Este ejemplo, compara las actividades antiinfecciosas de la α-MSH y / o sus derivados, con respecto al fluconazol, un agente antifúngico establecido. Se procedió a someter a test de ensayo, las α-MSH (1-13) (SEQ. ID. NO. 4), (4-10) (SEQ. ID. NO. 2), (6-13) (SEQ. ID. NO. 3), (11-13) (SEQ. ID. NO. 1), ACTH (1-39), (18-39), y fluconazol, a unas concentraciones correspondientes a una gama comprendida dentro de unos márgenes que van de 10−6 a 10−4 M, contra la C. albicans, utilizando el mismo procedimiento que en el ejemplo II. La figura 4, muestra el hecho de que, comparado con el fluconazol, las α-MSH (113) (SEQ. ID. NO. 1), (6-13) (SEQ. ID. NO. 3), y (1-13) (SEQ. ID. NO. 4), eran más efectivas contra la C. albicans. Sus actividades inhibitorias, eran similares a las del fluconazol, a las mismas concentraciones molares. Como contraste de ello, la secuencia de α-MSH (4-10) (SEQ. ID. NO. 2) “núcleo”, la cual tenia efectos de comportamiento, pero poca actividad antiinflamatoria, provocó aproximadamente un 50% menos de inhibición de unidades de formación de colonias (CFU). Si bien este efecto inhibidor eras substancial (p < 0,01 vs. control), éste era substancialmente menos potente que los fragmentos de α-MSH que portaban la secuencia de señal de KPV, es decir, las α-MSH (6-13) (SEQ. ID. NO. 3) y (11-13) (SEQ. ID. NO. 1) (p < 0,01), o la molécula progenitora α-MSH (1-13) (p < 0,05). La figura 4, muestra asimismo el hecho de que, la ACTH (1-39) y el fragmento de ACTH (18-39), no reducía la viabilidad de la C. albicans. Incluso a una concentración mayor de 10−4 M, la cual no se muestra en las figuras, los péptidos ACTH, eran igualmente inefectivos. Así, de este modo, este ejemplo demuestra el hecho de que, la α-MSH o sus derivados, son tan efectivos como el fluconazol, en la inhibición del crecimiento de Cándida.

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Ejemplo IV (No perteneciente a la invención)

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Este ejemplo, ilustra el hecho de que, la α-MSH y sus derivados, inhiben la geminación o la formación tubular de gérmenes de C. albicans. La formación tubular de gérmenes, es una parte significativa de la patogénesis de la infección por C. albicans. Esta patogénesis, involucra la adhesión a células huéspedes epiteliales y endoepiteliales y el cambio morfológico del blastoporo elipsoide a varias formas filamentosas, por ejemplo tubos de gérmenes, pseudohifas e hifas. Gow, N.A. Germ Tube Growth of Candida albicans, -Crecimiento de tubos de germens de Candida albicans, Curr. Topicis Med. Myco 8, 43 - 55 (1997).

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La C. albicans procedente de los cultivos de fase estacionaria, se lavaron dos veces con agua destilada, y se suspendieron en HBBS, a una concentración final de 2 x 106 /ml. Se procedió a inducir el crecimiento hifal, mediante la adición de suero de caballo inactivado al 10%, (GIBCO / BRL), Paisley, Gran Bretaña), a levadura incubada durante 45 minutos a 37◦ C, con agitación continua. Se procedió, a continuación, a eliminar el suero de caballo, mediante el lavado de células, dos veces, con HBSS, y se continuó adicionalmente con la incubación, durante un tiempo de 60 minutos, a una temperatura de 37◦ C, en presencia de α-MSH (1-13) (SEQ. ID. NO. 4), (6-13) (SEQ. ID. NO. 3) ó (1113) (SEQ. ID. NO. 1), ACTH (1-39), (18-39), a una concentración de 10−6 , con agitación continua. El porcentaje de células filamentosas, se evaluó con un microscopio de luz, con la ayuda de un hemocitómetro. Los experimentos, se llevaron a cabo por triplicado, y se marcaron por lo menos 200 células. Se procedió a tomar fotomicrográficos, con una cámara MC100, unida a un microscopio Zeiss del tipo Axioscop. Las figuras 5A a 5D, muestran el hecho de que, la incubación de C. albicans con α-MSH (1-13) (SEQ. ID. NO. 4), ó (11-13) (SEQ. ID. NO. 1), inhibía la formación de tubos de gérmenes, inducida por suero de caballo. La α-MSH (113) (SEQ. ID. NO. 4), provocó un porcentaje del 28 - 32% de reducción, en el número de células filamentosas, mientras que, la α-MSH (11-13) (SEQ. ID. NO. 1), provocaba la reducción de un porcentaje del 54 - 58%. Si bien no se muestra en las figuras, la α-MSH (6-13) (SEQ. ID. NO. 3), tenía, de una forma similar, aproximadamente un porcentaje del 50% de reducción en el número de células filamentosas. Así, de este modo, esto demuestra el hecho de que, la α-MSH ó sus derivados, pueden inhibir un modo de patogénesis de Candida, inhibiendo su formación de tubos de gérmenes. 7

ES 2 251 982 T3 Ejemplo V (No perteneciente a la invención) 5

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El sacrificio reducido de patógenos, es una consecuencia directa de la terapia con corticosteroides y de otros fármacos antiinflamatorios no esteroides, durante la infección. Stevens, D.L., Could Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs (NSAIDs) Enhance Progression of Bacterial Infections to Toxic Shock Síndrome?, -¿Podrían los fármacos no esteroides antiinflamatorios mejorar la progresión de infecciones bacterianas al síndrome del shock térmico?-, Clin. Infect. Dis. 21, 977 - 80 (1997); Capsoni, F., et. al., Effect of Corticosteroids on Mutrophil Function: Inhibition of Antibody-dependent Cell-Mediated Cytotoxicity (ADCC), -Efecto de los corticosteroides en la función neutrófila: inhibición de la citotoxicidad mediatizada por células anticuerpo-dependientes (DAC). J. Immunopharmacol. 5, 217 30 (1983). Este ejemplo, ilustra el hecho de que, la α-MSH y / o sus derivados, inhiben el crecimiento de los agentes infecciosos sin comprender la capacidad de los neutrófilos humanos, para combatir estas infecciones. Este ejemplo, muestra adicionalmente el hecho de que, la α-MSH o sus derivados, pueden realmente mejorar la capacidad de los neutrófilos, para eliminar (matar) estos agentes infecciosos. Se procedió a anticoagular con heparina, sangre venosa (20 ml) procedente de varios voluntarios sanos. Se procedió, a continuación, a aislar los neutrófilos, utilizando sedimentación de dextrano y centrifugación con Ficoll-Hypaque (Sigma Chemical Co. St. Louis, Missouri, USA). Los eritrocitos, se lisaron, vía shock hipotónico, representando, los neutrófilos resultantes, por un menos un porcentaje del 97% de la suspensión celular. La viabilidad celular, estimada mediante exclusión azul de tripano, era mayor de un porcentaje del 98%. Los neutrófilos, se resuspendieron en HBSS, para los experimentos. Se procedió a opsonificar la C. albicans (1 x 106 , con suero humano AB, en un baño agua agitada, durante un tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 37◦ C. Éstos se incubaron con neutrófilos, en presencia de medio solo, o medio con α-MSH (1-13) (SEQ. ID. NO. 4), ó α-MSH (1-13) (SEQ. ID. NO. 1), en concentraciones correspondientes a una gama comprendida entre unos márgenes de 10−15 a 10−4 M, en un baño de agua agitada, durante un tiempo de dos horas, a una temperatura de 37◦ C. Después de la incubación, los tubos de cultivo, se emplazaron sobre hielo, para parar el crecimiento y, los organismos extracelulares, se lavaron dos veces, con centrifugación, a 1000-x g, a una temperatura de 4◦ C. Se procedió a añadir, a la suspensión, una solución de desoxicolato sódico al 2,5% y, los tubos, se agitaron durante un tiempo de 5 minutos. Se procedió, a continuación, a añadir agua destilada, para obtener una suspensión de 106 células/ml. Se realizó la dilución de dos series 1/100, en HBSS, para obtener una suspensión final de 100 células/ml. Se procedió, a continuación, a dispensar alícuotos de un mililitro, en placas de agar, de sangre, y se incubaron durante un tiempo de 48 horas, a una temperatura de 37◦ C. Se contaron las unidades formadoras de colonias al final del período de incubación, con experimentos que avanzaron en triplicados, y se repitieron utilizando sangre procedente de diferentes donantes.

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La figura 6, muestra el hecho de que, las α-MSH (1-13) y (11-13) (SEQ. ID. NO. 1), mejoran realmente el sacrificio (eliminación) de neutrófilos de C. albicans, cuando se administran a concentraciones correspondientes a una gama comprendida dentro de unos márgenes que van de 10−12 a 10−4 M (p < 0,01). Ésta muestra que, este sacrificio intensificado, acontece en una gama de concentraciones muy amplia, incluyendo la concentración micromolar, la cual es igual a la concentración de α-MSH humana, encontrada en el plasma humano.

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Así, de esta forma, este ejemplo, demuestra el hecho de que, la α-MSH o sus derivados, pueden combatir de una forma simultánea, contra la infección y la inflamación, lo cual puede también aplicarse a la candidiasis, vaginitis, uretritis, balanopostitis, o hemorroides. Ejemplo VI

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(No perteneciente a la invención) Este ejemplo, sugiere el mecanismo celular, mediante el cual, la α-MSH o sus derivados ejercen sus propiedades anti-microbianas, en general, y propiedades antifúngicas, en particular.

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Se procedió a incubar C. albicans (106 /ml), permeabilizada con tolueno / etanol, a una temperatura de 37◦ C, mediante agitación continua, en presencia o ausencia de 10−6 M α-MSH (1-13) (SEQ. ID. NO. 4), (11-13) (SEQ. ID. NO. 1), o forscolina, un agente que se conoce que incrementa el cAMP intramuscular. Las reacciones, se pararon después de un tiempo de tres minutos, mediante la adición de etanol enfriado con hielo. Los niveles de cAMP, se midieron en duplicados, utilizando un equipo comercial, a modo de kit, de inmunoensayo enzimático (Amersharm, Reino Unido), después de la extracción vía el procedimiento en fase líquida, en concordancia con las instrucciones del fabricante. En un experimento relacionado, se procedió también a exponer la C. albicans, a didesoxiadenosina (ddAdo, Sigma), un potente inhibidor de adenililciclasa, a concentraciones de 25, 50, y 100 x 10−5 M, durante un tiempo de dos horas, y a α-MSH o sus derivados, durante un tiempo adicional de dos horas. Los efectos de la forscolina y ddAdo, en la capacidad de la C. albicans, para formar colonias, se determinaron en concordancia con los procedimientos descritos en el ejemplo II.

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La figura 7, muestra el hecho de que, las α-MSH (1-13) (SEQ. ID. NO. 4) y (11-13) (SEQ. ID. NO. 1), mejoraban el contenido de cAMP en la C. albicans. Este incremento de cAMP, era del mismo orden de magnitud que el que se inducía mediante forscolina equimolar. La figura 8, muestra el hecho de que, conjuntamente con las α-MSH (1-13) (SEQ. ID. NO. 4) y (11-13) (SEQ. ID. NO. 1), la forscolina, inhibía también de una forma significativa el crecimiento de C. albicans relativo al control. La figura 9, muestra el hecho de que, la ddAdo, tiene la capacidad de invertir el efecto de las α-MSH (1-13) (SEQ. ID. NO. 4) y (11-13) (SEQ. ID. NO. 1), en el crecimiento de la C. albicans. Este ejemplo, demuestra el hecho de que, la α-MSH y sus derivados, inhiben de la forma más verosímil, el crecimiento de C. albicans y de otros microorganismos, procediendo a incrementar su nivel de cAMP, el cual, a su vez, inhibe la síntesis de mRNA y de proteína. Véase, por ejemplo, Bhattacharya A., et. al., Effect of Cyclic AMP on RNA and Protein Synthesis in Candida albicans, -Efecto del AMP cíclico, en la síntesis de RNA y proteínas, en Candida albicans-, Biochem. Biophisycs. Res. Commun., 77: 1483-44 (1977). Ejemplo VII (No perteneciente a la invención)

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Este ejemplo, ilustra la capacidad de la α-MSH o de sus derivados, para inhibir la replicación vírica en células humanas. De una forma más específica, la α-MSH, inhibió la replicación y expresión de HIV-1, en monocitos humanos crónicamente infectados.

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La línea de células promocítica U1 HIV-1-infectada de forma crónica, es un modelo in vitro de la infección de latente de HIV en monocitos. Estas células, portan copias províricas integradas de HIV, y la expresión constitutiva de HIV, es muy reducida. La replicación vírica, no obstante, según se mide mediante transcripción de RNA, antígeno p24, o liberación de transcriptasa inversa, puede activarse mediante diferentes estímulos, tales como los TNF-α, IL-6, IL-10, PMA o concurrencia acumulativa de células.

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Para determinar los efectos de la α-MSH o sus derivados en la replicación de HIV, estas células, se mantuvieron en fase logarítmica, de crecimiento, en medio de cultivo completo (RPMI 1640 suplementado con Hepes 10 mM), L-glutamina 2 mM (Sigma - Aldrich), FCS inactivada por calor, al 10% (Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA), penicilina a 100 unidades/ml, y estreptomicina a 100 µg/ml (Gibco Laboratories, Grand Island, N.Y. ), en fase logarítmica de crecimiento. Se procedió, en primer lugar, a llevar a cabo experimentos pilotos, con objeto de determinar la densidad de células óptima, la concentración de estímulos, y la cinética de la producción de HIV-1-p24-antígeno, utilizando estas condiciones de cultivo. Antes del uso, las células, se lavaron tres veces con HBSS, para eliminar los virus extracelulares. Se procedió, a continuación, a emplazar las células, en placas de fondo redondeado, de 24 hoyos, a una concentración de 2 x 105 /ml (volumen final de un ml), con medio solo, o más TNF-α (10 ng/ml) (R&D Systems, Oxford, England, UK), en presencia o ausencia de α-MSH (1-13) (SEQ. ID. NO. 4), ó (11-13) (SEQ. ID. NO. 1), en concentraciones de 10−15 a 10−4 M. En experimentos adicionales, se procedió a añadir α-MSH (11-13) (SEQ. ID. NO. 1), sola, a 10−5 M, a células U1, estimuladas con TNF-α (10 mg/ml), IL-6 (20 ng/ml), IL-10 (20 ng/ml) (R&D Systems, Oxford, Inglaterra, UK), PMA (1 mg/ml) (Sigma-Aldrich), o en condiciones de concurrencia acumulada. Se procedió a realizar la acumulación (“crowding”), mediante el sembrado de células U1, a una densidad de 2 x 105 /ml, y manteniéndolas en cultivo a una temperatura de 37◦ C, en CO2 al 5%, sin cambiar el medio durante siete días. Los cultivos activados con citocinas ó PMA, se mantuvieron únicamente durante 48 horas. Se procedió, a continuación, a retirar los sobrenadantes, mediante centrifugación y se ensayaron para antígeno p24, utilizando equipos de ELISA, a modo de kits, procedentes de la firma Cellular Products, Inc., in Buffalo, NY, USA. Se procedió, también, a medir las liberaciones de transcriptasa inversa, utilizando un equipo a modo de kit, comercialmente obtenible en el mercado, del ensayo ELISA Restroys RT, procedente de la firma Innovagen, Lund, Suecia. Para estos experimentos, la adición de α-MSH (11-13) (SEQ. ID. NO. 1), aconteció en un día y, cada condición, se sometió a test de ensayo, en triplicados. La figura 10, muestra el hecho de que, las α-MSH (1-13) (SEQ. ID. NO. 4) y (11-13) (SEQ. ID. NO. 1), inhiben de una forma significativa la liberación del antígeno p24, procedentes de células de U1 estimuladas con TNF-α, en una amplia gama de concentraciones. La concentración más efectiva, para ambos péptidos, era de 10−5 M, causando un 52,7% un 56,0% de inhibición, respectivamente. La figura 11, muestra el hecho de que, la α-MSH (11-13) (SEQ. ID. NO. 1), inhibe también la liberación del antígeno p24 y de transcriptasa inversa, procedente de las células de U1, inducidas por IL-6, IL-10, PMA y en condiciones de concurrencia acumulada. Adicionalmente, la figura 12, muestra el hecho de que, la α-MSH (11-13) (SEQ. ID. NO. 1), inhibe también la trascripción de ambas, las células U1 estimuladas en PMA, de HIV-1-RNA, empalmadas y no empalmadas, según se mide mediante análisis de transferencia de Northern Blot. Así, de este modo, este ejemplo demuestra el hecho de que, la α-MSH o sus derivados, pueden inhibir la transcripción de genes víricos por mediación de las trayectorias de TNF-α, IL-6 e IL-10.

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ES 2 251 982 T3 Ejemplo VIII (No perteneciente a la invención) 5

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Este ejemplo, ilustra adicionalmente la capacidad de la α-MSH, para inhibir la replicación y activación vírica. De una forma más específica, la adición de un anticuerpo neutralizante a la α-MSH, en células U1, incrementaba substancialmente la liberación de antígeno p24. Se procedió a cultivar las células U1, de una forma similar a la que se describe en el ejemplo VII. La α-MSH endógena producida por las células α-MSH, se bloqueó con un anticuerpo de afinidad, purificado, de anti-α-MSH del conejo (Euro-Diagnostica, Malmo, Suecia), diluido a 1:250, con el medio. El anticuerpo de control, era una igG del conejo, a la misma dilución. Las células (2 x 105 /ml) tratadas con anti-α-MSH o el anticuerpo control, se incubaron con medio o PMA (1 ng/ml). Después de un tiempo de 48 horas de incubación, a una temperatura de 37◦ C, los sobrenadantes, se separaron y se sometieron a tests de ensayo, para la liberación del antígeno p24. En experimentos de concurrencia acumulativa (“crowding”) con células U1 cultivadas de la forma que se ha descrito anteriormente, arriba, el anticuerpo anti-α-MSH ó IgG de control, se añadieron a razón de uno por día y, los sobrenadantes, se recolectaron a razón de siete por día. La figura 13, muestra el hecho de que, el bloqueo de α-MSH, en reposo, PMA-inducido ó células U1 acumuladas, incrementaba de una forma significativa, la liberación del antígeno p24. Este ejemplo, implica, de una forma muy fuerte, el hecho de que, la replicación vírica, se afecta mediante una α-MSH. Ejemplo IX

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(No perteneciente a la invención) Este ejemplo, ilustra el mecanismo mediante el cual, la α-MSH o sus derivados, inhiben la replicación y la expresión vírica. De una forma más específica, la α-MSH o sus derivados, inhiben la activación y enlace de NF-κB, TNFα-inducido.

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Para determinar el nivel de actividad NF-κB, se procedió a preparar extractos nucleares, procedentes de 20 x 106 células U1 (2 x 105 /ml, en medio completo), estimulados durante un tiempo de cuatro horas, con TNF-α (20 ng/ml), en presencia o ausencia de 10−5 M α-MSH (SEQ. ID. NO. 1). Las células, se lavaron una vez con PBS frío, y dos veces con tampón A (10 mM Hepes pH 7,9, 1,5 mM MgCl2 , 10 mM KCl, 0,5 mM PMSF y 0,5 mM DTT), se centrifugaron y se incubaron durante un tiempo de diez minutos, en hielo, en tampón A más 0,1% NP-40. A continuación, los sobrenadantes, se retiraron y, los gránulos nucleares, se resuspendieron en 15 µl de tampón C (20 mM Hepes pH 7,9, 1,5 mM MgCl2 , 0,42 M KCl, 0,2 mM EDTA, 25% glicerol, 0,5 mM PMSF, y 0,5 mM DDT), se incubaron durante un tiempo de 15 minutos en hielo, se mezclaron y, a continuación, se centrifugaron. Los sobrenadantes, se diluyeron con 75 µl de tampón modificado D (20 mM Hepes pH 7,9, 0,05 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 20% glicerol, 0,5 mM PMSF, y 0,5 mM DDT), y se almacenaron a una temperatura de -80◦ C. La reacción de enlace, se llevó a cabo durante un tiempo de quince minutos, a la temperatura ambiente, con 10 µg de proteína de extracto de proteína nuclear y 0,5 ng de NF-κB marcada con 32 P (30.000 cpm/µl) ó concenso de AP1 en tampón A (12 mM Tris-HCl pH 7,8, 60 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 0,3 mM DTT), más 10% glicerol, 2 µg/ml de albúmina de suero bovino, y 1 µg(ml de DNA de simple hebra (Pharmacia Biotech). Los oligonucleótidos para NF-κB utilizados en estos estudios, eran: + GAT CCA AGG GGA CTT TCC GCT GGG GAC TTT CCA TG, y - GAT CCA TGG AAA GTC CCC AGC GGA AAG TCC CCT TG. Cada oligonucleótido, se reasoció a su hebra complementaria y se marcó en sus finales con 32 P-γATP, utilizando polinucleótido-quinasa. Para la determinación de las bandas específicas, se procedió, en primer lugar, a incubar extractos nucleares, con sonda no marcada, 100 veces en exceso, durante un tiempo de cinco minutos, antes de la incubación con una sonda marcada. La mezclas, se hicieron avanzar en gel de acrilamida al 5% (30:1), en 1 x TBE. Los geles, se secaron y se autorradiografiaron.

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La figura 14, muestra el hecho de que, el TNF-α, mejoraba de una forma muy extensa la activad de enlace de NFκB, pero, la co-incubación de α-MSH(11-13) (SEQ. ID. NO. 1), a 10−5 M, reducía significativamente la activación de NF-κB, en células en reposo. Esto sugiere el hecho de que, la α-MSH y / o sus derivados, inhiben la replicación y expresión vírica, mediante la regulación del enlace de NF-κB.

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La replicación de agentes víricos, depende, a menudo, del estado de activación de las células infectadas y se regula, a menudo, mediante interacciones entre factores víricos y huéspedes. Estos factores huéspedes, pueden incluir al TNFα, y otros citocinas, tales como las interleucinas. De una forma similar a la infección y activación del HIV-1, el virus del herpes simple, se reactiva también a partir de una latencia, en respuesta a las citocinas huéspedes. Así por ejemplo, el TNF-α y el IL-6, pero no el IL-1 y el IL-3, han venido mostrado que reactivan una infección de HSV. La neutralización de IL-6, con anticuerpo contra el IL-6, inhibía de una forma significativa la reactivación del HSV, mientras que la neutralización del interferón alfa y beta, no lo hacía. Véase, por ejemplo, Baker, M., et. al., The relationship betwen Interleukin-6 and Herpes Simplex Virus Type-1: Implications for Behavior and Immunopathology, -La relación entre la interleucina-6 y el virus del Herpes simple, tipo-1. Implicaciones para el comportamiento e inmunopatología-, Brain Beba. Immun. 13(3) : 201-11 (1999); Noisakran S. et. al., Lymphocytes Delay Kinetics of HSV-1 Reactivation from in vitro Explants of Latent Infectet Trigerminal Ganglia, -La cinética de retardo de los linfocitos de la reactivación del HSV-1, a partir de explantes in vivo de ganglios trigerminales latentes, J. Neuroimmunol. 95 (1-2): 126 - 35 (1999); 10

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Walev, I., et. al., Enhancement by TNF-alpha of Reactivation and Replication of Latent Herpes Simplex Virus from Trigerminal Ganglia of Mice, -Intensificación, mediante TNF-alfa, de la reactivación y replicación del virus del herpes simple, a partir de ganglios trigerminales de ratones-, Arch. Virol. 140 (6): 987 - 92 (1995); Domk-Optiz, I., et. al., Stimultation of Macrophages by Endotoxin Results in the Reactivation of a Persistent Herpes Simplex Virus Infection, Estimulación de macrófagos mediante resultados de endotoxinas, en la reactivación de una infección persistente del virus de herpes simple-, Scand J. Immunol. 32(2) 69 - 75 (1990); Fauci, A.S., Host Factors in the Pathogenesis of HIV-induced Diseasa, -Factores huéspedes en la patogénesis de enfermedad HIV-inducida-, Nature 384: 529 (1996). El TNF-α ó la infección mediante virus, incluyendo el HSV, pueden provocar la destrucción pretendida como diana de IκB, la cual, a su vez, activa la trasposición nuclear del NF-κB. La trasposición nuclear, fomenta el enlace del NF-κB a operadores de DNA, para la transcripción de una gama de agentes inflamatorios, incluyendo los TNF-α, IL6 y otras citocinas. La expresión de estas citocinas, otra vez, reactivan adicionalmente otras células HSV-infectadas, para producir virus HSV. Véase, por ejemplo, Patel A., et. al., Herpes Simples Type 1 Induction of Persistent NF-κB Nuclear Translocation Increases the Efficiency of Virus Replication, La inducción del Herpes simple del tipo 1, de la trasposición nuclear persistente de NF-κB, incrementa la eficacia de la replicación vírica-, Virology 257(2): 212 - 22 (1998). Así, de este modo, procediendo al bloqueo del enlace del NF-κB, la α-MSH y / o sus derivados, inhiben la expresión de citocinas más inflamatorias, que pueden reactivar el HSV. Este ejemplo y los ejemplos VII y VIII, muestran el hecho de que, la α-MSH y / o sus derivados, inhiben la replicación, expresión y reactivación vírica, mediante la inhibición del enlace de NF-κB, como respuesta a citocinas corporales u otra infección vírica. Ejemplo X

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(No perteneciente a la invención) Este ejemplo, ilustra la capacidad de la α-MSH y / o sus derivados, para inhibir la replicación vírica en células humanas infectadas de forma aguda. De una forma más específica, la α-MSH inhibía la replicación de la expresión de HIV-1, en células mononucleares de sangre humana periférica, infectadas de una forma aguda (PBMCs).

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Se procedió a aislar PBMCs, procedentes de donantes normales, mediante centrifugación de gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque. Se aislaron monocitos mediante gradiente de Percoll, y se dejó que se diferenciaran en macrófagos (MDM), en medio completo de RPMI más 20% FCS, utilizando una placa de cultivo de tejidos, de 24 hoyos, a 106 células/ml, durante un tiempo de siete días. Los MDM, se infectaron con la cepa HIVBA-1 (1:10), durante el transcurso de toda la noche. El pié vírico no diluido, contenía 107 unidades infecciosas / ml. Después de un tiempo de 24 horas, los MDM, se lavaron y resuspendieron en medio completo, y se reemplazaron tres veces por semana, durante tres semanas. Las liberaciones de transcriptasa inversa, se midieron semanalmente, post-infección, utilizando un equipo, a modo de kit, comercialmente disponible en el mercado, del tipo de ensayo de ELISA Retrosys RT, y procedente de la firma Innovagen. Lund, Suecia. Se procedió a añadir 10−5 M α-MSH (11-13) (SEQ. ID. NO. 1), al tiempo de la infección de HIV y, diariamente, hasta las recolecciones. La figura 15, muestra el hecho de que, la α-MSH, inhibía la liberación de transcriptasa inversa, en MDM infectado de forma aguda. Este efecto inhibitorio, era más pronunciado, en el día seis, pero era todavía estadísticamente significativo, en el día 21.

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Así, de este modo, este ejemplo, demuestra el hecho de que, la replicación vírica, en el sitio de infección, puede inhibirse mediante α-MSH o sus derivados. Por consiguiente, la transmisión sexual de enfermedades venéreas, en general, y el HIV, en particular, puede inhibirse procediendo a asociar la α-MSH y / o sus derivados, con contraceptivos tales como los condones, diafragmas, o esponjas, durante el contacto sexual y / o la aplicación post-contacto sexual de supositorios, cremas, ungüentos, geles, o espumas aerosoles, que contengan α-MSH y / o sus derivados. Ejemplo XI (No perteneciente a la invención)

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Este ejemplo, ilustra los equivalentes funcionales biológicos de la α-MSH y / o sus derivados. A pesar del hecho de que, las secuencias específicas de aminoácidos descritas aquí, son efectivas, está claro, para aquellas personas especializadas en el arte esta técnica, el hecho de que, los aminoácidos, pueden sustituirse o suprimirse, sin alterar la efectividad de los péptidos. Adicionalmente, se conoce el hecho de que, la estabilización de la secuencia de α-MSH, puede incrementar ampliamente la actividad del péptido, y que, la sustitución de formas de D-aminoácido, por formas L, pueden mejorar o disminuir la efectividad de los péptidos. Así, por ejemplo, un análogo estable de α-MSH, [Nle4 , D-Phe7 ]-α-MSH, el cual se conoce que tiene una marcada actividad en las células de melanocitos y melanomas, es aproximadamente diez veces más potente que el péptido progenitor, en la reducción de la fiebre. Adicionalmente, al añadir aminoácidos al terminal C de la α-MSH(11-12) (SEQ. ID. NO. 1), puede reducirse o intensificarse la potencia antipirética. La adición de glicina, para formar la secuencia 10-13 (SEQ. ID. NO. 5), hizo decrecer ligeramente la potencia; la secuencia 9-13 (SEQ. ID. NO. 6), se encontraba casi desprovista de actividad, mientras que, la potencia de la secuencia 8-13 (SEQ. ID. NO. 7), era mayor que la de la secuencia 1111

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13 (SEQ. ID. NO. 1). Se conoce el hecho de que la Ac[D-K11]-α-MSH 11-13-NH2, tiene la misma potencia general que la forma L del tripéptido α-MSH (11-13) (SEQ. ID. NO. 1). No obstante, la sustitución con D-prolina, en la posición 12 del tripéptido, convertía a éste en inactivo. Véase, por ejemplo, Holdeman, M. et. al., Antipyretic Activity of a Potent α-MSH Analog, -Actividad antipirética de un potente análogo de α-MSH-, Peptides 6, 273 - 5 (1985). Deeter, L.B. et. al., Antipyretic Properties of Centrally Administered α-MSH Fragments in the Rabbit, -Propiedades antipiréticas de fragmentos de α-MSH centralmente administrados, en el conejo-, Peptides 9, 1285 - 8 (1989), Hilz, M.E., Anti-inflammatory Activity of α-MSH (11-13) Analogs: Influences of Alterations in Sterochemistry, Actividad antiinflamatoria de análogos de la α-MSH (11-13): Influencias de las alteraciones en esteroquímia-, Péptides 12, 76771 (1991).

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Pueden también obtenerse equivalentes funcionales biológicos, mediante la sustitución de aminoácidos que tengan similares valores hidropáticos. Así, de esta forma, por ejemplo, la isoleucina y la leucina, que tienen un índice hidropático de +4,5 y +3,8, respectivamente, pueden sustituirse por valina, la cual tiene un índice hidropático de +4,2, y obtenerse todavía una proteína que tenga una actividad biológica semejante. De una forma alternativa, en el otro lado de la escala, la lisian, puede sustituirse por arginina (-4,5), y así sucesivamente. En general, se cree que, los aminoácidos, pueden sustituirse, de una forma exitosa, en donde, tal tipo de aminoácido, tiene una marca (entalladura) hidropática, de una unidad de índice hidropático de +/- 1, del aminoácido reemplazado. Adicionalmente, estos análogos modificados de α-MSH y / o sus derivados, pueden también formar dímeros, tal y como se ejemplifica mediante el dímero KPV, en la figura 16. Ejemplo XII

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Una mujer, experimentaba un malestar en su vagina, vulva y / o tracto urinario. Un reconocimiento por parte del médico, puede incluir el tomar un cultivo de esta área. Después de determinar la causa del malestar, incluyendo cualquier infección o inflamación, el médico, puede prescribir un antibiótico, un fármaco anti-fúngico, anti-vírico, o anti-inflamatorio, allí en donde fuere apropiado. Adicionalmente, el tratamiento, puede incluir una aplicación tópica, de cantidades farmacológicamente efectivas de α-MSH y / o sus derivados, portados en un ungüento, crema, gel, píldora soluble, aerosol proyectable por pulverización (spray), supositorio, solución líquida para ducha, o el material absorbente de tampones. El tratamiento tópico, puede aplicarse una vez o múltiples veces, en concordancia con la discreción del médico, hasta que se resuelva la patología. Este ejemplo, allí en donde sea apropiado, según la discreción del médico, puede también aplicarse a un hombre, el cual experimente un malestar en su pene, testículos, y / o tracto urinario. Adicionalmente, esta aplicación tópica de α-MSH y / o sus derivados, puede también lograrse sin un médico, como por ejemplo, un fármaco de venta libre.

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ES 2 251 982 T3 REIVINDICACIONES

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1. Un dímero que comprende dos polipétidos ligados conjuntamente, en donde, los polipéptidos, comprenden, en sus términos C, una secuencia de aminoácidos, seleccionada de entre el grupo consistente en KPV (SEQ. ID. NO: 1), MEHFRWG (SEQ. ID. NO: 2), HFRWGKPV (SEQ. ID. NO: 3), y SYSMEHFRWGKPV (SEQ. ID. NO: 4). 2. El dímero de la reivindicación 1, en donde, los polipéptidos, se encuentran ligados en sus términos N.

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3. El dímero de la reivindicación 1 ó 2, que tiene la fórmula:

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4. El dímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde, el dímero, es un homodímero o un heterodímero. 5. El dímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde, el dímero, está N-acetilado ó C-amidado, o ambos.

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6. Una composición que comprende un dímero como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-5. 7. La composición de la reivindicación 6, comprende adicionalmente un portador o vehículo seleccionado de entre el grupo consistente en un gel, un ungüento, una espuma, un bálsamo, una crema, una píldora soluble, un aerosol proyectable por pulverización (spray), una espuma aerosol, una solución líquida o una ducha.

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8. La composición de la reivindicación 7, la cual comprende adicionalmente un aplicador seleccionado entre el grupo consistente en jeringas, vendajes, catéteres, y espátulas. 40

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ES 2 251 982 T3 LISTA DE SECUENCIAS Lipton, J.M., Catania A. P., Zengen, Inc. 5

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UN SISTEMA DE TRATAMIENTO DE PATOLOGÍA URO-GENITAL 252/100 PCT/US 00/07846 2000-03-23 US 60/126,233 1999-03-24 8 Microsoft Word 1 3 PRT Secuencia artificial Polipétido diseñado, con propiedades anti-inflamatorias, antimicrobianas, antifúngicas, y anti-víricas. 1 Lys Pro Val 1

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2 7 PRT Secuencia artificial Polipétido diseñado, con propiedades anti-inflamatorias, antimicrobianas, antifúngicas, y anti-víricas. 2 Met Glu His Phe Arg Trp Gly 1 5 3 8 PRT Secuencia artificial Polipétido diseñado con propiedades anti-inflamatorias, antimicrobianas, antifúngicas, y anti-víricas. 3 His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val 1 5 4 13 PRT Secuencia artificial alfa-MSH con propiedades anti-inflamatorias, antimicrobianas, antifúngicas, y anti-víricas.

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ES 2 251 982 T3 4 Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val 1 5 10 5

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5 4 PRT Secuencia artificial Polipéptido diseñado con propiedades anti-inflamatorias, antimicrobianas, antifúngicas, y anti-víricas. 5 Gly Lys Pro Val 1

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Trp Gly Lys Pro Val 1 5 35

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7 5 PRT Secuencia artificial Polipéptido diseñado con propiedades anti-inflamatorias, antimicrobianas, antifúngicas, y anti-víricas. 7 Arg Trp Gly Lys Pro Val 1 5 8 4 PRT Secuencia artificial Polipéptido diseñado con propiedades anti-inflamatorias, antimicrobianas, antifúngicas, y anti-víricas. 8 Cys Lys Pro Val 1

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