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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 238 728

51 Int. Cl. : C12N 15/12

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C07K 14/705 C07K 16/30 A61K 38/17 G01N 33/50 C12Q 1/68

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 97940155 .1

86 Fecha de presentación: 02.09.1997

87 Número de publicación de la solicitud: 0939813

87 Fecha de publicación de la solicitud: 08.09.1999

54 Título: Gen asociado al carcinoma de mama.

30 Prioridad: 03.09.1996 EP 96114098

73 Titular/es: Roche Diagnostics GmbH

Sandhofer Strasse, 112-132 68305 Mannheim, DE

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

01.09.2005

72 Inventor/es: Weidle, Ulrich y

Schiemann, Sabine

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Isern Jara, Jorge

ES 2 238 728 T3

01.09.2005

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 238 728 T3 DESCRIPCIÓN Gen asociado al carcinoma de mama. 5

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La presente invención se refiere a una composición farmacéutica, a su empleo para el diagnóstico, terapia y prevención de tumores, procedimiento para el diagnóstico, terapia y prevención de tumores, así como anticuerpos y su empleo. El crecimiento incontrolado de células tumorales está provocado por una nueva muestra de la expresión de genes, los cuales gobiernan el control del ciclo celular, la adhesión, angiogénesis, invasividad y finalmente la formación de metástasis (Pardee, Advances in Cancer Res. 65 (1994), 213-227; Ponta et al., Biochem. Biophys. Acta 1198 (1994), 1:10). El curso clínico de las enfermedades tumorales, como por ejemplo, el cáncer de mama, se caracteriza por varios procesos moleculares definidos como por ejemplo el crecimiento dependiente de estrógenos, la resistencia al tamoxifen, la expresión del vimentin, el aumento de la invasividad y finalmente la resistencia cruzada frente a un gran número de medios quimioterapéuticos, la cual recibe a menudo el nombre de resistencia a multidrogas (ver p. ej., Clarke et al., J. Endocrinol. 122 (1989), 331.340; Sommers et al., Cancer Res. 53 (1992), 5190-5197; Sommers et al., Cancer Res. 49 (1989), 4258-4263 y Saceda et al., Mol. Endocrinol. 2 (1988), 1157-1162).

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Es un objetivo central de la investigación tumoral, identificar los genes que participan esencialmente en la aparición y progresión de enfermedades tumorales y a base de estos genes proporcionar nuevos medios para el diagnóstico, prevención o terapia de tumores.

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La presente invención describe la identificación, clonación y caracterización del gen de un polipéptido, el cual recibe el nombre de proteína “PAP” asociada a la progresión. Esta proteína se expresa en la línea celular metastizante MCF-7ADR de carcinoma de mama humano, mientras que en la línea celular MCF-7 de carcinoma de mama no metastizante no se ha encontrado ninguna expresión. La proteína PAP, el ácido nucleico que la codifica, así como los anticuerpos dirigidos contra la proteína, son por todo ello apropiados como agentes para el diagnóstico, terapia o prevención de enfermedades tumorales, en particular del cáncer de mama.

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Mediante la invención se proporciona una composición farmacéutica, la cual se caracteriza porque como componentes activos contiene: (A) un ácido nucleico, el cual comprende:

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(a) la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína representada en SEQ ID No 1, (b) una de las secuencias de (a) en el marco de la correspondiente secuencia de nucleótidos de la degeneración del código genético,

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(c) una secuencia hibridadora con las secuencias a partir de (a) o/y (b) en condiciones estrictas, o (d) un fragmento de por lo menos 20 nucleótidos de longitud, el cual contiene las secuencias de (a), (b) o/y (c),

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(B) un polipéptido o péptido que está codificado por un ácido nucleico según (A), o/y (C) un anticuerpo contra un polipéptido o péptido según (B).

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Debe comprenderse en esta composición que en condiciones estrictas de hibridación, tiene lugar una hibridación también después del lavado a 55ºC, de preferencia a 62ºC y con particular preferencia a 68ºC, en un tampón poco rico en sal (p. ej., 0,2 x SSC, 0,1% de SCS) (ver también Sambrock et al., (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual (“Clonado molecular, un manual de laboratorio”), Cold Spring Harbor Laboratory Press). En una forma de ejecución preferida, la composición farmacéutica contiene además soportes, materias auxiliares o aditivos farmacéuticos habituales. La secuencia de nucleótidos que codifica la proteína representada en SEQ ID No 1, codifica una proteína con una longitud de 157 aminoácidos, la cual corresponde a la secuencia de nucleótidos B4B descritos por Ruegg et al., 1996 (B4B, a Novel Growth-Arrest Gene, Is Expressed by a Subset of Progenitor/Pre-B-Lymphocytes Negative for Cytoplasmic µ-Chain (“B4B un nuevo gen para paralizar el crecimiento expresado por un subgrupo de linfocitos progenitores/Pre-B, negativo para la cadena µ citoplasmática”), Am. Ass. Imm., 1996 pp 72-80), y presenta una homología para las proteínas ya conocidas. En los ensayos efectuados por Ruegg et al., (ver más arriba) la expresión de la proteína B4B debe ocasionar un paro en el crecimiento en las células Cos-7. Por este motivo se propugna el empleo de la proteína B4B como un potencial supresor tumoral.

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Una de estas proteínas es la proteína CL-20 del conejo, la cual es inducida durante la diferenciación de las células traqueales de conejo y se encuentra con mucha frecuencia en los tejidos de placas epiteliales (Marvin, J. Biol. Chem. 270 (1995), 28910-28916). La expresión de la proteína CL-20 no depende de las condiciones de crecimiento, sino que 2

ES 2 238 728 T3 los retinoides que inhiben la diferenciación de las placas epiteliales, reprimen la inducción de la proteína CL-20.

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Otra proteína homóloga a la PAP es la proteína de la membrana epitelial de las ratas EMP-1 la cual se encuentra principalmente en las zonas de proliferación y diferenciación de las glándulas externas del estómago así como en las células epiteliales de la región estomacal (Taylor et al., J. Biol.. Chem. 270 (1995), 28824-28833). Además, la PAP es homóloga a la proteína de mielina periférica PMP22 del hombre, ratón y rata, en la que se trata de una proteína estructural transmembránica asociada a la mielina. La PMP22 es una proteína específica para la inhibición del crecimiento, la cual impide la progresión del ciclo celular (Hayasaka et al., BBRC 186 (1992), 827-831; Edomi et al., Gene 126 (1993), 289-290; Welcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 7195-7198; Spreyer et al., EMBO J. 10 (1991), 3661-3668). A base de los datos de Ruegg et al., y la homología con la proteína PMP22 responsable del mantenimiento del estado de reposo celular, fue altamente sorprendente, que la proteína PAP se expresara selectivamente en la línea celular MCF-7ADR metastizante fuertemente degenerada, pero no en la línea celular MCF-7 menos degenerada. Además, la proteína PAP presenta una alta homología con las proteínas hasta aquí no publicadas, cuyas secuencias están almacenadas en el banco de genes. Estas proteínas reciben el nombre de TMP de ratón ó respectivamente TMP humana y tienen una identidad de aminoácidos del 76% ó respectivamente 95% con la proteína PAP.

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Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la TMP de ratón están representadas en SEQ ID No 3 y 4 y las de la TMP humana en SEQ ID No 5 y 6. La diferencia entre la PAP y la TMP humana reside en particular en la región de aminoácidos 32-48. 25

Además, un objeto de la presente invención es el empleo de un vector, el cual contiene por lo menos una copia de un ácido nucleico como se ha definido antes o un fragmento del mismo, para la transformación de una célula. Este ácido nucleico puede ser p. ej., ADN, ADNc ó ARNm genómico. De preferencia se trata de una molécula de ADN recombinante.

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La invención se refiere también al empleo de un vector el cual contiene un tramo de por lo menos 20 nucleótidos de largo de la secuencia codificadora de la proteína el cual está representado en SEQ ID No 1. De preferencia, este tramo posee una secuencia de nucleótidos específica para la PAP. Estos ácidos nucleicos son apropiados en particular para la obtención de ácidos nucleicos antisentido terapéuticamente utilizables, los cuales de preferencia tienen 50 nucleótidos de longitud.

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El vector que contiene los ácidos nucleicos puede ser replicado en eucariotas o procariotas. Puede ser un vector integrable en el genoma de la célula anfitriona, p. ej., el bacteriófago λ, ó un vector que es extracromosómico (p. ej., un plásmido). El vector según la invención puede obtenerse por subclonación del ADN de la PAP en un vector base. Esta clase de vectores base, en particular vectores con los elementos necesarios para la expresión de proteínas son familiares al experto en la especialidad. En la clonación de un ácido nucleico que codifica la PAP se obtiene un vector de expresión, el cual es conducido a una célula anfitriona apropiada para la expresión en la cual aparece la proteína según la invención. Las células anfitrionas preferidas son los microorganismos como la E. coli o levaduras, pero también células superiores, p. ej., células de mamíferos o de insectos. Son vectores de expresión preferidos p. ej., los plásmidos, bacteriófagos λ para procariotas, vectores de levaduras o vectores víricos para células superiores, p. ej., SV40, vacunas, baculovirus. Con respecto a la expresión de un ácido nucleico que codifica la PAP, hay que remitirse en particular a los métodos citados por Sambrook et al. (más arriba). Para la expresión de la PAP, los sistemas apropiados contienen vectores apropiados, p. ej., el vector pcADN1 (invitrogen) mediante el cual el ADN que se expresa se encuentra bajo el control del promotor citomegalovirus. Otro objeto de la presente invención es una célula la cual se caracteriza por estar transformada con un ácido nucleico, el cual es

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(a) la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína representada en SEQ ID No 1 (b) una de las secuencias de (a) en el marco de la secuencia de nucleótidos correspondiente a la degeneración del código genético, o 60

(c) una secuencia de nucleótidos que contiene una homología de más del 95% con una secuencia de (a) o/y (b), con la condición de que la célula no es la célula Cos-7. 65

La célula puede ser tanto una célula eucariótica como también una célula procariótica. Los procedimientos para la transformación de células con ácidos nucleicos forman parte del estado general actual de la técnica y por lo tanto no necesitan ser aquí detallados. Igualmente es un objeto de la presente invención, el empleo de un polipéptido de PAP, con la secuencia de aminoá3

ES 2 238 728 T3 cidos representada en SEQ ID No 2, fragmentos de este polipéptido o variantes del mismo, como inmunógeno para la obtención de anticuerpos. 5

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Con el término “variantes” deben comprenderse las secuencias que se diferencian por substitución, deleción o/y inserción de los aminoácidos individuales o fragmentos cortos de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID No 2. Bajo el concepto “variante” están comprendidas tanto las variaciones alélicas de PAP que se encuentran en la naturaleza, así como las proteínas obtenidas mediante la tecnología del ADN recombinante (en particular mediante mutagénesis in vitro, con ayuda de oligonucleótidos sintetizados químicamente), las cuales con respecto a su actividad biológica o/y inmunológica corresponden esencialmente a la proteína representada en SEQ ID No 2. En una forma de ejecución preferida, la invención se refiere al empleo de una composición farmacéutica para el diagnóstico de tumores, con particular preferencia para el diagnóstico de carcinomas mamarios. Particularmente preferido es además el empleo como marcador de la progresión tumoral, cuya expresión es correlativa con el avance del tumor o/y con el grado de metástasis. En una forma de expresión particularmente preferida para el diagnóstico de tumores, la fuerza de expresión de la proteína PAP va correlativa con el estadio del tumor, en particular con la tendencia a la formación de metástasis.

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Todavía otro objeto de la presente invención es un procedimiento para el diagnóstico de tumores, en el cual se pone en contacto un tejido procedente de un paciente, con una composición farmacéutica según la invención, y se determina cualitativamente o/y cuantitativamente la expresión de la proteína PAP. Esta determinación puede efectuarse por ejemplo a nivel de ácidos nucleicos mediante el empleo de sondas de hibridación de ácidos nucleicos o mediante transcripción invertida/PCR ó respectivamente a nivel de ácidos nucleicos mediante anticuerpos según métodos cito o histoquímicos. Se prefiere particularmente el empleo de una composición farmacéutica como marcador de la progresión tumoral para la identificación de la agresividad de tumores, en particular carcinomas de mama mediante la cuantificación de la expresión de la PAP, por ejemplo después de una intervención quirúrgica o para el control del transcurso en un tratamiento por quimioterapia.

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Junto a los ácidos nucleicos y polipéptidos de PAP son también apropiados los anticuerpos contra los polipéptidos o fragmentos de los mismos como componentes de la composición farmacéutica. 35

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Particularmente apropiados son los anticuerpos policlonales contra un polipéptido como el descrito más arriba, con la condición de que el anticuerpo no esté dirigido contra la secuencia peptídica CSDSLSYASEDALK ó la CSHYANRDGTOQYHH ó un anticuerpo monoclonal contra un polipéptido como se ha descrito más arriba. El de mayor preferencia es un anticuerpo que se caracteriza porque está dirigido contra una secuencia peptídica la cual corresponde a los aminoácidos 32 a 48, 49 a 62 ó 119 a 129, representados en la secuencia de aminoácidos SEQ ID No 2. La obtención de anticuerpos puede lograrse de manera convencional mediante la inmunización de animales de ensayo con la proteína PAP completa o fragmentos de la misma y a continuación, recogida de los antisueros policlonales resultantes. Según el método de Köhler y Milstein o sus desarrollos posteriores pueden obtenerse a partir de las células productoras de anticuerpos de los animales de ensayo de manera ya conocida mediante fusión celular de los anticuerpos monoclonales. Igualmente pueden obtenerse los anticuerpos monoclonales humanos según métodos ya conocidos. Como inmunógenos preferidos están los péptidos que derivan de los dominios extracelulares de PAP (ver figura 2). Los péptidos particularmente preferidos derivan de regiones que corresponden a los aminoácidos 32-48, 49-62 ó 119-129 de SEQ ID No 2. Estos péptidos se copulan de preferencia de acuerdo con métodos ya conocidos, con un soporte, p. ej., la hemocianina del Keyhole Limpet (Snipes et al., J. Cell. Biol. 117 (1992), 225.238). Los conjugados resultantes se emplean para la inmunización de animales del ensayo, p. ej., conejos. Otro objeto de la presente invención es un anticuerpo contra la proteína PAP ó una variante de la misma, de preferencia un anticuerpo el cual no muestra ninguna reacción cruzada con las proteínas homólogas como EMP1, PMP22 y CL-20. Particularmente preferido es el anticuerpo dirigido contra una secuencia de péptidos, la cual corresponde a los aminoácidos 32 a 48, 49 a 62 ó 119 a 129 la cual corresponde a la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID No 2. Otro objeto de la invención es el empleo de los anticuerpos descritos más arriba en un procedimiento inmunológico de una inmunoprecipitación, un Western Blot, un ensayo inmunológico competitivo o un ensayo sandwich. Todavía, otro objeto de la invención es el empleo de un polipéptido o un fragmento del mismo el cual está codificado por:

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(a) la secuencia de nucleótidos que codifican la proteína representada por SEQ ID No 1, (b) una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de (a) en el marco de la degeneración del código genético, o bien 4

ES 2 238 728 T3 (c) una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de más del 95% con una secuencia de (a) ó/y (b), para la obtención de un anticuerpo mediante el empleo de una biblioteca de anticuerpos de exposición de fagos. 5

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Con este procedimiento es posible la identificación y obtención de un anticuerpo contra la proteína PAP exclusivamente con métodos de la tecnología del ADN recombinante sin el empleo de animales o células (primarias) obtenidas de animales. Los pasos que necesitan consumir trabajo y tiempo indispensables en una obtención “clásica” de anticuerpos, como p. ej., la inmunización de los animales de ensayo, no precisan de tratamientos de refuerzo o fusión celular, ni ciclos de selección de clones individuales. Los resultados expuestos crean además la suposición para un diagnóstico seleccionado, de enfermedades que están unidas causalmente con modificaciones de la actividad PAP. Estas investigaciones pueden efectuarse con ayuda de sondas específicas de ácidos nucleicos para la detección a nivel de ácidos nucleicos es decir, a nivel de genes y transcriptos, o con ayuda de anticuerpos contra la PAP para la detección a nivel de proteínas. La invención se describe con más detalle mediante los siguientes ejemplos, figuras y protocolos de secuencias, entre los que se muestran:

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Figura 1. Una comparación de las secuencias de aminoácidos entre la PAP humana (1), la TMP humana (2) y de ratón (3), la EMP-1 de ratas (4), la CL-20 de conejo (5), la humana (6) de ratón (7) y de ratas (8) PMP 22, 25

Figura 2 Un pronóstico de la topología de la PAP en una capa doble de lípido. El círculo lleno significa una potencial posición de la N-glicosilación, SEQ ID No. 1 Una secuencia de ácidos nucleicos, la cual contiene la información genética que codifica la PAP, SEQ ID No. 2 La secuencia de aminoácidos de la PAP,

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SEQ ID No. 3 La secuencia de ácidos nucleicos del ADNc de la TMP de ratón, SEQ ID No. 4 La secuencia de aminoácidos de la TMP de ratón, 35

SEQ ID No. 5 La secuencia de ácidos nucleicos del ADNc de la TMP humana y SEQ ID No. 6 La secuencia de aminoácidos de la TMP humana. Ejemplos

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Ejemplo 1 Cultivo de líneas celulares 45

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Las líneas celulares MCF-7 y MCF-7ADR son líneas celulares de carcinoma de mama humano (Thompson et al., J. Cell. Physiol. 150 (1992), 534-544 y Fairchild et al., Cancer Res. 47 (1987), 5141-5148. La línea celular MCF-7 no es metastizante, expresa el receptor de estrógenos, muestra el crecimiento dependiente de estrógeno en el ratón inmunodeprimido y ninguna expresión del Vimentin. La línea celular MCF-7ADR deriva de la MCF-7 y se seleccionó por su resistencia contra la adriamicina. Es metastizante, muestra una resistencia a múltiples drogas, ninguna expresión del receptor de estrógeno así como un crecimiento dependiente de estrógeno en el ratón inmunodeprimido. El cultivo de estas líneas celulares tiene lugar en el medio esencial mínimo mejorado (IMEM; Gibco, Grand Island, NY) con 5% de suero fetal de ternera (Gibco). Las células se cultivaron a 37ºC y en una atmósfera con un 5% de CO2 . Ejemplo 2 Exposición diferencial de la PCR

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La exposición diferencial de la reacción en cadena de la polimerasa (DD-PCR) se efectuó mediante métodos ya conocidos (ver Liang y Pardee, Science 275 (1992), 967-970; Liang et al., Cancer Res. 52 (1992), 6966-6968 y Liang et al., Nucleic Acids Res. 21 (1993), 3269-3275) con el empleo del kit-map de ARN (GenHunter Corp., Brookine, MA) según las prescripciones del fabricante. 65

A partir de las células MCF-7 y MCF-7ADR se aisló la totalidad del ARN de acuerdo con el método de Chomczynski y Sacchi (Anal. Biochem. 162 (1987), 156-159) mediante el empleo del Sistema de Aislamiento Total del ARN (Promega Corp., Madison, WI). La separación de las contaminaciones del ADN de las muestras de ARN se efectuó 5

ES 2 238 728 T3 mediante la incubación con DNasa I exenta de RNasa mediante el empleo del Kit Message-Clean (GenHunter Corp., Brookline, MA) mediante incubación durante 30 minutos a 37ºC. 5

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La totalidad del ARN exento de ADN (0,2 µg) de las células MCF-7 y MCF-7ADR se empleó como matriz para la síntesis de la primera cadena de ADNc en presencia de 10 µM de un cebador de anclaje T12 MG, T12 MC, T12 MA y T12 MT (en donde M está degenerado tres veces para G, A y C), tampón de transcriptasa inversa 1 X (125 mM de TrisCl, pH 8,3; 188 mM de KCl; 7,5 mM de MgCl2 ; 25 mM de ditiotreitol) y 250 µM de mezcla de dNTP. La solución se calentó durante 5 minutos a 65ºC, se enfrió a 37ºC durante 10 minutos y a continuación se añadieron 200 U de transcriptasa invertida de Leukaemiavirus de ratón Moloney (MMLV). Después de una hora de incubación a 37ºC se interrumpió la reacción mediante incubación a 95ºC durante 5 minutos. La PCR se efectuó en una solución de reacción, la cual contenía volúmenes de 0,1 de la mezcla para la transcripción inversa, 10 mM del correspondiente cebador de anclaje T12 MN, 2 µM 10-mero del cebador con la secuencia arbitrariamente seleccionada, tampón de PCR 1X (100 mM de Tris-Cl, pH 8,4; 500 mM de KCl; 15 mM de MgCl2 ; 0,01% de gelatina), 25 µM de dNTP, 10 µCi[α-35 S] de dATP y 10 U de polimerasa de ADN de Amplitaq (Perkin Elmer, Norwalk, CT). La PCR se efectuó con un total de 40 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, a 40ºC durante 2 minutos, a 72ºC durante 30 segundos y finalmente 5 minutos a 72ºC. Después de la adición de tampón de carga a 3,5 µl de muestra en cada caso, se calentaron los productos de la PCR durante 2 minutos a 80ºC y a continuación se aplicaron sobre un gel desnaturalizado de secuenciación con el 5% de poliacrilamida para electroforesis. El gel seco se analizó autoradiográficamente para detectar los genes expresados diferencialmente. Se recortaron del gel seco las bandas identificadas en dos reacciones DD-PCR independientes, las cuales corresponden a genes diferencialmente expresados. El ADNc fue eluido a partir del gel mediante ablandamiento del trozo de gel en 100 µl de H2 O durante 10 minutos y subsiguiente ebullición durante 15 minutos. El ADNc fue aislado mediante precipitación con etanol en presencia de 3M de acetato de sodio y 50 µg de glicógeno como soporte, y extraído en 10 µl de H2 O. Se reamplificaron 4 µl del ADNc eluido en una segunda PCR. Para ello se emplearon los mismos cebadores 5’ y 3’ y las condiciones descritas más arriba, además de que se emplearon concentraciones de dNTP de 20 µM y la mezcla de reacción no contenía ningún radioisótopo. Los fragmentos de la PCR amplificados obtenidos de esta forma fueron separados mediante un gel de agarosa al 1,5%, se purificaron, y se emplearon como sondas para el análisis Northern del ARN de MCF-7 y MCF-7ADR .

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Ejemplo 3 Análisis Northern

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Se aisló el poliA+ARN a partir de la totalidad del ARN mediante el empleo del sistema de aislamiento del ARNm poliA T-tractIII (Promega Corp., Madison, WI). Huellas paralelas de poliA+ARN de células MCF-7 y MCF-7ADR (1 µg de cada línea celular) fueron separadas según el tamaño, sobre un gel desnaturalizado de Agarosa 1% y formaldehido, y a continuación se traspasaron sobre una membrana de nylon cargada positivamente (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim) mediante transferencia capilar en 20 X SSC. Después de una reticulación mediante UV (Stratagene UVStratalinker 1800) las membranas se hibridaron con los productos de la DD-PCR marcados con [α-32 P]dCTP, los cuales habían sido obtenidos mediante el método de marcado de ADN “cebado al azar”, y marcados hasta una actividad específica de 2 x 108 dpm/µg con el empleo del sistema de marcado de ADN Rediprime (Amersham, Braunschweig). La hibridación previa (5 horas) y la hibridación (durante la noche) con sondas radiactivas se efectuó en formamida 50%, 5% de SSC, solución 5 X de Denhardt, 1% de SDS y 100 µg/ml de ADN de esperma desnaturalizada de salmón a 42ºC. Las membranas fueron lavadas con 1 X SSC, 0,1% de SDS a temperatura ambiente durante 15 minutos, lavadas 2 X, seguido de lavados con 0,25 X SSC, 0,1% de SDS a 55-60ºC durante 15 a 30 minutos. A continuación, se analizaron las membranas autoradiograficamente. Los correspondientes productos de la DD-PCR en los cuales pudo comprobarse una expresión diferencial del ARNm, se subclonaron mediante el sistema de clonación TA (Invitrogen, San Diego, CA) en el vector PCR-II. Los fragmentos subclonados fueron aislados mediante el empleo del kit de plásmido Quiagen (Quiagen, Hilden) y se utilizaron de nuevo como sondas para el análisis Northern para la verificación de la expresión diferencial del ARNm. Ejemplo 4

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Caracterización de los fragmentos DD-PCR que corresponden a ARNm expresados diferencialmente.

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Los fragmentos subclonados, los cuales derivan de ARNm expresados diferencialmente, fueron secuenciados en el vector de clonación TA, mediante el empleo del kit de secuenciado de ciclo Dye-Terminator (Applied Biosystems GmbH, Foster City, CA). Los datos de la secuencia de nucleótidos fueron analizados para determinar la homología con genes conocidos en los bancos de datos Genbank y EMBL mediante el empleo del programa de ordenador BLAST. De esta manera pudo ser identificada junto a 10 conocidas especies de ARNm, una nueva especie de ARNm, la cual se expresa diferencialmente en la línea celular MCF-7ADR. 6

ES 2 238 728 T3 Para obtener la totalidad del ADNc de este nuevo ARNm, se empleó un fragmento DD-PCR subclonado de 556 bp de largo, como sonda para el muestreo de un banco de ADNc de corazón humano (Clontech, Palo Alto, CA) el cual había sido obtenido en un vector lambda gt10. De esta manera se aisló un clon de ADNc de aproximadamente 2 kb, del cual se secuenciaron las dos cadenas y se compararon con el fragmento clonado de DD-PCR. 5

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Para la identificación de la región 5’ del ADNc se efectuó una PCR RACE (amplificación rápida de los extremos del ADNc) de acuerdo con el método descrito por Frohmann (PCR-Meth. Appl. 4 (1994), 40-58) y Schaefer (Anal. Biochem. 227 (1995), 255-273), con las modificaciones de Kato et al. (Gene 150 (1994), 243-250). El producto 5’ RACE PCR de 1 kb de largo obtenido de esta manera se secuenció y se comparó con el clon del DNAc obtenido del muestreo del banco de DNAc. La secuencia de nucleótidos resultante del ADNc completo se comparó con las secuencias de ADN conocidas del banco de genes y el banco de datos EMBL.

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Como se comprobó con el análisis Northern Blot, el nuevo ARNm identificado se expresa exclusivamente en la línea celular MCF-7ADR . Por ello, los ADNc y la proteína codificada por ellos recibió el nombre de “proteína asociada a la progresión” (PAP). Las secuencias de nucleótidos y amino-ácidos de la PAP están detalladas en la SEQ ID No. 1 y 2. La secuencia de nucleótidos contiene 2786 nt con un marco abierto de lectura de 471 nt (157 aminoácidos) el cual empieza con un codon de iniciación ATG en la posición 219 y termina con un codon TAA de interrupción en la posición 692. Una potencial señal de N-glicosilación en la región de los aminoácidos 43-45 se identificó con el aminoácido 43 como posible receptor del grupo del azúcar. Una potencial posición de acilación mediante la adición covalente de miristato fue identificado en la posición 39 de los aminoácidos. Una posible posición de fosforilación para la Serin-treonina-quinasa caseinaquinasa II fue identificada en la posición 48.

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El ADNc de la PAP es miembro de una familia de genes. Una comparación de las secuencias de aminoácidos de miembros de esta familia de genes está representada en la figura 1. La mayor similitud la tiene la PAP humana con la proteína CL-20 del conejo, y con la proteína de la rata EMP-1 (identidad del 77% ó respectivamente del 76%) seguido de la proteína PMP-22 del hombre, ratón y rata (identidad del 41%, 43% y 41%).

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Además se comprobó que la PAP tiene una gran similitud con proteínas hasta ahora no publicadas, las cuales se conocen con los nombres de proteína de membrana, asociada al tumor, de ratón (TMP de ratón, banco de genes U25633, SEQ ID NO. 3/4) y proteína de membrana, asociada al tumor, humana, banco de genes U43916 SEQ ID NO. 5/6). La TMP de ratón tiene una longitud de 160 aminoácidos de los cuales 39 aminoácidos son diferentes a la PAP (identidad 76%). La TMP humana tiene una longitud de 157 aminoácidos de los cuales 7 aminoácidos son distintos a la PAP (identidad 95%).

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Basándose en las gráficas de hidrofobicidad de apoyo del ordenador y el pronóstico de la estructura secundaria, se puede proponer un modelo para la hipotética topología de la PAP (figura 2). 40

En consecuencia, la PAP contiene 4 dominios hidrófobos potencialmente transmembránicos y 2 dominios potencialmente extracelulares (aminoácidos 29-63 ó respectivamente 118-130) En la región del primer dominio extracelular, en particular en el dominio de los aminoácidos 32-48, están las más grandes diferencias de la PAP con la TMP humana (5 aminoácidos).

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Ejemplo 5 Muestra de expresión de la PAP 50

55

Para investigar la expresión de la PAP específica en tejidos, se investigó la distribución del ARNm-PAP en diferentes tejidos humanos mediante el análisis de Northern Blot, empleando múltiples Northern Blots de tejidos (Clontech, Palo Alto, CA). Con ello se comprobó que el ARNm-PAP se expresa en la mayor parte de tejidos humanos. El ARNm-PAP sin embargo, falta en los leucocitos periféricos de la sangre y se expresa solamente muy débilmente en el cerebro. Además el ARNm-PAP falta en distintas líneas celulares de linfoma y de leucemia, como por ejemplo HL 60 (leucemia promielocitaria), K562 (leucemia mieloide crónica), Molt-4 (leucemia linfoblas-toide), Raji (linfoma de Burkitt) y HeLa (carcinoma cervi-cal). En células SW480 se comprobó sin embargo una fuerte expresión del ARNm-PAP (adenocarcinoma colorrectal) y en células de melanoma G361.

60

Ejemplo 6 Obtención de una construcción de la expresión de la PAP y expresión transitoria en células COS 65

El ADNc-PAP se subclonó en el sitio EcoRV del vector de expresión pcADN1 (Invitrogen, San Diego, CA) corriente adelante a partir del promotor del Cytomegalovirus. El vector original sin la inserción ADNc fue empleado como control negativo. El ADN recombinante se purificó mediante una columna de Quiagen (Quiagen, Hilton, DE) y se cuantificó mediante la determinación de la absorción a 260 nm. 7

ES 2 238 728 T3

5

10

15

Las células COS las cuales crecieron exponencialmente en DMEM con el 10% de suero fetal de ternera, se trataron con tripsina, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato y se centrifugaron a 800 g. Se resuspendieron 1,5 x 106 células en 200 µl de solución salina tamponada con fosfato con 5 µg del vector de ADN. Las células se enfriaron durante 5 minutos con hielo, se pasaron a una cubeta de electroporación (Biorad, Herkules, CA) con una rendija de 4 mm, y se sometieron a 300 V y 125 microfaradios, a una electroporación. Las células transfectadas se enfriaron durante 5 minutos con hielo, se repartieron en siete cápsulas de cultivo de 35 mm con 2 ml de DMEM y 10% de suero fetal de ternera y se cultivaron durante 48 horas. A continuación se lavaron las células con solución salina tamponada con tris, se fijaron en DMEM con 2% de paraformaldehido durante 30 minutos, se lavaron con solución salina tamponada con tris y se permeabilizaron durante 30 minutos en solución salina tamponada con tris con 0,1% de saponina. Los sitios de unión inespecíficos se bloquearon durante 30 minutos a temperatura ambiente en solución salina tamponada con tris, 2% de albúmina de suero de vaca, 1% de gelatina de piel de cerdo (tipo A Sigma), 2% de suero de cabra y 0,1% de saponina. Las células se diluyeron con anticuerpos anti PAP (ejemplo 7), 1:500 en tampón de bloqueo con 0,02% de saponina, y se incubaron durante la noche a 4ºC. A continuación, se añadió inmunoglobulina anti conejo de cabra, marcada con isotio-cianato de fluoresceína, 1:200 en tampón de bloqueo diluido con 0,02% de saponina. Después de lavar con solución salina tamponada con tris se aplicaron las células sobre un portaobjetos y se hizo visible la reactividad inmunológica mediante microscopía confocal con un Biorad MRC-600-scanner juntamente con un microscopio de fluorescencia Zeiss Axiophot. Como control negativo se empleó suero preinmunológico (1:500) como antisuero primario.

20

Ejemplo 7 Obtención de anticuerpos 25

Los anticuerpos antipéptido se obtuvieron contra péptidos sintéticos de los primeros y segundos bucles extracelulares de PAP: Péptido 1: Cys49 -Ser-Asp-Ser-Leu-Ser-Tyr-Ala-Ser-Glu-Asp-Ala-Leu-Lys62 -COOH

30

35

Péptido 2: His119 -Tyr-Ala-Asn-Arg-Asp-Gly-Thr-Gln-Tyr-His129 -COOH Los péptidos se copularon con hemocianina de Keyhole-Limpet mediante métodos ya conocidos (Snipes et al., (1992), ver más arriba). Los conjugados se emplearon para la inmunización de conejos con el coadyuvante completo de Freund. A continuación siguió un reforzamiento de la inmunización en dos semanas de intervalo durante un total de 4 veces con 500 µg de péptido y coadyuvante incompleto de Freund. Se extrajo sangre de los animales inmunizados y se aisló el suero. Se analizó la actividad del suero inmunológico mediante un análisis ELISA de fase sólida (ejemplo 6).

40

45

50

55

60

65

8

ES 2 238 728 T3 REIVINDICACIONES 1. Empleo de una composición, la cual comprende como componente activo: 5

(A) un ácido nucleico, el cual comprende (a) una secuencia de nucleótidos codificadora de la proteína, representada en SEQ ID No 1

10

(b) una secuencia de nucleótidos correspondiente a una secuencia de (a) en el marco de la degeneración del código genético, (c) una secuencia hibridadora con las secuencias de (a), ó (b) en condiciones restrictivas, ó

15

(d) un fragmento, de por lo menos 20 nucleótidos de longitud, de las secuencias de (a), (b) ó (c), (B) un péptido o polipéptido (“PAP”) asociado a la progresión, el cual está codificado por un ácido nucleico según (A), ó

20

(C) un anticuerpo contra un péptido o polipéptido según (B), para la obtención de un medio para el diagnóstico de carcinomas de mama, adenocarcinomas colorrectales o melanomas en donde la expresión del péptido o polipéptido PAP va correlacionada con el estadio del tumor. 2. Empleo, según la reivindicación 1, para el diagnóstico de carcinomas de mama.

25

3. Empleo, según la reivindicación 1, como marcador de la progresión de un tumor. 4. Empleo, según una de las reivindicaciones 1 a 3,

30

caracterizado porque para el diagnóstico de un tejido procedente de un paciente se pone el tejido en contacto con una composición según la reivindicación 1 ó 2, y se determina la expresión del péptido o polipéptido PAP, cualitativa o/y cuantitativamente.

35

5. Empleo según la reivindicación 4, caracterizado porque

40

la fuerza de la expresión del péptido o polipéptido de la PAP va correlacionada con la formación de metástasis en los tejidos. 6. Empleo según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque

45

el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 7. Empleo de un anticuerpo según la reivindicación 6,

50

caracterizado porque está dirigido contra una secuencia peptídica que corresponde a los aminoácidos 32-48, 49-62 ó 119-129 de la secuencia de aminoácidos representadas en SEQ ID No. 2.

55

60

65

9

ES 2 238 728 T3

10

ES 2 238 728 T3

11

ES 2 238 728 T3 LISTA DE SECUENCIAS (1) DATOS GENERALES: 5

(i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Boehringer Mannheim GmbH (B) CALLE: Sandhofer Strasse

10

(C) LOCALIDAD: Mannheim-Waldhof (E) PAÍS: Alemania (F) CÓDIGO POSTAL: 68305 (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevo gen asociado al carcinoma de mama

15

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 6 (iv) LECTURA DEL ORDENADOR (A) SOPORTE DE DATOS: disco flexible 20

(B) ORDENADOR: PC IBM compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA DE SOFTWARE: PatentIn Release #1,0 versión #1.30 (EPA)

25

(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

30

(A) LONGITUD: 2786 pares de bases (B) CLASE: nucleótido (C) TIPO DE CADENA: bicatenario (D) TOPOLOGÍA: lineal

35

(ii) CLASE DE MOLÉCULA: ADNa (vii) PROCEDENCIA INMEDIATA: (B) CLON(ES): PAP humana

40

(ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) POSICIÓN: 219.689

45

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

50

55

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65

1

ES 2 238 728 T3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

2

ES 2 238 728 T3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

ES 2 238 728 T3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

(2) DATOS DE SEQ. ID. NO:2: (i) CARACTEÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 157 aminoácidos

65

(B) CLASE: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal

4

ES 2 238 728 T3 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2: 5

10

15

20

25

30

35

40

45

(2) DATOS DE SEQ. ID. NO:3: (i) CARACTEÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 50

(A) LONGITUD: 2614 pares de bases (B) CLASE: nucleótido (C) Tipo de cadena: bicatenario

55

(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vii) PROCEDENCIA INMEDIATA:

60

(B) CLON(ES): TMP de ratón (ix) CARACTERÍSTICA (A) NOMBRE/CLAVE: CDS

65

(B) POSICIÓN: 90..569 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3 5

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5

10

15

20

25

30

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55

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6

ES 2 238 728 T3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

ES 2 238 728 T3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

8

ES 2 238 728 T3 (2) DATOS DE SEQ. ID. NO:4: (i) CARACTEÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5

(A) LONGITUD: 160 aminoácidos (B) CLASE: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal

10

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

15

20

25

30

35

40

45

50

55

(2) DATOS DE SEQ. ID. NO:5: (i) CARACTEÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 756 pares de bases

60

(B) CLASE: nucleótido (C) TIPO DE CADENA: bicatenario (D) TOPOLOGÍA: lineal

65

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vii) PROCEDENCIA INMEDIATA: 9

ES 2 238 728 T3 (B) CLON(ES): TMP de ratón (ix) CARACTERÍSTICA: 5

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) POSICIÓN: 1.471 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

10

ES 2 238 728 T3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

(2) DATOS DE SEQ. ID. NO:6: 50

(i) CARACTEÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 157 aminoácidos (B) CLASE: aminoácido 55

(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína

60

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6

65

11

ES 2 238 728 T3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

12