19

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 210 527

51 Int. Cl. : C07K 16/08, A61K 39/29

7

A61K 39/42, C12N 5/28 G01N 33/569, G01N 33/577 // A01K 67/027

ESPAÑA

12

TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 97924227 .8

86 Fecha de presentación: 10.06.1997

87 Número de publicación de la solicitud: 0912611

87 Fecha de publicación de la solicitud: 06.05.1999

54 Título: Anticuerpos monoclonales humanos para el antígeno de superficie de Hepatitis B.

30 Prioridad: 11.06.1996 IL 11862596

73 Titular/es: YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT

COMPANY, Ltd. Weizmann Institute of Science Herzl Street at Yavne Road P.O. Box 95 Rehovot 76100, IL XTL BIOPHARMACEUTICALS LIMITED 45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

01.07.2004

72 Inventor/es: Reisner, Yair y

Dagan, Shlomo

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Isern Jara, Jorge

ES 2 210 527 T3

01.07.2004

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 210 527 T3 DESCRIPCIÓN Anticuerpos monoclonales humanos para el antígeno de superficie de Hepatitis B. 5

Campo de la invención La presente invención se refiere a líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos humanos capaces de unirse al antígeno de superficie del virus de la hepatitis B, anticuerpos producidos por las líneas celulares, y varios usos de los mismos.

10

Antecedentes de la invención

15

20

La infección por el virus de la Hepatitis B (VHB) es un problema principal de salud en el mundo entero. Aproximadamente el 5% de la población mundial está infectada por el VHB y los pacientes infectados crónicos tienen un riesgo elevado de desarrollar cirrosis y carcinoma hepatocelular (Progress in Hepatits Research: Hepatitis B (VHB), Hepatitis C virus (VHC) and Hepatitis Delta Virus (VHD) Ed. O. Crivelli, Sorin Biomedica, 1991). La respuesta inmune a los antígenos que codifican VHB incluyen tanto una respuesta inmune celular que es activa en la eliminación de células infectadas de VHB, así como la respuesta del anticuerpo humoral a los antígenos de la cubierta del virus que contribuyen a limpiar de la circulación las partículas del virus. La causa dominante de la persistencia viral durante la infección del VHB es el desarrollo de una respuesta inmune antiviral débil. Las vacunas VHB recombinantes proporcionan un método efectivo y seguro par la inmunización activa contra VHB, aunque, no siempre inducen una respuesta de anticuerpos rápida y suficiente.

25

30

El interferón α se usó en la terapia de la infección por Hepatitis B mostrando una eficacia en sólo el 30-40% de pacientes altamente seleccionados. Además, la inmunización pasiva con antisuero anti Hepatitis B policlonal humano ha demostrado ser efectivo en retrasar y prevenir la infección del VHB recurrente (Wright, T.L. and Lau, J.Y.N. The Lancet 342:1340-1344, (1993)), Tales antisueros policlonales humanos son preparados a partir del plasma reunido de donantes inmunizados. Estas preparaciones son muy caras y disponibles en cantidades relativamente pequeñas. Además, el plasma reunido puede contener muestras de sangre contaminada y así el tratamiento con tal antisuero aumenta el riesgo del paciente a contraer otras infecciones virales tales como Hepatitis C o VIH.

35

Un método alternativo para el tratamiento de la infección por VHB es el uso de anticuerpos monoclonales (MoAb).

40

PCT Solicitud de patente PCT/NL 94/00102 revela anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra el antígeno de superficie de la Hepatitis B que son secretados por las líneas celulares de hibridoma Mab 4-7B y Mab 9H9. El anticuerpo monoclonal secretado por la línea celular Mab 4-7b reconoce un epítopo lineal del VHBsAg y es diferente del anticuerpo monoclonal Mab 9H9 que reconoce un epítopo conformacional. Los anticuerpos se reivindicaron para el uso simultáneo en el tratamiento de infecciones de la Hepatitis B crónica.

45

PCT solicitud de la patente PCT/US92/09749 revela anticuerpos monoclonales humanos contra VHBsAg que son secretados por las líneas celulares de hibridoma PE1-1, ZM1-1, ZM1-2, MD3-4 y LO3-3. Los anticuerpos unidos a diferentes epítopos VHB se usaron para reducir el nivel de VHBsAg circulantes.

50

La solicitud de la Patente Japonesa JP 93066104 revela un hibridoma de una cepa celular de linfocitos humanos TAW-925 y un linfocito humano transformado por el virus Epstein-Barr. El hibridoma produce un anticuerpo monoclonal humano contra VHBsAg.

55

La solicitud de la Patente estadounidense No. 4.883.752 revela la preparación de anticuerpos monoclonales derivados de humanos para VHBsAg, mediante la administración de la vacuna VHBsAg a humanos, recubriendo sus linfocitos, estimulando los linfocitos in vitro con un estimulador inespecífico, fusionando dichas células con una célula de mieloma, y seleccionando para hibridomas que secretan un anticuerpo anti VHBsAg.

60

Ichimori et al., Biochem. And Biophysic. Research Communications 129(1):26-33, 1985 revela un hibridoma que secreta anticuerpos monoclonales anti VHBsAg humanos que reconocen el determiante-a de VHBsAg. Después, Ichimori, et al., supra 142,(3):805-812, 1987 revela otro hibridoma que secreta establemente anticuerpos monoclonales humanos contra AgsHb. Los anticuerpos mencionados anteriormente se desarrollaron todos por inmortalización in vitro de células productoras de anticuerpos a partir de individuos positivos en anticuerpos anti-VHB.

65

Un logro nuevo que permite la transferencia adaptativa de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) dentro de cepas normales irradiadas letalmente de ratones radioprotegidos con una inmunodeficiencia de medula ósea combinada severa (SCID) se describió recientemente (Lubin I., et al., Blood, 83:2368, 1994). Respuestas humorales secundarias a varios antígenos de recuerdo así como la respuesta humoral primaria a otros antígenos se 2

ES 2 210 527 T3 mostró que se generaba efectivamente en tales quimeras ratón/humano (Marcus H., et al., Blood, 86:398-406, 1995). Resumen de la invención 5

10

15

20

En concordancia con la presente invención, se encontró que las líneas celulares de hibridoma que secretan anticuerpos humanos capaces de unirse al antígeno de superficie de la Hepatitis B (VHBsAg) pueden obtenerse usando las quimeras humano/ratón mencionadas anteriormente. De acuerdo con la presente invención, los linfocitos de sangre periférica humana (PBL) de donantes positivos humanos para anticuerpos anti VHBsAg se injertan en cepas normales de ratones que son irradiados letalmente y radioprotegidos con SCID de médula ósea. Tras la inmunización de tales ratones quiméricos con VHBsAg, las células humanas se obtuvieron a partir del bazo y se fusionaron in vitro con células de heteromieloma para generar hibridomas que secretan anticuerpos humanos que tienen una alta afinidad y especificidad para VHBsAg. Los anticuerpos de la presente invención se generaron mediante un proceso para obtener anticuerpos monoclonales humanos (hMoAb) capaces de unirse al antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B (VHBsAg) que comprenden: (a) inmunizar un roedor quimérico M4 que tiene células hematopoyéticas xenogénicas con antígeno de superficie de la Hepatitis B (VHBsAg) tal que las células que producen anticuerpos xenogénicos se produzcan en dicho roedor, en donde dicho roedor M4 es un roedor M1, las células hematopoyéticas del cual han sido sustancialmente destruidas, dicho roedor M1 tiene transplantado en él células hematopoyéticas derivadas de un ratón M2 que tiene una deficiencia hematopoyética, y células hematopoyéticas xenogénicas derivadas de M3 humanas. (b) extraer e inmmortalizar dichas células productoras de anticuerpos;

25

(c) seleccionar y clonar las células productoras de anticuerpos inmortalizadas que producen anticuerpos capaces de unirse a VHBsAg y; (d) aislar los anticuerpos producidos por las células productoras de anticuerpos inmortalizados clonadas y seleccionadas.

30

35

40

45

50

55

Los bazos de los roedores quiméricos inmunizados M4 se extrajeron entre los días 12 y 20 tras el trasplante de PBL humano, preferiblemente el día 14 tras el trasplante del mismo. Las suspensiones celulares se prepararon a partir de los bazos y las células productoras de anticuerpos obtenidas de los roedores quiméricos inmunizados M4 se fusionan preferiblemente con parejas de fusión ratón-humano tal como heteromieloma mediante técnicas bien conocidas en el campo (por ejemplo. Köhler & Milstein, Nature, 256:495-497, 1975). Para aislar los anticuerpos producidos por las líneas celulares de hibridoma seleccionadas, las líneas celulares de hibridoma son además cultivadas in vitro en un medio adecuado en donde el anticuerpo monoclonal deseado se recupera a partir del sobrenadante o, alternativamente, las líneas celulares de hibridoma se pueden inyectar intraperitonealmente en ratones y los anticuerpos cultivados a partir de la ascitis maligna o suero de estos ratones. Los sobrenadantes de las líneas celulares de hibridoma se criba primero para ver la producción de anticuerpos IgG humanos mediante cualquiera de estos métodos conocidos en el campo tal como un ensayo de inmunoabsorción de unión a enzimas (ELISA) o radioinmunoensayo (RIA). Los hibridomas que dan positivo en el ensayo para la IgG humana entonces serán cribados para la producción de anticuerpos anti AgVHBs por su capacidad de unirse a AgVHBs. El roedor M1 es un roedor usado convencionalmente como animal de laboratorio, como una rata o ratón. El ratón M2 puede tener cualquier deficiencia hematopoyética incluyendo deficiencias hematopoyéticas genéticas así como deficiencias hematopoyéticas inducidas. Ejemplos no limitantes de las deficiencias hematopoyéticas incluyen SCID, Bg, Nu, Xid o ratones con cualquier combinación de las deficiencias hematopoyéticas anteriormente mencionadas. Además, la deficiencia hematopoyética podría ser resultado de la delección génica o puede usarse ratones transgénicos. Las células hematopoyéticas derivadas a partir del ratón donante M2 son células de médula ósea cualquiera no tratada o deplecionada de linfocitos-T. Otras fuentes adecuadas de células hematopoyéticas que se pueden usar incluyen, por ejemplo, células del bazo, células del hígado fetal o células de sangre periférica. Las células hematopoyéticas xenogénicas derivadas de M3 humano son células PBL que pueden derivarse de cualquier fuente adecuada de células hematopoyéticas humanas como células de médula ósea, células sanguíneas del cordón umbilical, células del timo, bazo o linfoides, etc.

60

65

El roedor M1 puede ser un ratón o rata, el ratón M2 puede ser un ratón SCID y las células hematopoyéticas xenogénicas derivadas del humano M3 podrían ser PBL de un humano M3 que se ha expuesto ya a VHBsAg tanto espontáneamente como resultado de una infección anterior o inducida tras una vacunación. Tales humanos tendrán un título relativamente elevado de anticuerpos anti VHBsAg comparado con individuos que nunca han estado infectados con VHB y, por consiguiente, cuando PBLs a partir de tales donantes se usan como células donantes M3 en concordancia con la presente invención, la inmunización del ratón quimérico M4 con VHBsAg despertará una respuesta inmune secundaria de las PBLs humanas transplantadas en el ratón quimérico M4. Un donante humano M3, por ejemplo, es el 3

ES 2 210 527 T3 que da negativo en el ensayo para el virus de la HB pero muestra un título alto de anticuerpos contra VHBsAg. Tales PBLs de donantes M3 humanos se pueden obtener tanto por donación de sangre como por leucoforesis. 5

10

Los VHBsAg usados para la inmunización de roedores quiméricos M4 en concordancia con la invención son, por ejemplo, una vacuna del virus de la Hepatitis B que contiene el antígeno de superficie principal purificado del virus preparado por tecnología de DNA recombinante (Engerix TM− B, SIB Biological (Rixensart, Belgium)). La presente invención se dirige a líneas celulares de hibridoma tal como se definen en la reivindicación 2 que producen anticuerpos monoclonales humanos capaces de unirse a VHBsAg, así como anticuerpos monoclonales humanos capaces de unirse a VHBsAg tal como se define en la reivindicación 1 y fragmentos de los mismos que mantienen sustancialmente las características de unión al antígeno del anticuerpo total. Tales fragmentos pueden ser, por ejemplo, fragmentos Fab o F(ab)2 obtenidos por digestión del anticuerpo entero con varios enzimas, como se conoce y describe extensamente en el campo. Las características antigénicas de un anticuerpo se determinan probando la unión de un anticuerpo a ciertos determinantes antigénicos usando ensayos estándar tal como análisis RIA, ELISA o FACS.

15

Normalmente, los anticuerpos monoclonales humanos de la presente invención tienen una afinidad relativamente elevada hacia VHBsAg que está en el rango de alrededor de 10−9 M hasta alrededor de 10−10 M como se determina en un ELISA competitivo. 20

25

30

35

40

45

50

55

De acuerdo con una realización específica de la presente invención se suministra una línea celular de hibridoma designada aquí como “19.79.5” que se depositó el 22 de Mayo de 1996, en the European Collection of Cell Cultures (ECACC, CAMR, Salisbury, Wiltshire, SP40JG, UK), bajo el No. De acceso 96052168. Los anticuerpos monoclonales humanos anti VHBsAg secretados por la línea celular de hibridoma anterior y designada aquí como “Ab.19.79.5” también se proporcionan así como fragmentos del mismo que retiene las características de unión al antígeno de los anticuerpos. Otros aspectos de la presente invención son varios usos de diagnóstico, terapéuticos y profilácticos de los anticuerpos monoclonales VHBsAg. De acuerdo con este aspecto de la invención, las composiciones farmacéuticas comprendiendo anticuerpos monoclonales anti VHBsAg humanos podrían usarse para el tratamiento de los pacientes con Hepatitis B crónica administrando a tal paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo monoclonal o porción de la misma capaz de unirse al VHBsAg siendo una cantidad efectiva que alivia los síntomas de la infección por VHB o reduciendo el número de partículas virales circulantes en un individuo. Tales composiciones farmacéuticas pueden comprender uno o más anticuerpos de la invención. Además de los anticuerpos de la invención las composiciones farmacéuticas pueden opcionalmente comprender un vehículo seleccionado de cualquiera de los vehículos conocidos en el campo. Un ejemplo de tal vehículo es un liposoma. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden también comprender varios diluyentes y adyuvantes conocidos de por si. Las composiciones de la invención se pueden administrar por una variedad de vías de administración incluyendo la parenteral, oral, etc. Las composiciones que comprenden los anticuerpos de la invención, tal como se describe anteriormente, pueden administrarse en combinación con otros agentes antivirales. Tales agentes pueden incluir, como ejemplos no limitativos: Interferones, anticuerpos monoclonales anti HB, anticuerpos policlonales anti HB, análogos de nucleósido, e inhibidores de la DNA polimerasa. En el caso de tal terapia de combinación los anticuerpos pueden darse simultáneamente con el agente antiviral o secuencialmente tanto antes como después del tratamiento con el agente antiviral. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden usarse también, por ejemplo, para la inmunización de bebés recién nacidos contra infecciones VHB o para la inmunización de pacientes con trasplante de hígado para eliminar posibles infecciones del VHB recurrentes en tales pacientes. Mediante una realización más, los anticuerpos de la invención se pueden usar en un método para el diagnóstico de las infecciones por VHB en un individuo obteniendo una muestra de fluido corporal del individuo ensayado que puede ser una muestra de sangre, muestra de linfa o cualquier otra muestra de fluido corporal y poner en contacto la muestra de fluido corporal con un anticuerpo anti VHBsAg humano de la invención bajo condiciones que permiten la formación de complejos antígeno-anticuerpo. El nivel de tales complejos se determina entonces por métodos conocidos en el campo, un nivel significativamente superior que el formado en una muestra control indica una infección de VBH en el individuo a ensayar. De la misma manera, el antígeno específico unido por los anticuerpos de la invención también puede usarse para diagnóstico.

60

Breve descripción de las figuras

65

Fig. 1. Es una representación gráfica que muestra la cantidad de Ig humana total (mg/mL) y la cantidad de anticuerpos anti HBs específicos (mU/mL) en el suero de ratones irradiados que estaban radioprotegidos con SCID de médula (ratón quimérico). PBL+Engerix: los ratones quiméricos se trasplantaron además con PBL humano a partir de donantes positivos para anticuerpos anti HBs, y se vacunaron con Engerix B en un adyuvante de hidróxido de aluminio (alumbre). 4

ES 2 210 527 T3 PBL+Alumbre: los ratones quiméricos además se trasplantaron con PBL humano de donantes positivos para anticuerpos anti HBs, y se vacunaron con alumbre sólo (sin Engerix B). SCID-BM+Engerix: los ratones quiméricos se vacunaron con Engerix B (sin trasplante de PBL humano). 5

SCID-BM+Alumbre: los ratones quiméricos se vacunaron con alumbre (sin PBL humano y sin Engerix B). La línea negra representa el nivel inicial de anticuerpos anti HBs en el suero del donante PBL humano. 10

Fig. 2. es una representación gráfica que muestra la actividad específica, es decir, los niveles de anticuerpos anti VHBs por mg de Ig humana en el suero de donantes humanos (A-D, columnas negras) y la actividad específica en el suero de ratones quiméricos transplantados respectivamente con PBL humana de dichos donantes (A-D, columnas rayadas).

15

Fig. 3. es una representación gráfica que muestra la curva respuesta tiempo de la actividad específica de anticuerpos anti HBs (mU/mg) en el suero de ratones quiméricos (línea punteada). Las columnas negras representan el nivel de Ig humana total (mg/mL), y las columnas rayadas representan el nivel de anticuerpos anti HBs específicos (mU/mL).

20

25

Fig. 4. es una representación gráfica que muestra una inhibición competitiva de unión de los anticuerpos anti HBs a las partículas HBs. El grado de unión se midió mediante un ELISA usando un anticuerpo secundario IgG antihumano marcado con peroxidasa de rábano picante. Los anticuerpos anti HBs se diluyeron como se indica en la gráfica en medio (cuadros vacíos) o en partículas de HBs de 0,5 µg/mL (cuadros negros). Fig. 5. es una fotografía que muestra secciones de hígado infectadas con Hepatitis B teñidas con anticuerpos anti VHBs. Todas las secciones se tiñeron con un anticuerpo “secundario”, es decir Ig anti-humana de cabra conjugada con biotina. A - Control negativo. No primer anticuerpo.

30

Control positivo. Primer anticuerpo - anticuerpo anti HB de ratón e Ig anti-ratón secundaria. C - Tinción con anticuerpo anti HBs No.19.79.5. D - Tinción con anticuerpo anti HBs No.18.5.1013.

35

Fig. 6. es una representación esquemática de la unión de Ab 19.79.5 a un grupo de 15 pocillos caracterizados de tipos HBsAg. El eje de las y representa unidades de densidad óptica. El eje de las x representa diferentes tipos de HBsAg. 40

Fig. 7. es una representación gráfica del porcentaje de animales infectados por VHB los días 11 y 18 en el grupo no tratado y grupo tratado Ab 18.5.1013 (en el modelo de inhibición). Fig. 8. es una representación gráfica del porcentaje de animales infectados por VHB los días 10 y 17 en el grupo no tratado y el grupo tratado Ab 19.79.5 (en el modelo de inhibición/profilaxis combinada).

45

Fig. 9. es una representación gráfica del porcentaje de animales infectados por VHB los días 11 y 19 en el grupo no tratado y el grupo tratado Ab 19.79.5 (en el modelo de tratamiento/inhibición combinada). 50

Fig. 10. secuencia de ácidos nucléicos y correspondiente secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del dominio variable de Ab 19.79.5. Fig. 11. secuencia de ácidos nucléicos y la correspondiente secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del dominio variable de Ab 19.79.5.

55

Se hará ahora referencia a los ejemplos siguientes que se facilitan a modo de ilustración y no pretenden constituir una limitación de la presente invención. Ejemplos

60

Materiales y métodos Ratones

65

Los animales usados tenían de 6 a 10 semanas de edad. Los ratones BALB/C se obtuvieron de Harlan (Weizmann Institute Animal Breeding Center (Rehovot, Israel), los ratones SCID/NOD del Weizmann Institute Animal Breeding Center (Rehovot, Israel). Todos los ratones se alimentaron con comida estéril y agua ácida que contenía ciprofloxacino (20 µg/mL) (Bayer, Leverkusen, Alemania). Siempre que fue necesario, a los ratones se inyectaran diariamente 1 mg de Fortum intraperitonealmente durante cinco días post BMT (Glaxo Operations UK, Greenford, England). 5

ES 2 210 527 T3 Régimen de acondicionamiento

5

Los ratones BALB/c se sometieron a una radiación del cuerpo entero (TBI), a partir de una fuente 150-A 60 Co de rayos gamma (producida por Atomic Energy of Canada, Kanata, Ontario) con F.S.D de 75 cm y una tasa de dosis de 0,7 Gy/min, con 4 Gy seguido 3 días después de 10-11 Gly (mitad de dosis). Preparación y transplante de células de médula ósea

10

Los huesos tibial y femoral se extrajeron del ratón y se homogenizaron en una cámara de acero inoxidable Omni-Mixer de 50 mL esterilizada (Homogenizador Omni-Mixer, Modelo No. 17106, OMNI International. Waterbury, CT.USA). Se inyectaron intravenosamente los ratones recipientes con 4-6 x 106 de células de médula ósea SCID/NOD (en 0,2 mL de PBS) inmediatamente después de la radiación.

15

Transplante de linfocitos de sangre periférica

20

Se obtuvieron los linfocitos de sangre periférica (PBL) tras el consentimiento informado mediante leucoforesis a partir de donantes positivos para anticuerpos HBs y negativos para VHB. Se lavaron dos veces los PBLs, se contaron y resuspendieron en PBS a la concentración celular deseada. Se inyectaron intraperitonealmente 100x 106 PBL humanos en ratones recipiente, condicionados tal como se describió anteriormente. Los ratones control no recibieron PBL humano.

25

Inmunización de los animales quiméricos Se inmunizaron los ratones una vez con la vacuna de la Hepatitis B (Engerix Bélgica) administrado intraperitonealmente junto con el PBL.

30

35

TM

-B; SB Biologicals, Rixensart,

Colección de plasma y células de la quimera ratón humano Se sangraron los animales a partir de la vena retro-orbital usando capilares de vidrio recubiertos de heparina. El plasma se guardó para la determinación de la Ig-humana. Se extrajeron los bazos después de sacrificar a los animales por dislocación cervical, se cortaron en piezas y se presionaron a través de tamices de acero inoxidable para obtener suspensiones celulares en PBS. Fusión celular

40

45

Las células se mezclaron con heteromieloma de ratón humano HMMA2.11TG/0 (Posner et al. Hybridoma, 6:611625, 1987) en una proporción 3:1. Se realizó la fusión con 50% (p/V) PEG 1500 (Boehringer Manheim GmbH) en un procedimiento estándar. Las células fusionadas se sembraron a una concentración de 3.000 células/pocillo en placas microtituladas con el fondo en forma de U de 96 pocillos (Nunc, Denmark) en un medio completo que contiene suplemento HAT (1x) (Biological industries, Beit Haemek, Israel). Se alimentaron las células con medio HAT fresco una semana después. Dos semanas tras la fusión, los sobrenadantes se cultivaron mediante ELISA y el medio se reemplazó con medio HT fresco. Los cultivos de hibridoma que secretan Ig anti-HBs específicas se clonaron en 0,5 células/pocillo en placas microtituladas con fondo en forma de U de 96 pocillos.

50

55

60

65

Determinación de inmunoglobulina humana Se ensayó el suero para Ig humana total y específica de antígeno. Se cuantificó la Ig humana total mediante ELISA sándwich usando IgG+IgM+IgA antihumana F(ab)2-purificado de cabra (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) como agente de captura y antihumano de cabra purificado conjugado con peroxidasa (Zymed Laboratories) como reactivo de detección. El suero humano con concentración de inmunoglobulina conocida se usó como estándar (Sigma, Rehovot, Israel). Las microplacas (Nunc, Roskilde, Dinamarca) pre-cubiertas con el reactivo de captura (2,5 ug/mL, 50 uL/pocillo) y se bloquearon con BSA al 1% se incubaron toda la noche a 4ºC con diluciones de plasma a partir de 1:200.000 a 1:640.000, o el estándar a partir de 0,2 a 0,06 ug/mL, entonces se lavó 5 veces con una solución PBSTween. El reactivo de detección se añadió y las placas se incubaron durante 1 h a 37ºC, entonces se lavaron 3 veces. La solución de sustrato fresco (TMB, Sigma) se añadió y, tras el desarrollo del color catalizado por peroxidasa, la reacción se paró por la adición de ácido sulfúrico al 10%. La absorbancia a 450 nm se cuantificó en un lector ELISA (Dynatech, Port Guernsey, Channel Islands, UK). La concentración de los anticuerpos humanos específicos de antígeno en suero de ratones se determinó mediante un equipo HbsAg EIA (ZER, Jerusalem, Israel). Los anticuerpos humanos en sobrendantes de hibridoma se determinaron por incubación toda la noche de los 6

ES 2 210 527 T3 sobrenadantes en las placas cubiertas de IgG+A+M antihumano de cabra (Zymed), con peroxidasa IgG anti-humana de cabra conjugada como reactivo secundario. 5

Los anticuerpos específicos de antígeno en sobrenadantes de hibridoma se determinaron como anteriormente usando placas cubiertas de antígeno Hbs. Determinación de las subclases de IgG humana

10

Las subclases de IgG humana se determinaron mediante un ELISA sándwich usando placas cubiertas de IgG+IgM+ IgA antihumana F(ab)2-purificada de cabra (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y placas cubiertas de antígeno has. Las subclases de IgG antihumana de ratón (Sigma) se usaron como anticuerpo secundario y anticuerpo antihumano de cabra purificado conjugado con peroxidasa (Zymed Laboratories) como reactivo de detección. Análisis estadístico

15

Se realizó el análisis estadístico usando el programa Stat View II (Abacus Concepts, Inc., Berkely, CA) en Mackintosh Quadra 605 o Microsoft Excel 5.0 (Microsoft) en un PC 486 DX2 compatible. Se utilizó la T-test de Student, la correlación Anova y análisis de regresión para calcular los valores de la probabilidad (p) y el coeficiente de correlación (r). Los resultaron se presentaron como media ± error estándar. 20

Mediciones de la constante de afinidad

25

30

35

La determinación de las constantes de afinidad (KD ) de los diferentes anticuerpos anti-HBs a los antígenos ad (Chemicon Cat. No. AG 850) en solución se realizó de acuerdo a Friguet y al. (Journal of Immunological Methods, 77:305-319, 1985). El antígeno a varias concentraciones (3,5 x 10−10 M a 1,4 x 10−9 M) se incubó primero en una solución con una cantidad constante de anticuerpo (3,4 x 10−11 M), en tampón de fosfato de sodio 0,1 M que contiene 2 mM de EDTA y 10mg/mL de BSA pH 7,8 (tampón de medio). Después de la incubación durante toda la noche a 20ºC la concentración del anticuerpo libre se determinó mediante un ELISA indirecto. Un volumen de 300 ul de cada mezcla se transfirió e incubó durante 2 h a 20ºC en los pocillos de una placa de microtitulación (Nunc) recubierta previamente con Ad (50 µl/pocillo a 1 µg/mL en un tampón de NaHCO3 0,1 M, pH 9,6 durante 2 h a 37ºC). Después de lavar con PBS que contiene Tween 20 al 0,04%, los anticuerpos unidos se detectaron añadiendo IgG anti-humana de cabra HRP-F(ab’)2 (Zymed) diluido 1:3.000 con tampón de medio, 50 µL /pocillo 2 h a 20ºC. La placa se desarrolló con cromógeno TMB (comprimidos T-405 Sigma) 50 µL/pocillo, la reacción se paró con H2 SO4 al 10% 50 µl y la placa se leyó en un lector ELISA a 450 nm. Las condiciones se escogieron de manera que los valores de f resultantes (ver Friguet y al) estaban alrededor de 0,1. La concentración de anticuerpo usada se dedujo a partir de una calibración ELISA realizada en la misma placa. La constante de afinidad KD se calculó a partir de la representación Scatchard. Ensayos de inhibición

40

45

Los ensayos de inhibición se realizaron en placas microtituladas cubiertas con partículas HBs (2 µg/mL en PBS). La placa se bloqueó con BSA 3% en PBS. Los sobrenadantes de hibridoma que contienen los anticuerpos antiHBs se diluyeron en serie. Se añadieron 50 µl de cada dilución a los pocillos microtitulados cubiertos. A continuación, 50 µl de partículas HBs (ad/ay, 0,5 µl/ml en PBS) o sólo PBS se añadieron a cada pocillo. Las placas se incubaron toda la noche a temperatura ambiente en una cámara húmeda y se lavó 5 veces con PBS-Tween. Se añadió a cada pocillo 50 µl IgG anti-humana de cabra conjugada con HRP (diluida 1:5.000 en PBS). Tras 4 horas de incubación a temperatura ambiente en una cámara húmeda las placas se lavaron 5 veces con PBS-Tween, y se añadió TMB a cada pocillo. Los resultados se leyeron por un lector ELISA, a longitud de onda de 450 nm. Inmunohistotinción

50

55

Se fijó el fragmento de hígado positivo en VHB en formaldehído de tampón neutro al 4% durante 24 h y luego se depositó en parafina usando procedimientos rutinarios. Secciones de 4 µm de espesor se cortaron de los bloques de parafina y se montaron en portaobjetos cubiertos de poli-lisina. Tras la desparafinización y tratamiento con peroxidasa se realizó una tinción usando nuestros anticuerpos purificados de Proteína A anti-HBs humanos monoclonales seguido por IgG (H+L) anti-Humana de cabra biotinilada (Zymed, San Francisco, CA) usando un kit de Histotinción-SPTM de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se tiñeron en paralelo los portaobjetos control sin usar el primer anticuerpo anti-HBs humano. Análisis de secuencia

60

65

Se aisló el RNA total a partir de 10 x 106 células de hibridoma con reactivo B RNAsol (TEL-TEX, Inc. Friendswood, Texas) Se preparó cDNA a partir de 10 µg de RNA total con transcriptasa reversa y oligo dT (Promega, Madison, WI) de acuerdo con procedimientos estándar. Se realizó la PCR en 1/50 de la mezcla de reacción a temperatura ambiente con cebadores líder VH , VL o Vκ.. 5’ y cebadores 3’ que corresponden a la región constante humana. Los fragmentos de PCR se clonaron en el vector pGEM-T (Promega). Los insertos se secuenciaron usando una máquina de secuenciación ABI 377. Se analizaron las secuencias por comparación con GenBank y por alineación a las secuencias Kabat (Kabat et al. 1991, Sequences of proteins of immunological interest (5th Ed.) U.S. Dept. of Health and Human services, Nacional Institutes of Health, Bethesda, MD). 7

ES 2 210 527 T3 Ejemplo 1 Producción de anticuerpos anti HBs humanos en ratones quiméricos 5

10

15

20

Los linfocitos de sangre periférica humana (PBL) de donantes positivos para anticuerpos anti HBs se implantaron intraperitonealmente en ratones BALB/C irradiados que fueron radioprotegidos por transplante de la médula ósea de ratones SCID. Estos ratones quiméricos se inmunizaron con la vacuna de la Hepatitis B (Engerix B) para inducir una respuesta inmune secundaria. La producción de anticuerpos anti HBs específicos junto con la secreción de Ig humana total se midió en el suero de los ratones. La Fig. 1 muestra los niveles de Ig humana total y anticuerpos anti HBs específicos en el suero de los ratones 14 días tras el trasplante de la PBL humana. Aunque los niveles de Ig humana secretada son similares en ratones control e inmunizados, una respuesta inmune específica fuerte se desarrolla en el ratón vacunado con la vacuna de la hepatitis B comparado con el grupo control. La comparación de los niveles de los anticuerpos humanos específicos producidos en respuesta al antígeno en ratones inmunizados a sus niveles en el suero de los donantes, indica un incremento de 5-10 veces en los ratones. Además, la actividad específica medida en el suero de los ratones, es decir, los niveles de anticuerpos específicos anti HBs por mg de Ig humana secretada, es 102104 veces superior que la actividad específica observada en el donante. Este incremento demuestra una amplificación muy elevada de la producción de anticuerpos anti HBs en respuesta al antígeno en los ratones quiméricos. (Fig. 2). La producción de anticuerpos humanos es detectable 10 días tras la inmunización y alcanzó el máximo tras tres semanas. La actividad específica es máxima el día 13 tras la inmunización y después decrece (debido al incremento en la secreción de Ig humana total). (Fig. 3). Ejemplo 2 Preparación y caracterización de anticuerpos monoclonales humanos contra HBs

25

30

35

40

45

50

Los linfocitos B humanos se cultivaron de bazos de ratón, dos semanas tras la inmunización se fusionaron con células de heteromieloma de ratón-humano (Posner et al. Supra). Las células de hibridoma se ensayaron para ver su tasa de crecimiento, la secreción de Ig total y la producción de anticuerpos específicos. Se realizaron experimentos de fusión control en los donantes PBL que se activaron in vitro con PWM y VHBsAg. Las frecuencias de fusión en diferentes experimentos estaban en el rango a partir de 0,9-5 x 10-5. La mayoría de los clones de hibridoma crecientes secretaron Ig humana del que 0,1-4% producen anticuerpos anti HBs humanos específicos. Las células de hibridoma que secretan Anti-HBs derivadas de los bazos de ratones quiméricos se compararon con aquellos obtenidos a partir de la fusión de los donantes de PBL activada in vitro en términos del tipo de Ig y estabilidad como se muestra en la Tabla 1 posterior. La mayoría de hibridomas de ratones quiméricos se encontró que eran de tipo IgG y todos eran estables durante más de 12 meses. En contraposición, los hibridomas derivados de PBL de donantes eran mayoritariamente inestables, sólo un clón ha sido estable durante más de 12 meses. Se caracterizaron dos clones de hibridoma estables que secretan anticuerpos monoclonales anti HBs humanos específicos. Como se muestra en la Tabla 2 posterior, estos anticuerpos se purificaron en una columna de proteína A así como una columna de agarosa-Ig antihumana y se encontró que ambos eran de la subclase de IgG1. Las constantes de afinidad están en el rango de 1,3 x 10−9 M a 6 x 10−9 M como se ensayó mediante ELISA competitivo. La especificidad se ensayó por ensayo de inhibición competitiva usando un antígeno de superficie HB del subtipo ad-ay (1:1) (Fig. 4). La Fig. 5 muestra la unión específica del MoAbS humano de la invención a VHB mediante tinción de fragmentos de hígado humano infectados con VHB. Se aisló el gen que codifica la región variable de Ab 19.79.5, se secuenció entero, y se determinaron sus subgrupos y CDRs. El anticuerpo tenía una secuencia del gen de Ig humana completo como se determinó por el alineamiento a las secuencias GeneBank y a las secuencias de proteína Kabat. La Fig. 10 muestra la secuencia de nucleótido del cDNA que codifica la cadena ligera de la región variable de Ab 19.79.5 y su correspondiente secuencia de aminoácidos (Secuencias de identificación Nos. 1 y 3). La Fig. 11 muestra la secuencia de nucleótidos del cDNA que codifica la cadena pesada de la región variable de Ab 19.79.5 y su secuencia de aminoácidos correspondiente (Secuencia de identificación 2 y 4). Los datos de secuenciación revelan que la región variable de Ab 19.79.5 consiste de los subgrupos VH3 , JH12 , Vλ3 y

55

Jλ3 .

60

Los genomas VHB se clasificaron en seis grupos de A a F, basándose en el grado de similitud entre sus secuencias de nucleótidos. La variabilidad genética de VHB se refleja más en el caso de diferentes serotipos de HbsAg. El determinante común “a” y dos pares de determinantes exclusivos mutuamente “d/y” y “w/r” capaces de distinguir cuatro subtipos principales de HbsAg: adw, adr, ayw y ayr. Determinantes adicionales designados subdeterminantes de w(w1 a w4) permitió la definición de cuatro serotipos de ayw (ayw1-4) y dos serotipos de adw, es decir adw2 y adw4. Variaciones de subtipo adicionales se añadieron mediante el determinante q, que está presente en al menos todos los subtipos. Esta ausencia se marcó mediante un signo “q-”.

65

La clase de serotipos de VHB reconocidos por Ab 19.79.5 se examinó usando un grupo de 15 tipos de HbsAg diferentes (Norder et al., 1992, Journal of General Virology, 73. 3141; Magnius and Norder, 1995. Intervirology, 38, 24-34). Como puede verse en la Fig. 6, Ab 19.79.5, tiene un patrón de reconocimiento complejo de diferentes serotipos HbsAg. 8

ES 2 210 527 T3 Ejemplo 3 Actividad biológica de los anticuerpos monoclonales humanos contra HBs 5

La actividad biológica de Ab 19.79.5 y Ab 18.5.1013 (el último anticuerpo no siendo parte de la invención reivindicada), se caracterizó usando el modelo animal de VHB siguiente: se trató un ratón para permitir el injerto estable de fragmentos de hígado humano. El tratamiento incluye irradiación intensiva seguida del trasplante de médula ósea del ratón SCID (inmunodeficiencia combinada severa). La infección viral de los fragmentos de hígado se realizó ex vivo usando el suero humano positivo en VHB (PE 699 235).

10

El modelo animal se usó de tres modos diferentes representando varios usos potenciales de los anticuerpos: la inhibición del modo de infección, modo de inhibición / profilaxis combinada y tratamiento / inhibición combinada. 1. Modo de inhibición 15

20

Este modelo demuestra la capacidad para usar el anticuerpo para inhibir la infección del hígado por VHB. El experimento mostrado en la Fig. 7 se indica sólo con propósitos ilustrativos. El suero humano positivo en VHB se preincubó con Ab 18.5.1013, seguido por infección del hígado ex vivo estándar. Se ensayó el VHB-DNA en el suero de los ratones 11 días y 18 días tras el trasplante. Como se ve en la Fig. 7 hubo una reducción significativa en el porcentaje de animales infectados en el grupo tratado con anticuerpos comparado con el grupo no tratado. 2. Modo de inhibición / profilaxis combinada

25

30

35

Este modelo representa un trasplante de hígado. En este modelo los ratones se trataron con Ab 19.79.5 (10 I.U/ratones) tres días antes del trasplante de hígado seguido por el trasplante de fragmentos de hígado humano que fueron infectados ex vivo con VHB en presencia de Ab 19.79.5 (100 I.U.) El DNA del VHB se ensayó en el suero de los ratones los días 10 y 17 tras el trasplante. Como se puede ver en la Fig. 8 hubo una reducción significativa en el porcentaje de animales infectados en el grupo tratado comparado con el grupo control. 3. Modo de tratamiento / inhibición combinado a) el suero humano positivo en VHB se preincubó con Ab 19.79.5 seguido por infección del hígado ex vivo estándar. b) los ratones se trataron con Ab 19.79.5 los días 0 y 7 tras el trasplante. El DNA de VHB en el suero de los ratones se ensayó los días 11 y 19. Como se puede ver en la Fig. 9, el porcentaje de animales infectados en el grupo tratado Ab 19.79.5 se redujo significativamente pero rebotó dos semanas después de parar el tratamiento. Ejemplo 4 Terapia de combinación de anticuerpos monoclonales humanos contra HBs y un agente antiviral

40

Usando el modelo VHB descrito anteriormente, se trataron los ratones con un fármaco antiviral (un análogo de nucleósido, 0,5 mg/ratón/día) los días 17-20 tras el trasplante. Un grupo de ratones se trató además con anticuerpos monoclonales humanos de la invención los días 19 y 20. La presencia de DNA del VHB en el suero de los ratones se ensayó los días 21 y 27. 45

TABLA 1 Estabilidad 50

Secretores Anti-HBs

Fuente de células de hibridoma

IgM

Ig G

1 estable durante>10 meses 47 inestable

25 (52%)

23 (48%)

PBL activada in vitro

6 estable durante>10 meses 3 inestable

3 (33%)

6 (67%)

Esplenocitos de ratón quimérico

55

60

65

9

ES 2 210 527 T3 TABLA 2 Kd (M)

Producción de mg/105 células/día

Tipo

Clon

6,1 x 10−9

10,3

IgG1 V1

18.5.1013

1,62 x 10−9

5,8

IgG1 V1

19.79.5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

10

ES 2 210 527 T3 REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste de: 5

(a) el anticuerpo monoclonal que se secreta por la línea celular de hibridoma depositada en el European Collection of Cell Cultures (ECACC) bajo el No. de Acceso 96052168; (b) fragmentos del anticuerpo de (a) que retienen sustancialmente las características de unión al antígeno del anticuerpo entero;

10

(c) un anticuerpo monoclonal codificado por secuencias de ácido nucleico que comprenden las secuencias de ácido nucleico mostradas en la Fig. 10 y Fig. 11; y (d) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias de aminoácidos mostradas en la Fig. 10 y Fig. 11. 15

2. Una línea celular de hibridoma depositada en el ECACC bajo el No. de acceso 96052168. 3. Una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo de la reivindicación 1 y opcionalmente un vehículo aceptable farmacéuticamente. 20

4. La composición farmacéutica de la reivindicación 3 que además comprende al menos otro ingrediente activo siendo un agente antiviral. 25

5. El uso del anticuerpo de la reivindicación 1 para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de las infecciones de VHB. 6. El uso de un anticuerpo de la reivindicación 1 en combinación con un agente antiviral para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de infección de VHB.

30

7. La composición farmacéutica de la reivindicación 4 o el uso de la reivindicación 6, en donde dicho agente antiviral se selecciona a partir del grupo que consiste de interferones, anticuerpos policlonales antiHB, análogos de nucleósido e inhibidores de la DNA polimerasa. 8. Un método para el diagnóstico de infecciones de VHB en una muestra de fluido corporal que comprende:

35

(a) poner en contacto dicha muestra con el anticuerpo de la reivindicación 1 bajo condiciones que permiten la formación de complejos antígeno-anticuerpo; (b) determinación del nivel de complejos antígeno-anticuerpo formados; 40

en donde un nivel significativamente superior al formado en la muestra control indica una infección por VHB en la muestra de fluido corporal ensayada. 45

50

55

60

65

NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluida en la mencionada reserva. 11

ES 2 210 527 T3

12

ES 2 210 527 T3

13

ES 2 210 527 T3

14

ES 2 210 527 T3

15

ES 2 210 527 T3

16

ES 2 210 527 T3

17

ES 2 210 527 T3

18

ES 2 210 527 T3

19

ES 2 210 527 T3

20

ES 2 210 527 T3

21