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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 226 393

51 Int. Cl. : C12N 15/11

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A61K 31/70 C07H 21/00

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 99926337 .9

86 Fecha de presentación: 20.05.1999

87 Número de publicación de la solicitud: 1080192

87 Fecha de publicación de la solicitud: 07.03.2001

54 Título: Oligonucleótidos antisentido para el tratamiento de células poliferadoras.

30 Prioridad: 22.05.1998 DE 198 22 954

73 Titular/es: Faustus Forschungs Cie. Translational

Cancer Research GmbH Grimmaische Strasse 2-4 04109 Leipzig, DE

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.03.2005

72 Inventor/es: Flad, Hans-Dieter;

Gerdes, Johannes; Böhle, Andreas y Ährchen-Deinert, Irina

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Isern Jara, Jorge

ES 2 226 393 T3

16.03.2005

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 226 393 T3 DESCRIPCIÓN Oligonucleótidos antisentido para el tratamiento de células proliferadoras. 5

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La invención se refiere a oligorribo y oligodesoxirribonucleótidos, que son apropiados para la terapia de estadios de enfermedades que cursan con una elevada proliferación celular. Como oligonucleótidos antisentido se denominan aquellos fragmentos de ácidos nucleicos cuya secuencia es complementaria a la cadena codificadora o “con sentido” de ADN ó de un RNA mensajero (ARNm) y por ello tiene la capacidad de unirse específicamente (hibridar) con estas secuencias diana complementarias. Con ello es posible influir selectivamente en procesos celulares. Los oligonucleótidos antisentido han encontrado interés como herramienta para la investigación, así como un medio potencial para las terapias antivíricas y tumorales (E. Uhlmann, A. Peyman, Chemical Reviews, 90 (1990) 544-584); S. Agrawal, TIBTECH 10 (1992) 152-158) y en parte han alcanzado ya el nivel de la investigación clínica (M.D. Matteucci, R.W. Wagner, Nature 384 (196) 20.22).

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Ki-67 es una proteína celular que no se produce en todas las fases activas del ciclo celular (G1 , S, G2 y mitosis) pero si se produce durante la fase de reposo (Go ). La fase de reposo o fase Go describe el estado en el cual la actividad de división celular está paralizada, es decir, las células han abandonado las fases activas del ciclo celular y no se dividen. La Ki-67 es una proteína humana nuclear, cuya expresión está estrechamente asociada con la proliferación celular. Se utilizan anticuerpos específicos contra la proteína Ki-67 en Histopatología para la determinación de la proporción de células en crecimiento en tumores humanos (J. Gerdes, Seminars in Cancer Biology (“Seminarios de Biología del Cáncer”) 1 (1990) 199-206). Se demostró además, que mediante una proteína Ki-67 formada por 21 bases, el 2’-desoxioligonucleótido antisentido, puede inhibirse la proliferación de las células humanas IM-9 en función de la concentración (C. Schlüter et al., The Journal of Cell Biology (“Revista de biología celular”) 123 (1993) 513-522). La secuencia completa de nucleótidos del ADNc de la proteína Ki-67 así como la secuencia de aminoácidos que se derivan de la misma son ya conocidos (Schlüter et al., ver antes). La figura 1 (SEQ ID NO 1) muestra la cadena con sentido, del cADN de la Ki-67.

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El objetivo de la presente invención es la preparación de oligonucleótidos antisentido, que sean apropiados para la terapia de estadios de enfermedades, que cursan con una elevada proliferación celular. Ejemplos de tales estadios de enfermedades son los tumores, alergias, enfermedades autoinmunológicas, cicatrización, inflamaciones y enfermedades reumáticas así como la supresión de reacciones de defensa en los trasplantes.

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Este objetivo se consigue mediante los oligorribo u oligodesoxirribonucleótidos así como sus sales fisiológicamente aceptables, los cuales tienen la capacidad de hibridar con el ARNm que codifica la proteína Ki- 67.

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Se ha descubierto que los oligorribo u oligodesoxirribonucleótidos según la invención, tienen una acción citotóxica y no solamente inhibidora sobre las células proliferadoras como por ejemplo las células tumorales, y ocasionan la muerte de las células. Este descubrimiento es sorprendente en tanto que la proteína Ki-67 no es comprobable en las células no proliferativas con lo que claramente no es necesaria para la supervivencia de las células. Son oligonucleótidos preferidos aquellos que a 37ºC y a una concentración fisiológica de sal hibridan con el ARNm de la Ki-67.

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Son particularmente preferidos los oligorribo y oligodesoxirribonucleótidos y particularmente los oligodesoxirribonucleótidos, cuya secuencia es complementaria de la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1) de la cadena con sentido del ADNc de la Ki-67, es decir, en una longitud de cadena de 10 bases, presenta como máximo de 0 a 4, de preferencia de 0 a 2 y con particular preferencia, no presenta ningún fallo, en los pares de bases (desapareamientos). Como particularmente activos se muestran además los oligorribo u oligodesoxirribonucleótidos, que hibridan con una secuencia de nucleótidos de la región 5’ del ARNm de la Ki-67, es decir, oligorribo u oligodesoxirribonucleótidos que son complementarios con la región 5’ de la secuencia mostrada en la figura 1, de preferencia en un fragmento de la región desde la posición 197 hasta la 2673 ó 2673 hasta la 9962, con particular preferencia desde la posición 197 hasta la 220. Los oligonucleótidos según la invención presentan de preferencia una longitud de cadena de 12 a 66 nucleótidos, con particular preferencia desde 17 hasta 46, y con particular preferencia, desde 22 hasta 46 nucleótidos.

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Muy particularmente preferida es la secuencia (SEQ ID NO: 3): (5’- ACC AGG CGT CTC GTG GGC CAC AT) 65

Los oligonucleótidos sin modificar y en particular los oligorribonucleótidos sin modificar están sometidos en gran medida a la degradación nucleolítica y por ello presentan solamente una pequeña estabilidad y un pequeño tiempo biológico del valor mitad. Para mejorar la viabilidad de la membrana y para aumentar el tiempo biológico del valor mitad, se modifican de preferencia las bases, radicales de azúcares y/o fosfatos de los oligonucleótidos según la invención. 2

ES 2 226 393 T3

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Son preferidos los oligonucleótidos en los cuales uno o varios grupos fosfato están cambiados por grupos fosfotioato, metilfosfonato, fosforamidato, metilen(metilimino)(MMI) y/o grupos guanidino. La estructura de estos grupos está representada en la figura 2. Son particularmente preferidos los oligonucleótidos tiolados, es decir, los oligonucleótidos en los cuales los grupos fosfato están cambiados por grupos fosfotioato. Pueden estar modificados uno o varios de los grupos fosfato del oligonucleótido. En una modificación parcial se modifican de preferencia los grupos que están en los extremos, pero los más preferidos son los oligonucleótidos en los cuales están modificados todos los grupos fosfato. Las modificaciones preferidas de azúcares comprenden el cambio de uno o varios radicales ribo del oligonucleótido por hexosa (figura 2) o por aminoácidos (ácidos péptidonucleicos, PNA, figura 2). Las modificaciones de las bases comprenden el empleo del 5-propinil-uracilo, 5-propinilcitosina y fenoxazina de análogos tricíclicos de la citosina.

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La síntesis de oligonucleótidos modificados así como otras posibilidades de modificación adecuadas están descritas en la literatura (ver por ejemplo, E. Uhlmann, A. Peyman, ver antes; M.D. Matteuci, R.W. Wagner, ver antes). Además, los oligonucleótidos según la invención están protegidos por las uniones internucleótidas 3’ - 3’ y/o 5’ - 5’ terminales, frente a una degradación mediante exonucleasas (H. Seliger et al., Nucleosides & Nucleotides (“Nucleósidos y nucleótidos”) 10 (1-3), 469-477 (1991)). Además, los oligonucleótidos según la invención pueden adicionalmente estar substituidos con grupos, los cuales favorecen la absorción intracelular, los cuales in vivo o in vitro sirven como grupos informadores, y/o grupos que en la hibridación del oligorribonucleótido con el ARN diana, se adhieren a éste mediante una unión o una escisión.

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Ejemplos para grupos que favorecen la absorción intracelular son los radicales lipófilos como los radicales alquilo, por ejemplo, de 1 hasta 18 átomos de carbono, grupos colesterilo o tiocolesterilo (E.Uhlmann, A. Peyman ver antes), o conjugados, que se valen de sistemas Carrier naturales, como p. ej., el ácido gálico o péptidos para el correspondiente receptor (p. ej., endocitosis inducida por receptores). 30

Ejemplos de grupos informadores son los grupos fluorescentes (p. ej., grupos acridinilo, dansilo, fluorescinilo) o grupos quimioluminiscentes como p. ej., grupos ésteres de acridinio. 35

Ejemplos de conjugados de oligonucleótidos que se unen a ácidos nucleicos y/o escinden, se encuentran en E. Uhlmann, A. Peyman, ver antes). Asociados de conjugados son entre otros, la acridina, psolares, cloroetilaminoarilo, fenantredina, azidofenacilo, azidoproflavina, fenazina, fenantrolin/Cu, porfirin/Fe, benzo[e]piridoindol, EDTA/Fe (Mergny et al., Science 256 (1992) 1681).

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La representación de los oligonucleótidos según la invención se determina de forma de por sí ya conocida (ver p. ej., E. Uhlmann, A. Peyman, ver antes). Se prefiere la síntesis en fase sólida con ayuda de un aparato de síntesis automático.

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Para la obtención de medicamentos, se combinan los oligonucleótidos según la invención con soportes habituales, excipientes y/o aditivos. Los oligonucleótidos son apropiados para empleo sistémico, local, subcutáneo, intratecal y tópico, y para la aplicación mediante enemas. Para ello pueden disolverse en disolventes apropiados, de preferencia soluciones acuosas, en forma de liposomas, como emulsión o se encuentran en forma sólida, por ejemplo como polvo o en forma microencapsulada.

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La cantidad de oligonucleótidos en los medicamentos se ajusta según la aplicación deseada y de preferencia se ajusta de forma que se obtiene una aplicación de 0,001 a 100 mg de oligonucleótido por kg de peso corporal, de preferencia 0,001 a 10 mg/kg de peso corporal, con más preferencia de 0,01 a 3 mg/kg de peso corporal. El tratamiento se efectúa de preferencia repitiendo el tratamiento en un período de tiempo de un día a 6 semanas, en una dosis de preferencia 0,01 a 3 mg/kg por día. Los oligonucleótidos según la invención son apropiados para el tratamiento de estadios de enfermedades que cursan con una elevada proliferación celular, en particular para el tratamiento de tumores benignos y malignos, como tumores de testículos, linfomas, carcinomas de estómago, carcinomas de vesícula, carcinomas de mama, carcinomas bronquiales, sarcomas, carcinomas renales, melanomas, enfermedades autoinmunológicas, cicatrización, inflamaciones, alergias, enfermedades reumáticas y reacciones de defensa en trasplantes.

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Una ventaja particular de los oligonucleótidos según la invención tiene que ver con que permiten el tratamiento de tumores que son resistentes contra la quimioterapia convencional. Estas resistencias aparecen en citostáticos no específicos como por ejemplo la vinblastina o la cisplatina, o secundariamente, es decir, después de múltiples aplicaciones, o están ya presentes originalmente en determinados tumores como por ejemplo el carcinoma de riñón. 65

Particularmente sorprendente fue la constatación de que los oligonucleótidos según la invención no solamente inhiben el crecimiento de las células sino que también presentan una acción citotóxica, es decir, conducen a la muerte de las células tumorales tratadas. La acción citotóxica aparece en general después de un tiempo de tratamiento de 3

ES 2 226 393 T3 aproximadamente 5 a 12 días. Para el total aniquilamiento de todas las células proliferativas puede ser necesario un tiempo de tratamiento de algunas semanas, pudiendo interrumpirse el tiempo de tratamiento con períodos de tiempo de no tratamiento. 5

A continuación, se aclara la invención con más detalle, a la vista de diferentes ejemplos de ejecución. Ejemplo 1 Acción sobre el crecimiento de células RT4 en el ensayo de esferoides multicelulares

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Se investigó la acción de los oligonucleótidos según la invención, sobre las células del carcinoma de vesícula de la línea celular RT4 en esferoides multicelulares, y se comparó con las correspondientes cadenas con sentido y sin sentido, como controles. 15

Para ello se obtuvieron de forma ya conocida (Uhlman y Peyman, ver antes) los 2’-desoxioligonucleótidos con las siguientes secuencias:

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Todos los nucleótidos se emplearon, cuando no se menciona otra cosa, en forma tiolada, es decir, un átomo de oxígeno del radical del ácido fosfórico se substituyó con un átomo de azufre. 30

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Según el método de Carlsson & Yuhas (J. Carlsson y J.M. Yuhas, Liquid- overlay culture of cellular spheroids, Recent Results in Cancer Research (“Cultivo del recubrimiento líquido de los esferoides celulares, recientes resultados en la investigación del cáncer”, 95; 1-23, 1984), se obtuvieron esferoides multicelulares de la línea celular RT-4 (ATCC nº: HTB2). Después de cuatro días los esferoides multicelulares presentaban una morfología esférica con una marcada clara delimitación. A continuación, se incubaron los esferoides multicelulares de RT4 en presencia de 120 µmoles/litro del correspondiente oligonucleótido en medio de cultivo a 37ºC, 5% de CO2 y se midió el cambio de diámetro de los esferoides. Los oligonucleótidos se añadieron directamente al medio, después del período de tiempo necesario para la aparición de los esferoides. Como controles negativos sirvieron por un lado una muestra a la que no se añadió ningún oligonucleótido (controles), y por otro lado muestras de oligonucleótidos sin sentido y con sentido. A continuación se midió el diámetro de los esferoides multicelulares en períodos de tiempo de 2 días. Por cada ensayo se investigaron tres preparaciones iguales y a continuación se calculó el valor medio. Los resultados están expuestos en la figura 3 representados gráficamente. En los controles se observó un aumento del diámetro de los esferoides hasta el 132% del valor de partida, mientras que la adición del oligonucleótido sin sentido tiolado producía una interrupción del crecimiento. La adición del oligodesoxinucleótido con sentido produjo una pequeñísima disminución del diámetro de los esferoides hasta el 90%, mientras que la adición del oligonucleótido antisentido condujo a una rápida disminución del diámetro de los esferoides hasta una completa disolución del esferoide el día 12avo de la incubación. Después de la coincubación de los esferoides multicelulares con oligonucleótidos, se sometieron además a un análisis con ayuda de colorantes fluorescentes, para determinar su vitalidad. Los colorantes empleados para ello fueron el acetato disódico marcado con fluoresceína (FITC-FDA) y el yoduro de propidio (PI). Cada esferoide multicelular se incubó con 2 µl de FITC-FDA de concentración 1 µmol/litro durante 20 minutos y con 10 µl de PI (concentración: 20 µg/ml) durante 10 minutos. Con el microscopio de fluorescencia se observaron células vivas con la tintura FITC-FDA de color verde, y células muertas con la tintura PI de color rojo. Quedó demostrada una marcada reacción citotóxica de las células investigadas del grupo tratado con antisentido. Los resultados demuestran que el oligonucleótido antisentido según la invención es citotóxico para la línea celular tumoral ensayada, y que tiene una acción perjudicial irreversible sobre las células, que conduce a la muerte de las mismas. Para excluir que el disolvente solo, tenía influencia sobre el crecimiento, se efectuaron las correspondientes pruebas de control con el disolvente (disolvente; se añadió solamente el disolvente de los oligonucleótidos, pero no el propio oligonucleótido), las cuales demostraron que esta influencia era despreciable (ver figura 4).

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ES 2 226 393 T3 Ejemplo 2 Acción sobre el crecimiento de las células RT4 en la microinyección 5

Se investigó la acción de los oligonucleótidos mencionados en el ejemplo 1 sobre las células RT4, en la inyección directa de los compuestos en la célula. Para ello se emplearon los oligonucleótidos en la forma sin modificar (forma no tiolada). Mediante este ensayo se puede demostrar por un lado la actividad de los oligonucleótidos sin modificar y por otro lado se puede concluir que la unión no específica de los oligonucleótidos a los receptores de la membrana celular es la responsable de los efectos descritos en el ejemplo 1.

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Las células RT4 se sembraron en cubreobjetos especiales (cubreobjetos CELLocate®, de la firma Eppendorf). En estos cubreobjetos la retícula grabada al ácido en el centro facilita el encuentro de las células inyectadas. Antes de la siembra de las células se colocan los cubreobjetos en cápsulas de Petri con un diámetro de 3,5 cm y se impregnan cada una con 1 µl de fibronectina, lo cual hace que las células tengan una mejor adherencia. A continuación se sembraron 1,5 x 105 células por cápsula las cuales habían sido previamente disueltas en tripsina, en 2,5 ml de medio RPMI 1640, y se cultivaron a 37ºC durante la noche en le estufa de incubación. La microinyección se efectuó con ayuda del transyector 5246 y del micromanipulador 5171 (de la firma Eppendorf) bajo control del microscopio de luz (microscopio inverso tipo Leitz DMIL, de la firma Leica). Los capilares de la microinyección se llenaron con ayuda de puntas de pipeta Mikroloader® (de la firma Eppendorf) con 2,0 µl cada vez, de solución de oligonucleótidos (concentración 120 µmole/litro). El ajuste de la concentración se efectuó con solución de sal común tamponada con fosfato filtrada estéril (solución salina tamponada con fosfato, PBS). Para comprobar la estanqueidad de los capilares llenos, se empleó la función limpieza del transyector con un control microscópico. En los capilares abiertos se observó después de la inmersión en el medio de cultivo una pérdida regular del líquido de inyección. La presión de inyección se fijó empíricamente en 130 hPa y después de las primeras inyecciones se corrigió de forma que la inyección condujera a un claro aumento del tamaño de las células, sin destruirlas. El tiempo de inyección fue entre 0,3 y 0,5 segundos. Para las inyecciones citoplasmáticas, la punta capilar se introdujo en el citoplasma hasta que se observó en la célula un reflejo de luz debido a la presión. A continuación el capilar se levantó de nuevo algunos µm y mediante una presión del botón se interrumpió el movimiento automático de la inyección. Durante la inyección se podía corregir el límite de la inyección en pasos de 0,14 µm hacia arriba y hacia abajo, de forma que podían compensarse las irregularidades del fondo de las células. Para estudios comparativos se emplearon capilares de microinyección que fueron empleados en una fase de trabajo para mantener lo más constante posible la cantidad de líquido derramada por inyección. Sin embargo, el volumen inicial varió de célula a célula puesto que la presión de inyección y con ello la solución a inyectar, podía difundirse mejor o peor según la región encontrada. Para minimizar los efectos del enfriamiento y desviación del pH del medio de cultivo sobre el comportamiento al crecimiento de las células, se limitó el tiempo total de inyección por capsulita de cultivo celular a 15 minutos. Los resultados del ensayo están representados gráficamente en la figura 5. Se demostró que la inyección de oligonucleótidos antisentido y las subsiguientes 22 horas de tiempo de incubación tenían como consecuencia una pérdida de adhesión en aproximadamente el 70% de las células. Puesto que solamente las células vivas permanecen adheridas en el cubreobjetos, este resultado es comparable a la muerte del 70% de las células. La inyección del oligonucleótido con sentido o sin sentido condujo en cada caso a una pérdida de adhesión en el 30% de las células y la sola inyección del disolvente (PBS) condujo a una pérdida de adhesión en el 10% de las células. Ejemplo 3 Acción sobre el crecimiento de las células J82

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Análogamente al ejemplo 1, se investigó la acción de los oligonucleótidos sobre la línea celular del tumor de vesícula humana J82. El oligonucleótido antisentido tiolado, a una concentración de 120 µmoles/litro, condujo después de 11 días a una disminución del diámetro esferoidal del 20%, mientras que el diámetro esferoidal del control en el mismo espacio de tiempo aumentó aproximadamente un 30% (figura 6). 55

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ES 2 226 393 T3 REIVINDICACIONES

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1. Empleo de un oligorribonucleótido u oligodesoxirribonucleótido que tiene la capacidad de hibridar con un ARNm que codifica la proteína Ki-67, ó una sal fisiológicamente aceptable del mismo, para la obtención de un medicamento para el aniquilamiento de células proliferadoras. 2. Empleo según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos del oligorribonucleótido u oligodesoxirribonucleótido es complementaria con la secuencia SEQ ID NO 1.

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3. Empleo según la reivindicación 2, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos del oligorribonucleótido u oligodesoxirribonucleótido es complementaria con la región que va desde la posición 197 a la 9962 de la secuencia SEQ ID NO 1. 4. Empleo según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el oligorribonucleótido o el oligodesoxirribonucleótido tiene de 12 a 66 nucleótidos. 5. Empleo según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el oligorribonucleótido o el oligodesoxirribonucleótido tiene de 17 a 46 nucleótidos.

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6. Empleo según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el oligorribonucleótido o el oligodesoxirribonucleótido tiene la secuencia (5’-ACC AGG CGT CTC GTG GGC CAC AT). 7. Empleo según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque uno o varios grupos fosfato del oligorribonucleótido u oligodesoxirribonucleótido están cambiados por el(los) grupo(s) fosfotioato, metilfosfonato, fosforamidato, metilen(metilimino) y/o guanidino. 8. Empleo según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el oligorribonucleótido o el oligodesoxirribonucleótido tienen unos terminales 3’ - 3’ y/o 5’ - 5’ de enlace internucleótido.

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9. Medicamento para el aniquilamiento de células proliferadoras, caracterizado por un contenido en un oligorribonucleótido y/o un oligodesoxirribonucleótido, que tiene la capacidad de hibridar con un ARNm, que codifica la proteína Ki-67 asociada al ciclo celular o una sal fisiológicamente aceptable de la misma, junto a soportes habituales, excipientes y/o aditivos, en donde la cantidad de oligonucleótido está ajustada de forma que se logra una aplicación de 0,001 a 100 mg/kg de peso corporal. 10. Empleo de un oligorribonucleótido o un oligodesoxirribonucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 8, para la obtención de un medicamento para el aniquilamiento de células proliferadoras en el tratamiento de tumores, linfomas, enfermedades autoinmunológicas, cicatrización, inflamaciones, alergias, enfermedades reumáticas, reacciones de defensa después de un trasplante. 11. Procedimiento para la elaboración de un medicamento según la reivindicación 9, para el aniquilamiento de células proliferadoras, caracterizado porque mediante el empleo de los oligorribonucleótidos u oligodesoxirribonucleótidos, que tienen la capacidad de hibridar con el ARNm, que codifica la proteína Ki-67, ó una sal fisiológicamente compatible. 12. Procedimiento según la reivindicación 11, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de tumores, enfermedades autoinmunológicas, cicatrización, inflamaciones, alergias, enfermedades reumáticas o reacciones de defensa después de los trasplantes.

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13. Procedimiento según la reivindicación 11 ó 12, que comprende la combinación de un oligorribonucleótido u oligodesoxirribonucleótido, que tiene la capacidad de hibridar con el ARNm, el cual codifica la proteína Ki-67, con soportes habituales, excipientes y/o aditivos. 14. Oligorribonucleótido u oligodesoxirribonucleótido, o una sal fisiológicamente compatible del mismo, caracterizado porque tiene la capacidad de hibridar con el ARNm, el cual codifica la proteína Ki-67, que tiene los nucleótidos 22 al 46 y que tiene un efecto citotóxico sobre las células proliferadoras. 15. Oligorribonucleótido u oligodesoxirribonucleótido, según la reivindicación 14, caracterizado porque presenta la secuencia (5’-ACC AGG CGT CTC GTG GGC CAC AT).

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ES 2 226 393 T3 LISTA DE SECUENCIAS (1) DATOS GENERALES: 5

(i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Centro de investigación Borstel (B) CALLE: Parkallee 1-40

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(C) LOCALIDAD: Borstel (D) PAÍS FEDERAL: Schleswig-Holstein (E) PAÍS: Alemania (F) CÓDIGO POSTAL: D 23845

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(ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Oligonucleótidos antisentido para el tratamiento de células proliferadoras (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 3 (iv) ORDENADOR - FORMATO DE LECTURA:

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(A) SOPORTE DE DATOS: disco flexible (B) ORDENADOR: IBM PC compatible (C) SISTEMA DE TRABAJO: PC-DOS/MS-DOS

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(D) PROGRAMA: PatentIn Release # 1.0, versión # 1.30 (EPA) (2) DATOS DE SEQ ID NO: 1:

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(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 12493 PARES DE BASES (B) CLASE: Nucleótido (C) CADENA: doble cadena

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(D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA:

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(A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) POSICIÓN: 197..9964 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

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9

ES 2 226 393 T3

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5

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30

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45

(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 2: 50

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 3256 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido

55

(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

60

65

15

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5

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5

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(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA 35

(A) LONGITUD: 23 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) CADENA: monocatenario

40

(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico especial (A) DESCRIPCIÓN: /desc = “oligonucleótido sintético”

45

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: ACCAGGCGTC TCGTGGGCCA CAT

50

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