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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 242 955

51 Int. Cl. : A61K 39/12

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C12N 15/09 C12N 7/04

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 94912186 .7

86 Fecha de presentación : 08.03.1994

87 Número de publicación de la solicitud: 0688227

87 Fecha de publicación de la solicitud: 27.12.1995

54 Título: Producción de la proteína de la cápside del virus del papiloma humano y partículas de tipo viral.

30 Prioridad: 09.03.1993 US 28517

07.03.1994 US 207309

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.11.2005

73 Titular/es: The University of Rochester

518 Hylan Building Rochester, New York 14627-0140, US

72 Inventor/es: Rose, Robert C.;

Bonnez, William y Reichman, Richard C.

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Ungría López, Javier

ES 2 242 955 T3

16.11.2005

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 242 955 T3 DESCRIPCIÓN Producción de la proteína de la cápside del virus del papiloma humano y partículas de tipo viral. 5

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La presente solicitud es una continuación, en parte de la Solicitud de Patente U.S. Nº de Serie 08/028.517, registrada el 9 de marzo de 1993, ahora pendiente; y la Solicitud de Patente U.S. Nº de Serie, “a asignar”, registrada el 7 de marzo de 1994, ahora pendiente. El Gobierno de los Estados Unidos puede tener algunos derechos en esta invención, de acuerdo con las adjudicaciones AI-82509, AI-35159 y CA-11198 del Public Health Service de los National Institutes of Health. Campo de la invención

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La presente invención se refiere, en general, al virus del papiloma (PV). Más concretamente, la invención tiene que ver con un método para expresar la secuencia codificadora para la proteína de la cápside del virus del papiloma humano tipo 6 (HPV-6) y tipo 11 (HPV-11), utilizando el sistema de expresión de baculovirus, la producción de partículas similares (VLPs) al virus HPV y el empleo de estas VLPs en la producción de anticuerpos que reconozcan epítopos en el HPV, y para el desarrollo de vacunas para el HPV, y para el desarrollo de pruebas serológicas para la detección de la infección por HPV.

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Antecedentes de la invención

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La familia Papovaviridae constituye un grupo de virus de ADN que inducen infecciones líticas y tumores benignos o malignos. Estructuralmente, todos son viriones icosaédricos desnudos con 72 capsómeros, y contienen ADN circular doble hélice. Los virus incluidos en la familia son: (1) virus del papiloma humanos y animales, (2) virus del polioma del ratón, (3) virus vacuolizante símico, y (4) virus BK y JC humanos. Los virus del papiloma humanos (HPV) infectan los epitelios cutáneo, genital, oral y respiratorio de una manera tejido-específica. La infección con HPV ha estado asociada fielmente con el desarrollo de lesiones benignas y malignidades (Reichman y col., Papillomaviruses, 1990, págs. 1.191-1.200; y Mandell y col., Principles and Practice of Infectious Diseases, 3rd Edition, Churchill Livingstone, Nueva York, N.Y.). Por ejemplo, el HPV tipo 1 (HPV1) está presente en verrugas plantares, el HPV tipo 6 u 11 (HPV-6 o HPV-11) en condylomata acuminata (verrugas anogenitales), mientras que el HPV tipos 16 ó 18 (HPV-16 o HPV-18) son frecuentes en lesiones premalignas y malignas del epitelio escamoso del cérvix (ver Crum y col., “Human papillomavirus infection and cervical neoplasia: New perspectives, ”1984, Int. J. Gynecol. Pathol., vol. 3, págs. 376-388; zur Hausen, Genital Papillomavirus Infections, 1985, págs. 83-90; Rigby y col., Viruses and Cancer, Cambridge University Press, Cambridge, UK; y Koutsky y col., “Epidemiology of genital human papillomavirus infection”, 1988, Epidemiol. Rev., vol. 10, págs. 122-163). Sin embargo, las dificultades para propagar el HPV in vitro ha conducido al desarrollo de enfoques alternativos para la producción de antígenos para estudios inmunológicos. Por ejemplo, Bonnez y col., “The PstI-XhoII restriction fragment of the HPV-6b L1 ORF lacks immunological specificity as determined by sera from HPV 6 condyloma acuminatum patients and controls”, 1990, UCLA Symp. Mol. Cell. Biol., New Series, vol. 124, págs. 77-80; Jenison y col., “Identification of immunoreactive antigens of human papillomavirus type 6b by using Escherichia coli-expressed fusion proteins”, 1988, J. Virol., vol. 62, págs. 2.115-2.123; Li y col., “Identification of the human papillomavirus type 6b L1 open reading frame protein in condylomas and corresponding antibodies in human sera”, 1987, J. Virol., vol. 61, págs. 2.684-2.690; Steele y col., “Humoral assays of human sera to disrupted and nondisrupted epitopes of human papillomavirus type 1”, 1990, Virology, vol. 174, págs. 388-398; y Strike y col., “Expression in Escherichia coli of seven DNA segments comprising the complete L1 and L2 open reading frames of human papillomavirus type 6b and the location of the “common antigen””, 1989, J. Gen. Virol, vol. 70, págs. 543-555, han expresado secuencias codificadoras para la proteína de cápside recombinante en sistemas procariotas, y utilizadas en análisis Western blot de sueros obtenidos a partir de individuos con infección por HPV del tracto genital. Los resultados de estos estudios han sugerido que los anticuerpos para epítopos desnaturalizados, esto es, lineales, de proteínas de la cápside del HPV pueden ser detectados en los sueros de algunos individuos infectados. También se han utilizado partículas de virus completos para detectar anticuerpos en sueros humanos, incluyendo anticuerpos dirigidos contra epítopos conformacionales. Estos estudios han sido difíciles de conducir porque la mayoría de las lesiones inducidas por HPV de origen natural producen pocas partículas. Sin embargo, se pueden obtener partículas de virus completos en cantidades suficientes, para conducir ensayos inmunológicos, a partir de verrugas plantares inducidas por HPV tipo 1 (Kienzler y col., “Humoral and cell-mediated immunity to human papillomavirus type 1 (HPV-1) in human warts”, 1983, Br. J. Dermatol., vol. 108, págs. 65-672; Pfister y col., “Seroepidemiological studies of human papilloma virus (HPV-1) infections”, 1978, Int. J. Cancer, vol. 21, págs. 161-165; y Steele y col., “Humoral assays of human sera to disrupted and nondisrupted epitopes of human papillomavirus type 1”, 1990, Virology, vol. 174, págs. 388-398) y xenoinjertos en ratón atímico con HPV-11 inducido experimentalmente (Kreider y col., “Laboratory production in vivo of infectious human papillomavirus type 11”, 1987, J. Virol., vol. 61, págs. 590-593; y Kreider y col., “Morphological transformation in vivo of human uterine cervix with papillomavirus from condylomata acuminata”, 1985, Nature, vol. 317, págs. 639-641). Más concretamente, la Patente U.S. Nº 5.071.757 según Kreider y col., revela un método para propagar viriones infecciosos de HPV-11 en el laboratorio utilizando un sistema de modelos de xenoinjerto en ratón atímico. Aunque este sistema sea capaz de producir cantidades de virus 2

ES 2 242 955 T3 infeccioso que se pudieran utilizar para el desarrollo de una prueba serológica para la infección genital por HPV, este sistema es muy caro e incómodo. Además, únicamente un tipo de HPV genital ha sido propagado hasta aquí en este sistema, limitando de este modo su utilidad. Además, el virus infeccioso producido utilizando este sistema representa un riesgo biológico y, por lo tanto, sería difícil de utilizar en una formulación para vacuna. 5

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Zhou y col., en “Expression of vaccinia recombinant HPV 16 L1 and L2 ORF proteins in epithelial cells is sufficient for assembly of HPV virion-like particles”, 1992, Virology, vol. 185, págs. 251-257, han informado de la formación de partículas similares al virus HPV 16, en núcleos de células CV-1, después de la infección con un vector de expresión recombinante doble de L1/L2 del virus vaccinia HPV-16. Sin embargo, los autores no fueron capaces de producir VLPs con un vector expresando únicamente L1. Además, las VLPs producidas carecían de una simetría bien definida, y eran más variables en tamaño y más pequeñas, solamente unos 35-40 nm de diámetro, que los viriones de HPV (55 nm) o las VLPs de la presente invención (VLPs de HPV-11 producidas por baculovirus, unos 50 nm de diámetro). La Patente U.S. Nº 5.045.447 según Minson revela un método para escrutar sobrenadantes de cultivos de hibridomas para anticuerpos monoclonales con especificidades deseadas. El método de Minson está ejemplificado por la producción de anticuerpos para la proteína L1 del virus del papiloma humano tipo 16 (HPV-16), utilizando esta proteína como antígeno diana en ratones. Sin embargo, Minson fracasa para revelar la expresión de la proteína L1 o producción de partículas similares al virus HPV (VLPs).

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La Patente U.S. Nº 4.777.239 según Schoolnik y col. revela secuencias peptídicas cortas derivadas de varios de los marcos de lectura abiertos de la región temprana del virus del papiloma, que obtienen anticuerpos tipo-específicos para el virus del papiloma. Sin embargo, los inventores no tienen éxito para revelar cualquier secuencia dirigida hacia el marco de lectura abierto tardío principal, L1.

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La Patente U.S. Nº 5.057.411 según Lancaster y col. revela una secuencia polinucleotídica de unos 30 nucleótidos del marco de lectura abierto de la proteína L1 de la cápside del virus del papiloma, que los inventores afirman que codifica un epítopo tipo-específico del virus del papiloma. Sin embargo, los inventores no revelan animales infectados que produzcan anticuerpos que reconozcan esta secuencia. En lugar de eso, sintetizaron una versión de la secuencia (un péptido de 10 aminoácidos, o decapéptido) del virus del papiloma tipo 1 bovino (BPV-1), después inmunizaron conejos y ensayaron la capacidad del antisuero para reaccionar con tejido de fibropapiloma inducido con BPV-1 o BPV-2. El antisuero peptídico reacciona únicamente con el tejido de BPV-1 y no con el de BPV-2. Después, los inventores concluyeron que el péptido contenía un determinante antigénico que era tipo-específico, y por lo tanto, todas las secuencias codificadoras para L1 del virus del papiloma contienen un epítopo tipo-específico en este punto. Esta es una especulación teórica por parte de los inventores, que no dan datos de soporte para esta hipótesis. Además, se cree, en general, que las secuencias de aminoácidos reveladas (10 aminoácidos) no son capaces de adoptar estructuras antigénicas de orden superior, esto es, epítopos conformacionales que posean una estructura tridimensional tal como las producidas mediante el método descrito aquí.

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Otro problema asociado con las infecciones por el virus del papiloma es la necesidad de modalidades terapéuticas y profilácticas alternativas. Una de tales modalidades, que ha recibido un pequeño estudio reciente, sería las vacunas para el virus del papiloma. En 1944, Biberstein trató a pacientes con condiloma acuminado con una vacuna autógena obtenida a partir de las verrugas de los pacientes (Biberstein, “Immunization therapy of warts”, Arch. Dermatol Syphilol, 1944, vol. 50, págs. 12-22). Después de eso, Powell y col. desarrollaron la técnica típicamente utilizada hoy día para preparar vacunas autógenas para verrugas, para el tratamiento del condiloma acuminado (Powell y col., “Treatment of condylomata acuminata by autogenous vaccine”, 1970, South Med. J., vol. 63, págs. 202-205). Únicamente un estudio doble ciego, controlado con placebo, ha intentado evaluar la eficacia de la vacuna autógena (Malison y col., “Autogenous vaccine therapy for condyloma acuminatum: A double-blind controlled study”, 1982, Br. J. Vener. Dis., vol. 58, págs. 62-65). Los autores concluyeron que la vacunación autógena no fue eficaz en el tratamiento del condylomata acuminata, aunque esta interpretación puede ser errónea. El pequeño número de pacientes estudiados imposibilitó sacar conclusiones negativas válidas. En todo caso, las vacunas autógenas, como se describieron luego, tienen varias desventajas. En primer lugar, el paciente necesita tener verrugas relativamente grandes (2 g a 5 g) para preparar la vacuna. En segundo lugar, el médico general necesita acceso al equipo del laboratorio y habilidad cada vez que se trata un nuevo paciente. De este modo, la preparación de la vacuna es muy cara, tediosa, y no posible en casos que impliquen una masa de lesión relativamente pequeña.

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Desafortunadamente, los métodos tradicionales de propagación del virus no han sido todavía adaptados al estudio de virus del papiloma, y los métodos alternativos anteriormente descritos fracasan para producir viriones infecciosos en cualquier cantidad significativa para estudios inmunológicos. También, la propagación in vivo del HPV-11 en un sistema de ratón atímico no es muy práctica debido a que es caro, de mucha mano de obra, y al mismo tiempo limitado al HPV-11. Por consiguiente, se necesita un método alternativo para producir epítopos de cápside del HPV para su uso en estudios inmunológicos y producción de vacunas. Sumario de la invención

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La presente invención está dirigida hacia un método para expresar la secuencia codificadora para la proteína de la cápside del virus del papiloma (PV) en una célula, comprendiendo el transfectar la célula con un vector de expresión conteniendo la secuencia codificadora para la proteína de la cápside del virus del papiloma, bajo condiciones que faciliten la expresión de la proteína en la célula. 3

ES 2 242 955 T3 En otro aspecto de la invención, se proporciona una partícula(s) similar a virus (VLPs), fragmento(s), capsómero(s), o porción(s) del mismo, formados a partir de la proteína de la cápside del virus del papiloma. Se ha descubierto que la partícula(s) similar al virus consta de una característica(s) similar a la de partículas del virus del papiloma infeccioso nativo. 5

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En una forma de realización preferida de la invención, se proporciona un método para expresar la secuencia codificadora para la proteína L1 de la cápside del virus del papiloma humano tipo 6 (HPV-6) y tipo 11 (HPV-11) en células de insecto Sf-9, utilizando el sistema de expresión de baculovirus. Las secuencias codificadoras para HPV-6 y HPV11 fueron clonadas, utilizando técnicas estándar en la técnica, dentro de un vector de transferencia de baculovirus. El vector de transferencia de baculovirus resultante fue utilizado para cotransfectar células de insecto Sf-9 con el virus de la polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV), formando un baculovirus recombinante (Ac6L1 o Ac11L1) que fue recuperado. Después, las células de insecto Sf-9 fueron infectadas con Ac6L1 o Ac11L1 bajo condiciones que facilitasen la expresión de la proteína en las células. Se descubrió que la proteína L1 formaba partículas similares a virus (VLPs). Las VLPs fueron identificadas mediante microscopía electrónica de fracciones en bandas de sacarosa teñidas negativamente, obtenidas a partir de células Sf-9 infectadas con el baculovirus recombinante Ac11L1. Se descubrió además que las VLPs poseían características inmunológicas y morfológicas similares a las de viriones de HPV11 nativos, como se definió mediante antisueros de conejo. La partícula(s) similar a virus, producida según la invención, puede ser utilizada en ensayos diagnósticos, puede jugar un papel en la identificación y caracterización de un receptor celular del HPV, y puede ser utilizada para el desarrollo de vacunas (terapéuticas y profilácticas). Se comprende que el método de la invención descrito aquí para la producción de HPV-11 y HPV-6 se puede utilizar para producir reactivos inmunológicos similares de otros virus del papiloma animales y/o humanos. Además, las VLPs producidas según la invención proporcionarán abundantes reactivos con los que llevar a cabo estudios inmunológicos de virus del papiloma, y para desarrollar vacunas contra los virus del papiloma. Breve descripción de las figuras

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La Fig. 1A muestra gel de poliacrilamida-SDS, teñido con azul Coomassie, de lisados celulares Sf-9 infectados con AcNPV salvaje y Ac11L1 recombinante. La Fig. 1B muestra un Western blot de lisados celulares Sf-9 infectados con AcNPV salvaje y Ac11L1 recombinante, investigados con antisuero policlonal de conejo específico para el epítopo común de L1 del HPV.

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La Fig. 2 muestra una micrografía electrónica de partículas similares al virus HPV-11, recuperadas por centrifugación en densidad de sacarosa a partir de células Sf-9 infectadas con Ac11L1. Las VLPs mostradas son de aproximadamente 52 nm de diámetro (escalado mediante patrones de amplificación) y poseen simetría icosaédrica, coherentes con observaciones publicadas con respecto a las características morfológicas de viriones del papiloma de origen natural.

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La Fig. 3 muestra comparaciones de Western blot e inmunodot blot de las inmunorreactividades de antisueros de conejo con L1 recombinante. En el panel A, el lisado de células de insecto de L1 recombinante fue analizado mediante Western blot bajo condiciones desnaturalizantes. En el panel B, se aplicaron lisados de células de insecto de L1 (L1) no recombinante (+) o recombinante a una membrana de transferencia bajo condiciones no desnaturalizantes. Las tiras A fueron investigadas con un antisuero policlonal de conejo específico para el epítopo común de L1 del HPV; las tiras B fueron investigadas con un antisuero policlonal de conejo específico para la secuencia de aminoácidos aminoterminal de L1 del HPV; las tiras C fueron investigadas con un antisuero policlonal de conejo para las partículas virales completas.

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La Fig. 4 muestra un ensayo Western blot utilizando lisados de células de insecto de L1 recombinante. Las tiras A-X corresponden a diferentes anticuerpos primarios utilizados (las tiras A y B fueron hechas reaccionar con antisueros preinmunes y postinmunes de conejo anti-partículas virales completas, respectivamente; la tira C fue hecha reaccionar con antisuero postinmune de conejo anti-epítopo común de L1 desnaturalizado; las tiras D-O fueron hechas reaccionar con sueros de pacientes con condiloma acuminado; las tiras P-X fueron hechas reaccionar con sueros de control).

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La Fig. 5 muestra un ensayo inmunodot blot utilizando lisados celulares de insecto. Las letras de arriba de las tiras corresponden a diferentes anticuerpos primarios utilizados, los cuales fueron los mismos descritos en la Fig. 4. 60

La Fig. 6 es una micrografía electrónica de VLPs del HPV tipo 6, producidas mediante la construcción y expresión de un baculovirus recombinante de L1 del HPV-6 (Ac6L1). La Fig. 7 es una micrografía electrónica de VLPs del HPV tipo 6, producidas mediante la construcción y expresión de un baculovirus recombinante de L1 del HPV-6 (Ac6L1).

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La Fig. 8 muestra la serorreactividad de pacientes con condiloma acuminado hacia VLPs de L1 del HPV-11. La Fig. 9 muestra la correlación entre las serorreactividades hacia viriones y VLPs del HPV-11. 4

ES 2 242 955 T3 La Fig. 10(a) muestra un Western blot (panel izquierdo) de las proteínas L1 del HPV-11 (Tira 2) y L1 del HPV-16 (Tira 3). Los marcadores moleculares de referencia están a la izquierda, la flecha indica las posiciones aproximadas de las proteínas L1 recombinantes del HPV-11 y HPV-16. 5

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La Fig. 10(b) es un inmunodot blot (panel derecho) donde la Tira 1: AcNPV (muestra infectada con baculovirus salvaje); Tira 2: Ac11L1 (muestra infectada con Ac11L1 recombinante); Tira 3: Ac16L1 (muestra infectada con Ac16L1 recombinante). La Fig. 11 muestra la detección con SDS-PAGE y Western inmunoblot de L1 recombinante del HPV-11 en el sobrenadante del cultivo de células Sf-9 infectadas con Ac11L1 [Panel A: SDS-PAGE (teñido con Coomassie); Panel B: Western blot utilizando el suero de antígenos comunes PVL1; Tira 1: gránulo a alta velocidad del sobrenadante de cultivo celular infectado con AcNPV; Tira 2: gránulo a alta velocidad del sobrenadante de cultivo celular Sf-9 infectado con Ac11L1; los marcadores de peso molecular (Mr ) están a la izquierda; la flecha a la derecha representa la posición de L1 recombinante de 55 kD de Mr ).

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La Fig. 12 muestra un análisis microscópico electrónico de preparaciones de VLPs brutas y purificadas con ClCs (A - VLPs granuladas a partir de sobrenadante del cultivo sin células Sf-9 infectadas con Ac11L1; B - VLPs purificadas con ClCs, barra = 50 nm). 20

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La Fig. 13 muestra un análisis inmunodot blot de VLPs recombinantes purificadas y viriones completos de HPV11 (Tira 1: sueros preinmunes, tira 2: sueros postinmunes; A - Conejo R-366, inmunizado con viriones completos de HPV-11 purificados; B - Conejo R-399, inmunizado con VLPs de HPV-11 purificadas; Antígenos: VLP (partículas similares a virus de L1 del HPV-11); WVP (partículas virales completas de HPV-11)]. La Fig. 14 muestra un análisis dotplot de los diámetros medios geométricos (GMD) de xenoinjertos. La Fig. 15 muestra un inmunoensayo Western blot de preparaciones de VLPs purificadas de HPV-11, HPV16 y HPV-18 (Tira A: VLPs de L1 del HPV-11; tira B, VLPs de L1 del HPV-16; tira C, VLPs de L1 del HPV18).

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La Fig. 16 (A-C) muestra una micrografía electrónica de VLPs purificadas con cloruro de cesio, obtenidas del HPV tipos 11, 16 y 18. Las VLPs fueron purificadas como se describe en la especificación, y teñidas negativamente con ácido fosfotúngstico al 2%. A) VLPs de L1 del HPV-11; B) VLPs de L1 del HPV-16; C) VLPs de L1 del HPV18; las barras corresponden a 100 nm. 35

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La Fig. 17 muestra las inmunorreactividades de antisueros postinmunes de conejo de VLPs, con preparaciones de VLPs homólogas y heterólogas. Antígenos: VLPs de L1 del HPV-11, barras blancas; VLPs de L1 del HPV-16, barras punteadas; VLPs de L1 del HPV-18, barras negras. Antisueros: A) antisuero de conejo anti-antígeno común PVL1; B) antisuero de conejo de viriones completos de HPV-11; C, D) de dos conejos inmunizados con VLPs de L1 del HPV11; E, F) de dos conejos inmunizados con VLPs de L1 del HPV-16; G, H) de dos conejos inmunizados con VLPs de L1 del HPV-18. Descripción detallada de la invención

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La presente invención está dirigida hacia un método para expresar la secuencia codificadora para la proteína de la cápside del virus del papiloma en una célula, utilizando el sistema de expresión de baculovirus bajo condiciones que faciliten la expresión de la proteína en la célula. En otro aspecto de la invención, se ha descubierto que una partícula(s) similar a virus (VLPs), fragmento(s), capsómero(s), o porción del mismo, se forma a partir de la proteína de la cápside del virus del papiloma. Se ha descubierto además que la partícula(s) similar al virus consta de características antigénicas similares a las de partículas infecciosas nativas de virus del papiloma. Como se utiliza aquí, “partícula(s) similar a virus (VLPs)” se refiere a una partícula(s) similar al virus, fragmento(s), capsómero o porción(s) del mismo, producidos a partir de la secuencia codificadora de la proteína del cápside de virus del papiloma, y comprendiendo una característica(s) antigénica similar a la de partículas infecciosas de virus del papiloma. Como se utiliza aquí, “característica(s) antigénica(s)” se refiere a (1) la capacidad de la partícula(s) similar a virus a reaccionar cruzadamente con partículas salvajes (partículas infecciosas nativas del virus del mismo tipo de HPV) como se determina mediante antisueros generados en animales y/o humanos por inmunización con VLPs o virus infeccioso; y/o (2) la capacidad para reconocer o detectar anticuerpos en sueros humanos de personas conocidas por estar infectadas con un virus homólogo.

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Como se utiliza aquí, “secuencia codificadora para la proteína L1” o “secuencia codificadora para la proteína L1 de la cápside” se refiere al marco de lectura abierto que codifica para la proteína L1 en el virus del papiloma. Cuando se expresa, la secuencia codificadora para la proteína L1 produce una proteína, o complejo proteico, o agregado, que posee características inmunológicas y morfológicas similares a las de viriones nativos de virus del papiloma. La secuencia codificadora para L1 utilizada en la invención puede ser aislada y purificada a partir de ADN genómico de virus del papiloma, o sintetizada utilizando técnicas clásicas de ingeniería genética.

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ES 2 242 955 T3 Como se utiliza aquí, el término “transfectar” se refiere a cualquier medio para introducir un virus, plásmido o vector dentro de una célula. Ejemplos de tales medios incluyen la infección, precipitación con fosfato cálcico, y electroporación. 5

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En una forma de realización preferida de la invención, se proporciona un método para expresar la secuencia codificadora para la proteína L1 de la cápside del virus del papiloma humano tipo 11 (HPV-11), o del virus del papiloma humano tipo 6 (HPV-6), en células de insecto Sf-9, utilizando el sistema de expresión de baculovirus. Se comprende que las secuencias codificadoras para las proteínas de la cápside de estos tipos de HPV sean utilizadas únicamente con fines de ilustración, y que se puede utilizar cualquier secuencia codificadora para la proteína L1 de la cápside para cualquier tipo de virus del papiloma animal o humano, sin desviarse del ámbito de aplicación pretendido de la invención. Tales tipos de HPV incluyen, sin limitación, los tipos 16, 18, 31, 33, 35 del HPV (Gissman y col., Cancer Cells, 1987, vol. 5, pág. 275, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia); y aquellos tipos de HPV revelados en la publicación PCT nº WO 92/16636 según Boursnell y col., cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia.

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El sistema de expresión preferido utilizado en el método de la invención es el sistema de expresión de baculovirus, sin embargo, se entiende que se pueda emplear aquí cualquier otro tipo de sistema(s) de expresión siempre que el sistema(s) pueda expresar la secuencia codificadora para la proteína L1. Ejemplos de tales sistemas incluyen, sin limitación, cualquier sistema(s) procariota y/o eucariota abarcando adenovirus, SV40, E. coli, células CHO, virus vaccinia, virus de insectos, levadura, virus bacteriófago o virus modificados, plásmidos de ADN, vectores y otros. La célula huésped para la expresión de la secuencia codificadora para L1 depende del sistema de expresión utilizado. Ejemplos de células huésped apropiadas incluyen, sin limitación, bacterias (procariotas), microorganismos tales como levadura, células mamíferas (eucariotas) y células de insecto. Cuando se utiliza el sistema de expresión de baculovirus, se prefieren células de insecto tales como las Sf-9 o Sf-21.

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En otro aspecto de la invención, se descubrió que la proteína L1 produce partículas similares a virus (VLPs), fragmento(s), capsómero(s) o porción(s) del mismo, formados a partir de proteína de la cápside del virus del papiloma. Se ha descubierto que la partícula(s) similar a virus consta de una característica(s) antigénica similar a la de partículas infecciosas nativas del virus del papiloma. Más concretamente, estas VLPs contienen un determinante antigénico que es específicamente identificado por anticuerpos presentes en sueros obtenidos de pacientes infectados con HPV genital. Por ejemplo, la reacción de extractos de células de insecto conteniendo VLPs, con antisueros dirigidos contra epítopos desnaturalizados o no desnaturalizados de la cápside, como se dedujo por las inmunorreactividades en ensayos Western blot e inmunodot blot, sugirió que los epítopos conformacionales presentes en viriones infecciosos nativos de HPV-11 también estaban presentes en las VLPs de HPV-11, producidas por baculovirus, de la presente invención. Los ensayos inmunodot blot que utilizan sueros humanos obtenidos de individuos con condiloma acuminado confirmado por biopsia, se correlacionan fielmente con los resultados previamente obtenidos en ensayos ELISA basados en partículas virales completas de HPV-11, como se describió por Bonnez y col., “Use of human papillomavirus type 11 virions in an ELISA to detect specific antibodies in humans with condylomata acuminata”, 1991, J. Gen. Virol., vol. 72, págs. 1.343-1.347, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia.

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Estas similitudes morfológicas e inmunológicas hacia los viriones nativos de HPV-11 sugieren que las VLPs recombinantes, producidas en el sistema de baculovirus, serán útiles en estudios de seroepidemiología y de patogénesis de no únicamente la infección genital por HPV, sino para cualquier virus del papiloma y para el desarrollo de vacunas. La L1 tiene la capacidad intrínseca de autoensamblaje. De este modo, no son necesarias otras proteínas del virus del papiloma para la formación de VLPs en el sistema de baculovirus. Esto respalda la contienda de que se pueden producir VLPs para todos los tipos de virus del papiloma según el método descrito aquí. Las VLPs de la invención pueden ser utilizadas para producir anticuerpos en sujetos para los que se desea protección contra la infección por HPV, eso es, vacunas, o para intensificar la respuesta inmunológica hacia una infección por HPV ya presente. Las VLPs de la invención pueden ser inyectadas en especies animales para obtener antisueros útiles en diagnosis. Además de antisueros policlonales, se pueden obtener anticuerpos monoclonales utilizando los métodos de Kohler y Milstein, o por modificación de los mismos, o inmortalizando células del bazo o productoras de anticuerpos, a partir de animales inyectados para obtener clones productores de anticuerpos, esto es, hibridomas.

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Los anticuerpos obtenidos se pueden utilizar para diagnosis de la infección por HPV en biopsias de cérvix o frotis de Papanicolau, y para valorar los niveles de enfermedad en humanos u otros sujetos. En particular, la diagnosis utilizando los anticuerpos de la invención permite supervisar la evolución de la enfermedad. Los anticuerpos se pueden utilizar en análisis de suero para detectar el virus, así como para supervisar el progreso de la terapia con agentes antivirales u otros terapéuticos dirigidos para el control de la infección o carcinoma. Los anticuerpos también se pueden utilizar como terapia pasiva, teniendo en cuenta las variaciones de las especies. Las VLPs de la invención pueden ser utilizadas en inmunoensayos para detectar la presencia de anticuerpos producidos contra el HPV en el suero de pacientes sospechosos de abrigar infecciones por HPV, o para titular los sueros de pacientes siendo tratados con una vacuna anti-HPV. Las VLPs de la invención pueden ser directamente administradas a un huésped para inducir la formación de anticuerpos neutralizantes (Bonnez y col., 1992, citado aquí en otra parte; y Rose y col., en prensa, citado aquí en otra 6

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parte, cuyas menciones están incorporadas por este medio mediante referencia), para otorgar inmunidad protectora contra el HPV o, si el paciente está ya infectado, estimular la propia respuesta inmunológica del paciente. Para todas las aplicaciones, las VLPs son administradas en forma inmunogénica. Opcionalmente, las VLPs pueden estar conjugadas con un material soporte que le confiera inmunogenicidad, siendo el material, preferentemente, antigénicamente neutro. Dependiendo del uso requerido, las VLPs de la invención tienen la capacidad de servir como vacunas tipoespecíficas o de amplio rango y como diagnósticos. Las VLPs que sean para administrar como vacunas pueden ser formuladas según métodos convencionales y/o futuros para tal administración al sujeto a proteger, y se pueden mezclar con adyuvantes convencionales. El péptido expresado se puede utilizar como inmunógeno en formulaciones de vacunas subunidad, las cuales pueden ser multivalentes. La formulación de vacunas multivalentes puede comprender VLPs cada una codificando una proteína L1 diferente de distintos HPVs. El producto puede ser purificado con el fin de formulación de vacunas a partir de cualquier sistema vector/huésped que exprese la proteína heteróloga. Las VLPs purificadas deberían ser ajustadas a una concentración apropiada, formuladas con algún adyuvante de vacunas apropiado, y envasada para su uso. Los adyuvantes adecuados abarcan, pero no se limitan a: geles minerales, por ejemplo, hidróxido de aluminio; sustancias tensoactivas tales como lisolecitina, polioles Pluronic; polianiones; péptidos; emulsiones oleosas; y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (Bacilo Calmette-Guerin) y Cornebacterium parvum. El inmunógeno también puede ser incorporado en liposomas, o conjugado con polisacáridos y/u otros polímeros para su uso en una formulación de vacunas. Se pueden utilizar muchos métodos para introducir las formulaciones de vacunas descritas anteriormente; estos abarcan, pero no se limitan a, vías oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea e intranasal. Si son utilizadas directamente como reactivos diagnósticos, son purificadas utilizando métodos convencionales y envasadas conforme a tal empleo. Si son utilizadas para producir anticuerpos con fines diagnósticos, se pueden utilizar animales de ensayo apropiados para preparar los antisueros adecuados. Los huéspedes apropiados abarcan ratones, ratas, conejos, cobayas, o incluso mamíferos más grandes tales como ovejas. Los anticuerpos pueden ser utilizados terapéuticamente con tal que sean compatibles con el huésped a tratar. Para esta aplicación, se prefieren anticuerpos monoclonales que tengan las características apropiadas de las especies. Los Ejemplos siguientes se proporcionan para ilustrar adicionalmente la presente invención.

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Ejemplo I Métodos 35

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1. ADN Viral de HPV-11 y Construcción del Vector de Transferencia de Baculovirus pVL11L1 Se obtuvo ADN genómico de HPV-11 a partir de partículas de virus que fueron purificadas de xenoinjertos en ratón atímico inducidos experimentalmente, como se describió por Rose y col., “Expression of the full-length products of the HPV-6b and HPV-11 L2 open reading frames by recombinant baculovirus, and antigenic comparisons with HPV-11 whole virus particles”, 1990, J. Gen. Virol., vol. 71, págs. 2.725-2.729, cuya revelación está incorporada mediante referencia. La secuencia codificadora para L1 fue clonada mediante amplificación por PCR de ADN genómico purificado, utilizando cebadores diseñados para introducir sitios de las enzimas de restricción Bg/II y EcoRI en los extremos 5’ y 3’, respectivamente. Las secuencias de los cebadores directo e inverso fueron, respectivamente, 5’-CGC AGA TCT ATG TGG CGG CCT AGC-3’ y 5’-CAT ATG AAT TCC CAC AAC ACA CTG ACA CAC-3’. Los sitios de restricción (subrayados) fueron introducidos proximales al supuesto codon de inicio de L1 (texto en negrita), y aproximadamente 30 nucleótidos por debajo del supuesto codon de parada de L1, mediante mutagénesis dirigida con cebadores. La amplificación fue realizada, esencialmente, como se describe por Bonnez y col., “Antibody-mediated neutralization of human papillomavirus type 11 (HPV-11) infection in the nude mouse: Detection of HPV-11 mRNAs by the polymerase chain reaction”, 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376-380, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia, utilizando 500 ng de cada cebador y 2 unidades de Taq ADN polimerasa (Amplitaq, Perkin-Elmer Cetus Corp., Norwalk, CT). Después de la amplificación, el producto PCR fue digerido con Bg/II y EcoRI. El producto de digestión de 1.539 pares de bases (pb), que contenía el marco de lectura abierto (ORF) completa de L1 de HPV-11, fue purificado mediante electroforesis en gel de agarosa como se describe por Rose y col., “Expression of the full-length products of the HPV-6b and HPV-11 L2 open reading frames by recombinant baculovirus, and antigenic comparisons with HPV-11 whole virus particles”, 1990, J. Gen. Virol., vol. 71, págs. 2.725-2.729, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia, y clonado dentro de los sitios correspondientes de un vector de transferencia de baculovirus, pVL-1392 (M.D. Summers, Texas A&M University, College Station, TX). La construcción resultante, pVL11L1, fue utilizada para cotransfectar células Sf-9 con ADN genómico del virus de la polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) según los métodos de Summers y col., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, 1987, Texas A&M University, College Station, Texas, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia. Los baculovirus recombinantes fueron recuperados mediante examen visual y selección de las placas con oclusión negativa (occ-), y fueron sometidos a dos rondas adicionales de purificación en placa según los métodos de Summers y col., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, 1987, Texas A&M University, College Station, Texas, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia. La expresión de la proteína, a partir de soluciones madre de virus aislados, fue determinada mediante Western blot.

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ES 2 242 955 T3 2. Detección por SDS-PAGE y Western blot de la Expresión de L1 Recombinante en Células Sf-9

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Se cultivaron células Sf-9 infectadas en matraces con 150 cm2 de cultivo tisular, y se prepararon para el ensayo analítico SDS-PAGE y Western blot. Las células infectadas con L1 recombinante o no recombinante fueron recolectadas de los matraces mediante resuspensión con una pipeta Pasteur, e igual número de células infectadas con L1 salvaje o recombinante fueron centrifugadas a 500xg, durante 10 minutos a 4ºC. Se extrajeron los sobrenadantes y los gránulos de células fueron transferidos a hielo, resuspendidos inmediatamente en 1 ml de tampón de lisis [Tris 30 mM, pH 7’6; Cl2 Mg 10 mM; Cl2 Ca 1 mM; fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF); leupeptina (10 µg/ml); 1% de NP40] y dejados estar a temperatura ambiente durante 15 minutos, con agitación con remolino periódica. Después de la centrifugación a 500xg durante 2 minutos a 4ºC, se extrajo la fracción soluble en NP-40 contenida en el sobrenadante, y se diluyó 1:1 con tampón de muestra Laemmli 2x, como se describió por Laemmli, “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriofage T4”, 1970, Nature, vol. 277, págs. 680-685, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia, y se calentó a 95ºC durante 3 minutos. El gránulo insoluble en NP-40 (conteniendo materia nuclear) fue lavado una vez con PBS frío (PMSF 1 mM; 10 µg/ml de leupeptina) y solubilizado mediante ebullición y agitación con remolino en tampón Laemmli 1x. Las muestras fueron sometidas a electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida al 10%, seguido por tinción con azul Coomassie (Fig. 1, panel A) o transferencia (Fig. 1, panel B) a una membrana Immobilon-P (Millipore Corp., New Bedford, MA) como se describió por Rose y col., “Expression of the full-length products of the HPV-6b and HPV-11 L2 open reading frames by recombinant baculovirus, and antigenic comparisons with HPV-11 whole virus particles”, 1990, J. Gen. Virol., vol. 71, págs. 2.7252.729, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia. 3. Preparación de Soluciones Madre de L1 Recombinante y No Recombinante

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Estos ensayos fueron realizados utilizando diluciones de soluciones madre de sobrenadante clarificadas (alta velocidad), preparadas a partir de extractos de células de insecto infectadas con AcNPV o Ac11L1. Los cultivos de la suspensión (100 ml) de células Sf-9, infectadas con AcNPV o Ac11L1 a una multiplicidad aproximada de infección de 10 unidades formadoras de placa por célula, fueron incubados a 27ºC durante 72 horas. Después, se centrifugaron los cultivos a 1.000xg durante 10 minutos a 4ºC, y los gránulos de células fueron resuspendidos en 20 ml de tampón de homogenización (tampón de lisis con ClNa 1M), y homogeneizados con 50 golpes en un homogenizador Dounce en hielo. Los homogenados fueron transferidos a tubos Corex fríos de 30 ml, con tapa de rosca, y centrifugados a 3.000 xg durante 10 minutos a 4ºC. Las fracciones de sobrenadante de baja velocidad fueron transferidas después a un tubo limpio y centrifugadas a 100.000xg durante 30 minutos a 4ºC. Se midieron las concentraciones de proteína total de las fracciones de sobrenadante de alta velocidad, mediante absorción espectrofotométrica a 280 nm, según el procedimiento de Stoscheck, “Quantitation of proteins”, 1990, en Methods in Enzymology, vol. 182, pág. 54, Academic Press Inc., Nueva York, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia, y ajustas hasta equivalencia con tampón de homogenización reciente (concentraciones de proteína aproximadamente iguales a 30 mg/ml). Se añadió glicerol hasta el 10%(v/v), y las soluciones madre repartidas en partes iguales y almacenadas a -20ºC.

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4. Ensayos Western Blot e Inmunodot blot

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Se utilizaron los ensayos Western blot e inmunodot blot para determinar las especificidades de los anticuerpos contra epítopos lineales y conformacionales en antisueros de conejo y sueros humanos. Los ensayos Western blot (Fig. 3, panel A, y Fig. 4) se realizaron utilizando 2 µl (aproximadamente 60 µg de proteína total) de solución madre de L1 recombinante diluida 1:100 con tampón de muestra Laemmli 1x, el cual contiene reactivos para desnaturalización de proteínas como se describió por Laemmli, “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriofage T4”, 1990, Nature, vol. 277, págs. 680-695, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia, y calentados a 95ºC durante 3 minutos. La muestra desnaturalizada fue cargada en un único pocillo de muestras de 100 mm de ancho, sometida a electroforesis en un gel de poliacrilamida-SDS al 10%, y transferidas a una membrana Immobilon-P. Después de bloquear con una solución de BSA al 2% (Kirkegaard and Perry Labs Inc., Gaithersburg, MD) durante 2 horas a 37ºC, se rebanó la membrana en tiras de 24’4 mm de ancho, conteniendo cada una aproximadamente 2’5 µg de proteína total. Después de eso, las tiras fueron investigadas con antisueros (Fig. 3, panel A, y Fig. 4).

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Para análisis inmunodot blot, las soluciones madre de L1 recombinante o no recombinante fueron diluidas 1:1.000 con PBS frío (Cl2 Ca 1 mM), y se transfirieron alícuotas de 100 µl (conteniendo aproximadamente 3’0 µg de proteína total) sobre una membrana Immobilon-P. De la preparación de las muestras para inmunodot blot se suprimieron los reactivos de desnaturalización de proteínas para conservar la conformación nativa de la L1 recombinante. El bloqueo, las soluciones diluyentes de anticuerpos primarios y secundarios, los lavados, y el sustrato utilizado son como se describió por Strike y col., “Expression in Escherichia coli of seven DNA segments comprising the complete L1 and L2 open reading frames of human papillomavirus type 6b and the location of the “common antigen””, 1989, J. Gen. Virol, vol. 70, págs. 543-555, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia. Las incubaciones de los anticuerpos primarios se realizaron durante la noche a 4ºC, las incubaciones de los anticuerpos secundarios se hicieron a temperatura ambiente durante 90 minutos. Todas las soluciones para los inmunodot blots, excepto la solución de sustrato, contenían Cl2 Ca a 1 mM. Las diluciones de anticuerpos primarios fueron 1:2.000 para antisueros de conejo, y 1:1.000 para sueros humanos. Los anticuerpos unidos específicamente fueron detectados con conjugados anti-IgG de conejo (Kirkegaard and Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD) o humana (TAGO Immunodiagnostics, Burlingame, 8

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CA) con fosfatasa alcalina, purificados por afinidad, utilizados a diluciones de 1:2.000 y 1:5.000, respectivamente, utilizando BCIP/NBT (Kirkegaard and Perry Laboratories Inc.) como sustrato. Las reacciones de los inmunodot blots fueron valoradas mediante comparación visual de las intensidades de los puntos de la L1 recombinante o no recombinante. Una reacción fue considerada positiva si la intensidad de color del punto de la L1 recombinante era mayor que la intensidad de color del punto de control no recombinante presente en la misma tira. 5. Antisueros

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El antisuero para L1 desnaturalizada utilizado fue descrito anteriormente como anti-pEX480 por Strike y col., “Expression in Escherichia coli of seven DNA segments comprising the complete L1 and L2 open reading frames of human papillomavirus type 6b and the location of the “common antigen””, 1989, J. Gen. Virol, vol. 70, págs. 543-555, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia. Este antisuero fue obtenido por inmunización de conejos con una proteína de fusión expresada bacterialmente, purificada en gel, que contenía una secuencia de 160 aminoácidos derivada de la región media del marco de lectura abierto, de L1 de HPV-6b, fusionado al carboxi-terminal de la betagalactosidasa, como se describió por Stanley y col., “Construction of a new family of high efficiency bacterial expresión vectors: Identification of cDNA clones coding for human liver proteins”, 1984, EMBO. J., vol. 3, págs. 1.429-1.434; y Strike y col., “Expression in Escherichia coli of seven DNA segments comprising the complete L1 and L2 open reading frames of human papillomavirus type 6b and the location of the “common antigen””, 1989, J. Gen. Virol, vol. 70, págs. 543-555, cuyas revelaciones están incorporadas por este medio mediante referencia. Esta secuencia contiene el antígeno común de L1 de virus del papiloma, como se describió por Strike y col., “Expression in Escherichia coli of seven DNA segments comprising the complete L1 and L2 open reading frames of human papillomavirus type 6b and the location of the “common antigen””, 1989, J. Gen. Virol, vol. 70, págs. 543-555, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia. El antisuero de conejo para partículas virales completas utilizado fue como se describió por Bonnez y col., “Antibody-mediated neutralization of human papillomavirus type 11 (HPV-11) infection in the nude mouse: Detection of HPV-11 mRNAs by the polymerase chain reaction”, 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376-380, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia, y producido por inmunización de conejos con viriones HPV-11 no desnaturalizados purificados, los cuales fueron obtenidos a partir de xenoinjertos de prepucio en ratón atímico según Bonnez y col., “Antibody-mediated neutralization of human papillomavirus type 11 (HPV-11) infection in the nude mouse: Detection of HPV-11 mRNAs by the polymerase chain reaction”, 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376-380; y Kreider y col., “Laboratory production in vivo of infectious human papillomavirus type 11”, 1987, J. Virol., vol. 61, págs. 590-593, cuyas revelaciones están incorporadas por este medio mediante referencia. Los sueros de los pacientes fueron obtenidos de individuos con condiloma acuminado confirmado por biopsia. Las muestras de suero previamente descubiertas positivas mediante ELISA basado en partículas virales completas de HPV-11, como se describió por Bonnez y col., “Use of human papillomavirus type 11 virions in an ELISA to detect specific antibodies in humans with condylomata acuminata”, 1991, J. Gen. Virol., vol. 72, págs. 1.343-1.347, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia, fueron utilizados para maximizar la capacidad para detectar anticuerpos dirigidos contra VLPs. Los sueros de control se obtuvieron de monjas que no profesaban ningún contacto sexual en mucho tiempo. Estos sueros fueron negativos para anticuerpos para HPV-11, como se determinó por el ELISA basado en partículas de HPV-11 descrito por Bonnez y col., “Use of human papillomavirus type 11 virions in an ELISA to detect specific antibodies in humans with condylomata acuminata”, 1991, J. Gen. Virol., vol. 72, págs. 1.343-1.347, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia. 6. Producción y Purificación de Partículas Similares a L1 del Virus HPV-11

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Se purificaron VLPs recombinantes directamente del sobrenadante, de cultivos sin células, de cultivos en suspensión de células Sf-9 infectadas con Ac11L1, mediante una serie de etapas de centrifugación a baja y alta velocidad. Las células Sf-9 infectadas fueron granuladas a partir de un cultivo en suspensión de 200 ml a baja velocidad (1.000xg), y se centrifugó nuevamente el sobrenadante sin células a alta velocidad (100.000xg) durante 90 minutos a 4ºC. El gránulo de alta velocidad fue resuspendido en tampón A (Tris 50 mm, pH 8’0; ClNa 1M; Cl2 Mg 10 mM, Cl2 Ca 10 mM; fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF) 2 mM; 10 µg/ml de leupeptina), se añadieron 5’2 g de ClCs sólido, y se ajustó el volumen final a un total de 13 ml con tampón A reciente (0’4 g/ml de concentración final). Después de centrifugación (100.000xg, 22 horas, 10ºC), la única banda obtenida fue extraída y diluida con 12 ml de tampón A reciente (sin CLCC) y centrifugada nuevamente (100.000xg, 90 minutos, 4ºC) para granular VLPs purificadas. Las VLPS purificadas mediante centrifugación en gradiente en densidad de sacarosa fueron identificadas por microscopía electrónica después de tinción con ácido fosfotúngstico tamponado neutro al 2% (Figs. 2, 6, y 7). Ejemplo II Expresión y Detección Inmunológica de Proteína L1 Recombinante de HPV-11 en Células Sf-9

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El análisis SDS-PAGE de las proteínas totales de células Sf-9, a partir de células de insecto infectadas con el virus recombinante Ac11L1, demostró una nueva proteína de 55 kD, vista por tinción con azul Coomassie, en células infectadas con Ac11L1 (Fig. 1A, tira 3). Con referencia a las Figuras 1 (A y B), la Fig. 1A muestra gel de poliacrilamidaSDS, teñido con azul Coomassie, de lisados de células Sf-9 infectadas con AcNPV salvaje y Ac11L1 recombinante; y la Fig. 1B muestra un Western blot de lisados de células Sf-9 infectadas con AcNPV salvaje y Ac11L1 recombinante, investigados con un antisuero policlonal de conejo específico para el epítopo común de L1 de HPV. Los lisados de células Sf-9 infectadas con L1 no recombinante (tiras 1, 2) y recombinante (tiras 3, 4) fueron fraccionados en fracciones insolubles (tiras 1, 3) y solubles (tiras 2, 4), y sometidas a electroforesis en geles de poliacrilamida al 10%. A la 9

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izquierda se exponen los marcadores moleculares de referencia, y la flecha a la derecha indica la posición aproximada de la L1 recombinante (aproximadamente 55 kD de Mr ) Esta proteína no está presente en lisados de AcNPV salvaje, y coemigra con una proteína que es inmunorreactiva (Fig. 1B, tiras 3 y 4) con un antisuero de conejo preparado contra el antígeno común lineal de L1 de HPV, como se describió por Strike y col., “Expression in Escherichia coli of seven DNA segments comprising the complete L1 and L2 open reading frames of human papillomavirus type 6b and the location of the “common antigen””, 1989, J. Gen. Virol, vol. 70, págs. 543-555, cuya revelación está incorporada aquí mediante referencia. También se detectaron bandas inmunorreactivas a L1 de Mr inferior, y pueden derivar de la degradación del producto L1 completo (Fig. 1B, tiras 3 y 4). Aunque la porción predominante de L1 producida en este sistema apareció en la fracción insoluble en NP-40, aproximadamente el 25-30% estaba presente en la fracción soluble en NP-40 (Fig. 1B, tira 4). La acumulación máxima de L1 ocurrió a las 72 horas postinfección. Ejemplo III Visualización microscópica electrónica de VLPs

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Las micrografías electrónicas de preparaciones teñidas negativamente de VLPs en las bandas de sacarosa (Figs. 2, 6, y 7) mostraron diferentes VLPs. La Fig. 2 muestra partículas similares a la cápside del HPV-11, que estaban presentes en el 50-60% de la superficie de separación del gradiente de densidad de sacarosa. La Fig. 6 muestra partículas similares a la cápside del HPV tipo 6b (HPV-6b) que resultaron de la expresión de la secuencia codificadora para L1 de HPV-6b en el sistema de baculovirus, y que fueron purificadas exactamente de la misma manera. La Fig. 7 demuestra que este método es también apropiado para la producción de VLPs de HPV tipo 16 (HPV-16), en la expresión de la secuencia codificadora para L1 de HPV-16. Las Figs. 12 y 16 demuestran que también se pueden purificar VLPs mediante centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio. Los diámetros de partícula, determinados por medición directa de las VLPs en la Fig. 2, fueron aproximadamente de 52 nm. Esta medición es coherente con el diámetro de viriones asilados de virus del papiloma descritos por Klug y col., “Structure of viruses of the papillomapolyoma type I: Human wart virus”, 1965, J. Mol. Biol., vol. 11, págs. 403-423, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia. Ejemplo IV

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Inmunorreactividad de Extractos de Células de Insecto, conteniendo VLPs de HPV-11, con Antisueros de Conejo

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Se estudiaron las propiedades inmunológicas de la proteína L1 recombinante utilizando antisueros de conejo que reaccionaban con epítopos de la proteína L1 nativa o desnaturalizada. Antisuero pEX480 de conejo, dirigido contra el antígeno común del virus del papiloma, reaccionó bien con L1 recombinante desnaturaliza en ensayos Western blot, pero no reaccionaron con la misma preparación de antígenos mediante inmunodot blot, un tipo de inmunoensayo en el antígeno se coloca en la membrana de transferencia bajo condiciones no desnaturalizantes (Fig. 3, comparar las tiras A). A diferencia del modelo de reactividad exhibida por el anti-pEX480, el anticuerpo policlonal de conejo producido contra partículas virales completas de HPV-11 no reaccionó con L1 recombinante mediante Western blot, pero reaccionó intensamente con L1 recombinante en el ensayo inmunodot blot (Fig. 3, comparar las tiras C). Esta reactividad era específica como se demostró por la carencia de reactividad en el suero postinmune contra la preparación de control no recombinante nativa (Fig. 3, panel B, tira C). En estos inmunoensayos se incluyó el antisuero pEX215 de conejo para permitir la comparación de las cantidades relativas de L1 presentes en los dos tipos de inmunoensayos. El nivel de inmunorreactividad del antisuero pEX215 con L1 recombinante en ambos formatos es groseramente equivalente (Fig. 3 tiras B), indicando que las cantidades de L1 presentes son aproximadamente iguales. Además, la observación de que este antisuero es capaz de reaccionar con L1 en ambos formatos sugiere que el epítopo(s) amino-terminal de L1 inmunorreactiva lineal, reconocido por el antisuero pEX215, no está obscurecido por la adopción de una conformación de L1 de orden superior. Ejemplo V Inmunorreactividad de Extractos de Células de Insecto, conteniendo VLPs, con Sueros Humanos

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Para determinar la prevalencia de anticuerpos en sueros humanos dirigidos contra epítopos lineales frente a conformacionales, se evaluaron sueros obtenidos de individuos con condiloma acuminado, confirmado por biopsia, en ensayos Western blot e inmunodot blot utilizando VLPs como antígeno. Ninguno de los sueros de los pacientes o de control fueron inmunorreactivos con L1 recombinante desnaturalizada por Western blot [Fig. 4, tiras D-O (pacientes) y P-X (controles)]. A la inversa, 11 de 12 sueros de pacientes (Fig. 5, las tiras D-O fueron leídas como positivas, con la excepción de la tira H) y 0 de 9 sueros de control (Fig. 5, tiras P-X) fueron inmunorreactivas con L1 recombinante por inmunodot blot, una diferencia estadísticamente muy significativa (p = 7 x 10−5 ; test exacto de Fisher). Este resultado se correlaciona bien con resultados obtenidos previamente utilizando los mismos sueros en un ELISA basado en partículas de HVP-11, como se describió por Bonnez y col., “Use of human papillomavirus type 11 virions in an ELISA to detect specific antibodies in humans with condylomata acuminata”, 1991, J. Gen. Virol., vol. 72, págs. 1.343-1.347, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia.

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ES 2 242 955 T3 Ejemplo VI Ensayo ELISA 5

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Las VLPS purificadas por ClCs fueron cuantificadas mediante un espectrofotómetro (A280 ), y diluidas hasta una concentración de 8 ng/ul en PBS frío. Se cargaron alícuotas (100 µl) de PBS o solución diluida de VLPs (800 ng de proteína total) en pocillos, y las placas se dejaron estar a 4ºC durante la noche. Las placas fueron bloqueadas, durante 2 horas a temperatura ambiente, con una solución de BSA al 1%, seguido por la adición de antisueros, por duplicado, a una dilución de 1:100. Los antisueros primarios reaccionaron a temperatura ambiente durante 90 minutos. Se lavaron las placas cuatro veces y se añadió anticuerpo secundario (conjugado de cabra anti-IgG humana/fosfatasa alcalina) (TAGO, 1:5.000), y se dejó estar las placas a temperatura ambiente durante 90 minutos. Se añadió sustrato a cada pocillo, y se leyó la absorbancia a 405 nm. Se calculó la absorbancia específica restando la absorbancia del PBS a la absorbancia de las VLPs para cada replicado, y tomando el valor medio de absorbancia.

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Los resultados obtenidos utilizando VLPs (Fig. 8) fueron equivalentes a los resultados anteriormente reportados en un ensayo ELISA de los mismos sueros (de pacientes con PRR), el cual utilizaba partículas virales completas de HVP-11 como antígeno (50%). En la Fig. 9 (r2 = 0’75) se da la buena correlación con los resultados de un ELISA previo basado en partículas virales completas.

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Ejemplo VII Western Blot e Inmunodot Blot

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Se infectaron cultivos en suspensión de Sf-9(100 ml) con baculovirus recombinantes AcNPV (control no recombinante), Ac11L1, o Ac16L1 como se describió anteriormente por Rose y col., 1993, J. Virol., vol. 67, págs. 1.936-1.944, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia, y se incubaron 72 horas a 27ºC. Con referencia a la Figura 11, se prepararon las muestras, se sometieron a electroforesis, y se transfirieron como se describió anteriormente por Rose y col., 1993, J. Virol., vol. 67, págs. 1.936-1.944; y Rose y col., 1990, J. Gen. Virol., vol. 71, págs. 2.725-2.729, cuyas revelaciones están incorporadas por este medio mediante referencia. Las VLPs estaban presentes en ambas preparaciones de muestras, como se verificó mediante microscopía electrónica (datos o mostrados). Las concentraciones de proteína total de las muestras fueron equilibradas antes de su utilización por el espectrofotómetro (A280 ). Con referencia a la Figura 10(a), las muestras (20 µg de proteína total/ tira) fueron sometidas a electroforesis en un gel de poliacrilamida-SDS al 10% y analizadas por Western blot durante la noche, como se describió anteriormente por Bonnez y col., 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376-380, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia. La membrana de nitrocelulosa fue investigada con antisuero R5-409 de conejo, utilizado a una dilución de 1:1.000 como se describió por Christensen y col., 1991, Virus Research, vol. 21, págs. 169-179, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia. Como se muestra en la Fig. 10(a) (panel izquierdo), se detectaron las proteínas L1 recombinante de HPV-11 (tira 2) y L1 recombinante de HPV-16 (tira 3), en cantidades aproximadamente iguales, mediante antisuero R5-409 anti-epítopo común de L1 de virus del papiloma. La secuencia de aminoácidos pronosticada de la proteína L1 del HPV-6 es cinco aminoácidos más larga que la secuencia pronosticada de la proteína L1 del HPV-11, lo cual es coherente con la ligeramente más lenta velocidad de migración exhibida por la proteína recombinante L1 del HPV-16.

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Con referencia a la Figura 10(b), las muestras fueron diluidas (diluciones en serie dos veces, hechas con PBS) y aplicadas a nitrocelulosa bajo condiciones no desnaturalizantes, empezando con una concentración de proteína total de 25 µg (inferior), y terminando con una concentración de proteína total de 25 ng (superior). Se utilizó antisuero R366 de conejo a una dilución de 1:1.000. En el panel derecho, (esto es, el inmunodot blot) el antisuero para partículas virales completas detectó la preparación de VLPs de L1 recombinante de HPV-11 por encima de un rango de dilución de 1.000 veces. Sin embargo, este mismo antisuero hiperinmune de conejo no fue inmunorreactivo con la preparación de VLPs de L1 recombinante de HPV-16, incluso a una concentración superior de antígeno (25 µg) que la utilizada para análisis por Western blot (20 µg).

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El antisuero hiperinmune de conejo, neutralizador de viriones nativos de HPV-11, no reaccionó cruzadamente con proteína L1 de HPV-16 nativa, sugiriendo que el epítopo(s) conformacional de la cápside del HPV-11, que es reconocido por este antisuero, es inmunológicamente diferente de los epítopos conformacionales presentes en la preparación de VLPs de HPV-16.

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Ejemplo VIII Ensayo Western Inmunoblot

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Se detectaron VLPs en, y purificadas directamente de, el medio sobrenadante de un cultivo en suspensión (200 ml) de células Sf-9 infectadas con Ac11L1. Las células fueron granuladas a baja velocidad (1.000xg), y después se centrifugó el sobrenadante sin células a alta velocidad (100.000xg). Se eliminaron las células mediante centrifugación a baja velocidad (1.000xg), y se prepararon VLPs a partir de los sobrenadantes de los cultivos como se describió anteriormente en Rose y col. en “Human papillomavirus type 11 (HPV-11) virus-like particles (VLPs) induce the formation 11

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of neutralizing antibodies”, 1993 (sometido a consideración para publicación), cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia. El panel A es un gel de poliacrilamida-SDS al 10% teñido con azul Coomassie. El panel B es un Western inmunoblot de un gel cargado idénticamente, investigado con un antisuero de conejo específico para el antígeno común de HPV como se describió por Strike y col., 1989, J. Gen. Virol., vol. 70, págs. 543-555, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia, utilizado a una dilución de 1:1.000. Los exámenes de los gránulos de alta velocidad, obtenidos de sobrenadantes de cultivos de células Sf-9 infectadas con L1 recombinante o no recombinante, indicaron la presencia de VLPs en la fracción de sobrenadante infectado con L1 recombinante. El gránulo de alta velocidad de L1 recombinante resuspendido fue purificado mediante centrifugación de equilibrio en gradiente de densidad, como se describió previamente en Bonnez y col., 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376-380, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia. La única banda obtenida mediante este método fue extraída con una aguja estéril de calibre 18, diluida con tampón A reciente (Tris 50 mM, pH 8’0; ClNa 1M; Cl2 Mg 10 mM; Cl2 Ca 10 mM; fluoruro de fenilmetilsulfonilo 2 mM (PMSF); 10 µg/ml de leupeptina) hasta un volumen de 12 ml, y centrifugada nuevamente a 100.000xg durante 90 minutos a 4ºC. Después de la resuspensión del gránulo en 0’5 ml de tampón A reciente (50% de glicerol), el análisis microscópico electrónico de una porción de la muestra, teñida negativamente con ácido fosfotúngstico al 2%, confirmó la presencia de VLPs íntegras de HPV (Fig. 12). Como se describió anteriormente, las VLPs recombinantes fueron inmunorreactivas con anticuerpos dirigidos contra partículas virales completas de HPV-11 (ver Rose y col., 1993, J. Virol., vol. 67, págs. 1.936-1.944, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia). En este estudio, los solicitantes inmunizaron conejos con VLPs purificadas y ensayaron los sueros post-inmunes por su inmunorreactividad con viriones completos. Conejos blancos New Zealand fueron inmunizados intramuscularmente, en dos sitios, con una emulsión 1:1 de VLPs purificadas (∼ 20 µg de proteína) en adyuvante completo de Freund (0’25 ml por sitio). Después de 30 días se dieron estímulos con una emulsión de VLPs preparada en adyuvante incompleto de Freund, y se recolectaron sueros inmunes 14 días después. Los sueros fueron hechos reaccionar con viriones de HPV-11 nativos o VLPs recombinantes en un inmunoensayo dot blot como se describió previamente en Rose y col., 1993, J. Virol., vol. 67, págs. 1.936-1.944, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia. La reactividad cruzada inmunológica de anticuerpos anti-VLPs con viriones completos, como se muestra en la Figura 13, demuestra que las VLPs son inmunogénicas, y parecen replicar fielmente el perfil antigénico de viriones de HPV-11 infecciosos. Con referencia a la Figura 13, se aplicaron preparaciones de muestras purificadas, no desnaturalizadas, a nitrocelulosa como se describió por Rose y col., 1993, J. Virol., vol. 67, págs. 1.936-1.944, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia. Ejemplo IX Actividad de Neutralización

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La preparación de la suspensión viral Hershey de HPV-11 para infección (originalmente proporcionada por John Kreider, Department of Pathology and Microbiology and Immunology, The Milton S. Hershey Medical Center, Hershey, PA) ha sido descrita por Bonnez y col., 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376-380, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia. En cuatro experimentos en paralelo, se incubaron 450 µl de la suspensión viral infectadora (lote 4/90) a 37ºC, durante 1 hora, con 50 µl (dilución final 1:10) de suero preinmune anti-HPV-11 (grupo 1), suero postinmune anti-HPV-11 (grupo 2), suero preinmune anti-VLPs (grupo 3), o suero postinmune anti-VLPs (grupo 4). Los grupos 1 y 2 fueron controles de neutralización que se han descrito anteriormente por Bonnez y col., 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376-380, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia, y los grupos 3 y 4 fueron los grupos de ensayo. La preparación de prepucios humanos cortados por circuncisión rutinaria también ha sido descrita por Bonnez y col., 1991, J. Gen. Virol., vol. 72, págs. 1.343-1.347, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia. Los prepucios se cortaron en cuadrados de 1x1 mm, y se congelaron sobre una placa fría en nieve carbónica y guardaron algunos fragmentos pequeños de cada prepucio utilizado. Los restantes fragmentos fueron divididos por igual en cuatro grupos, y se añadió cada grupo a una de las cuatro mezclas de suspensión viral-suero al final del periodo de incubación. Las mezclas fueron incubadas durante 1 hora a 37ºC. Para cada grupo experimental, se puso un fragmento de prepucio bajo la cápsula renal de cada riñón de 3 ratones nu/nu atímicos hembra de 4-6 semanas de edad, emparejados por camadas, en un fondo genético Balb/c (Taconic Farms, Germantown, NY). Se replicó el experimento en un día diferente, con diferente prepucio. De este modo, se implantaron un total de 12 injertos para cada grupo experimental. Los animales fueron sacrificados 12 semanas después de la inserción, en cuyo momento se extrajeron y procesaron los injertos (ver Bonnez y col., 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376-380, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia). Con referencia a la Figura 14, se prepararon injertos para su análisis como se describió aquí, y se infectaron con lisado viral que fue pretratado con sueros de conejo (1) preinmunes y (2) postinmunes de partículas virales completas de HPV-11, o sueros de conejo (3) preinmunes y (4) postinmunes de partículas similares a virus de L1 de HVP-11. Los círculos rellenos corresponden al primer experimento replicado, los círculos rasos al segundo experimento replicado. Las barras horizontales indican el DGM medio. Para comparación de los tamaños de los injertos, se calculó el diámetro geométrico medio (DGM) tomando la raíz cúbica del producto de la longitud, el ancho, y la altura de los injertos recuperados. En el momento de la eutanasia, se perdió un injerto de cada uno de los grupos de control de neutralización pre y postinmune tratados anti-HPV-11. De este modo, el número de injertos disponibles para análisis en cada uno de estos grupos era 11 (Fig. 14). Los DGM medios [intervalo] (mm) de los injertos en los grupos de control pre y postinmune fueron, respectivamente, 2’9 [1’0, 4’9] y 1’3 [1’0, 2’6]. La diferencia, 1’6 mm, fue estadísticamente significativa (P = 0’004, test U de Mann-Whitney). Los 12 injertos implantados estaban disponibles para análisis en ambos grupos pre y postinmune tratados con anticuerpo anti-VLPs (Fig. 4). Los DGM medios [intervalo] (en 12

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mm) de los injertos fueron, respectivamente, 2’3 [1’3, 4’2] y 1’0 [1’0, 1’8]. La diferencia en tamaño, 1’3 mm, fue estadísticamente significativa (p < 10−4 ). Aunque la diferencia en los tamaños de los injertos entre el primer y el segundo experimento no fue estadísticamente significativa (P = 0’62) en el grupo preinmune, fue significativa (P = 0’007) en el grupo postinmune. Por lo tanto, los solicitantes compararon las diferencias en los tamaños de injerto entre los grupos preinmune y postinmune tratados con anticuerpo anti-VLPs, dentro de cada experimento replicado. Ambos fueron estadísticamente significativos (P = 0’002 y P = 0’04, respectivamente, para el primer y segundo replicado). Ejemplo X

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Fuente de ADNs Virales Se han descrito la fuente de ADN genómico del HPV-11 (Bonnez y col., 1991, J. Gen. Virol., vol. 72, págs. 1.343-1.347, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia) y la construcción del baculovirus recombinante Ac11L1 (Rose y col., 1993, J. Virol., vol. 67, págs. 1.936-1.944, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia). La secuencia genómica del HPV-16 fue recobrada a partir de una lesión CIN III, y se utilizaron métodos de clonación estándar para construir el baculovirus Ac16L1 (Chesters y McCance, datos no publicados). Se amplificó la secuencia de L1 del HPV-18 mediante reacción en cadena de la polimerasa a partir del prototipo de HPV-18 (suministrado por H. zur Hausen), y utilizada para construir el baculovirus Ac18L1 mediante el mismo procedimiento utilizado para la construcción del AC11L1 (Rose y col., 1993, J. Virol., vol. 67, págs. 1.9361.944, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia). Ejemplo XI Purificación de VLPs Recombinantes

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Se purificaron VLPs recombinantes como se describió por Rose y col., 1993, “Human papillomavirus type 11 (HPV-11) virus-like particles (VLPs) induce the formation of neutralizing antibodies and detect genital HPV-specific antibodies in human sera”, en prensa, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia. Se extrajeron las bandas simples conteniendo VLPs de HPV-11, de HPV-16 o de HPV-18 a partir de gradientes de densidad de ClCs mediante jeringa, se diluyeron con tampón A [salino tamponado con fosfato (PBS); Cl2 Mg 1 mM; Cl2 Ca 1 mM; fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF)] hasta 12 ml, y sedimentaron a 100.000xg durante 90 minutos a 4ºC. Los gránulos fueron resuspendidos en 200 µl de tampón A conteniendo 50% de glicerol, se cuantificaron mediante espectrofotometría (280 nm), y se almacenaron a -20ºC. Se analizaron las proteínas L1 recombinantes por SDS-PAGE e inmunoensayo Western blot, como se describió anteriormente (Rose y col., 1993, J. Virol., vol. 67, págs. 1.936-1.944, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia). Las muestras conteniendo 5 µg de VLPs de HPV-11, de HPV-16 o de HPV-18 purificas fueron sometidas a electroforesis, transferidas a una membrana, e investigadas con antisuero de conejo anti-antígeno común de L1 de virus del papiloma (anti-PVL1), como se describió anteriormente (Strike y col., 1989, J. Gen. Virol., vol. 70, págs. 543-555; y Rose y col., 1993, J. Virol., vol. 67, págs. 1.936-1.944, cuyas revelaciones están incorporadas por este medio mediante referencia). Las capacidades predictivas de codificación de los marcos de lectura abiertos (ORFs) de L1 de HPV-11, de HPV-16 y de HPV18 son 501 aminoácidos (Dartmann y col., 1986, Virology, vol. 151, págs. 124-130, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia), 505 aminoácidos (Seedorf y col., 1985, Virology, vol. 145, págs. 181-185, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia), y 507 aminoácidos (Cole y col., J. Mol. Biol., vol. 193, págs. 599-608, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia), respectivamente, y una banda inmunorreactiva a L1 del tamaño esperado (∼ 55 kD de Mr ) apareció en cada una de las tres preparaciones de muestras ensayadas por inmunoensayo Western blot (Fig. 15). También se detectaron proteínas inmunorreactivas a L1 de inferior peso molecular, mediante inmunoensayo Western blot de las preparaciones de VLPs purificadas con ClCs (Fig. 15), y es probable que sean productos de degradación de proteínas L1 completas, ya que las cantidades relativas de estas proteínas variaban en análisis posteriores (datos no mostrados). Sin embargo, las principales bandas inmunorreactivas a L1 de ∼ 55 kD de Mr no variaron en cada una de las muestras, tampoco en sus movilidades o en sus cantidades relativas (datos no mostrados). La microscopía electrónica de muestras purificadas (teñidas negativamente con ácido fosfotúngstico al 2%) confirmó la formación de VLPs en preparaciones de VLPs de HPV-11 (Fig. 16A), HPV-16 (Fig. 16B), y HPV-18 (Fig. 16C). Ejemplo XII Preparación de Sueros Inmunes de VLPs de Conejo y Condiciones del ELISA

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Se prepararon sueros inmunes de VLPs de L1 de HPV-11, HPV-16, y HPV-18, inmunizando intramuscularmente dos conejos blancos New Zealand, en dos sitios, con cada una de las preparaciones de VLPs (esto es, fueron inmunizados seis conejos), utilizando métodos descritos anteriormente (Bonnez y col., 1992, J. Infect. Dis., vol. 165, págs. 376-380; Rose y col., 1993, J. Virol., vol. 67, págs. 1.936-1.944, cuyas revelaciones están incorporadas por este medio mediante referencia). Anticuerpo de conejo anti-antígeno común de PVL1 (Strike y col., 1989, J. Gen. Virol., vol. 70, págs. 543-555, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia), virión completo de HPV11 (Bonnez y col., 1992, J. Infect. Dis., vol. 165, págs. 376-380, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia), y antisueros para VLPs de HPV-11, HPV-16 y HPV-18 fueron ensayados con ELISA frente a las tres preparaciones de VLPs recombinantes (Fig. 17). Para este ELISA, las VLPs purificadas fueron diluidas hasta una concentración de 10 ng/µl en PBS, y se dispensaron alícuotas conteniendo aproximadamente 1 µg de antígeno, 13

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o PBS únicamente, en filas alternas de placas ELISA de 96 pocillos. Las condiciones del ensayo fueron exactamente como se describió anteriormente [Rose y col., 1993, “Human papillomavirus type 11 (HPV-11) virus-like particles (VLPs) induce the formation of neutralizing antibodies and detect genital HPV-specific antibodies in human sera”, en prensa, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia], excepto que los antisueros primarios fueron preabsorbidos con lisado de células Sf-9 infectadas con baculovirus no recombinante (AcNPV), diluido en solución bloqueante (2% v/v) antes de ensayar. Todos los antisueros fueron ensayados por duplicado, en numerosas ocasiones, a diluciones oscilando desde 1:1.000 hasta 1:128.000. Los valores de absorbancia, para todos los antisueros de conejo anti-VLPs mostrados en la Figura 17, fueron obtenidos a la dilución óptima de estos antisueros de 1:16.000. Los valores de absorbancia, para los antisueros de conejo anti-antígeno común de PVL1 y virión completo de HPV11, fueron obtenidos a una dilución menor (1:1.000). Los valores de absorbancia específica fueron determinados restando los valores de control (pocillos con PBS) de los valores experimentales (pocillos conteniendo antígeno) para cada replicado, y se determinaron los valores de absorbancia medios (405 nm). Ejemplo XIII

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ELISA de VLPs

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Se ensayaron VLPs en un inmunoensayo ELISA para valorar su capacidad para detectar anticuerpos específicos en sueros de pacientes, y los resultados se compararon con los resultados previamente obtenidos utilizando los mismos sueros en un inmunoensayo ELISA de viriones completos de HPV-11 (Bonnez y col., 1993, J. Med. Virol., vol. 39, 340-344, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia). El antígeno fue diluido en salino tamponado con fosfato (PBS) para dar una cantidad equivalente a la cantidad utilizada en el ELISA de viriones completos anterior (Bonnez y col., 1993, J. Med. Virol., vol. 39, 340-344, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia), y la solución de antígeno o PBS sin ningún antígeno fue repartida en partes iguales en filas alternas de placas de 96 pocillos. Después de revestir durante 16 horas a 4ºC, se aspiraron estas soluciones y se bloquearon los pocillos con solución diluyente/bloqueante (Kirkegaard and Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD) a temperatura ambiente durante 2 horas. Un total de 59 sueros humanos (43 pacientes, 16 controles), ensayados previamente mediante ELISA para partículas virales completas de HPV-11 (Bonnez y col., 1993, J. Med. Virol., vol. 39, 340-344, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia), fueron diluidos 1:100 en solución diluyente/bloqueante y se añadieron alícuotas de 100 µl a los pocillos tratados con sólo PBS o con solución de antígeno (dos replicados por muestra de suero). Las placas fueron incubadas a temperatura ambiente durante 90 minutos, y lavadas después cuatro veces (solución de lavado, Kirkegaard and Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD). Se añadió conjugado de anti-IgG humana/fosfatasa alcalina (alícuotas de 100 µl, diluido 1:5.000, TAGO, Burlingame, CA) a cada pocillo, y se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 90 minutos. Las placas fueron lavadas cuatro veces y desarrolladas con sustrato de fosfatasa alcalina (fosfato de p-nitrofenilo en tampón de dietanolamina). Se calculó la absorbancia específica a 405 nm para cada muestra de suero, restando el valor obtenido del pocillo tratado con PBS del valor obtenido del pocillo conteniendo antígeno para cada replicado, y se calcularon las diferencias medias de los replicados. En el ELISA para viriones completos discutido aquí en otra parte, se analizó sueros de 42 pacientes (y sueros de 20 controles) por los cambios en los niveles de anticuerpo contra la cápside durante el transcurso del tratamiento (Bonnez y col., 1993, J. Med. Virol., vol. 39, 340-344, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia). Todos los sueros ensayados en el presente estudio ELISA fueron reunidos en el artículo dentro del estudio previo. Uno de los sueros de pacientes analizados en el estudio previo fue excluido posteriormente por razones relacionadas con la consecuencia del tratamiento y no por los resultados del inmunoensayo. Sin embargo, debido a que el valor de absorbancia de este suero estaba disponible, el suero fue incluido en el presente ensayo, lo que aumentó a 43 el número de sueros de pacientes analizados en el presente estudio ELISA. El número de sueros de control analizados fue reducido de 20 a 16 por consideraciones logísticas que tienen que ver con el ensayo. La seroactividad media [intervalo] de los 16 sueros de control, expresada como valor de D.O., fue 0’005 [-0’029, 0’025], comparada con 0’024 [-0’063, 0’512] para los 43 sueros de pacientes, una diferencia estadísticamente significativa (P = 0’01, test U de Mann-Whitney). Utilizando el valor de D.O. máximo en el grupo de control como corte, la sensibilidad del ensayo fue del 49% (P = 2 x 10−4 , test exacto de Fisher). Por lo tanto, el ELISA para VLPs de HPV-11 fue capaz de discriminar entre pacientes con condiloma acuminado y los controles. Además, había una excelente correlación (“Pearson Product-Moment”, r = 0’87; P < 10−6 ) entre las seroactividades de las muestras con el ELISA para VLPs de HPV-11 y el ELISA para viriones de HPV-11 cuando se incluyeron todos los sueros, o cuando únicamente se consideraron los 21 sueros positivos mediante ELISA para VLPs de HPV-11 (r = 0’87; P < 10−6 ). Resultados

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Las observaciones inmunológicas sugieren que la L1 recombinante adopta una conformación nativa. El antisuero de conejo producido contra el antígeno común de L1 desnaturalizada fue inmunorreactivo únicamente con L1 recombinante desnaturalizada (esto es, mediante Western blot), mientras que el antisuero de conejo producido contra partículas virales completas no desnaturalizadas reaccionó únicamente con L1 recombinante no desnaturalizada (esto es, mediante inmunodot blot). Además, los sueros humanos de pacientes con condiloma acuminado, que fueron reactivos con viriones de HPV-11 en un ELISA según Bonnez y col., “Use of human papillomavirus type 11 virions in an ELISA to detect specific antibodies in humans with condylomata acuminata”, 1991, J. Gen. Virol., vol. 72, págs. 1.343-1.347, también reaccionaron con L1 recombinante de HPV-11 no desnaturalizada (Figs. 4, 8 y 9). Por lo tanto, parece que los epítopos conformacionales de las VLPs de la invención son similares a los presentes en viriones de HPV-11 nativos, los cuales son reconocidos por el sistema inmunológico humano durante la infección natural. Varios 14

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estudios de serología del virus del papiloma demuestran que las especificidades de los anticuerpos contra los epítopos conformacionales son buenos indicadores de la infección por virus del papiloma (Bonnez y col., “Use of human papillomavirus type 11 virions in an ELISA to detect specific antibodies in humans with condylomata acuminata”, 1991, J. Gen. Virol., vol. 72, págs. 1.343-1.347; Bonnez y col., “Evolution of the antibody response to human papillomavirus type 11 (HPV-11) in patients with condyloma acuminatum according to treatment response”, 1991, J. Med. Virol., en prensa; Bonnez y col., “Antibody-mediated neutralization of human papillomavirus type 11 (HPV-11) infection in the nude mouse: Detection of HPV-11 mRNAs by the polymerase chain reaction”, 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376380; Christensen y col., “Detection of human serum antibodies that neutralize infectious human papillomavirus type 11 virions”, 1992, J. Gen. Virol., vol. 73, págs. 1.261-1.267; Kienzler y col., “Humoral and cell-mediated immunity to human papillomavirus type 1 (HPV-1) in human warts”, 1983, Br. J. Dermatol., vol. 108, págs. 665-672; y Steele y col., “Humoral assays of human sera to disrupted and nondisrupted epitopes of human papillomavirus type 1”, 1990, Virology, vol. 174, págs. 388-398, cuyas revelaciones están incorporadas por este medio mediante referencia). Estas especificidades pueden jugar también un papel significativo en la patogénesis viral. Por ejemplo, un antisuero de conejo dirigido contra partículas de HPV-11 completas neutraliza la infectividad por HPV-11 (Bonnez y col., “Antibody-mediated neutralization of human papillomavirus type 11 (HPV-11) infection in the nude mouse: Detection of HPV-11 mRNAs by the polymerase chain reaction”, 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376-380; y Christensen y col., “Antibody-mediated neutralization in vivo of infectious papillomavirus”, 1990, J. Virol., vol. 64, págs. 3.151-3.156) Además, Christensen y col., “Detection of human serum antibodies that neutralize infectious human papillomavirus type 11 virions”, 1992, J. Gen. Virol., vol. 73, págs. 1.261-1.267, utilizando sueros humanos, informaron de una correlación entre anticuerpo anti-viriones de HPV-11 completos y la actividad neutralizadora de los sueros. La detección de tales anticuerpos con las VLPs de L1 recombinante de la presente invención puede tener trascendencia diagnóstica y funcional. Cuando se tiene en cuenta la construcción del baculovirus recombinante, algunos de los baculovirus recombinantes construidos tempranamente por los solicitantes tenían la secuencia codificadora para L1 correcta, pero no estuvieron produciendo niveles detectables de proteínas L1. Esto originó que los solicitantes revisaran en las regiones 3’ no traducidas del HPV-11 y varias otras secuencias codificadoras para L1 de HPV. Se determinó que una secuencia señal pentanucleotídica de la degradación de ARNm, AUUUA (Shaw G. y Kamen R., “A conserved AU sequence from the 3’ untranslated region of GM-CSF mRNA mediates selective mRNA degradation”, Cell, 1986, vol. 46, págs. 659-67: Cole MD. y Mango SE., “cis-acting determinants of c-myc mRNA stability”, 1990, Enzyme, vol. 44, págs. 167-80; Shyu AB y col., “Two distinct destabilizing elements in the c-fos message trigger deadenylation as a first step in rapid mRNA decay”, Genes & Development, 1991, vol. 5, págs. 221-31; Savant-Bhonsale S. y Cleveland DW., “Evidence for instability of mRNAs containing AUUUA motifs mediated through translation-dependent assembly of a : 20S degradation complex”, Genes & Development, 1992, vol. 6, págs. 1.927-37, cuyas revelaciones están incorporadas por este medio mediante referencia), estaba dentro de los 30 nucleótidos del codon de parada de la secuencia codificadora para L1 de HPV-11 y, además, los otros tipos de HPV considerados tenían también la secuencia AUUUA en la proximidad del codon de parada de L1. Si esta secuencia fuese eliminada, o introducida una mutación, podría incrementarse el nivel de expresión de la proteína L1. Por lo tanto, se diseñarían también los cebadores PCR para amplificar la secuencia codificadora para L1 a partir de ADN genómico de HPV-11, los cuales no solamente incorporarían sitios de la enzima de restricción para clonación, sino también mutarían la secuencia pentanucleotídica AUUUA, 30 nucleótidos por debajo del codon de parada de L1. El aumento a escala de este clon produjo niveles de proteína L1 sumamente altos. Los informes que utilizan el sistema BEVS han dado niveles de producción de proteína recombinante en el intervalo de 300-500 mg/litro de cultivo celular. En la presente invención, los niveles de producción de proteína L1 recombinante fueron mucho mayores, aproximadamente 600-800 mg/litro, debido posiblemente a la eliminación de la secuencia señal de la degradación de L1 en la región 3’ no traducida. Estos resultados demuestran que, bajo condiciones experimentales similares, sueros postinmunes de conejos inmunizados con VLPs de HPV-11 pueden bloquear la infección por HPV-11 de tejido humano, tan eficazmente como sueros obtenidos de conejos inmunizados con viriones completos de HPV-11. El bloqueo, que no se observó con los sueros preinmunes respectivos, estaba asociado con la ausencia de expresión genética viral temprana. Por lo tanto, el efecto fue coherente con la neutralización viral clásica, esto es, la prevención de penetración del virus o decapsidación (Dimmock, 1993, Neutralization of Animal Viruses, Berlín: Springer-Verlag, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia). Para proporcionar la confirmación de la neutralización del HPV-11 mediante análisis de expresión genética viral, se analizaron todos los injertos para la presencia del transcripto de ARNm de HPV-11 ensamblado con E1^E4 (datos no mostrados), como se describió anteriormente en Bonnez y col., 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376-380, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia. El ARNm E1^E4 fue detectado en 10/12 (83%) y en 0/12 (0%) de los injertos de los grupos pretratados con sueros pre o postinmunes de VLPs, respectivamente (p < 10−4 ). De manera similar, para los grupos de control pretratados con sueros pre o postinmunes anti-viriones completos, el ARNm E1^E4 fue detectado en 8/11 (73%) y en 0/11 (0%) injertos, respectivamente (p = 10−3 ). Estos resultados indican que el tratamiento del inóculo viral con el suero postinmune de VLPs está asociado con una acusada inhibición del crecimiento del injerto y expresión genética viral, efectos que son coherentes con la inmunoneutralización. De este modo, las VLPs recombinantes pueden inducir una respuesta de neutralización similar en magnitud a la respuesta obtenida por la inmunización con virus infeccioso. Las VLPs de L1-L2 del HPV-16 descritas por Zhou y col., 1991, Virology, vol. 185, págs. 251-257, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia, fueron variables en tamaño y menores (35-40 nm de diámetro) 15

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que los viriones de HPV (50-55) o las VLPs de HPV-11 producidas por baculovirus (50-55 nm; Rose y col, en prensa, 1993, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia). Estas características morfológicas son bastante diferentes de las de las VLPs descritas en la presente invención. Además, utilizando el método de la invención, la proteína L1 de HPV sola es suficiente para la formación de partículas cuyas características biofísicas y propiedades antigénicas reflejen fielmente las de los viriones nativos de HPV. Utilizando un enfoque similar, Kirnbauer y col. informaron de la inhibición de la transformación in vitro, mediada por BPV-1, de células C127 de ratón mediante anticuerpos anti-VLPs de BPV-1 (Kirnbauer y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol. 89, págs. 12.180-12.184, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia). Los resultados obtenidos en ese sistema respaldan los resultados informados en la presente invención, en la que los solicitantes han demostrado la neutralización utilizando un HPV genital y su tejido diana normal. Aunque la concordancia de resultados del ensayo BPV-1/células C127 y el sistema de xenoinjertos de piel fetal bovina en ratón atímico ha sido reportada como se describió previamente por Ghim y col., 1993, Int. J. Cancer, vol. 49, págs. 285-289, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia, el sistema fibroblástico BPV-1/C127 de ratón es no productivo y, por lo tanto, la neutralización puede ser únicamente inferida a partir de la ausencia de focos transformados in vitro. Además, el BPV-1 no infecta naturalmente a ratones, y el mecanismo por el que consigue entrar dentro de células C127 puede diferir del mecanismo involucrado en el proceso de la infección natural. Por contraste, el modelo de ratón atímico utilizado en el presente estudio confía en la infección por un HPV genital de su tejido diana natural, como se describió previamente por Kreider y col., 1985, Nature, vol. 317, págs. 639-641, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia, el injerto infectado es mantenido in vivo, y la transformación morfológica e histológica del injerto infectado está acompañada por la producción de viriones infecciosos (ver Kreider y col., 1987, J. Virol., vol. 61, págs. 590-593, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia). La inhibición del crecimiento del injerto mediada por anticuerpos, como se describió previamente por Bonnez y col., 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376-380; Christensen y col., J. Virol., vol. 64, págs. 3.151-3.156; Christensen y col., 1991, Virus Research, vol. 21, págs. 169-179; Christensen y col., 1990, J. Virol., vol. 64, págs. 5.678-5.681; y Christensen y col., 1992, J. Gen. Virol., vol. 73, págs. 1.261-1.267, cuyas revelaciones están incorporadas por este medio mediante referencia, y la evidencia inmunocitoquímica y biológica molecular de la inhibición de la expresión genética viral ha sido bien documentada, como se describió previamente por Bonnez y col., 1991, J. Gen. Virol., vol. 72, págs. 1.3431.347; y Bonnez y col., 1992, J. Inf. Dis., vol. 165, págs. 376-380, cuyas revelaciones están incorporadas por este medio mediante referencia. Por lo tanto, las observaciones hechas en el sistema de ratón atímico pueden reflejar más exactamente los sucesos que ocurren en la infección natural. Los anticuerpos neutralizantes para HPV-11 han sido identificados en humanos con condiloma acuminado, como se describió anteriormente por Christensen y col., 1992, J. Gen. Virol., vol. 73, págs. 1.261-1.267, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia, pero se desconoce su significado biológico. Si la neutralización prueba ser un mecanismo efector inmunológico protector contra infecciones por virus del papiloma in vivo, entonces la inmunización con VLPs recombinantes puede proporcionar inmunidad protectora a individuos en peligro de infección. Los resultados de los solicitantes sugieren que la magnitud de la actividad de neutralización de los anticuerpos para VLPs de HPV-11 es similar a la de anticuerpos específicos para viriones infecciosos de HPV-11. Por lo tanto, parece que las VLPs son buenas candidatas para vacunas. Sin embargo, no se conoce todavía el grado de reactividad cruzada de los determinantes conformacionales de la cápside entre diferentes tipos de HPV, y puede ser bajo como se describió anteriormente por Gissmann y col., 1977, Virology, vol. 76, págs. 569-580; Gross y col., 1983, Oncogenic Viruses, Pergamon Press, Nueva York; Hagensee y col., 1993, J. Virol., vol. 67, págs. 315-322; Howley y col., “Papillomavirinae and their replication”, cap. 58, págs. 1.625-1.650, en B. N. Fields y D. M. Knipe (ed.), Virology, 2ª ed., Vol. 2, Raven Press, Nueva York (1990); Kirnbauer y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol. 89, págs. 12.180-12.184; Kreider y col., 1987, J. Virol., vol. 61, págs. 590-593; Kreider y col., 1985, Nature, vol. 317, págs. 639-641; y Orth y col., 1977, J. Virol., vol. 24, págs. 108-120, cuyas revelaciones están incorporadas por este medio mediante referencia. La caracterización detallada del potencial de las VLPs recombinantes para su uso como inmunógenos, para la prevención de la enfermedad genital por HPV, requerirá estudios complementarios que impliquen VLPs obtenidas de otros tipos de HPV genital. Será de importancia particular el determinar si los anticuerpos para VLPs de HPV genital heterólogas sean capaces de neutralizar la infección por HPV. Con referencia a la Figura 17, los antisueros para partículas virales completas de HPV-11 (B) y para VLPs de HPV-11 (C, D) reaccionaron intensamente con VLPs de HPV-11, pero ninguno de estos antisueros reaccionaron con las preparaciones de VLPs de HPV-16 o de HPV-18. De manera similar, los antisueros de conejo para VLPs de L1 de HPV-16 (E, F) y de HPV-18 (G, H) reaccionaron únicamente con VLPs homotípicas. Las especificidades de estas reacciones fueron verificadas en experimentos de preabsorción, en los que la inmunorreactividad de cada antisuero de conejo para VLPs fue abrogada mediante preabsorción con VLPs homotípicas, pero no heterotípicas (datos no mostrados). Ninguno de los sueros preinmunes de conejo reaccionó con alguna de las preparaciones de VLPs (datos no mostrados). El antisuero anti-antígeno común de PVL1, que reaccionó bien con proteínas L1 recombinantes mediante Western inmunoblot (Fig. 15), reaccionó únicamente un poco con preparaciones de VLPs nativas en el ELISA (Fig. 17A). Esta observación sugiere que los epítopos normalmente reconocidos por este antisuero están enmascarados bajo las condiciones del ensayo ELISA, y que las proteínas L1 examinadas en este ensayo están, en su mayor parte, desnaturalizadas.

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La presente invención ha demostrado que los epítopos de VLPs de L1 de HPV-11, 16, y 18 son antigénicamente distintos. Aunque las proteínas L2 de la cápside no estaban presentes en estas preparaciones de VLPs, es probable que la diferencia antigénica observada entre los tipos de HPV también se aplique a viriones. La L2 representa aproxi16

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madamente el 10% del contenido de proteína total de las partículas de HPV (Doorbar y col., 1987, J. Virol., vol. 61, 2.793-2.799, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia) y, aunque su localización exacta en la partícula no ha sido determinada (Baker y col., 1991, Biophysical J., vol. 60, págs. 1.445-1.456, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia), estudios recientes han sugerido que puede ser necesaria para la encapsidación del ADN (Zhou y col., 1993, J. Gen. Virol., vol. 74, págs. 763-768, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia) y que un dominio presente en la relativamente conservada porción amino-terminal de la secuencia de aminoácidos de L2 de HPV-16 media la unión no especifica al ADN (Zhou y col., 1994, J. Virol., vol. 68, págs. 619-625, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia). Aunque el resto de la secuencia de aminoácidos de L2 es muy heterogénea entre los virus del papiloma (Danos y col., 1990, J. Invest. Dermatology, vol. 83, págs. 7-11, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia), no está nada claro si los anticuerpos específicos para L2 reaccionan con viriones intactos (Komly y col., 1986, J. Virol., vol. 60, págs. 813-816; y Hagansee y col., 1993, J. Virol., vol. 67, págs. 351-322, cuyas revelaciones están incorporadas por este medio mediante referencia). De este modo, no se espera que la proteína L2 altere sustancialmente los resultados del presente estudio.

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Estudios previos han indicado que se pueden distinguir entre sí los diferentes tipos de HPV, utilizando técnicas serológicas. Por ejemplo, se descubrió que los anticuerpos reactivos con viriones de verrugas plantares eran mucho más comunes en sueros de pacientes con verrugas plantares que en sueros de pacientes con verrugas comunes, planas, anogenitales, o laríngeas (Pfister & zur Hausen, 1978, Int. J. Cancer, vol. 21, págs. 161-165; Kienzler y col., 1983, Brit. J. Dermatilogy, vol. 108, págs. 665-672; y Viac y col., 1990, J. Med. Virol., vol. 32, págs. 18-21, cuyas revelaciones están incorporadas por este medio mediante referencia). Anisimova y col., 1990, también demostraron directamente, mediante microscopía inmunoelectrónica, que el HPV-1 y el HPV-2 son antigénicamente distintos. Sin embargo, también parece que los otros tipos de HPV son antigénicamente afines. Por ejemplo, la detección de anticuerpos que reconocen específicamente viriones de HPV-11, en sueros de pacientes con infección por HPV-6 documentada, fue reportada anteriormente (Bonnez y col., 1991, J. Gen. Virol., vol. 72, págs. 1.343-1.347; y Bonnez y col., 1992, Virol., vol. 188, págs. 384-387, cuyas revelaciones están incorporadas por este medio mediante referencia). Debido a la carencia de viriones de HPV disponibles a partir de la mayoría de los tipos de HPV, las VLPs son actualmente la mejor herramienta disponible para explorar la relación antigénica entre los HPVs. Las diferencias antigénicas entre los tipos de HPV son apropiadas para reflejar la diversidad genética dentro de la secuencia codificadora para L1. Chan y col. construyeron un árbol filogenético del virus del papiloma que está basado en la divergencia genética dentro de una región definida de la secuencia de aminoácidos de L1 del virus del papiloma (Chan y col., 1992, J. Virol., vol. 66, págs. 5.714-5.725, cuya revelación está incorporada por este medio mediante referencia). Su trabajo muestra la relativamente cercana relación evolutiva entre el HPV-6 y el HPV-11, que es coherente con la reactividad cruzada potencial entre las cápsides del HPV-6 y del 11. Por otra parte, el HPV-16 y el HPV-18, que han divergido extensamente en sus secuencias de L1, se cuenta con que tengan una pequeña reactividad cruzada antigénica entre sí o con el HPV-11. Esos pronósticos son coherentes con los resultados de la presente invención. Se desconoce la conexión biológica de la variabilidad antigénica de la cápside del HPV, pero la diversidad de la proteína de la cápside podría responder de la especificidad tisular del virus del papiloma. La disponibilidad de VLPs recombinantes a partir de diversos virus del papiloma puede probar la utilidad en la identificación de supuestos receptores celulares específicos del huésped y del tejido. Además, Las VLPs deberían jugar un importante papel en la delineación de las características antigénicas de los HPVs, y en la dirección de los estudios de respuestas inmunológicas hacia estos virus. La presente invención ha sido descrita con algún detalle vía ilustración y ejemplo con fines de claridad de comprensión, sin embargo, será obvio que se pueden practicar algunos cambios y modificaciones dentro del campo de aplicación de las reivindicaciones adjuntadas.

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1. Una partícula, o capsómero, purificada recombinante similar a virus del papiloma humano, que consta de proteína L1 de la cápside del virus del papiloma humano 16 (HPV-16) expresada a partir de una secuencia codificadora para la proteína L1 que produce una proteína o complejo proteico, que posee características inmunológicas y morfológicas similares a las del virus del papiloma nativo, en donde dicha partícula o capsómero es capaz de reconocer anticuerpos en sueros humanos de personas conocidas por estar infectadas con el HPV-16. 2. Una partícula similar a virus según la Reivindicación 1, la cual tiene un diámetro coherente con el diámetro de viriones aislados del virus del papiloma. 3. Una partícula o capsómero similar a virus según la Reivindicaciones 1 ó 2, en donde dicha secuencia codificadora para la proteína L1 se expresa en una célula utilizando un sistema de expresión de baculovirus.

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4. Una partícula o capsómero similar a virus según alguna de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo una proteína L1 de la cápside. 5. Una partícula o capsómero similar a virus de alguna de las reivindicaciones precedentes, para su uso como vacuna. 6. Una vacuna constando de una partícula o capsómero similar a virus de alguna de las reivindicaciones precedentes.

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7. Una vacuna según la Reivindicación 6, la cual es una vacuna multivalente constando de una partícula, similar a virus, de diferentes virus del papiloma humano. 8. Una vacuna según la Reivindicación 7, o comprendiendo además un adyuvante.

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9. El empleo de una partícula o capsómero similar a virus según alguna de las Reivindicaciones 1 a 4, en la fabricación de una vacuna para otorgar inmunidad protectora contra el virus del papiloma humano o, si el paciente está ya infectado, estimular la propia respuesta inmunológica del paciente. 10. Un método para producir una partícula o capsómero similar a virus del papiloma humano según la Reivindicación 1, el método comprendiendo el transfectar una célula con un vector de expresión recombinante conteniendo la secuencia codificadora para la proteína L1 de la cápside del HPV-16, bajo condiciones que faciliten la expresión de dicha proteína de la cápside, de ese modo produciendo dichas partículas similares a virus. 11. Un método según la Reivindicación 10, en donde el vector de expresión recombinante es un sistema de expresión de baculovirus. 12. Un método según la Reivindicación 11, en donde la célula es una célula de insecto. 13. Un método según la Reivindicación 10, en donde dicha transfección se lleva a cabo mediante infección.

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14. Un método según alguna de las Reivindicaciones 10 a 13, el método comprendiendo: clonar la secuencia codificadora para la proteína L1 de la cápside del HPV-16 dentro de un vector de transferencia de baculovirus;

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cotransfectar células de insecto con dicho vector de transferencia de baculovirus y ADN genómico del virus de la polihedrosis nuclear Autographa californica; recuperar baculovirus recombinantes; e

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infectar células de insecto con dicho baculovirus recombinante, bajo condiciones que faciliten la expresión de dicha proteína, produciendo de ese modo partículas similares a virus.

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