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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

C12N 15/29 (2006.01) C12N 15/82 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) A01H 5/00 (2006.01)

ESPAÑA

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11 Número de publicación: 2 263 214

51 Int. Cl.:

TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

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86 Número de solicitud europea: 98938763 .4

86 Fecha de presentación : 07.08.1998

87 Número de publicación de la solicitud: 1003868

87 Fecha de publicación de la solicitud: 31.05.2000

54 Título: Gen Rht del trigo para el control genético del crecimiento y desarrollo vegetal.

30 Prioridad: 13.08.1997 GB 9717192

73 Titular/es:

PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL, Inc. 7100 N.W. 62nd Avenue, P.O. Box 1000 Johnston, Iowa 50131-1000, US

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

01.12.2006

72 Inventor/es: Harberd, Nicholas, Paul;

Richards, Donald, Ernest y Peng, Jinrong

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Ponti Sales, Adelaida

ES 2 263 214 T3

01.12.2006

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid

ES 2 263 214 T3 DESCRIPCIÓN Gen Rht del trigo para el control genético del crecimiento y desarrollo vegetal. 5

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Esta invención se refiere al control genético del crecimiento y/o desarrollo de plantas, y a la clonación y expresión de genes implicados en la misma. Más particularmente, la invención se refiere a la clonación y expresión de homólogos del gen Rht de Triticum Aestivum procedentes de otras especies, y al uso de los genes en las plantas. Una comprensión de los mecanismos genéticos que influyen en el crecimiento y desarrollo de las plantas, incluyendo la floración, proporciona un medio para alterar las características de una planta diana. Entre especies para las cuales podría ser ventajosa la manipulación de las características del crecimiento y/o desarrollo se incluyen todos los cultivos, siendo ejemplos importantes los cereales, el arroz, y el maíz, probablemente los más agronómicamente importantes en las zonas climáticas más cálidas, y el trigo, la cebada, la avena y el centeno en climas más templados. Son cultivos importantes para productos de semillas, la colza para aceite en semillas y la canola, el maíz, el girasol, la soja y el sorgo. Por supuesto, muchos cultivos que se recolectan por sus raíces, se cultivan anualmente a partir de semillas, y la producción de semillas de cualquier tipo depende mucho de la capacidad de la planta para florecer, ser polinizada y producir semillas. En horticultura, el control del ritmo del crecimiento y desarrollo, incluyendo la floración, es importante. Entre las plantas de horticultura cuya floración podría controlarse se incluyen la lechuga, la endivia y las brasicas vegetales, incluyendo la col, el brécol, y la coliflor, y los claveles y geranios. Las plantas enanas por un lado, y las plantas gigantes, más altas por otro, podrían ser ventajosas y/o deseables en varios contextos hortícolas y agrícolas, incluyendo además los árboles, los cultivos de plantaciones y los céspedes. En las décadas recientes se ha observado un enorme incremento en los rendimientos de los granos de trigo debido a la incorporación de homeoalelos de Rht de semienanismo en los programas de producción. Estos incrementos han permitido que la productividad del trigo se mantenga a la par con las demandas de la creciente población mundial. Previamente, se describió la clonación de los alelos gai de Arabidopsis (solicitud de patente internacional PCT/GB97/00390 depositada el 12 de febrero de 1997 y publicada como WO97/29123 el 14 de agosto de 1998, John Innes Centre Innovations Limited, el contenido completo de la cual se incorpora en la presente por referencia), los cuales, al igual que los alelos mutantes de Rht en trigo (una monocotiledónea), confieren un fenotipo enano semidominante en Arabidopsis (una dicotiledónea) y una reducción en la capacidad de respuesta a la hormona giberelina (GA) del crecimiento de plantas. gai codifica una proteína mutante (gai) la cual carece de un segmento de 17 residuos aminoácidos que se halla cerca del extremo N-terminal de la proteína (GAI) del tipo salvaje. La secuencia de este segmento está altamente conservada en una secuencia de ADNc del arroz (EST). En la presente, se muestra que este ADNc se corresponde con una sección corta de los mapas de genoma de cereales solapados que se sabe que contienen el loci Rht, y que se ha usado el ADNc para aislar los genes Rht del trigo. Que genomas tan ampliamente divergidos como los de Arabidopsis y Triticum fueran portadores de una secuencia conservada, la cual, cuando está mutada, afecta la capacidad de respuesta a la GA, indica un papel para esta secuencia en la señalización de la GA que se conserva en todo el reino vegetal. Además, la clonación del Rht permite su transferencia a muchas especies cultivadas diferentes, con el objetivo de potenciar el rendimiento tanto como se ha obtenido previamente con el trigo.

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La introducción de homeoalelos Rht de semienanismo (conocidos originalmente como genes de Norin 10, derivados de una variedad japonesa, la Norin 10) en la élite de líneas reproductoras de trigo para pan fue una de las contribuciones más significativas a la denominada “revolución verde” (Gale et al., Dwarfing genes in wheat. En: Progress in Plant Breeding, editor G. E. Russell, Butterworths, Londres, 1985, pp 1-35). El trigo que contenía estos homeoalelos superó permanentemente a los trigos que carecían de ellos, y ahora comprende aproximadamente el 80% de los cultivos de trigo del mundo. La base biológica para esta potenciación del rendimiento parece ser doble. En primer lugar, el fenotipo de semienanismo conferido por los alelos Rht causa una resistencia incrementada al encamado (aplastamiento de las plantas a causa del viento/lluvia, con la consiguiente pérdida de rendimiento). En segundo lugar, estos alelos causan una reubicación del fotoasimilado, habiendo más dirigido hacia el grano y menos hacia el tallo (Gale et al., 1985). Estas propiedades tienen efectos importantes sobre los rendimientos del trigo, tal como se demostró por el hecho de que los rendimientos de trigo en el Reino Unido incrementaron en más del 20% durante los años en que las líneas que contenían el Rht fueron aceptadas por los agricultores. Los mutantes rht son enanos porque contienen un alelo de rht mutante, genéticamente dominante, que compromete sus respuestas a la giberelina (GA, un regulador endógeno del crecimiento de la planta) (Gale et al., Heredity, 37:283289 (1976)). Por tanto, los coleóptilos de los mutantes rht, a diferencia de los de las plantas de trigo del tipo salvaje, no responden a las aplicaciones de GA. Además, los mutantes rht acumulan GA biológicamente activas hasta niveles más elevados a los hallados en los controles del tipo salvaje (Lenton et al., Gibberellin insensitivity and depletion in wheat-consequences for development. En: Hormone action in Plant Development-a critical appraisal. G. V. Haod, J. R. Lenton, M. B. Jackson y R. K. Atkin (editores), Butterworths, Londres, 1987, pp 145-150). Estas propiedades (dominancia genética, respuestas a la GA reducidas, y niveles endógenos de GA elevados) son comunes a los fenotipos conferidos por mutaciones en otras especies (D8/D9 en el maíz; gaí en Arabidopsis), indicando que estos alelos mutantes definen genes ortólogos en estas especies diferentes, respaldado además por la observación de que D8/D9 y Rht son loci sinténicos en los genomas del maíz y trigo.

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El término “función Rht” indica la capacidad de influir en el fenotipo de una planta de forma similar al gen Rht de Triticum. La “función Rht” podría observarse fenotípicamente en una planta como la inhibición, supresión, represión o reducción del crecimiento de la planta, siendo antagonizada dicha inhibición, supresión, represión o reducción por 2

ES 2 263 214 T3 la GA. La expresión de Rht tiende a conferir un fenotipo enano a la planta, el cual es antagonizado por la GA. La sobreexpresión en una planta, a partir de una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido con función Rht, podría usarse para conferir un fenotipo enano a una planta, el cual puede corregirse mediante tratamiento con GA. 5

Las plantas mutantes del rht son enanas en comparación con el tipo salvaje, siendo el enanismo insensible a la GA. En la presente, “Rht” (con mayúscula) se usa para referirse a la función del tipo salvaje, mientras que “rht” (sin mayúsculas) se usa para referirse a la función del mutante.

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Los procesos de crecimiento y desarrollo de muchas plantas están regulados por miembros específicos de una familia de factores de crecimiento diterpenoides tetracíclicos conocidos como giberelinas (GA) (Hooley, Plant Mol. Biol., 26:1529-1555 (1994)). Por giberelina o GA se quiere indicar una molécula diterpenoide con la estructura de anillos de carbono básica mostrada en la Figura 5, y que posee actividad biológica, es decir, se refiere a las giberelinas biológicamente activas.

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La actividad biológica podría definirse por una o más de entre la estimulación de la elongación celular, senescencia de las hojas, u obtención de la respuesta α-amilasa en células de la aleurona del cereal. Hay muchos ensayos estándares disponibles en la técnica, un resultado positivo en alguno, o más, de los que señaliza una giberelina de ensayo como activa (Hoad et al., Phytochemistry, 20:703-713 (1981); Serebryakov et al., Phytochemistry, 23:1847-1854 (1984); Smith et al., Phytochemistry, 33:17-20 (1993)). Los ensayos disponibles en la técnica incluyen el ensayo del hipocótilo de lechuga, el ensayo del hipocótilo del pepino, y el ensayo de la primera hoja de la avena, todos ellos determinan la actividad biológica en base a la capacidad de una giberelina aplicada para causar la elongación del tejido respectivo. Los ensayos preferidos son aquéllos en los cuales la composición de ensayo se aplica a una planta deficitaria en giberelina. Entre tales ensayos preferidos se incluyen el tratamiento de la Arabidopsis enana deficitaria en GA para determinar el crecimiento, el ensayo del guisante enano, en el que se determina la elongación del entrenudo, el ensayo del arroz enano Tan-ginbozu, en el que se determina la elongación de la vaina foliar, y el ensayo del maíz-d5, en el que también se determina la elongación de la vaina foliar. Los bioensayos de elongación miden los efectos de la elongación celular general en los órganos respectivos, y no están restringidos a determinados tipos celulares. Los ensayos adicionales disponibles incluyen el ensayo de la senescencia de las hojas de acedera (Rumex) y el ensayo de la α-amilasa en células de aleurona de cereal. Las células de aleurona que rodean el endospermo en el grano secretan α-amilasa durante la germinación, la cual digiere el almidón para producir azúcares usados a continuación por la planta en crecimiento. La producción de enzima está controlada por la GA. Las células de la aleurona aisladas a las que se suministra GA biológicamente activa secretan α-amilasa, cuya actividad puede ensayarse a continuación, por ejemplo, mediante la medición de la degradación del almidón. Las características estructurales importantes para una actividad biológica elevada (mostrada por la GA1 , GA3 , GA4 y GA7 ) son un grupo carboxilo en el C-6 del anillo B; una lactona C-19, C-10; y una β-hidroxilación en C-3. La βhidroxilación en C-2 causa inactividad (mostrada por GA8 , GA29 , GA34 y GA51 ). Los mutantes rht no responden al tratamiento con GA, por ejemplo, al tratamiento con GA1 , GA3 o GA4 . El tratamiento con GA se realiza preferiblemente mediante pulverización con una solución acuosa, por ejemplo, mediante pulverización con GA3 o GA4 10−4 M en solución acuosa, quizá semanal o más frecuentemente, y podría hacerse colocando gotitas sobre las plantas en vez de mediante pulverización. La GA podría aplicarse disuelta en un disolvente orgánico tal como etanol o acetona, porque es más soluble en éstos que en agua, pero esto no es preferido porque estos disolventes tienen tendencia a dañar las plantas. Si va a usarse un disolvente orgánico, entre las formulaciones apropiadas se incluyen 24η1 de GA3 o GA4 0, 6, 4,0 ó 300 mM disueltos en etanol al 80%. Las plantas, por ejemplo, Arabidopsis, podrían cultivarse en un medio que contuviera GA, tal como medio de cultivo de tejidos (GM) solidificado con agar y conteniendo GA suplementaria. Las realizaciones de la presente invención, en todos los aspectos, emplean una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostradas en la Figura 6b o en la Figura 9b. Tal secuencia codificante podría ser tal como la mostrada en las Figuras 6a ó 9a. La presente invención también proporciona una construcción o vector de ácido nucleico que comprenden ácido nucleico con cualquiera de las secuencias proporcionadas, preferiblemente una construcción o vector a partir del cual puede expresarse el polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucleicos. La construcción o vector es preferiblemente apropiada para su transformación dentro de una célula vegetal. La invención abarca además una célula huésped transformada con dicha construcción o vector, especialmente una célula vegetal. Por tanto, se proporciona una célula huésped, tal como una célula vegetal, que comprende ácido nucleico según la presente invención. Dentro de la célula, el ácido nucleico podría incorporarse en el cromosoma. Podría haber más de una secuencia de nucleótidos heteróloga por genoma haploide. Esto, por ejemplo, permite la expresión incrementada del producto del gen en comparación con los niveles endógenos, tal y como se discute posteriormente. Una construcción o vector que comprende un ácido nucleico según la invención no tiene porque incluir un promotor u otra secuencia reguladora, particularmente si el vector va a usarse para introducir el ácido nucleico en células para 3

ES 2 263 214 T3 su recombinación en el genoma. No obstante, en un aspecto, la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia codificante de Rht unida a una secuencia reguladora para el control de la expresión, siendo la secuencia reguladora distinta de la que está fusionada de forma natural a la secuencia codificante y, preferiblemente procedente o derivada de otro gen. 5

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Las moléculas de ácido nucleico y los vectores según la presente invención podrían presentarse como un aislado, aislado proporcionado a partir de su entorno natural, en forma sustancialmente pura u homogénea, o libres o sustancialmente libres de ácido nucleico o genes de las especies de interés u origen distintos de la secuencia que codifica un polipéptido capaz de influir en el crecimiento y/o desarrollo, lo que podría incluir la floración, por ejemplo, en un ácido nucleico distinto de la secuencia codificante de Rht en Triticum Aestivum. El término “aislado de ácido nucleico” abarca total o parcialmente el ácido nucleico sintético. El ácido nucleico podría, obviamente, ser de hebra doble o sencilla, ADNc o ADN genómico, ARN, total o parcialmente sintético, según sea apropiado. Por supuesto, cuando el ácido nucleico según la invención incluye ARN, la referencia a la secuencia mostrada debería limitarse como que abarca el equivalente de ARN, con U sustituyendo a T. La presente invención abarca también el producto de la expresión de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos descritas, y los procedimientos para preparar el producto de la expresión mediante la expresión a partir de ácido nucleico codificante para el mismo, en condiciones apropiadas en células huéspedes apropiadas. Aquéllos expertos en la materia están perfectamente capacitados para construir vectores y diseñar protocolos para la expresión y recuperación de productos de la expresión de genes recombinantes. Pueden escogerse o construirse vectores apropiados, conteniendo 5 secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo las secuencias promotoras, los fragmentos terminadores, las secuencias de poliadenilación, las secuencias potenciadoras, los genes marcadores y otras secuencias según convenga. Para detalles adicionales consultar, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2ª edición, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Los procedimientos de transformación dependen del huésped usado, pero son bien conocidos. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación del ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácido nucleico, en la mutagénesis, en la secuenciación, en la introducción de ADN dentro de células y en la expresión de genes, y en el análisis de proteínas, se describen con detalle en Protocols in Molecular Biology, segunda edición, editores Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992. Los procedimientos y vectores específicos usados previamente con amplio éxito en plantas son descritos por Bevan, Nucl. Acids Res., 12:6711-8721 (1984)), y Guerineau y Mullineaux, Plant transformation and expression vectors, en: Plant Molecular Biology Labfax (editor R. R. D. Croy) Oxford, BIOS Scientific Publishers, (1993) pp 121-148. Los descubrimientos de Sambrook et al. y Ausubel et al., y todos los otros documentos mencionados en la presente se incorporan en la presente por referencia.

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La expresión como una fusión con una cola de polihistidina permite la purificación del Rht a conseguir usando una resina Ni-NTA disponible de QIAGEN Inc. (EE.UU.) y DIAGEN GmbH (Alemania). Consultar, Janknecht et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8972-8976 (1991) y EP-A-0253303 y EP-A-0282042. La resina Ni-NTA tiene una afinidad elevada por las proteínas con histidinas consecutivas cercanas a los extremos N- o C-terminal de la proteína, y por tanto, podría usarse para purificar proteínas Rht marcadas con histidinas y procedentes de plantas, partes de plantas, o extractos, o a partir de organismos recombinantes, tales como las levaduras o bacterias, por ejemplo, E. coli, que expresan la proteína. La proteína Rht purificada, por ejemplo, producida de forma recombinante mediante la expresión a partir del ácido nucleico de la misma, podría usarse para generar anticuerpos empleando técnicas que son estándares en la técnica. Los anticuerpos y los polipéptidos que comprenden los fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos, podrían usarse para identificar homólogos procedentes de otras especies tal y como se describe posteriomente. Entre los procedimientos para producir anticuerpos se incluyen la inmunización de un mamífero (por ejemplo, un humano, ratón, rata, conejo, caballo, cabra, oveja o mono) con la proteína o con un fragmento de la misma. Los anticuerpos podrían obtenerse a partir de animales inmunizados usando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas en la técnica, y podrían cribarse, preferiblemente usando la unión del anticuerpo al antígeno de interés. Por ejemplo, podrían usarse las técnicas de transferencia Western o de inmunoprecipitación (Armitage et al., Nature, 357: 80-82 (1992)). Los anticuerpos podrían ser policlonales o monoclonales.

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Como una alternativa o complemento a la inmunización de un mamífero, los anticuerpos con la especificidad de unión apropiada podrían obtenerse a partir de una biblioteca producida de forma recombinante de dominios variables de inmunoglobulinas expresada, por ejemplo, usando el bacteriófago lambda o el bacteriófago filamentoso, los cuales exhiben dominios de unión de inmunoglobulina funcionales sobre sus superficies; por ejemplo, consultar W092/01047. Los anticuerpos generados contra un polipéptido de la Rht pueden usarse en la identificación y/o aislamiento de polipéptidos homólogos, y a continuación de los genes codificantes. Por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para identificar o aislar un polipéptido según la invención, que comprende el cribado de los polipéptidos candidatos con un polipéptido que comprende el dominio unidor de antígeno de un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo completo o un fragmento del mismo) que tiene especificidad de unión por un polipéptido acorde con la invención. 4

ES 2 263 214 T3 Los polipéptidos candidatos para el cribado podrían, por ejemplo, ser los productos de una biblioteca de expresión creada usando un ácido nucleico derivado de una planta de interés, o podrían ser el producto de un proceso de purificación a partir de una fuente natural. 5

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Un polipéptido que se halla que se une al anticuerpo podría aislarse y, a continuación, someterse a la secuenciación de aminoácidos. Podría usarse cualquier técnica apropiada para secuenciar el polipéptido total o parcialmente (por ejemplo, podría secuenciarse un fragmento del polipéptido). La información de la secuencia de aminoácidos podría usarse en la obtención del ácido nucleico que codifica el polipéptido, por ejemplo, diseñando uno o más oligonucleótidos (por ejemplo, un conjunto degenerado de oligonucleótidos) para su uso como sonda o cebadores en la hibridación para un ácido nucleico candidato, tal y como se discute adicionalmente más abajo. Una célula que contiene el ácido nucleico de la presente invención representa un aspecto adicional de la invención, particularmente una célula vegetal, o una célula bacteriana.

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La célula podría comprender el ácido nucleico que codifica la proteína gracias a su introducción del ácido nucleico dentro de la célula o de un antepasado de la misma, por ejemplo, mediante su transformación usando cualquier técnica apropiada disponible para los especialistas en el campo. También de acuerdo con la invención, se proporciona una célula vegetal que tiene incorporado en su genoma el ácido nucleico tal como se ha descrito. Cuando se emplea una secuencia completa que ocurre de forma natural, la célula vegetal podría proceder de un planta distinta de la que es huésped natural de la secuencia.

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La presente invención también proporciona una planta que comprende tal célula vegetal. También de acuerdo con la invención, se proporciona una célula vegetal que tiene incorporado en su genoma una secuencia de nucleótidos tal como se proporciona en la presente invención, bajo el control operativo de un secuencia reguladora para el control de la expresión. Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un procedimiento para preparar tal célula vegetal, el cual implica la introducción de un vector que comprende la secuencia de nucleótidos dentro de una célula vegetal, y causar o permitir la recombinación entre el vector y el genoma de la célula vegetal para introducir la secuencia de nucleótidos en el genoma. Una planta acorde con la presente invención podría ser una que no se ajusta a la variedad en una o más propiedades. Podrían excluirse variedades de plantas, en particular variedades de plantas registrables de acuerdo con los derechos de obtención. Se destaca que una planta no tiene porqué considerarse “variedad de planta” simplemente porque contenga de forma estable un transgén en su genoma, introducido dentro de una célula de la planta o de un antepasado de la misma. Además de una planta, la presente invención proporciona cualquier parte suelta de tal planta, semilla, progenie propia o híbrida, y descendientes, y cualquier parte de estas, tales como esquejes, semillas. La invención proporciona cualquier propágulo de planta, es decir, cualquier parte que podría usarse en la reproducción o propagación, sexual o asexual, incluyendo los esquejes, las semillas, etcétera. También está abarcada por la invención una planta que es un vástago propagado sexual o asexualmente, un clon o descendiente de tal planta, o cualquier parte o propágulo de dicha planta, vástago, clon o descendiente. La invención proporciona además un procedimiento para influenciar en las características de una planta, el cual comprende la expresión de un polinucleótido heterólogo de la invención dentro de las células de la planta. El término “heterólogo” indica que el gen/secuencia de nucleótidos en cuestión ha sido introducido en dichas células de la planta, o un ancestro de la misma, usando ingeniería genética, es decir, mediante intervención humana, la cual podría comprender la transformación. El gen podría estar en un vector extragenómico o incorporado, preferiblemente de forma estable, en el genoma. El gen heterólogo podría remplazar un gen equivalente endógeno, es decir, uno que normalmente realiza la misma función o una similar en el control del crecimiento y/o del desarrollo, o la secuencia insertada podría ser adicional a un gen endógeno. Una ventaja de la introducción de un gen heterólogo es la capacidad de colocar la expresión del gen bajo el control de un promotor escogido, con objeto de ser capaz de influir la expresión del gen y, por tanto, el crecimiento y/o el desarrollo de la planta de acuerdo con ciertas preferencias. Además, los mutantes y derivados del gen del tipo salvaje podrían usarse en lugar del gen endógeno. El gen insertado podría ser ajeno o exógeno a la célula huésped, por ejemplo, de otra especie de planta. La característica principal que podría alterarse usando la presente invención es el crecimiento. De acuerdo con el modelo en el que el gen Rht actúa como un represor del crecimiento, la menor expresión del gen podría usarse para promover el crecimiento, al menos en plantas que sólo tienen un gen endógeno que confiere la función Rht (no, por ejemplo, en Arabidopsis, que tiene homólogos endógenos que la compensarían). Esto podría implicar el uso de la regulación antisentido o con sentido. Podrían conseguirse plantas más altas eliminando el Rht o el gen homólogo relevante en la planta de interés. Podrían obtenerse plantas que fueran resistentes a compuestos que inhiben la biosíntesis de la GA, tales como el paclobutrazol, por ejemplo, para permitir el uso de un inhibidor de la biosíntesis de la GA para mantener las malas hierbas enanas, pero dejar que las plantas cultivadas crecieran altas. 5

ES 2 263 214 T3 La sobreexpresión de un gen Rht podría conducir a una planta enana, lo que puede corregirse con GA, tal como predice el modelo de represión de la Rht. 5

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Una segunda característica que podría alterarse es el desarrollo de la planta, por ejemplo, la floración. En algunas plantas, y en ciertas condiciones medioambientales, se requiere una señal de GA para la inducción de la floración. Por ejemplo, las plantas de Arabidopsis mutantes y deficientes en GA hechas crecer en condiciones de días cortos, no florecen a menos que se traten con GA: estas plantas sí que florecen normalmente cuando se hacen crecer en condiciones de días más largos. Las plantas mutantes gai de Arabidopsis muestran un floración retrasada en condiciones de días cortos: los mutantes severos no florecen en absoluto. Así pues, por ejemplo, mediante la expresión o sobreexpresión del gen rht, podrían producirse plantas que permanecen vegetativas hasta que se les administra el tratamiento con GA para inducir la floración. Esto podría ser útil en contexto hortícolas, o para las espinacas, lechugas y otros cultivos en los que es deseable la supresión de la floración prematura. El ácido nucleico acorde con la invención podría colocarse bajo el control de un promotor de gen inducible externamente, para colocar la Rht o la secuencia codificante rht bajo el control del usuario. El término “inducible” tal como se aplica a un promotor es bien entendido entre aquéllos especialistas en el campo. En esencia, la expresión bajo el control de un promotor inducible está “activada” o incrementada en respuesta a un estímulo aplicado. La naturaleza del estímulo varía entre promotores. Algunos promotores inducibles causan niveles de expresión bajos o indetectables (o ninguna expresión) en ausencia del estímulo apropiado. Otros promotores inducibles causan la expresión constitutiva detectable en ausencia de estímulo. Cualquiera que sea el nivel de expresión en ausencia del estímulo, la expresión a partir de cualquier promotor inducible está incrementada en presencia del estímulo correcto. La situación preferible es cuando el nivel de expresión incrementa a partir de la aplicación del estímulo relevante en una cantidad efectiva para alterar una característica fenotípica. Por tanto, podría usarse un promotor inducible (o “activable”), el cual causa un nivel de expresión en ausencia del estímulo que es demasiado bajo para proporcionar un fenotipo deseado (y podría ser de hecho cero). A partir de la aplicación del estímulo, la expresión está incrementada (o activada) hasta un nivel que proporciona el fenotipo deseado. Los promotores apropiados incluyen el promotor del gen 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV 35S), que se expresa a un nivel elevado en virtualmente todos los tejidos vegetales (Benfey et al., 1990a y 1990b); el promotor del gen de la isoforma II de la glutatión-S-transferasa del maíz (GST-II-27), el cual se activa en respuesta a la aplicación de un herbicida Safener (W093/01294, ICI Ltd); el promotor meri 5 de la coliflor, que se expresa en el meristemo apical vegetativo así como en varias posiciones bien localizadas en el cuerpo de la planta, por ejemplo, en el floema interno, el primordio floral, los puntos de ramificación de las raíces y brotes (Medford, 1992; Medford et al., 1991); y el promotor LEAFY de Arabidopsis thaliana, que se expresa muy pronto en el desarrollo de la flor (Weigel et al., 1992). Se ha mostrado que el promotor del gen GST-II-27 es inducido por ciertos compuestos químicos, los cuales pueden aplicarse a plantas en crecimiento. El promotor es funcional en ambas, las monocotiledóneas y las dicotiledóneas. Por tanto, puede usarse para controlar la expresión del gen en una variedad de plantas modificadas genéticamente, incluyendo los cultivos tales como la canola, el girasol, el tabaco, la remolacha azucarera, el algodón; los cereales tales como el trigo, la cebada, el arroz, el maíz, el sorgo; frutos tales como los tomates, los mangos, los albaricoques, las manzanas, las peras, las fresas, las bananas, y los melones; y vegetales tales como la zanahoria, la lechuga, la calabaza y la cebolla. El promotor de GST-II-27 es también apropiado para su uso en una variedad de tejidos, incluyendo las raíces, las hojas, los tallos y los tejidos reproductores. En consecuencia, la presente invención proporciona en un aspecto adicional una construcción de gen que comprende un promotor inducible unido operativamente a una secuencia nucleotídica proporcionada por la presente invención. Esto permite el control de la expresión del gen. La invención también proporciona plantas transformadas con dicha construcción del gen, y procedimientos que comprenden la introducción de tal construcción en una célula vegetal y/o la inducción de la expresión de una construcción dentro de una célula vegetal, mediante la aplicación de un estímulo apropiado, un inductor exógeno efectivo. El promotor podría ser el promotor del gen GST-II-27 o cualquier otro promotor vegetal inducible.

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Cuando se introduce una construcción de gen escogida, deben tenerse en cuenta ciertas consideraciones, bien conocidas por los especialistas en la técnica. El ácido nucleico a insertarse debe ensamblarse dentro de una construcción que contiene elementos reguladores efectivos, los cuales dirigirán la transcripción. Debe haber disponible un procedimiento para transportar la construcción dentro de la célula. Una vez la construcción se encuentra dentro de la membrana celular, tendrá lugar, o no, la integración en el material cromosómico endógeno. Finalmente, en lo que se refiere a las plantas, el tipo celular debe ser tal que las células puedan regenerarse en plantas completas. Podrían usarse marcadores genéticos seleccionables, consistentes en genes quiméricos que confieren fenotipos tales como la resistencia a antibióticos como la kanamicina, la higromicina, fosfinotricina, clorsulfurona, metotrexato, gentamicina, spectinomicina, imidazolinonas y glifosato.

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ES 2 263 214 T3 Un aspecto de la presente invención es el uso de ácido nucleico acorde con la invención en la producción de una planta transgénica. 5

Un aspecto adicional proporciona un procedimiento que incluye introducir el ácido nucleico en una planta vegetal y causar o permitir la incorporación del ácido nucleico en el genoma de la célula. Cualquier procedimiento apropiado de transformación de la planta podría usarse para generar células vegetales que comprenden ácido nucleico según la presente invención. A continuación de la transformación, las plantas podrían regenerarse a partir de células vegetales y tejidos transformados.

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Las células y/o plantas transformadas exitosamente, es decir, con la construcción incorporada en su genoma, podría seleccionarse a continuación de la introducción del ácido nucleico dentro de las células vegetales, seguida opcionalmente por su regeneración en una planta, por ejemplo, usando uno o más genes marcadores tales como los de la resistencia a antibiótico (ver más arriba). 15

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Las plantas transformadas con el segmento de ADN que contiene la secuencia podrían producirse mediante técnicas estándares, las cuales ya son conocidas para la manipulación genética de plantas. El ADN puede transformarse dentro de células vegetales usando cualquier tecnología apropiada, tales como el vector de plásmido Ti desarmado portado por Agrobacterium, explotando su capacidad natural para la transferencia del gen (EP-A-270355, EP-A0116718, NAR, 12(22):8711-87215 (1984)), el bombardeo con partículas o microproyectiles (patente estadounidense n◦ 5.100.792, EP-A-44882, EP-A-434616), la microinyección (WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966, Green et al., Plant Tissue and Cell Culture, 1987, Academic Press), la electroporación (EP 290395, WO 8706614 Gelvin Debeyser--ver adjunta), otras formas de captación directa del ADN (DE 4005152, WO 9012096, patente estadounidense n◦ 4.684.611), la captación de ADN mediada por liposomas (por ejemplo, Freeman et al., Plant Cell Physiol., 29:1353 (1984)), o el procedimiento de agitación con vórtice (por ejemplo, Kindle, PNAS U.S.A., 87:1228 (1990d). Los procedimientos físicos para la transformación de células vegetales están revisados en Oard, Biotech. Adv., 9:1-11 (1991) La transformación de Agrobacterium es ampliamente usada por los especialistas en la técnica para transformar especies dicotiledóneas. Recientemente, ha habido un progreso sustancial hacia la producción rutinaria de plantas transgénicas fértiles y estables en casi todos los cultivos de plantas monocotiledóneas económicamente relevantes (Toriyama et al., Bio/Technology, 6:1072-1074 (1988); Zhang et al., Plant Cell Rep., 7:379-384 (1988)); Zhang et al., Theor. Appl. Genet., 76:835-840 (1988); Shimamoto et al., Nature, 338:274-276 (1989); Datta et al., Bio/Technology, 8:736-740 (1990); Christou et al., Bio/Technology, 9:957-962 (1991); Peng et al., International Rice Research Institute, Manila, Philippines, 563-574 (1991); Cao et al., Plant Cell Rep., 11, 585-591 (1992); Li et al., Plant Cell Rep., 12:250255 (1993); Rathore et al., Plant Molecular Biology, 21:871-884 (1993); Fromm et al., Bio/Technology, 8:833-839 (1990); Gordon-Kamm et al., Plant Cell, 2:603-618 (1990); 15 D’Halluin et al., Plant Cell, 4:1495-1505 (1992); Walters et al., Plant Molecular Biology, 18:189-200 (1992); Koziel et al., Biotechnology, 11:194-200 (1993); Vasil, I. K. Plant Molecular Biology, 25:925-937 (1994); Weeks et al., Plant Physiology, 102:1077-1084 (1993); Somers et al., Bio/Technology, 10:1589-1594 (1992); W092/14828). En particular, la transformación mediada por Agrobacterium está emergiendo ahora también como un procedimiento de transformación altamente eficiente en monocotiledóneas (Hiei et al., The Plant Journal, 6:271-282 (1994)). La generación de plantas transgénica fertiles se ha conseguido en los cereales arroz, maíz, trigo, avena y cebada (revisada en Shimamoto, K., Current Opinion in Biotechnology, 5:158-162 (1994); Vasil et al., Bio/Technology, 10:667-674 (1992); Vain et al., Biotechnology Advances, 13(4):653-671 (1995); Vasil, Nature Biotechnology, 14:702 (1996)). El bombardeo con microproyectiles, la electroporación, y la captación directa de ADN se prefieren cuando Agrobacterium es ineficiente o inefectivo. Alternativamente, podría emplearse una combinación de diferentes técnicas para potenciar la eficiencia del proceso de transformación, por ejemplo, bombardeo con micropartículas recubiertas con Agrobacterium (EP-A-486234) o bombardeo con microproyectiles para inducir lesiones seguido por co-cultivo con Agrobacterium (EP-A-486233). La transformación de Brassica napus se describe en Moloney et al., Plant Cell Reports, 8:238-242 (1989). A continuación de la transformación, una planta podrían regenerarse, por ejemplo, a partir de células sueltas, tejido de callo, o discos de hojas, tal como es estándar en la técnica. Casi cualquier planta puede regenerarse en su totalidad a partir de células, tejidos y órganos de la planta. Las técnicas disponibles se revisan en Vasil et al., Cell Culture and Somatic Cel Genetics of Plants, volúmenes I, II y III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984, y en Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989. La elección particular de una tecnología de transformación estará determinada por su eficiencia para transformar ciertas especie vegetal, así como por la experiencia y preferencia de la persona que está practicando la invención con un determinada metodología escogida. Será evidente para la persona capacitada que la elección particular de un sistema de transformación para introducir el ácido nucleico en células vegetales no es esencial para, o una limitación de la invención, ni lo es la elección de la técnica para la regeneración de la planta. 7

ES 2 263 214 T3 En la presente invención, podría conseguirse la sobreexpresión mediante la introducción de la secuencia de nucleótidos en una orientación con sentido. Por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para influir en una característica de una planta, comprendiendo el procedimiento el causar o permitir la expresión del ácido nucleico acorde con la invención a partir de ese ácido nucleico dentro de las células de la planta. 5

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La menor expresión del polipéptido que es producto del gen podría conseguirse usando la tecnología anti-sentido o la “regulación del sentido”. El uso de genes anti-sentido o de secuencias del gen parciales para regular a la baja la expresión del gen está actualmente bien establecida. El ADN se coloca bajo el control de un promotor, de tal forma que la transcripción de la hebra “anti-sentido” del ADN proporciona ARN que es complementario del ARNm normal transcrito a partir de la hebra “con sentido” del gen diana. Para el ADN de doble hebra, esto se consigue colocando una secuencia codificante o un fragmento de la misma en una “orientación invertida” bajo el control de un promotor. Se cree que la secuencia de ARN anti-sentido complementaria se une entonces con el ARNm para formar un dúplex, inhibiendo la traducción del ARNm endógeno, del gen diana en la proteína. Es todavía incierto si éste es el modo de acción real. Sin embargo, es un hecho establecido que la técnica funciona. Consultar, por ejemplo, Rothstein et al., 1987; Smith et al., Nature, 334:724-726 (1988); Zhang et al., The Plant Cell, 4:1575-1588 (1992), English et al., The Plant Cell, 8:179-188 (1996). La tecnología antisentido está revisada también en Bourque, Plant Science, 105:125149 (1995), y Flavell, PNAS USA, 91:3490-3496 (1994).

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No tiene porqué usarse la secuencia completa correspondiente a la secuencia codificante en orientación inversa. Por ejemplo, podrían usarse fragmentos con la longitud suficiente. Para la persona capacitada en la técnica es un asunto rutinario cribar fragmentos de varios tamaños y procedentes de varias partes de la secuencia codificante para optimizar el nivel de inhibición antisentido. Podría ser ventajoso incluir el codón de inicio ATG de metionina, y tal vez uno o más nucleótidos cadena arriba respecto del codón de inicio. Un posibilidad adicional es apuntar a una secuencia reguladora de un gen, por ejemplo, una secuencia que es característica de uno o más genes en uno o más patógenos contra los cuales se desea tener resistencia. Un fragmento apropiado podría tener al menos aproximadamente 14-23 nucleótidos, por ejemplo, aproximadamente 15, 16 ó 17, ó más, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 50, o más. Otros fragmentos podrían tener al menos aproximadamente 300 nucleótidos, al menos aproximadamente 400 nucleótidos, al menos aproximadamente 500 nucleótidos, al menos aproximadamente 600 nucleótidos, al menos aproximadamente 700 nucleótidos o más. Tales fragmentos en la orientación con sentido podrían usarse en la co-supresión (ver más abajo).

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No es esencial la total complementariedad de la secuencia, aunque podría preferirse. Uno o más nucleótidos podrían diferir en la construcción antisentido respecto el gen diana. Podría ser preferible para ellos tener homología suficiente por las respectivas moléculas de ARN con sentido y anti-sentido para hibridarse, particularmente en las condiciones existentes en una célula vegetal.

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Por tanto, la presente invención proporciona también un procedimiento para influir en una característica de una planta, comprendiendo el procedimiento el causar o permitir la transcripción a partir del ácido nucleico acorde con la invención dentro de células de la planta. 40

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Cuando se insertan copias adicionales del gen diana con sentido, es decir, con la misma orientación que el gen diana, se producen una serie de fenotipos que incluye individuos en los que ocurre la sobreexpresión, y algunos en los que ocurre la menor expresión de la proteína a partir del gen diana. Cuando el gen insertado es sólo parte del gen endógeno, el número de individuos con infraexpresión en la población transgénica aumenta. El mecanismo mediante el cual ocurre la regulación por sentido, particularmente la regulación a la baja, no se comprende del todo. Sin embargo, esta técnica también está bien descrita en la literatura científica y de patentes, y se usa rutinariamente para el control de los genes. Consultar, por ejemplo, van der Krol et al., The Plant Cell, 2:291-299 (1990); Napoli et al., The Plant Cell, 2:279-289 (1990); Zhang et al., The Plant Cell, 4:1575-1588 (1992), y US-A-5.231.020. Por tanto, la presente invención proporciona también un procedimiento para influir en una característica de una planta, comprendiendo el procedimiento el causar o permitir la expresión a partir del ácido nucleico acorde con la invención dentro de células de la planta. Esto podría usarse para influir en el crecimiento. Los aspectos y realizaciones de la presente invención se ilustrarán ahora, a modo de ejemplo, con referencia a los figuras que la acompañan. Las figuras muestran secuencias del maíz y del arroz de la invención y también, por referencia, secuencias procedentes de otras especies.

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Figura 1: Alineamiento del extremo N-terminal predicho de la secuencia de aminoácidos de GAI (Gai) con EST D39460 (0830) del arroz, con una región de homología remarcada en negro. Figura 2: Secuencias de ADN de C15-1, 14a1 y 5a1.

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La Figura 2a muestra una secuencia de ADN consenso G4 de ADNc de C15-1 (obtenida a través de la secuenciación de paso único). 8

ES 2 263 214 T3 La Figura 2b muestra datos procedentes de las análisis de secuenciación del ADN original procedente de 14a1 (un único paso). 5

La Figura 2c muestra datos procedentes de las análisis de secuenciación del ADN original procedente de 5a1 (un único paso). Figura 3: Secuencias del Rht.

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La Figura 3a muestra una secuencia de ADN compuesta del gen Rht de trigo derivada de los datos en la Figura 2, incluyendo la secuencia codificante. La Figura 3b muestra un alineamiento de la secuencia entera de proteína Rht predicha, codificada por la secuencia codificante de la Figura 2 (rht), con la secuencia entera predicha de la proteína GAI de Arabidopsis (Gai). Las regiones con identidad de secuencia se destacan en negro. Figura 4: Secuencia D39460.

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La Figura 4a muestra la secuencia de ADN (un único paso) del ADNc D39460 del arroz. Este ADNc es un clon parcial, incompleto, que carece del extremo 3’ del ARNm del que se deriva. La Figura 4b muestra un alineamiento de la secuencia entera de proteína Rht predicha (trigo, codificada por la secuencia codificante de la Figura 2) con la de GAI (Gai) y la secuencia de la proteína del arroz predicha a partir de la secuencia de ADN de la Figura 4a (Rice). Las regiones con identidad de aminoácidos se destacan en negro; algunas sustituciones conservadores están sombreadas. Figura 5: Estructura básica de anillos de carbono de las giberelinas.

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Figura 6: Secuencia EST del arroz. 35

La Figura 6a muestra la secuencia de nucleótidos de la EST D39460 del arroz, según la han determinado los presentes inventores. La Figura 6b muestra la secuencia de aminoácidos predicha codificada por la secuencia EST del arroz de la Figura 6a.

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Figura 7: ADNc del C15-1 de trigo. La Figura 7a muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc del C15-1 de trigo. 45

La Figura 7b muestra la secuencia de aminoácidos predicha del ADNc del C15-1 de trigo de la Figura 7a. Figura 8: Clon genómico 5al del trigo.

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La Figura 8a muestra la secuencia de nucleótidos del clon genómico 5a1 del trigo. La Figura 8b muestra la secuencia de aminoácidos predicha del clon genómico 5a1 del trigo de la Figura 8a.

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Figura 9: Clon genómico 1a1 del maíz. La Figura 9a muestra la secuencia de nucleótidos del clon genómico 1a1 del maíz, es decir, D8. 60

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La Figura 9b muestra la secuencia de aminoácidos del clon genómico 1a1 del maíz de la Figura 9a. La Figura 10 muestra un alineamiento PRETTYBOX de las secuencias de aminoácidos del polipéptido D8 del maíz con, el polipéptido Rht del trigo, la secuencia EST del arroz determinada por los presentes inventores, y el polipéptido Gai de Arabidopsis thaliana.

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ES 2 263 214 T3 Figura 11: Secuencias de los alelos de D8 del maíz. La Figura 11a muestra una secuencia parcial de nucleótidos del alelo D8-1 del maíz. 5

La Figura 11b muestra una secuencia parcial de aminoácidos del alelo D8-1 del maíz. La Figura 11c muestra una secuencia parcial de nucleótidos del alelo D8-2023 del maíz. La Figura 11d muestra una secuencia parcial de aminoácidos del alelo D8-2023 del maíz.

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Figura 12: Alelo rht-10 del trigo. La Figura 12a muestra una secuencia parcial de nucleótidos del alelo rht-10 del trigo. 15

La Figura 12b muestra una secuencia parcial de aminoácidos del alelo rht-10 del trigo.

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Previamente, clonamos el gen GAI de Arabidopsis (PCT/GB97/00390-WO97/29123 publicada el 14 de agosto de 10 1997). La comparación de las secuencias de ADN del tipo salvaje (GAI) y de los alelos mutantes (gai) mostró que gai codifica un producto de proteína predicha mutante (gai) que carece de un segmento de 17 aminoácidos de cerca del extremo N-terminal de la proteína. El cribado de las bases de datos de secuencias de ADN con la secuencia GAI reveló la existencia de una EST (D39460) del arroz, la cual contiene una región de una secuencia estrechamente relacionada con la del segmento que está suprimido del GAI en la proteína gai. Una comparación de las secuencias de aminoácidos predichas de la región DELLA a EQLE muestra que son idénticas en ambas secuencias. Las dos diferencias (V/A; E/D) son sustituciones conservadoras, en las que un residuo aminoácidos es remplazado por otro que tiene propiedades químicas muy similares. Además, la región de identidad se extiende más allá de los límites de la región de supresión en la proteína gai. La secuencia DVAQKLEQLE no se ve afectada por la supresión en gai, y todavía está perfectamente conservada entre las secuencias GAI i D39460 (Figura 1).

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Se usó un subfragmento SalI-NotI de aproximadamente 700 p.b. de D39460, en experimentos de hibridación con baja rigurosidad, para aislar los clones que se hibridaban a partir de ADNc de trigo y de bibliotecas genómicas (preparadas a partir de ADN de la variedad Chinese Spring), y a partir de una biblioteca genómica del maíz (preparada a partir de la línea B73N). Se aislaron varios clones, incluyendo los C15-1 y C15-10 (ADNc), y los 5a1 y 14a1 (clones genómicos). El clon C15-1 se ha usado en experimentos de mapado del gen. El análisis nulisómicotetrasómico mostró que el clon C15-1 se híbrida con fragmentos de ADN genómico derivados de los cromosomas 4A, 4B y 4D del trigo. Esto es consistente con que el clon C15-1 contenga la secuencia Rht, puesto que el loci Rht se cartografía en los cromosomas del grupo 4. Adicionalmente, el análisis recombinante usando una población de segregación para el alelo Rht-D1b (anteriormente Rht2) identificó un fragmento que se hibridaba, que mostraba un co-segregación perfecta con el alelo mutante. Esto situó la ubicación genómica del gen que codifica la secuencia de ARNm en el ADNc C15-1 dentro de un segmento de 2 cM (que ya se sabía que contenía el Rht) del grupo 4 de cromosomas, y proporciona una evidencia clara de que el ADNc y los clones genómicos contienen efectivamente el gen Rht. La secuencia de ADN del DB de maíz descubierta en la presente procede de fragmentos SalI de 1,8 kb y 3,0 kb contiguos subclonados (clonados en BluescriptTM SK+ ) procedentes de 1a1. La secuencia de Rht de trigo descubierta en la presente procede de un subfragmento DraI de 5,7 kb (clonado en BluescriptTM SK+ ) del clon 5a1. La Figura 2a proporciona la secuencia de ADN (un único paso) completa del ADNc de C15-1. Se ha obtenido también la secuencia de ADN para el C15-10; es idéntica a la del C15-1 y, por tanto, no se muestra. Las Figuras 2b y 2c muestran datos originales procedentes de los análisis de secuenciación de los clones 14a1 y 5a1. Las secuencias mostradas en la Figura 2 pueden solaparse para preparar una secuencia de ADN compuesta, mostrada en la Figura 3a. Esta secuencia exhibe una homología intensa con la del GAI de Arabidopsis, tal como se reveló mediante una comparación de la secuencia de aminoácidos de un producto de traducción predicho de la secuencia del trigo (Rht) con la del GAI (GAI), mostrada en la Figura 3b. En particular, la secuencia de aminoácidos predicha de la presunta Rht revela una región prácticamente idéntica con GAI a lo largo de la región que está ausente en gai (Figura 4). La Figura 4 revela que la homología que se extiende más allá de la región de supresión de gai en la EST del arroz, también está conservada en la Rht (DVAQKLEQLE), indicando, por tanto, que esta región, además de la hallada en la supresión de gai, está implicada en la transducción de señal de GAI. Esta región no se halla en SCR, otra proteína que está relacionada en su secuencia con la GAI, pero que no está implicada en la señalización de GAI. Los cebadores usados en los experimentos de secuenciación de más arriba se muestran en la Tabla 1. Se ha obtenido confirmación adicional de que estas secuencias son realmente los loci Rht del trigo y D8 del maíz mediante el análisis de las secuencias del gen procedentes de varios alelos mutantes, tal como sigue.

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Los presentes inventores obtuvieron y secuenciaron el clon identificado en la base de datos como la EST D39460 del arroz, y las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos predicha a partir de ese trabajo de muestran respectivamente en la Figura 6a y en la Figura 6b. 10

ES 2 263 214 T3

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El trabajo previo sobre el gen GAI de Arabidopsis mostró que la proteína GAI consiste en dos secciones, un mitad N-terminal que no presenta homología con ninguna otra proteína de función conocida, y un mitad C-terminal que presenta una homología extensa con el factor de transcripción candidato SCR de Arabidopsis (Peng et al., Genes and Development, 11:3194-3205 (1997); PCT/GB97/00390). Tal como se ha descrito más arriba, la supresión de una porción de la mitad N-terminal de la proteína causa las respuestas reducidas a la GA características del alelo mutante gai (Peng et al., 1997; PCT/GB97/00390). Por tanto, los inventores predijeron que si D8 y Rht son homólogos funcionales (ortólogos), respectivamente del maíz y del trigo, de la GAI de Arabidopsís, entonces los alelos mutantes dominante de D8 y Rht deberían contener también mutaciones que afectaran las secciones N-terminales de las proteínas que codifican.

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Los informes previos describen un cierto número de alelos mutantes dominantes de D8 y de Rht, en particular, D8-1, D8-2023 y Rht-D1c (anteriormente Rht10) (Börner et al., Euphytica, 89:69-75 (1996); Harberd y Freeling, Genetics, 121:827-838 (1989); Winkler y Freeling, Planta, 193:341-348 (1994)). Por tanto, los presentes inventores clonaron los genes D8/Rht candidatos procedentes de estos mutantes, y examinaron mediante secuenciación del ADN la porción del gen que codifica la mitad N-terminal de la proteína. Un fragmento de los genes D8 o Rht que codifica una porción de la mitad N-terminal de la proteína D8/Rht se amplificó mediante la PCR a partir de ADN genómico de plantas que contenían D8-1, D8-2023 y Rht-D1c, usando los siguientes cebadores para la amplificación: para D8-1, los cebadores ZM-15 y ZM-24; para D8-2023, los cebadores ZM-9 y ZM-11; para Rht-D1c se realizó la PCR anidad usando Rht-15 y Rht-26 seguidos por Rht-16 y Rha-2. Las reacciones de la PCR se realizaron usando un equipo de la PCR geneAmp XL de Perkin Elmer, usando las siguientes condiciones: las reacciones se incubaron a 94◦ C durante 1 minuto, a continuación se sometieron a 13 ciclos de 94◦ C, 15 segundos - x◦ C durante 15 segundos - 69◦ C 5 minutos (en donde x se reduce en 1◦ C por ciclo, empezando a 64◦ C y finalizando a 52◦ C), a continuación 25 ciclos de 94◦ C, 15 segundos - 53◦ C, 15 segundos - 65◦ C, 5 minutos, a continuación 10 minutos a 70◦ C. Estos fragmentos se clonaron a continuación en el vector pGEMR -T Easy (Promega, consultar el Manual Técnico), y se determinaron sus secuencias de ADN. Se hallaron mutaciones en los genes D8 y Rht candidatos en cada uno de los mutantes anteriores. La mutación D81 es una supresión en pauta que suprime los aminoácidos VAQK (55-59) y añade una G (ver la secuencia en la Figura 11a y en la Figura 11b). Esta supresión se solapa con el bloque de homología DVAQKLEQLE conservado descrito más arriba. D8-2023 es otra mutación de supresión en pauta que suprime los aminoácidos LATDTVHYNPSD (8798) del extremo N-terminal de la proteína D8 (ver la Figura 11c y la Figura 11d). Esta supresión no se solapa con la supresión en gai o en D8-1, pero cubre otra región que está altamente conservada entre GAI, D8 y Rht (ver la Figura 10). Finalmente, Rht-D1c contiene otra pequeña supresión en pauta que suprime los aminoácidos LNAPPPPLPPAPQ (109-121) en la región N-terminal de la proteína Rht mutante que codifica (ver la Figura 12a y la Figura 12b) (LN-P está conservada entre GAI, D8 y Rht, ver la Figura 10). Por tanto, todos los alelos mutantes descritos más arriba son dominantes, y confieren enanismo asociado con una respuesta reducida a la GA. Todos estos tres alelos contienen mutaciones de supresión que suprimen una porción de la mitad N-terminal de la proteína que codifican. Estas observaciones demuestran que se han clonado los genes D8 y Rht del maíz y del trigo.

TABLA 1 Cebadores usados en la secuenciación del Rht

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ES 2 263 214 T3 TABLA 1 (continuación)

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TABLA 2 55

Cebadores usados en la secuenciación de los clones D-8

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ES 2 263 214 T3 TABLA 2 (continuación)

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ES 2 263 214 T3 REIVINDICACIONES 5

1. Polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 9b para el polipéptido D8 del maíz. 2. Polinucleótido aislado según la reivindicación 1, en el cual el polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos codificante mostrada en la Figura 9a.

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3. Polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 6b. 4. Polinucleótido aislado según la reivindicación 3, en el cual el polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos codificante mostrada en la Figura 6a.

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5. Polinucleótido aislado en el cual un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 está unido operativamente a una secuencia reguladora para su expresión. 20

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6. Polinucleótido aislado cuya secuencia de nucleótidos es complementaria de una secuencia de al menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia codificante o secuencia complementaria de la secuencia codificante de un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, apropiado para su uso en una regulación antisentido o con sentido (“co-supresión”) de la expresión de dicha secuencia codificante y bajo el control de una secuencia reguladora para la transcripción. 7. Polinucleótido según la reivindicación 5 ó la reivindicación 6, en el cual la secuencia reguladora incluye un promotor inducible. 8. Vector de ácido nucleico apropiado para la transformación de una célula vegetal, y que incluye un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

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9. Célula huésped que contiene un polinucleótido heterólogo o vector de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores. 10. Célula huésped según la reivindicación 9, la cual es microbiana. 35

11. Célula huésped según la reivindicación 9, la cual es una célula vegetal. 12. Célula vegetal según la reivindicación 11 que tiene dicho polinucleótido heterólogo en su cromosoma. 40

13. Célula vegetal según la reivindicación 12 que tiene más de uno de dicho polinucleótido por genoma haploide. 14. Célula vegetal según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, la cual está comprendida en una planta, en una parte de planta, o en un propágulo de planta, o en un extracto o derivado de una planta.

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15. Procedimiento para producir una célula según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, incluyendo el procedimiento la incorporación de dicho polinucleótido o vector de ácido nucleico en la célula por medio de la transformación. 16. Procedimiento según la reivindicación 15, el cual incluye recombinar el polinucleótido con el ácido nucleico del genoma de la célula, de tal forma que se incorpore establemente en el mismo.

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17. Procedimiento según la reivindicación 15 o reivindicación 16, el cual incluye regenerar una planta a partir de una o más células transformadas. 18. Planta que comprende una célula vegetal según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13. 55

19. Parte o propágulo de una planta que comprende una célula vegetal según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13. 60

20. Procedimiento para producir una planta, incluyendo el procedimiento la incorporación de un polinucleótido o vector de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en una célula vegetal y la regeneración de una planta a partir de dicha célula vegetal. 21. Procedimiento según la reivindicación 20, que incluye el propagar sexual o asexualmente, o hacer crecer, un vástago o un descendiente de la planta regenerada a partir de dicha célula vegetal.

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22. Procedimiento para influir en una característica de una planta, incluyendo el procedimiento causar o permitir la expresión a partir de un polinucleótido heterólogo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, dentro de las células de la planta. 15

ES 2 263 214 T3 23. Utilización de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la producción de una planta transgénica. 24. Polipéptido aislado codificado por un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4. 5

25. Anticuerpo que incluye un sitio de unión a antígeno con afinidad de unión específica para el polipéptido según la reivindicación 24. 26. Polipéptido que incluye el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo según la reivindicación 25. 10

27. Procedimiento para identificar u obtener un polipéptido según la reivindicación 24, incluyendo el procedimiento cribar polipéptidos candidatos con un anticuerpo o polipéptido según la reivindicación 25 o reivindicación 26. 15

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