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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k ES 2 087 279 kInt. Cl. : A61K 35/78

11 N.◦ de publicaci´ on: 6

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˜ ESPANA

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A61K 31/70

TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 91900992.8 kFecha de presentaci´on : 10.12.90 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 504 254 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 23.09.92

T3

86 86 87 87

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54 T´ıtulo: El uso de giberelinas para el tratamiento de la prostatitis y la psoriasis.

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73 Titular/es: Per Oden

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72 Inventor/es: Oden, Per

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74 Agente: Hern´ andez Covarrubias, Arturo

30 Prioridad: 12.12.89 DK 6272/89

Motorbatsvagen 38 S-902 91 Taftea, SE

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.07.96

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 087 279 T3

16.07.96

Aviso:

k k k

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 087 279 T3 DESCRIPCION El uso de giberelinas para el tratamiento de la prostatitis y la psoriasis 5

Campo de la invenci´ on La presente invenci´on se refiere al uso del grupo de compuestos conocidos como giberelinas para la preparaci´ on de una composici´ on farmac´eutica para el tratamiento de la prostatitis, con inclusi´ on de hipertrofia y adenoma hiperpl´ astico de la pr´ostata.

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Fundamentos de la invenci´ on

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Las giberelinas son un grupo de compuestos que se encuentran en las plantas y en ciertos hongos. Las giberelinas son reguladores del crecimiento de las plantas (fitohormonas), que estimulan el crecimiento y la diferenciaci´on de las plantas en cantidades muy peque˜ nas. Se han aislado y descrito aproximadamente 75 giberelinas diferentes. Las giberelinas son ´acidos d´ebiles con un sistema de anillos que contiene enlaces dobles y 8 carbonos asim´etricos, y se pueden sintetizar a partir del hidrato de carbono diterpenoide tetrac´ıclico ent-kaur-16eno:

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Aproximadamente la mitad de las giberelinas tienen 20 a´tomos de carbono, y se hace referencia a umero 20 y se ´estas como giberelinas C20 . Las giberelinas restantes carecen del ´atomo de carbono n´ hace referencia a ellas como giberelinas C19 . La numeraci´on de los ´atomos de carbono sigue las reglas aceptadas para los diterpenos tetrac´ıclicos (McCrindle y Overton, Advan. Org. Chem. 1965, 5, 47113) y se utiliza en esta memoria (v´ease F´ormula I). La nomenclatura sistem´ atica est´a basada en “kaurano” y “giberelano”, y dado que las giberelinas son enanti´ omeros de estos compuestos, las giberelinas C20 se denominan ent- giberelanos y las giberelinas C19 se denominan ent-20-norgiberelanos. Por razones de comodidad, se hace referencia com´ unmente a las giberelinas de acuerdo con un sistema de numeraci´on est´andar (por ejemplo giberelina A1 o simplemente GA1 , y dicho sistema se emplear´a tambi´en en esta memoria). En conexi´on con la presente invenci´on, las giberelinas comprenden cualquier compuesto que tenga la estructura de anillos indicada anteriormente.

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Se acepta generalmente que el polen tiene un efecto de fortalecimiento general en los seres humanos as´ı como un efecto espec´ıfico contra la inflamaci´ on cr´ onica de la pr´ ostata (Br. J. Urol. 64 (1989) pp. 496-499); 66 (1990) pp. 393-97; 66 (1990) pp. 398-404. El efecto positivo de las preparaciones de polen (tales como las preparaciones suecas Cernilton y Cernitol) sobre la prostatitis cr´ onica se ha demostrado cient´ıficamente, y dichas preparaciones est´an registradas como medicamentos en ciertos pa´ıses. El polen es naturalmente rico en giberelinas, pero no se ha investigado con anterioridad si la presencia de dichas giberelinas est´a relacionada con los efectos beneficiosos del polen. Estas preparaciones de polen son extractos acuosos secos y su contenido de giberelinas es 0-1 µg por gramo de material seco procedente del extracto. R , se produce a partir de un extracto de semillas de calabaza y Otro medicamento natural, Curbicin frutos de una palma enana, y se sabe que las semillas de calabaza son ricas tambi´en en giberelinas, pero el efecto de las giberelinas en este medicamento no ha sido investigado.

Las giberelinas han sido propuestas previamente para formulaciones terap´euticas y cosm´eticas. V´eanse, por ejemplo, los documentos WO-A-84/01710; US-A-4.508.707; 4.424.232; y 4 .508.614. Los efectos biol´ogicos, tales como efectos anti-inflamatorios, en los mam´ıferos han sido descritos en la bibliograf´ıa cient´ıfica: Experintia (1977) pp. 1544-45; C.R. S´eances Soc. Biol. Filiales 163 (1969) pp. 1302-6; Gen. Physiol. Biophys. 6 (1987) pp. 279-83; Neoplasma (27.2.1980) pp. 203-9; Res. Commun. Chem. 2

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Path. Pharm. 28 (1980) pp. 123-32 y J. Am. Pod. Med. Ass. 79 (1989) pp. 24-26. Para una revisi´ on de los efectos farmacol´ogicos del ´acido giberel´ınico, v´ease Pharmazie 38 (1983) pp. 716-8. Se sabe que el ´acido giber´elico administrado a ratas castradas dar´a lugar al restablecimiento del peso de la pr´ostata; C.R. S´eances Soc. Biol. Filiales 163 (1969) pp. 1302-6. Breve descripci´ on de la invenci´ on

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Se ha encontrado ahora que las giberelinas poseen ciertas propiedades terap´euticas importantes que se desconoc´ıan con anterioridad. De acuerdo con el concepto de la invenci´on, las giberelinas estar´an asequibles para el tratamiento de la prostatitis como se ha indicado arriba. As´ı pues, un aspecto de la invenci´on se refiere al uso de una giberelina activa para la preparaci´ on de una composici´ on farmac´eutica destinada al tratamiento de la prostatitis (como se ha definido anteriormente). En el modo preferido, las giberelinas utilizadas est´ an de acuerdo con la estructura siguiente (F´ ormula I):

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en la cual 40

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R1 es H o un grupo -O-R20, donde R20 es H, o junto con R2 o R10 forma un enlace (enlace doble C1 -C2 o C1 -C10 , respectivamente); R2 es H o un grupo -O-R21, donde R21 es H, un grupo ´eter glicos´ılico (´eter de glic´osido) o junto con R4 forma un enlace (lactona) o junto con R1 o R3 forma un enlace (enlace doble C1 -C2 o C2 -C3 , respectivamente); R3 es H, =O, o -O-R24, donde R24 es H o un grupo ´eter glicos´ılico (´eter de glic´osido), o junto con R2 forma un enlace (enlace doble C2 -C3 ); R4 es OH o junto con R23 o R21 forma un enlace (lactona); R5 es H o -O-R22, donde R22 es H o un grupo ´ester glicos´ılico (´ester de glic´osido);

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R6 es H o OH o, junto con R7 , forma un enlace (enlace doble C12 -C13 ); R7 es H, =O, o -O-R25 , donde R25 es H o un grupo ´eter glicos´ılico (´eter de glic´osido) o junto con R6 forma un enlace (enlace doble C11 -C12 ); 60

R8 es H o -O-R26, donde R26 es H o un grupo ´eter glicos´ılico (´eter de glic´osido); R9 es H o OH; 3

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R10 es H, CH3 , CHO, COOH o un ´ester glicos´ılico (´ester de glic´osido) de dicho COOH, CH2 O-R23 o -O-R23 donde R23 es H o junto con R4 forma un enlace (lactona), o junto con R1 forma un enlace (enlace doble C1 -C10 ); R11 es OH o est´a ausente;

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R12 es CH3 , CH2 OH, COOH o un ´ester glicos´ılico (´ester de glic´osido) de dicho COOH; y sus sales y lactonas farmac´euticamente aceptables. La l´ınea de puntos junto con la l´ınea continua indican que puede estar situado un enlace doble entre dos de los tres a´tomos de carbono conectados por las l´ıneas de puntos y continua; con la condici´ on de que no est´ a presente un enlace doble si R11 es un grupo OH.

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La f´ ormula I cumple con las reglas de la valencia normal, es decir los a´tomos de carbono tienen siempre cuatro valencias, el ox´ıgeno dos y el hidr´ ogeno una. Esto conduce a las condiciones adicionales (i) que R1 y R2 no pueden formar un enlace si R10 y R1 y/o R2 y R3 forman un enlace, (ii) que R10 y R1 no pueden formar un enlace si R10 y R23 forman un enlace, y (iii) que R2 y R1 o R2 y R3 no pueden formar un enlace si R4 y R21 forman un enlace. Para los a´tomos de carbono que tienen solamente tres valencias en la F´ormula I, la valencia que falta est´a unida a un hidr´ ogeno (no representado).

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El tratamiento de la prostatitis (como se ha indicado anteriormente) comprende administrar a un individuo que padece de prostatitis una cantidad eficaz de una giberelina activa, que cumple preferiblemente con la F´ormula I, o una sal o lactona farmac´euticamente aceptable de aqu´ella. En particular, la invenci´ on se refiere al tratamiento de individuos no castrados.

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Los compuestos a utilizar en la invenci´on son activos en el sentido de que los mismos alivian los s´ıntomas de la prostatitis y la psoriasis, respectivamente. (V´ease “Mecanismo de Acci´on”.) Descripci´ on detallada de la invenci´ on

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Las giberelinas preferidas para la invenci´ on se pueden dividir en seis grupos principales, A-F. El grupo A comprende 12-OH-giberelinas γ-lact´onicas. Las giberelinas del grupo A comprenden compuestos de F´ ormula I en la cual R7 es OH y R10 es -O-R23, donde R23 junto con R4 forma un enlace (lactona). Un subgrupo del grupo A es el grupo en el cual R1 y R2 forman juntos un enlace o R2 y R3 forman juntos un enlace. Otro subgrupo es aqu´el en el cual R1 es H o OH, R2 es H o OH y R5 es O-R22 . En otro subgrupo, R1 es H o OH, R2 es H o OH, R3 es H, OH o =O, R5 es OH, R6 es H, R8 es H, R9 es H, R11 est´a ausente, y la l´ınea de puntos junto con la l´ınea continua indican que un enlace doble est´ a situado entre dos de los tres a´tomos de carbono conectados por las l´ıneas de puntos y continua. Compuestos especialmente preferidos del grupo A son GA30 , GA31 , GA33, GA48 , GA49 , GA58 , GA69 , GA70 y GA71 . El grupo B comprende 13-OH-giberelinas γ-lact´onicas. Las giberelinas del grupo B comprenden compuestos de F´ ormula I en la cual R8 es OH y R10 es -O-R23 , donde R23 junto con R4 forma un enlace. Un subgrupo del grupo B es aqu´el en el cual R1 y R2 forman juntos un enlace, o R2 y R3 forman juntos un enlace. En otro subgrupo, R1 es H o OH, y R5 es O-R22 . En un subgrupo adicional, R1 es H o OH; R2 es H o un grupo -O-R21 , donde R21 es H, o junto con R3 forma un enlace (enlace doble C2 -C3 ), R3 es H o OH, R5 es OH, R6 es H, R7 es H, R11 est´a ausente, y la l´ınea de puntos junto con la l´ınea continua indican que est´a situado un enlace doble entre dos de los tres a´tomos de carbono conectados por las l´ıneas de puntos y continua, y R1 y R2 pueden formar juntos un enlace o R2 y R3 pueden formar juntos un enlace. Compuestos especialmente preferidos del grupo B son GA1 , GA3 , GA5 , GA6 , GA8 , GA21 , GA22 , GA29, GA56 , GA57 , GA59 , GA60, GA67 y GA72 . El grupo C comprende 3-oxo-giberelinas γ-lact´onicas o giberelinas con o sin un grupo hidroxi en la posici´on 3. Las giberelinas del grupo C comprenden compuestos de F´ormula I en la cual R10 es -O-R23 , 4

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donde R23 junto con R4 forma un enlace. En un subgrupo del grupo C, R1 y R2 forman juntos un enlace, o R2 y R3 forman juntos un enlace (no en el caso de las 3-oxo-giberelinas). En otro subgrupo, R1 es H o OH, R2 es H o OH, y R5 es O-R22 . Un subgrupo adicional es aqu´el en el cual R3 es H o OH. Otro subgrupo adicional es aqu´el en el cual R1 es H o OH, R2 es H o OH, R3 es H o OH, R5 es OH, y R12 es CH3 . Compuestos especialmente preferidos del grupo C son 3-oxo-giberelinas tales como 3-oxo-GA1 y 3on 3, tales como GA1 , GA2 , GA3 , GA4 , oxo-GA3 y giberelinas con o sin un grupo hidroxilo en la posici´ GA7 , GA8 , GA9 , GA26 , GA30 , GA32, GA34, GA35 , GA47 , GA48 , GA49 , GA50 , GA54 , GA55 , GA56 , GA57 , GA58, GA68 y GA71 .

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El grupo D comprende precursores de giberelinas. Los precursores de giberelinas del grupo D comprenden compuestos de F´ ormula I en la cual R7 es H o OH. Un subgrupo del grupo D es aqu´el en el cual 1 2 3 R es H, R es H y R es H o OH. En este subgrupo, R1 es H, R2 es H, R3 es H o OH, R5 es H o OH, R6 es H, R9 es H, R10 es CH3 , CHO o CH2 O-R23, donde R23 junto con R4 forma un enlace, R11 est´a ausente, R12 es CH3 , y la l´ınea de puntos junto con la l´ınea continua indican que est´a situado un enlace doble entre dos de los tres a´tomos de carbono conectados por las l´ıneas de puntos y continua.

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Compuestos especialmente preferidos del grupo D son GA12 -aldeh´ıdo, GA12 , 12α-OH-GA12-aldeh´ıdo, 12α-OH-GA12, 12α-OH-GA14, 12α-OH-GA15, 12α-OH-GA37, GA19 y GA53 .

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El grupo E comprende varias otras giberelinas. Las giberelinas del grupo E comprenden compuestos de F´ormula I en la cual R11 est´a ausente y R12 es CH3 . En un subgrupo del grupo E, R10 y R1 forman juntos un enlace, o R1 y R2 forman juntos un enlace, o R2 y R3 forman juntos un enlace. En otro subgrupo, R1 es H, R2 es H y R6 es H. Un subgrupo adicional es aqu´el en el cual R3 es H o OH y R7 es H o OH. Todav´ıa otro subgrupo es aqu´el en el cual R1 es H, R2 es H, R3 es H o OH, R5 es H o OH, R6 es H, R7 es H o OH, R9 es H, R10 es CH3 , CHO, CH2 O-R23 o -O-R23 , donde R23 es H o, junto con R4 , forma un enlace, y la l´ınea de puntos junto con la l´ınea continua indican que un enlace doble est´ a situado entre dos de los tres ´atomos de carbono conectados por las l´ıneas de puntos y continua. El grupo E comprende giberelinas tales como GA1 , GA3 , GA4 , GA7 , GA9 , GA12 , GA12 -aldeh´ıdo, GA14, GA14 -aldeh´ıdo, GA15 , GA18 , GA18 -aldeh´ıdo, GA19, GA20 , GA23 , GA24 , GA30 , GA36 , GA37 , GA38, GA44 y GA53 -aldeh´ıdo.

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El grupo F comprende conjugados de giberelina tales como ´eteres y ´esteres de giberelinas. Ejemplos de ´eteres son ´eteres glicos´ılicos (´eteres de glic´osido) en los cuales el enlace glicos´ıdico preferido es un enlace O-β-D-glicos´ıdico y el componente az´ ucar se selecciona del grupo constituido por glucosa, galactosa, arabinosa y xilosa. En general, los conjugados ´eter-giberelina se forman en la posici´on R21 , R24 , ormula I, aunque los mismos pueden formarse tambi´en en otras posiciones. Una o R25 y/o R26 de la f´ m´as de estas posiciones pueden estar transformadas en un grupo ´eter. Eteres de giberelina especialmente preferidos son GA1 -3-O-β-D-gluc´osido, GA1 -13-O-β-D-gluc´osido, GA3 -3-O-β-D-gluc´osido, GA3 -13-O-βD-gluc´osido, GA3 -3,13-di-O-β-D-gluc´osido, GA4 -3-O-β-D-gluc´osido, GA7 -3-O-β-D-gluc´osido, GA19 -13O-β-D-gluc´osido, GA20-13-O-β-D-gluc´osido, GA30-12-O-β-D-gluc´osido y GA53-13-O-β-D-gluc´osido. Esteres preferidos son ´esteres glicos´ılicos (´esteres de glic´osido) en los cuales el az´ ucar es un az´ ucar α-D, α-L, ormula I, pero el ´ester puede formarse β-D o β-L. En general, el ´ester se forma en la posici´on R22 de la f´ en cualquier posici´ on que tenga un grupo funcional de a´cido carbox´ılico, p.ej. en las posiciones R10 o olica del ´ester es R12, respectivamente, cuando el grupo R10 y/o R12 es un grupo COOH. La parte alcoh´ t´ıpicamente un resto az´ ucar, especialmente un resto az´ ucar seleccionado del grupo constituido por glucosa, galactosa, arabinosa y xilosa (todos los cuales se encuentran en forma de grupos glicosidilo). Compuestos preferidos son aqu´ellos en los cuales el enlace ´ester formado en la posici´on R22 se selecciona del grupo constituido por un enlace ´ester β- D-glucosidilo, α-D-glucosidilo, β-D-galactosidilo, α-L-arabinosidilo y β-D-xilosidilo. Los ´esteres de giberelina preferidos son ´esteres de α- y β-glic´osidos, tales como GA1 D-glucosil-´ester, GA3 -D-glucosil-´ester, GA4 -D-glucosil-´ester-GA7 -D-glucosil-´ester, GA9 -D-glucosil-´ester, GA19-D- glucosil-´ester, GA20 -D-glucosil-´ester, GA30 -D-glucosil-´ester y GA53 -D-glucosil-´ester con estructura c´ıclica en los cuales el resto de hidrato de carbono puede estar unido a la estructura c´ıclica de la giberelina en las posiciones indicadas anteriormente. Cierto n´ umero de giberelinas existentes naturalmente son comercialmente asequibles. Las giberelinas que no se encuentran en el mercado pueden prepararse por s´ıntesis qu´ımica p.ej. utilizando giberelinas comercialmente asequibles como materiales de partida o pueden ser sintetizadas por v´ıa f´ ungica. La s´ıntesis puede, en caso necesario, ir seguida por la conversi´on de los compuestos aislados en las giberelinas deseadas.

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ES 2 087 279 T3 S´ıntesis qu´ımica de giberelinas y precursores de giberelinas

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La s´ıntesis total de giberelinas y precursores de giberelinas es muy complicada, consume mucho tiempo y es muy costosa. Adem´as, los rendimientos son usualmente muy bajos. Por esta raz´on, si es posible, el m´etodo de elecci´on consiste en utilizar cultivos f´ ungicos que est´ an dise˜ nados especialmente para sintetizar precursores de giberelinas espec´ıficos, giberelinas y conjugados de giberelinas. Si esto no es factible, se pueden emplear m´etodos para s´ıntesis total descritos en la bibliograf´ıa (Mori et al., 1969, Tetrahedron 25: 1293; Nagata et al., 1971, J. Am. Chem. Soc. 93: 5740; Corey et al., 1978, J. Am. Chem. Soc. 100: 8034; Mander, 1982, Search 13: 188). Una manera sencilla de producir GA1 , 3-oxo-GA1, 3-oxo-GA3, GA4 , GA5 , y GA20 consiste en utilizar el producto GA3 comercialmente asequible como material de partida. La preparaci´ on de estas giberelinas a partir de GA3 se describe en el Ejemplo 4. Otras giberelinas deseadas pueden prepararse an´ alogamente empleando giberelinas apropiadas como materiales de partida. S´ıntesis por hongos

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Aunque la s´ıntesis qu´ımica es una posibilidad, el m´etodo o´ptimo de producci´ on en gran escala de giberelinas es probablemente la s´ıntesis por hongos, seguida opcionalmente por conversi´on de los compuestos aislados en otros compuestos de giberelina. Los hongos existentes naturalmente productores de giberelinas (especialmente Gibberella fujikuroi; as´ı como el g´enero Sphacaeoloma) producen fundamenungicas mutadas. La talmente GA3 , GA4 y GA7 . Otras giberelinas pueden ser producidas por cepas f´ mutaci´on se ha conseguido especialmente por tratamiento ultravioleta, pero pueden emplearse tambi´en otros m´etodos de mutaci´ on, por ejemplo tratamiento qu´ımico. La identificaci´on de las cepas mutadas se realiza especialmente por t´ecnicas de inmunoensayo, empleando anticuerpos de giberelinas.

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Composiciones farmac´euticas

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Las formulaciones utilizadas en conexi´on con las giberelinas terap´euticamente activas est´an dise˜ nadas para ser administradas por v´ıas oral o parenteral en formas de dosificaci´ on que contienen veh´ıculos y excipientes convencionales, no t´oxicos y farmac´euticamente aceptables. Las formulaciones para uso oral incluyen tabletas, p.ej. tabletas efervescentes o tabletas masticables, pastillas, c´ apsulas, polvos, gr´ anulos, mezclas, jarabes, soluciones, suspensiones, emulsiones y an´ alogas.

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Las formas de dosificaci´on s´olidas (p.ej. tabletas, c´apsulas, gr´ anulos, etc.) pueden comprender el ingrediente activo en mezcla con veh´ıculos y/o excipientes no t´oxicos y farmac´euticamente aceptables. Estos incluyen agentes ligantes tales como almid´ on, gelatina, goma ar´abiga o polivinilpirrolidona; cargas tales como lactosa, celulosa microcristalina, almid´on de patata, almid´ on de ma´ız, fosfato de calcio, carbonato de calcio, cloruro de sodio, az´ ucar o sorbitol; agentes de granulaci´on o desintegrantes tales como almid´ on de patata o a´cido alg´ınico; agentes humectantes tales como lauril-sulfato de sodio; y lubricantes tales como estearato de magnesio, talco, ´acido este´arico, polietilenglicol o s´ılice. Las preparaciones l´ıquidas para administraci´ on oral (p.ej. mezclas, jarabes, soluciones, suspensiones, emulsiones, etc.) pueden comprender el ingrediente activo en mezcla con aditivos farmac´euticamente aceptables adecuados tales como agentes de suspensi´on, p.ej. gelatina, metil-celulosa, hidroxietil-celulosa, carboximetil-celulosa s´odica, hidroxipropil-celulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma ar´ abiga; agentes emulsionantes, p.ej. lecitina y monooleato de sorbit´ an; agentes dispersantes o humectantes, p.ej. lecitina y ´esteres de polioxietileno, (p.ej. estearato de polioxietileno); veh´ıculos no acuosos, p.ej. aceites vegetales (aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de almendras, aceite de s´esamo, aceite de coco) y aceites minerales (parafina); conservantes, p.ej. p-benzoatos de metilo, etilo o n-propilo; y uno o m´ as agentes colorantes, agentes saborizantes y/o agentes edulcorantes, p.ej. sacarosa o sacarina. Las formulaciones de tabletas pueden carecer de revestimiento o pueden proveerse de un revestimiento por t´ecnicas conocidas para controlar la liberaci´on de la sustancia activa o para retardar la desintegraci´ on y absorci´on en el tracto gastrointestinal. Las formulaciones para uso parenteral incluyen composiciones inyectables, aptas para infusi´ on y aptas para implantaci´ on. Las v´ıas potenciales de administraci´on son las v´ıas intravenosa, intramuscular, o subcut´ anea. Las formulaciones para inyecci´on pueden presentarse en forma de dosis unitaria, p.ej. ampollas, o en envases de dosis m´ ultiples con un conservante a˜ nadido. Las composiciones pueden encontrarse en forma de una soluci´ on, una suspensi´ on o una emulsi´ on o se pueden presentar como un polvo seco para su reconstituci´on con agua u otro veh´ıculo adecuado antes de su empleo. Las composiciones comprenden el ingrediente activo en mezcla con veh´ıculos y/o excipientes farmac´euticamente aceptables adecuados. La composici´ on puede comprender adicionalmente agentes de formulaci´ on tales como agentes de suspensi´ on, 6

ES 2 087 279 T3 estabilizadores y/o dispersantes.

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La v´ıa oral y la v´ıa parenteral de administraci´ on se prefieren especialmente para el tratamiento de la prostatitis como se ha definido anteriormente. Adicionalmente, las giberelinas tales como se han indicado anteriormente se pueden administrar por v´ıa externa a la piel en formas o composiciones de dosificaci´ on que comprenden el ingrediente activo en mezcla con veh´ıculos y/o excipientes farmac´euticamente aceptables y no t´ oxicos. Las formulaciones para uso externo incluyen cremas, ung¨ uentos, lociones, linimentos, geles, hidrogeles, soluciones, suspensiones, emulsiones, pastas, parches y otras clases de sistemas de suministro transd´ermico. Veh´ıculos o excipientes farmac´euticamente aceptables son, por ejemplo, bases de ung¨ uentos (p.ej. parafina, aceites R R y Tween ); agentes de suspensi´on; agentes emulsionantes (p.ej. devegetales, polietilenglicoles, Span rivados de lecitina, goma ar´ abiga y monooleato de sorbit´ an); agentes formadores de gel (p.ej. Carbopol, alginatos, gelatina y derivados de celulosa); antioxidantes (p.ej. a´cido asc´orbico, tocoferol y sus derivados e hidroxi-anisol butilado); agentes tamp´ on; conservantes (p.ej. cloruro de benzalconio y parabenes); humectantes (p.ej. glicerina, propilenglicol y urea); mejoradores de la penetraci´on (p.ej. propilenglicol, R , y trietanolamina); y perfumes y agentes protectores de la piel. DMSO, Azone La formulaci´ on de las composiciones mencionadas anteriormente ser´a bien conocida para los expertos en la t´ecnica de la formulaci´ on farmac´eutica. Rese˜ nas espec´ıficas para formular la composici´ on se pueden encontrar en “Remington’s Pharmaceutical Sciences”(edici´ on 16a¯ (1980), Mack Publishing Company, Easton, EE.UU.). Dosificaci´ on El intervalo de dosificaci´ on terap´eutico para las giberelinas terap´euticamente activas depender´a de cierto n´ umero de factores tales como la edad y el peso del paciente y la condici´on particular que se trata, as´ı como de la giberelina espec´ıfica seleccionada.

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Una forma de dosis unitaria, tal como una tableta o una c´ apsula, comprende por lo general aproximadamente 10 µg-5 mg del compuesto activo de la invenci´on, en particular aproximadamente 100-500 µg. La dosis diaria tal como se emplea para el tratamiento de un adulto humano que pese aproximadamente 70 kg estar´a comprendida preferiblemente entre aproximadamente 50 y aproximadamente 1000 µg al d´ıa, de manera muy preferible desde aproximadamente 100 a 500 µg al d´ıa y puede administrarse en aproximadamente 1-3 dosis al d´ıa dependiendo de la v´ıa de administraci´on y de la condici´ on que se est´e tratando. Una dosis eficaz para tratar la prostatitis, en particular para inhibir y reducir la hipertrofia y el adenoma hiperpl´ astico en la pr´ ostata de los varones humanos es aproximadamente 100-500 µg de las giberelinas, precursores de giberelinas o conjugados de giberelina al d´ıa durante un per´ıodo de tres semanas. Las giberelinas m´as eficaces para el tratamiento de la hipertrofia y el adenoma hiperpl´ astico en la pr´ ostata son giberelinas C-19 γ-lact´onicas hidroxiladas en posici´ on 12, p.ej. GA30 , GA31 , GA33 , GA48, GA49 , GA58 , GA69, GA70 y GA71 . Otros giberelinas terap´euticamente activas son giberelinas C-19 γ-lact´onicas hidroxiladas en posici´ on 13, p.ej. GA1 , GA3 , GA5 , GA6 , GA8 , GA21, GA22 , GA29 , GA56 , GA57, GA59 , GA60 , GA67 , GA72 y giberelinas C-19 γ-lact´onicas sin grupo hidroxilo alguno o con un grupo hidroxilo en posici´ on 3, p.ej. GA1 , GA2 , GA3 , GA4 , GA7 , GA8 , GA9 , GA26 , GA30 , GA32 , GA34 , GA35, GA47 , GA48 , GA49 , GA50 , GA54 , GA55 , GA56, GA57 , GA58 , GA68 , y GA71. Adicionalmente, preparaciones que contienen giberelinas y precursores de giberelinas tales como GA12 -aldeh´ıdo, GA12 , 12α-OH-GA12-aldeh´ıdo, 12α-OH-GA12 , 12α-OH-GA14, 12α-OH-GA15, 12α-OH-GA37, GA53 y GA19 son terap´euticamente activas. La composici´on farmac´eutica de acuerdo con la invenci´ on se puede administrar en combinaci´ on con otros agentes terap´euticos.

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En el caso de que la giberelina utilizada se origine de la extracci´ on de polen, la composici´on de la invenci´on contiene m´as de 10 µg de giberelina por gramo de materia seca en el extracto obtenido. Los modos o´ptimos de la invenci´ on conocidos en la fecha de prioridad se representan por el ejemplo 5.

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Mecanismo de acci´ on Si bien no se desea quedar ligados a teor´ıa particular alguna, se cree que las giberelinas act´ uan como 7

ES 2 087 279 T3 se describe en lo que sigue.

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Se cree que la acci´on de las giberelinas, precursores de giberelinas y conjugados de giberelinas depende principalmente de su acci´on semejante a los esteroides. Aunque no son estructuralmente semejantes a los esteroides, se cree que su acci´on fisiol´ ogica es semejante a la de los esteroides. La actividad de los conjugados de giberelina depende de una hidr´ olisis para liberar giberelinas. La hidr´ olisis es producida por escisi´on enzim´atica mediante p.ej. glucosidasa o bien por valores de pH extremos. Se propone el modelo siguiente para explicar la acci´ on de las giberelinas y los precursores de giberelinas sobre la prostatitis. El modelo proporciona tambi´en una explicaci´ on del efecto anab´ olico y acrecentador de la l´ıbido de las giberelinas y los precursores de giberelinas. Las giberelinas y los precursores de giberelinas tienen una semejanza estructural con la testosterona y por consiguiente se fijan a los receptores de testosterona. El complejo giberelina o precursor de giberelina-receptor es funcionalmente similar al complejo testosterona-receptor de testosterona. Los efectos fisiol´ogicos ejercidos por la testosterona son por consiguiente imitados por las giberelinas y los precursores de giberelinas. El efecto sobre la hiperplasia o el crecimiento hipertr´ ofico de las gl´ andulas prost´ aticas es tambi´en resultado de la actividad semejante a la testosterona. En este caso, se cree que las giberelinas o precursores de giberelinas se fijan a la enzima 5-α-reductasa, que convierte normalmente la testosterona en dihidrotestosterona. La dihidrotestosterona se sintetiza normalmente a partir de la testosterona en la pr´ ostata, as´ı como en otros tejidos diana, y causa la dilataci´ on de la pr´ ostata. Si la concentraci´on de giberelinas o precursores de giberelinas en la pr´ostata es suficientemente alta, la 5-α-reductasa puede ser bloqueada por las giberelinas o los precursores de giberelinas. Esto produce una disminuci´ on en la cantidad de dihidrotestosterona y subsiguientemente produce tambi´en una dilataci´on reducida de la pr´ ostata. Las giberelinas y los precursores de giberelinas son tambi´en claramente antiflog´ısticos en su acci´on. Se observ´o una disminuci´ on del hinchamiento de la pr´ ostata tan pronto como 4 horas despu´es de la adon rectal en un paciente var´on que padec´ıa adenoma ministraci´ on de 1 mg de giberelina GA4 por palpaci´ hiperpl´ astico de la pr´ ostata. El efecto antiflog´ıstico es debido probablemente a una acci´on semejante a los glucocorticoides de las giberelinas o los precursores de giberelinas. Se cree que la inflamaci´ on local disminuida en la pr´ ostata se debe parcialmente a la inhibici´ on de la fosfolipasa por GA4 , que da como resultado una menor liberaci´on de a´cido araquid´ onico a partir de los fosfol´ıpidos. Esto dar´ a como resultado, a su vez, una formaci´ on disminuida de leucotrienos, tromboxanos, prostaglandinas y prostaciclina. Se cree tambi´en que las giberelinas o los precursores de giberelinas estabilizan las membranas lisos´omicas e inhiben las enzimas lisos´omicas, dando como resultado una estabilidad incrementada de los lisosomas. Se ha demostrado tambi´en que la acci´on de las giberelinas, los precursores de giberelinas y los conjugados de giberelinas tiene un car´ acter inmunoactivador, dado que las cantidades de anticuerpos no espec´ıficos aumentan despu´es de la administraci´on. La invenci´on se ilustrar´a adicionalmente por los ejemplos no limitantes siguientes.

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Ejemplo 1 Aislamiento de precursores de giberelinas, giberelinas y conjugados de giberelinas a partir de polen de diferentes especies, semillas de calabaza (Cucurbita maxima L.), frutos de Sabal serrulata (M¨ unch.) Benth. y Hook y el gel parenquimatoso de Aloe barbadensis Mill.

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a) Extracci´ on y purificaci´ on de precursores de giberelinas, giberelinas y sus conjugados Se homogeneiz´ o polen procedente de diversas especies vegetales (Secale cereale, Zea mays, Alnus incana, Pinus sylvestris, Picea abies), semillas de Cucurbita maxima, gel de Aloe barbadensis o frutos de Sabal serrulata en 10 ml de etanol (EtOH) por g (peso en fresco) de material vegetal. La muestra se extrajo en la oscuridad a 4◦ C con agitaci´on continua durante 2 h. Despu´es de filtrar a trav´es de un filtro Whatman OOH, los restos de tejido se lavaron con 200 ml de EtOH de nuevo aporte. Se a˜ nadieron 10 ml de tamp´ on de fosfato de sodio 0,5 M, pH 8,0, al EtOH reunido, y se evapor´ o a sequedad el EtOH a o a un volumen de aproximadamente 10 ml con agua y presi´on reducida a 40◦ C. El residuo acuoso se ajust´ el pH se ajust´o a 8,0 con NaOH o HCl. El extracto se aplic´o a una columna de 300 x 20 mm de di´ ametro interior (d.i.) que se rellen´o con poli-N-vinilpolipirrolidona insoluble, y se eluy´ o con tamp´ on de fosfato de sodio 0,1 M, pH 8,0. Se recogi´ o la fracci´ on de 0-200 ml, se acidific´o a pH 2,7 con HCl 6 M y se extrajo cinco veces con 100 ml de acetato de etilo (EtOAc). Despu´es de extracci´on con EtOAc, se extrajo la fase de tamp´on cinco veces con 100 ml de n-butanol (n-BuOH) saturado con agua. Los extractos de EtOAc 8

ES 2 087 279 T3 acidos que conten´ıan las giberelinas libres se reunieron y se separ´o el agua por congelaci´ ´ on y filtraci´ on. Se evapor´ o el EtOAc a sequedad a presi´ on reducida a 40◦ C. Las fracciones de n-butanol a´cidas que conten´ıan las giberelinas conjugadas se reunieron y se evapor´ o el disolvente a sequedad a presi´on reducida a 70◦ C. 5

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b) Cromatograf´ıa l´ıquida de alta resoluci´ on (HPLC) Los extractos de EtOAc a´cidos y los extractos de n-BuOH a´cidos se purificaron ulteriormente utilizando un sistema de HPLC en fase inversa constituido por dos bombas Waters M501 (Millipore AB, Vstra Fr¨olunda, Suecia) conectadas a una columna de acero de 10 mm (d.i.) x 250 mm rellena con R C18 de 5 mm (Skandinaviska Genetec AB, Kungsbacka, Suecia). Las bombas se controlaron Polygosil por un controlador de sistema Waters M680 y el inyector era un Waters U6K. La fase m´ovil estaba constituida por un gradiente lineal de agua y a´cido ac´etico (99:1, vol/vol) a metanol (MeOH) y a´cido ac´etico (99:1, vol/vol). El tiempo de barrido en gradiente fue 60 min y el caudal fue 1 ml.min−1. Se recogieron 60 fracciones de 1 ml y se evaporaron en un Concentrador Savant Speed Vac (Tectum Instruments, Umeρ, Suecia). Cada una de estas fracciones se disolvi´o en 50 µl de etanol al 95% y se ensay´ o en partes al´ıcuotas 1/100 respecto a actividad semejante a GA con el bioensayo de la microgota en arroz enano Tan-ginbozu (Murakami, 1968, Bot. Mag. 81: 33), que se modific´ o por el uso de microgotas de 0,5 µl. La parte restante de las fracciones que exhib´ıan actividad biol´ ogica se purific´ o ulteriormente por HPLC anal´ıtica en fase normal. Este sistema estaba constituido por el mismo equipo Waters que se ha R NO2 descrito anteriormente con una columna de 150 mm x 4,6 mm (d.i.) rellena con 5 mm de Nucleosil (Skandinaviska Genetec AB, Kungsbacka, Suecia) que formaba la fase estacionaria. La fase m´ ovil era un gradiente lineal de n-heptano semi-saturado con ´acido f´ ormico 0,5 M en agua a EtOAc-agua-´ acido f´ ormico (98,5:1:0,5, vol/vol). El tiempo de barrido en gradiente fue 60 min y el caudal fue 2 ml.min−1. Se recogieron 60 fracciones de 2 ml, se evaporaron en el Concentrador Speed Vac, y se ensay´ o la actividad semejante a GA utilizando el bioensayo del arroz enano Tan-Ginbozu (Murakami, 1968). La identidad de las diferentes giberelinas que se detectaron se esclareci´o por cromatograf´ıa de gases y espectrometr´ıa de masas como se describe a continuaci´on. c) Cromatograf´ıa de gases y espectrometr´ıa de masas Las muestras destinadas al an´ alisis por cromatograf´ıa de gases y espectrometr´ıa de masas se metilaron con diazometano et´ereo. Despu´es de la evaporaci´on, se a˜ nadieron a cada muestra 50 µl de N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida con 1% de trimetilclorosilano, y las mezclas se calentaron a 90◦C durante 30 min. Despu´es de la evaporaci´on, las muestras metiladas y trimetilsililadas se disolvieron en heptano y se inyectaron sin separaci´on en una columna capilar de s´ılice fundida, con fase unida qu´ımicamente SE-30, de 25 m de longitud, 0,25 mm d.i. y 0,25 µm de espesor de pel´ıcula (Quadrex Co., EE.UU.) conectada a un Detector Selectivo de Masas Hewlett Packard 5970B y un equipo Hewlett Packard 59970B Workstation (Hewlett Packard, Spρnga, Suecia). En los casos en que se sospechaba que el compuesto era u ´ nicamente un ´ester met´ılico, el disolvente empleado fue metanol. La temperatura de inyecci´on fue de 230◦C. La temperatura de la columna se mantuvo a 60◦ C durante 1 min, y se increment´o luego en 20◦ C min−1 hasta 200◦ C seguido por un aumento de 4◦ C min−1 hasta 250◦C. El efluente de la columna se condujo a la fuente de iones con una temperatura de interfase de 275◦C. La energ´ıa de los electrones era 70 eV. Los espectros de impacto de electrones de las fracciones extra´ıdas se registraron y se compararon con espectros de patrones. Las muestras y los patrones se co-inyectaron tambi´en con n-alcanos C23 -C28 (Gaskin et al., 1971, Phytochemistry 10:1155). Se realiz´o una regresi´on lineal entre el tiempo de retenci´on y el n´ umero de a´tomos de carbono. Los ´ındices de retenci´ on Kovats (Kovats, 1959, Helv. Chim. Acta 41:1915) se calcularon por conversi´on de los tiempos de retenci´ on en n´ umero de carbonos y multiplicando finalmente este valor por 100. d) Cristalizaci´ on

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Los precursores de giberelinas, las giberelinas y los conjugados de giberelinas purificados de la manera anterior se disolvieron en una peque˜ na cantidad de ciclohexano, se cristalizaron a -20◦ C y se utilizaron en ensayos terap´euticos como se describe m´as adelante. De esta manera, se obtuvieron GA1 , GA3 , GA9 , GA19, GA20 y GA53 a partir de las preparaciones de polen, GA30 a partir de la semilla de calabaza Cucurbita maxima L.), GA3 y GA7 a partir del Aloe gel y GA12 -aldeh´ıdo a partir de la palma enana (Sabal serrulata). Comentarios a la extracci´ on con etanol La extracci´on de polen con etanol da como resultado un alto rendimiento de giberelinas fi-

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siol´ogicamente activas. La extracci´on con etanol es ventajosa tambi´en, debido a que los compuestos de pesos moleculares m´as altos, como prote´ınas, hidratos de carbono complejos y aminoaz´ ucares no son extra´ıdos eficientemente. Dado que el extracto se filtra tambi´en a trav´es de un filtro de 45 µm y un filtro de 10.000 Dalton, los tama˜ nos moleculares de los compuestos en el extracto est´an limitados. Esto hace que el extracto sea menos alerg´enico y tambi´en m´as concentrado en los compuestos activos, giberelinas, en comparaci´ on con la extracci´on en medios acuosos. El contenido de materia seca despu´es de la extracci´on del polen con etanol es aproximadamente 10% en comparaci´ on con un contenido de materia seca de aproximadamente 30-50% en el caso de la extracci´on con agua. La degradaci´ on de las giberelinas por procesos enzim´aticos en medios acuosos puede ser altamente significativa. Esta degradaci´on se reduce cuando se utiliza etanol como disolvente, dado que las enzimas se precipitan. Por estas razones, un extracto en etanol contendr´ a, cuando se prepara correctamente, 10-100 veces m´as compuestos activos, giberelinas, por unidad de masa de extracto, es decir el contenido de materia seca de un extracto en etanol contendr´ a 10 µg/g o m´as, normalmente 10-1000 µg/g. Una manipulaci´on optimizada del polen antes de la extracci´on puede aumentar adicionalmente la concentraci´on de compuestos activos en el extracto final. Ejemplo 2

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S´ıntesis de giberelinas por los hongos Gibberella fujikuroi (Saw.) Woll o la forma asexual Fusarium moniliforme (Sheld.) Winel. Se produjeron precursores de giberelinas, giberelinas y sus conjugados por cultivo del hongo Gibberella fujikuroi (Saw.) Woll o la forma asexual Fusarium moniliforme (Sheld. ) Winel, los dos cuales se a´ıslan a partir del suelo. Cepas diferentes del hongo seleccionado para una producci´ on elevada de precursores de giberelinas, giberelinas y sus conjugados se mantuvieron a 4◦ C en un medio que conten´ıa 20 g de agar, 5 g de glucosa, 100 ml de jugo de patata y 900 ml de agua. El medio se trat´ o en autoclave y el hongo se inocul´ o y se desarroll´o durante 10-14 d´ıas a 28◦ C. El hongo puede almacenarse luego a 4◦ C durante aproximadamente 2 meses. La producci´ on de giberelinas se inici´o inoculando el hongo en un medio de precultivo que conten´ıa 200 g de sacarosa, 15 g de hidrogenocitrato diam´onico, 1 g de Ca(NO3 )2 .4H2 O, 0,25 g de KH2 PO4 , 0,3 g de MgSO4 .7H2 O, 0,01 g de FeSO4 .7H2 O, 0,03 g de ZnSO4 .7H2 O, 0,1 g de KCl y 1000 ml de agua destilada. El medio se trat´ o en autoclave antes de su empleo. Se inocul´o 1 gramo del hongo tomado del medio de almacenamiento y se desarroll´ o en 100 ml del medio de precultivo a 28◦C durante 3-4 d´ıas. Se separ´ o luego el micelio por filtraci´ on, se lav´o con agua destilada y se disgreg´ o suavemente por medios mec´anicos en fragmentos m´ as peque˜ nos con un mortero. El hongo se inocul´ o luego en un medio constituido por 50 g de glucosa, 1,2 g de NH4 NO3 , 5 g de KH2 PO4 , 1 g de MgSO4 .7H2 O y 2 ml de una soluci´ on de elementos traza constituida por 1 g de FeSO4 .7H2 O, 88 mg de Na2 B4 O7 .6H2 O, 392 mg de CuSO4 .5H2 O, 72 mg de MnCl2 .H2 O, 37 mg de (NH4 )6 Mo7 O24 .4H2 O y 2,2 mg de ZnSO4 .7H2 O por 1000 ml de agua destilada. La mezcla se ajust´ o a un volumen de 1000 ml con agua destilada y se ajust´ o a un pH de 4,5 con HCl o NaOH. El hongo se desarroll´ o en un aparato de sacudidas durante 10 d´ıas a 28◦ C. Los precursores de giberelinas, las giberelinas y sus conjugados se aislaron luego a partir del medio por el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Ejemplo 3

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Mutaci´on y selecci´on de cepas de Gibberella fujikuroi (Saw.) Woll altamente productoras de giberelinas Se aislaron cepas altamente productoras de giberelinas GA1 , GA3 , GA4 , GA9 , GA7 y GA20, despu´es de mutaci´ on de los protoplastos f´ ungicos con N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), por escrutinio con anticuerpos espec´ıficos de giberelinas.

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Producci´ on de protoplastos Se aisl´o el micelio f´ ungico a partir de un medio de precultivo (v´ease Ejemplo 2) por filtraci´ on y se incub´ o en 10 ml de una preparaci´ on de enzimas l´ıticas constituida por 20 µg por ml de Cellulase “Onozuka R-10” (Tricoderma viride) 1,3 U/mg (Serva, Alemania Occidental, documento EC 3.2.1.4) y 5 µg por ml de Driselase 26,5 U/mg (Fluka, Suiza). Las enzimas se disolvieron en una soluci´on 0,7 M de MgSO4 como estabilizador osm´otico y el micelio se trat´o durante 4 horas a 32◦C con agitaci´on alternativa. Despu´es de la incubaci´ on, la soluci´ on de protoplastos se filtr´ o a trav´es de lana de vidrio y se centrifug´ o a 500 x g o durante 10 minutos. El sedimento de protoplastos se lav´ o luego con 10 ml de MgSO4 0,7 M y se centrifug´ a 500 x g durante 10 minutos. El sedimento se suspendi´ o luego en 10 ml de soluci´on 0,7 M de MgSO4 que conten´ıa 0,1 mg de N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG, Aldrich, Alemania Occidental). Despu´es de incubaci´on durante una hora a la temperatura ambiente, los protoplastos se centrifugaron a 500 x g durante 10 minutos. Se desech´ o el sobrenadante y el sedimento se lav´ o con 10 ml de MgSO4 10

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0,7 M y se centrifug´ o a 500 x g durante 10 minutos. El procedimiento de lavado se repiti´ o cinco veces. Los protoplastos se diluyeron y se extendieron en placas sobre un medio s´olido que conten´ıa 2 g de agar, 0,5 g de glucosa y 10 ml de jugo de patata por 100 ml de agua. Se a˜ nadi´ o manitol 0,7 M al medio como estabilizador osm´otico. Se incubaron las placas a 28◦C durante 7 d´ıas y los protoplastos regenerados se aislaron y se suspendieron en 0,2 ml de un medio de producci´ on constituido por 50 g de glucosa, 1,2 g de NH4 NO3 , 5 g de KH2 PO4 , 1 g de MgSO4 .7H2 O y 2 ml de la soluci´on de elementos traza del Ejemplo 2. La mezcla se ajust´o a un volumen de 1000 ml con agua destilada y se ajust´ o a pH 4,5. El hongo se desarroll´o en los pocillos de una placa de microtitulaci´ on durante 7 d´ıas a 28◦C. El medio se ensay´o despu´es de ello respecto a actividad de fijaci´on de giberelina en radioinmunoensayos utilizando anticuerpos contra GA1 , GA3 , GA4 , GA7 , GA9 y GA20. Radioinmunoensayos

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umina de bovino de acuerdo Se realiz´ o la conjugaci´ on de GA1 , GA3 , GA4 , GA7 , GA9 y GA20 a sero-alb´ con Weiler y Wieczorek (1981, Planta 152: 159). Se realizaron inmunizaciones de conejos y producci´ on de antisueros por Dakopatts, Copenhagen, Dinamarca. Las propiedades de fijaci´ on de estos anticuerpos policlonales se ensayaron antes de su empleo. Las muestras y los patrones se metilaron con diazometano et´ereo antes del radioinmunoensayo (RIA). Las mezclas de ensayo estaban constituidas por 300 µl de soluci´on salina tamponada con fosfato (PBS), pH 8,0 (fosfato 0,01 M y NaCl 0,15 M) m´ as 100 µl de patr´ on as metilado (GA1 , GA4 o GA20 ), muestras metiladas o muestras en blanco metiladas en tamp´on PBS m´ aproximadamente 100 Bq de trazador metilado en 100 µl de tamp´ on PBS ([1,2-3H]GA20, 1,1 TBq/milimol, [1,2- 3 H]GA4 , 37 GBq/milimol, [2,3-3H]GA9 , 1,7 TBq/milimol, [1,2-3H]GA20 , 1,1 TBq/milimol) m´as 100 µl de suero. La fijaci´ on no espec´ıfica se determin´o por exclusi´on del suero. Los contenidos de los viales se mezclaron y se incubaron durante 2 h. Se a˜ nadieron 0,6 ml de una soluci´ on saturada de sulfato de amonio a los viales y, despu´es de centrifugaci´on durante 0,5 h a 2000 x g, se desecharon los sobrenadantes, se dispersaron los sedimentos en 100 µl de agua, se a˜ nadi´ o 1 ml de escintilador l´ıquido Miniria 20, y se determin´o la radiactividad por espectrometr´ıa de centelleo de l´ıquido. La actividad de fijaci´ on de anticuerpos de las fracciones del extracto se calcul´o utilizando la f´ ormula (B-N)/(B0 -N)V x 100, donde B es la fijaci´on del trazador en presencia de patr´ on o muestras, B0 es la fijaci´on de trazador en ausencia de patr´ on o muestra y N es la fijaci´ on no espec´ıfica. Las colonias que produc´ıan sustancias inhibidoras de la fijaci´ on en cualquiera de los radioinmunoensayos se aislaron y se desarrollaron en un volumen mayor de medio de pre-cultivo, se transfirieron al medio de producci´ on, y se extrajeron y aislaron las giberelinas como se describe en el Ejemplo 1. Las giberelinas se separaron por HPLC y se identificaron por cromatograf´ıa de gases y espectrometr´ıa de masas. Ejemplo 4

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S´ıntesis qu´ımica de giberelinas La giberelina GA3 comercialmente asequible puede utilizarse como el material de partida para la producci´ on de GA1 , 3-oxo-GA1, 3-oxo-GA3, GA4 , GA5 y GA20 . se metil´o inicialmente GA3 con diazometano en ´eter (Schlenk y Gellerman, 1960, Analytical Chemistry 32: 1412). El enlace doble 1,2 en o luego con paladio al 2% sobre carbonato de bario en acetato de etilo y piridina GA3 -Me se hidrogen´ (Jones y McCloskey, 1963, J. Appl. Chem. 13: 324) obteni´endose GA1 -Me. El enlace del ´ester met´ılico se hidroliz´ o luego en hidr´ oxido de potasio 0,5 M a 70◦C durante 2 horas, obteni´endose GA1 . El grupo 3β-hidroxi de GA3 -Me puede oxidarse tambi´en con manganato de bario en cloruro de metileno durante 2 d´ıas. Esto produce 3-oxo-GA3-Me, que puede hidrogenarse ulteriormente para dar 3-oxo-GA1 con paladio al 2% sobre carbonato de bario en acetato de etilo y piridina (Jones y McCloskey, 1963). El enlace del ´ester met´ılico se hidroliz´o luego en hidr´ oxido de potasio 0,5 M a 70◦C durante 2 horas, obteni´endose nadiendo 6% 3-oxo-GA3 y 3-oxo-GA1. La GA1 -Me se puede convertir tambi´en en GA5 -Me en piridina y a˜ (peso/vol) de cloruro de tosilo. Los productos de reacci´ on se aislaron al cabo de 10 d´ıas y se separaron o en ´acido libre por hidr´ olisis en hidr´ oxido de potasio 0,5 M a 70◦C por HPLC. La GA5 -Me se convirti´ on sobre paladio al 2% durante 2 horas. La GA5 -Me se convirti´o tambi´en en GA20 -Me por hidrogenaci´ olisis en hidr´ oxido en carbonato de bario. La GA20 -Me se puede convertir luego en ´acido libre por hidr´ de potasio 0,5 M a 70◦C durante 2 horas.

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ES 2 087 279 T3 Ejemplo 5

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Tratamiento de la prostatitis, hipertrofia y adenoma hiperpl´ astico de la pr´ ostata con giberelinas GA20 y GA30 Se prepararon composiciones farmac´euticas por disoluci´on de 50 mg de cada una de las giberelinas on de esta soluci´on antes de su empleo a un volumen de 10 GA20 y GA30 en 1 ml de etanol al 95% y diluci´ ml con agua. Las giberelinas se a˜ nadieron luego a comida para ratas y se proporcionaron como alimento a ratas en cantidades de 100 µl, 20 µl, 10 µl y 2 µl. Esta dosis se administr´ o diariamente durante tres meses a ratas Wistar macho (tres ratas por dosis). Resultados

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El tratamiento de las ratas Wistar macho con 50 µg de cada una de las giberelinas GA20 y GA30 durante un per´ıodo de 3 meses dio como resultado un aumento significativo en el peso corporal de 19% comparado con los animales testigo. Los animales tratados durante 3 meses con las giberelinas GA20 y GA30 ten´ıan un peso medio de 296 gramos comparado con 249 gramos para los animales testigo. El peso de la pr´ ostata en relaci´on con el peso corporal total era significativamente menor en los animales tratados con las giberelinas de la manera descrita anteriormente. El peso de la pr´ostata en porcentaje del peso corporal total era 0,27% (672 mg) para los animales testigo y 0,18% (562 mg) para los animales tratados con las giberelinas. Cuando se trataron de la misma manera ratas castradas como animales j´ovenes, se obtuvo una respuesta similar. Las giberelinas ejercen tambi´en un efecto anab´ olico y miotr´ofico significativo sobre las ratas castradas. El tratamiento de ratas castradas con las giberelinas dio como resultado un aumento del 9% del peso corporal en comparaci´ on con animales castrados sin tratar. El peso de la pr´ ostata se incrementaba tambi´en significativamente por el tratamiento con las giberelinas. Se obtuvo un peso medio de pr´ ostata de 80 mg en los animales sin tratar, mientras que se obtuvo un peso medio de pr´ ostata de 350 mg en las ratas castradas tratadas con las giberelinas. Esto corresponde a un peso de pr´ ostata de 0,04% en relaci´on con el peso corporal total para las ratas castradas sin tratar y un peso de pr´ ostata de 0,14% en relaci´on con el peso corporal total para las ratas castradas tratadas. El crecimiento hipertr´ ofico inducido experimentalmente de la gl´ andula prost´ atica en las ratas por la dihidrotestosterona era inhibido tambi´en por las giberelinas. El tratamiento de ratas macho adultas sin castrar con una dosis diaria de 50 mg de dihidrotestosterona durante tres meses dio como resultado un crecimiento hipertr´ofico de la gl´ andula prost´ atica. El peso de la pr´ ostata era 814 mg, lo cual era equivalente a aproximadamente 0,34% del peso corporal total. Cuando las ratas recibieron simult´ aneamente una o un aumento en el peso de la pr´ ostata. dosis diaria de 100 µg de giberelinas GA20 y GA30 , no se detect´ El peso de la pr´ostata era en este caso 582 mg, lo cual era equivalente a 0,20% del peso corporal total. La hiperplasia y el crecimiento hipertr´ofico de las gl´ andulas prost´ aticas en los seres humanos varones se reduc´ıan tambi´en por tratamiento con las giberelinas GA20 y GA30 . Se administraron las sustancias por v´ıa oral en una soluci´ on diluida en etanol que conten´ıa dosis de 10 µg, 50 µg, 100 µg, 500 µg y 1 mg al d´ıa durante tres semanas. El tratamiento dio como resultado un hinchamiento reducido y un crecimiento reducido de la pr´ ostata. El tratamiento con las giberelinas dio tambi´en como resultado un ligero aumento en el peso corporal y un ligero aumento de la l´ıbido.

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ES 2 087 279 T3 REIVINDICACIONES

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1. El uso de una giberelina activa para la fabricaci´ on de una composici´ on farmac´eutica para el tratamiento de la prostatitis. 2. El uso de acuerdo con la reivindicaci´on 1 en el cual la giberelina est´a de acuerdo con la f´ormula general

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en la cual

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R1 es H o un grupo -O-R20 , donde R20 es H, o junto con R2 o R10 forma un enlace (enlace doble C1 -C2 o C1 -C10 , respectivamente); R2 es H o un grupo -O-R21 , donde R21 es H, un grupo ´eter glicos´ılico (´eter de glic´osido) o junto con R4 forma un enlace (lactona) o junto con R1 o R3 forma un enlace (enlace doble C1 -C2 o C2 -C3 , respectivamente);

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R3 es H, =O, o -O-R24 , donde R24 es H o un grupo ´eter glicos´ılico (´eter de glic´osido), o junto con R2 forma un enlace (enlace doble C2 -C3 ); R4 es OH o junto con R23 o R21 forma un enlace (lactona);

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R5 es H o -O-R22 , donde R22 es H o un grupo ´ester glicos´ılico (´ester de glic´osido); R6 es H o OH o, junto con R7 , forma un enlace (enlace doble C12 -C13 );

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R7 es H, =O, o -O-R25, donde R25 es H o un grupo ´eter glicos´ılico (´eter de glic´osido) o junto con R6 forma un enlace (enlace doble C11 -C12 ); R8 es H o -O-R26 , donde R26 es H o un grupo ´eter glicos´ılico (´eter de glic´osido);

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R9 es H o OH; R10 es H, CH3 , CHO, COOH o un ´ester glicos´ılico (´ester de glic´osido) de dicho COOH, CH2 O-R23 o -O-R23 donde R23 es H o junto con R4 forma un enlace (lactona), o junto con R1 forma un enlace (enlace doble C1 -C10 ); R11 es OH o est´a ausente;

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ES 2 087 279 T3 R12 es CH3 , CH2 OH, COOH o un ´ester glicos´ılico (´ester de glic´osido) de dicho COOH; preferiblemente como m´aximo 4 de los sustituyentes R1 , R2 , R3 , R6 , R7 , R8 , R9 y R11 son OH, y sus sales y lactonas farmac´euticamente aceptables. 5

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3. El uso de acuerdo con la reivindicaci´ on 2, en el cual (i) uno o m´ as de R21, R24 , R25 y/o R26 se seleccionan del grupo constituido por glucosa, galactosa, arabinosa y xilosa, estando unidos todos ellos glicos´ıdicamente al ´atomo de ox´ıgeno en OR21 , OR24 , OR25 o OR26 , respectivamente, de manera preferible OR21 , OR24 , OR25 y/o OR26 son /es un O-β-D-glicosidilo, preferiblemente O-β-D- glucosidilo, y/o (ii) al menos uno de R10 , R12 y COR5 es un grupo ´ester en el cual el resto alcohol se selecciona entre los glicosidilos, tal como O-α-D-glucosidilo, O-β-D-galactosidilo, O-α-L-arabinosidilo y O-βD-xilosidilo, preferiblemente en COR5 .

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4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-3, en el cual la giberelina se selecciona del grupo constituido por GA1 -3-O-β-D-gluc´osido, GA1 -13-O-β-D-gluc´osido, GA3 -3-O-β-D-gluc´osido, GA3 -13-O-β-D-gluc´osido, GA3 -3,13-di-O-β-D-gluc´osido, GA4 -3-O-β-D-gluc´osido, GA7 -3-O-β-D-gluc´osido, GA19 -13-O-β-D-gluc´osido, GA20 -13-O-β-D-gluc´osido, GA30-12-O-β-D-gluc´osido y GA53 -13-O-β-D-gluc´ osido, y giberelin-D-glucosidil-´esteres de GA1 , GA3 , GA4 , GA7 , GA9 , GA19 , GA20 , GA30 y GA53 (GA1 -D-glucosil-´ester, GA3 -D-glucosil-´ester, GA4 -G-glucosil-´ester, GA7 -D-glucosil-´ester, GA9 -D-glucosil-´ester, GA19 -D-glucosil-´ester, GA20 -D-glucosil-´ester, GA30 -D-glucosil-´ester y GA53-D-glucosil-´ester). 5. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el cual R7 es OH; y R10 es -O-R23 , donde R23 junto con R4 forma un enlace (lactona), preferiblemente R1 y R2 forman juntos un enlace, o R2 y R3 forman juntos un enlace. 6. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el cual R8 es OH; y R10 es -O-R23 , donde R23 junto con R4 forma un enlace (lactona), preferiblemente R1 y R2 forman juntos un enlace; o R2 y R3 forman juntos un enlace. 7. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el cual R10 es -O-R23 , donde R23 junto con R4 forma un enlace (lactona), preferiblemente R1 y R2 forman juntos un enlace, o R2 y R3 forman juntos un enlace.

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8. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, en el cual R7 es H o OH, preferiblemente R1 es H; R2 es H; y R3 es H o OH.

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9. El uso de una giberelina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el cual R11 est´a ausente; y R12 es CH3 , preferiblemente R10 y R1 forman juntos un enlace, o R1 y R2 forman juntos un enlace; o R2 y R3 forman juntos un enlace.

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10. El uso de acuerdo con una reivindicaci´ on anterior, en el cual el compuesto se selecciona del grupo de giberelinas constituido por GA1 , 3-oxo-GA1, GA2 , GA3 , 3-oxo-GA3, GA4 , GA5 , GA6 , GA7 , GA8 , GA9 , GA12 -aldeh´ıdo, GA12, 12α-OH-GA12, 12α-OH-GA14 , GA14 -aldeh´ıdo, GA14 , GA15 , 12α-OH-GA15, GA18, GA18 -aldeh´ıdo, GA19 , GA20 , GA21 , GA22 , GA23 , GA24 , GA26 , GA30, GA31 , GA32 , GA33 , GA34 , GA35, GA36 , 12α-OH-GA37, GA37 , GA38, GA44 , GA47 , GA48 , GA49 , GA50 , GA53-aldeh´ıdo, GA53 , GA54 , GA55, GA56 , GA57 , GA58 , GA59, GA60 , GA67 , GA68 , GA69, GA70 , GA71 y GA72.

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11. El uso de acuerdo con una reivindicaci´ on anterior, en el cual el compuesto se selecciona del grupo de giberelinas constituido por GA1 , GA3 , GA4 , GA9 , GA19 , GA20, GA53 y GA12 n-aldeh´ıdo.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales.

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Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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