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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 241 670

51 Int. Cl. : A61K 31/352

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A61K 35/78 A61P 35/00 A61P 25/00

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 00976087 .7

86 Fecha de presentación : 22.11.2000

87 Número de publicación de la solicitud: 1177790

87 Fecha de publicación de la solicitud: 06.02.2002

54 Título: Terapia con cannabinoides para el tratamiento de tumores cerebrales.

30 Prioridad: 11.02.2000 ES 200000323

73 Titular/es: Universidad Complutense de Madrid

Rectorado, Avenida de Séneca, 2 28040 Madrid, ES

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

01.11.2005

72 Inventor/es: Guzmán Pastor, Manuel;

Sánchez García, Cristina y Galve Roperh, Ismael

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Carpintero López, Francisco

ES 2 241 670 T3

01.11.2005

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 241 670 T3 DESCRIPCIÓN Terapia con cannabinoides para el tratamiento de tumores cerebrales. 5

Campo técnico de la invención La presente invención se encuadra en el campo de la terapia de tumores cerebrales (glioblastomas). Objetivo de la invención

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La presente invención, según se recoge en esta memoria descriptiva, se refiere a la utilización terapéutica de los compuestos cannabinoides para el tratamiento de tumores cerebrales. Las terapias utilizadas hoy en día para el tratamiento de estos tumores (cirugía, radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia, terapia génica) son generalmente ineficaces o a lo sumo paliativas. La invención supone una aproximación técnicamente simple, carente de efectos secundarios notorios y altamente eficaz en el tratamiento de tumores cerebrales, incluidos los más malignos (glioblastomas). Antecedentes

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Dentro de los tumores cerebrales que afectan a los seres humanos, los glioblastomas son los más frecuentes (1 por 50.000 personas y año), malignos (mortalidad cercana al 100%) y de evolución más rápida (esperanza de vida de semanas/meses tras su diagnóstico). Hoy en día, el tratamiento de los glioblastomas suele ser ineficaz o meramente paliativo, e implica técnicas tales como cirugía, radioterapia, quimioterapia e inmunoterapia (Louis, D.N. & Gusella, J.F., Trends Gener. 11, 412-415. 1995; Avgeropoulos, N.G. & Batchelor, T.T., Oncologist 4, 209-224, 1999). Además, la terapia génica ha comenzado a ser empleada como tratamiento experimental de los glioblastomas, aunque hasta ahora ha proporcionado escasos resultados positivos (Martuza, R.L., Nature Med. 3, 1323, 1997). La improbabilidad de éxito de estas aproximaciones terapéuticas puede complicarse además por factores como el crecimiento rápido, la gran heterogeneidad, el alto nivel de infiltración y la extrema resistencia a quimioterapia exhibida por los glioblastomas (Maintz, D. y col., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 56, 1098-1104, 1997 ; Mason, W., Louis, D.N. & Cairncross, J.G., J. Clin. Oncol. 15, 3423-3426 ; 1997 ; Martruza, op. cit.; Avegeropoulos & Batchelor, op. cit.). Por lo tanto sería muy deseable desarrollar alternativas terapéuticas novedosas para el tratamiento de tumores cerebrales. Los cannabinoides son compuestos llamados así por la planta que los sintetiza, Cannabis sativa L. Estos compuestos, entre los que el ∆9 -tetrahidrocannabinol (THC) destaca por sus elevadas potencia y abundancia, son responsables de los efectos centrales y periféricos del consumo de marihuana (Pertwee, R.G. Pharmacol. Ther. 74, 129-180, 1997; Felder, C.C. & Glass, M., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 38, 179-200, 1998). Los cannabinoides de C. sativa (Fig. 1) llevan a cabos sus efectos debido a que son similares a determinadas moléculas producidas por los animales (incluidos los humanos) que probablemente desempeñan funciones importantes en el sistema nervioso. Estas moléculas se denominan por lo tanto cannabinoides endógenos o endocannabinoides, y la anandamida (=araquidonoiletanolamida) es el más representativo (Di Marzo, V., Melck, D., Bisogno, T. & De Petrocellis, L., Trends Neurosci. 21, 521-528, 1998; Martín, B.R., Mechoulam, R. & Razdan, R.K., Life Sci. 65, 573-595, 1999). Además, se han obtenido en el laboratorio compuestos que mimetizan la acción de los cannabinoides naturales pero con una potencia mucho más elevada. Éstos se conocen como cannabinoides sintéticos, uno de cuyos representantes es el WIN-55.212-2 (Fig. 2) (Pertwee, op. cit.; Barth, F., Expert Opin. Ther. Patents, 8, 301-313, 1998). Tanto los cannabinoides naturales como los sintéticos actúan mediante su unión a receptores específicos de membrana (receptores de cannabinoides o de tipo CB), de los cuales se conocen hoy en día dos subtipos diferentes: CB1 y CB2 . (Pertwee, op. cit.; Howlett, A. y col., en: The IUPHAR Compendium of Receptor Characterization and Classification, eds. Godfraind, T., Humphrey, P., Ruffolo, R. & Vanhoutte, P. IUPHAR Media, pp. 97-104, 1998). No todos los tejidos del organismo poseen estos receptores: se localizan principalmente en el sistema nervioso, y así los efectos de los cannabinoides están principalmente en el cerebro (Pertwee, op. cit.; Childers, S.R. & Breivogel, C. S., Drug Alcohol Depen. 51, 173-187, 1998).

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Existe actualmente un gran número de estudios acerca de las posibles aplicaciones terapéuticas de los cannabinoides. Es más en el Reino Unido y en diversos estados de los Estados Unidos los médicos prescribir THC o determinados cannabinoides sintéticos como estimulantes del apetito e inhibidores del vómito en pacientes con SIDA o cáncer tratados crónicamente con quimioterapia (Grinspoon, L. & Bakalar, J.B., JAMA 273, 1875-1876, 1995; Voth, E. & Schwartz, R., Ann. Intern. Med. 126, 791-798, 1997). Entre los usos terapéuticos potenciales de los cannabinoides se pueden mencionar los siguientes: (a) como agentes analgésicos se ha demostrado que actúan de forma altamente eficaz en aliviar dolor agudo y crónico; (b) como agentes que reducen la actividad motora se están probando hoy en día en el tratamiento de los trastornos asociados a la enfermedad de Parkinson, la corea de Huntington y las esclerosis múltiple; (c) como agentes anticonvulsivantes se estudia su aplicación en el tratamiento de la epilepsia; (d) como agentes que disminuyen la presión intraocular podrían utilizarse en el tratamiento del glaucoma (Voth y Schwartz, op. cit.; Manzanares, J. y col., Trends Pharmacol. Sci., 20, 287-294; 1999; Pop, E., Curr. Opin. CPNS Invest. Drugs 1, 587-596, 1999; Sanudo-Pena, M.C., Tsou, K. & Walker, J.M., Life Sci. 65, 703-713, 1999). Algunos de estos usos terapéuticos de los compuestos cannabinoides ya han sido patentados (ver ejemplo US4189491, US6939429, WO9711668, WO9832441 y WO9957105).

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Uno de los efectos más intrigantes e inexplorados de los cannabinoides es su capacidad para inhibir el crecimiento de células transformadas in vitro. Así, se ha demostrado que diversos cannabinoides inhiben la proliferación de células de tumor de mama MCF-7 (De Petrocellis, L. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8375-8380, 1998), de células de 2

ES 2 241 670 T3 glioblastoma C6 (Sánchez, C., Galve-Roperh, I., Canova, C. Brachet, P. & Guzmán, M. FEBS Left. 436, 6-10, 1998) y de células de tumor de próstata PC-3 (Ruiz, L., Miguel, A. & Díaz-Laviada, I., FEBS Lett. 458, 400-404, 1999). Sin embargo, estos hallazgos en sistemas de cultivo celular no se han observado nunca antes in vivo, así que su significado biomédico es desconocido. 5

Descripción de la invención

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La presente invención hace un uso novedoso de los cannabinoides para el tratamiento de tumores cerebrales, y se basa en nuestras observaciones originales de regresiones marcadas inducidas por cannabinoides (que implican un alargamiento de la vida) e incluso la erradicación inducida por cannabinoides (que implican la curación) de glioblastomas en animales de laboratorio. Esta invención implica la utilización de una terapia técnicamente simple carente de efectos secundarios notorios, y más significativamente muy efectiva para el tratamiento de tumores cerebrales, los cuales como se mencionó anteriormente no se pueden tratar hoy en día de manera satisfactoria mediante otras técnicas o compuestos. Los experimentos que han conducido a la presente invención se describen a continuación.

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Acción antitumoral de los cannabinoides en ratas

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La inyección de células de glioblastoma C6 en un cerebro de rata se utiliza ampliamente como modelo experimental de tumor cerebral maligno (Barth, R.F., J. Neurooncol. 36, 91-102, 1998). Se inocularon células de glioblastoma C6 directamente en el cerebro de ratas Wistar, y los tumores se visualizaron mediante resonancia magnética. Todos los animales dejados sin tratar murieron uniformemente 12-18 días después de la inoculación con las células (Fig. 3a). Para evaluar el potencial antitumoral de los cannabinoides, 12 días después de la inoculación de las células se administró a un grupo de animales durante 7 días THC o WIN-55.212-2 a través de una cánula localizada en el sitio de inoculación. Los animales tratados con cannabinoides tuvieron una vida significativamente más larga que los animales control (Fig. 3a). Así, la administración de cannabinoides consiguió el tiempo de supervivencia a 19-35 días en 9/15 animales (tratamiento con THC) o a 19-43 en 4/15 animales (tratamiento con WIN-55.212-2). Es más, los cannabinoides erradicaron completamente el tumor en 3/15 animales (tratamiento con THC) o en 5/15 animales (tratamiento con WIN-55.212-2). La Fig. 3b muestra una imagen de resonancia magnética de uno de los animales curados con THC; tras la administración del cannabinoide la masa tumoral desaparecía completamente, y en su lugar se podía ver una zona hipointensa residual interpretada como una cicatriz fibrosa en el sitio de inoculación. No se observó recurrencia alguna en los 8 animales curados con cannabinoides. Acción de los cannabinoides en ratones inmunodeficientes

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Con el fin de discernir si la acción antiproliferativa de los cannabinoides se debe a un efecto directo sobre las células tumorales o a un efecto indirecto mediado por una respuesta inmune, se inocularon subcutáneamente células de glioblastoma C6 en ratones con una deficiencia en la recombinasa RAG-2 (RAG-2 −/− ), que carecen de linfocitos T y B maduros (Shinkai, Y. y col., Cell 68, 855-867, 1992). Como se muestra en la Fig. 4a, el tamaño de los tumores era extraordinariamente inferior en los animales tratados con THC o WIN-55.212-2 que en los animales control. En la Fig. 4b se muestran ejemplos de ratones portadores de tumores y de tumores diseccionados después del tratamiento con o sin cannabinoides durante 7 días. Seguridad del tratamiento con cannabinoides in vivo

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Después de esto se estudiaron los posibles efectos secundarios del tratamiento con cannabinoides. Las ratas sin tumores que se trataron con cannabinoides tuvieron una supervivencia totalmente no afectada (Fig. 3a). Al igual que con los 8 animales antes mencionados cuyos tumores se erradicaron con cannabinoides, un análisis minucioso mediante resonancia magnética de todos los animales sin tumor revelaba que el tratamiento con cannabinoides no daba como resultado ninguna señal de daño por necrosis, edema, infección, inflamación o trauma. Para descartar la posibilidad de efectos tóxicos de los cannabinoides sobre las células nerviosas que sufren división, se realizaron tinciones de TUNEL en el área subventricular del cerebro en ratas, que continúa proliferando en el animal adulto. La administración de cannabinoides no sólo no produjo ningún efecto apoptótico significativo en el cerebro in vivo, sino que además el ligero marcaje observado en el caudado putamen de los animales control no era evidente en los animales tratados con cannabinoides.

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Tanto en los animales sin tumor como en los portadores de tumor, los cannabinoides no indujeron ninguna alteración significativa de parámetros comportamentales como coordinación motora y actividad física. La ingesta de alimento y agua y la ganancia de peso tampoco se vieron afectadas por los cannabinoides. Asimismo, en los análisis de sangre los parámetros bioquímicos (glucosa, urea, ácido úrico, creatinina, colesterol, bilirrubina) y los marcadores de daño tisular (alanina y aspartato aminotransferasas, γ-glutamiltransferasa, creatina, quinasa, lactato deshidrogenasa) no resultaron afectados ni a lo largo del período de 7 días de administración ni hasta 2 meses después de la finalización del tratamiento con cannabinoides. Datos de otros autores apoyan la idea de que los cannabinoides no sólo no son compuestos tóxicos para las células nerviosas, sino que incluso las protegen de estímulos tóxicos tales como los agonistas glutamérgicos (Skaper, S.D. y col., Proc Natl. Acad. Sci. USA 93, 3984-3989. 1996; Shen. M. & Thayer, S.A. Mol. Pharmacol. 54, 459-462, 1998), los agentes oxidantes (Hampson, A.J., Grimaldi, M., Axelrod. J. & Wink, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8268- 8273, 1998) y la isquemia (Nagayama, T y col., J. Neurosci. 19, 29872995, 1999). 3

ES 2 241 670 T3 Caracterización farmacológica de la acción antitumoral de los cannabinoides

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Se llevaron a cabo experimentos con el objeto de obtener una caracterización farmacológica de la muerte inducida por cannabinoides de células de glioblastoma C6 en cultivo. Agonistas sintéticos de elevada potencia tales como WIN-55.212-2, CP-55.940 y HU-210 inducían la muerte de estas células a dosis menores que el THC, como se podía esperar de su mayor afinidad por los receptores de cannabinoides (Pertwee, op. cit.). Así, tras 5 días de exposición a cannabinoides, la viabilidad del glioblastoma C6 se redujo en un 50% a concentraciones de WIN-55.212-2 20 nM, CP-55.490 45 nM, HU-210 10 nM y THC 480 nM (n=4). Ni el SR141716 (un antagonista selectivo de CB1 ) ni el SR144528 (un antagonista selectivo de CB2 ) (Shire, D. y col., Life Sci. 65, 627-635, 1999) eran capaces por separado de prevenir la muerte celular inducida por el THC. Sin embargo, cuando los dos antagonistas se añadían conjuntamente a las incubaciones se observaba una prevención eficaz de la muerte celular inducida por THC (Fig. 5a). De acuerdo con ello, un análisis de bandas de Western demostró que las células de glioblastoma C6 expresaban tanto el receptor CB1 como el CB2 (Fig. 5b).

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Aplicación de la invención a otros casos

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Los experimentos que han conducido a la presente invención se han llevado a cabo con ratas y ratones como animales portadores de tumores. Sin embargo, en vista del diseño experimental empleado y la similitud que exhiben los tumores cerebrales en distintos mamíferos (R.F. Barth, op. cit.), la invención puede aplicarse al tratamiento de tumores cerebrales en otros mamíferos, incluido el ser humano. Los experimentos que han conducido a la presente invención se han llevado a cabo con glioblastomas como un modelo de tumor cerebral.

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Los experimentos que han conducido a la presente invención se llevaron a cabo con dos cannabinoides paradigmáticos, uno natural (THC) y uno sintético (WIN-55.212-2). En una realización preferida de la invención se utilizará el cannabinoide con efecto antiproliferativo más potente para un tumor dado. Sin embargo, puesto que el efecto antiproliferativo de estos compuestos está mediado por los receptores de cannabinoides (receptores de tipo CB, Howlett y col., op. cit.), la invención es aplicable a cualquier otro agonista de estos receptores, tanto cannabinoides de C. sativa (por ejemplo ∆9 -tretahidrocannbinol, cannabinol, cannabidiol) (Fig. 1) como cannabinoides sintéticos (por ejemplo HU-210, CP-55.940, CP-50.556) (Fig. 2) (Pertwee, op. cit.; F. Barth, op. cit.). También se incluyen en este apartado medicamentos que contengan en su composición cualquier cannabinoide. Los experimentos que condujeron a la presente invención se han llevado a cabo con la administración intratumoral del cannabinoide. En una realización preferida de la invención ésta será la vía de administración elegida, ya que permite una elevada accesibilidad del cannabinoide al tumor. Sin embargo, puesto que la acción del cannabinoide es directa sobre el tumor y no parece afectar sustancialmente a sistemas periféricos, la vía de administración puede ser también sistémica, por ejemplo intraperitoneal, intravenosa u oral. Los experimentos que condujeron a la presente invención se han llevado a cabo mediante la administración continua de una dosis de cannabinoide durante un tiempo determinado. En una realización preferida de la invención se pueden alterar estos parámetros de acuerdo con los requerimientos específicos del tratamiento: estado del paciente, tamaño y localización del tumor, número de tumores, etc. Así, por ejemplo, el modo de aplicación podrá ser continuo (modo preferido) o secuencial en una o varias dosis por día. Esto afectará obviamente las dosis de compuesto administradas y el tiempo total del tratamiento. Breve descripción de las figuras Figura 1

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Fórmula química de los principales cannabinoides de C. sativa Figura 2 55

Fórmula química de los principales cannabinoides sintéticos Figura 3 Acción antitumoral de los cannabinoides en ratas

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(a) Curvas de supervivencia de ratas con tumores cerebrales. Se indujeron glioblastomas en 45 ratas (día 0); 15 animales no se trataron con cannabinoides (-), mientras que otros 15 se trataron con THC (-) y otros 15 con WIN55.212-2 (-) entre los días 12 y 19. Los animales tratados con cannabinoides vivieron significativamente más tiempo que los controles (P