Re p u b l i co fEc u a d o r ≠ EDI CTOFGOVERNMENT± I no r d e rt op r o mo t ep u b l i ce d u c a t i o na n dp u b l i cs a f e t y ,e q u a lj u s t i c ef o ra l l , ab e t t e ri n f o r me dc i t i z e n r y ,t h er u l eo fl a w,wo r l dt r a d ea n dwo r l dp e a c e , t h i sl e g a ld o c u me n ti sh e r e b yma d ea v a i l a b l eo nan o n c o mme r c i a lb a s i s ,a si t i st h er i g h to fa l lh u ma n st ok n o wa n ds p e a kt h el a wst h a tg o v e r nt h e m.

NTE INEN 0729 (1985) (Spanish): Leche y productos lácteos. Determinación del colesterol

CDU: 637



AL 03.01-326

  Norma Técnica Ecuatoriana

LECHE Y PRODUCTOS LACTEOS. DETERMINACION DEL COLESTEROL

INEN 729

Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN – Casilla 17-01-3999 – Baquerizo Moreno E8-29 y Almagro – Quito-Ecuador – Prohibida la reproducción

1. OBJ ETO

1.1 Esta norma establece el método para determinar el contenido de colesterol en leche y productos lácteos.

2. ALCANCE

2.1 Esta norma se aplica para: a)

Productos que contienen pequeña cantidad de grasa, y

b)

Productos que requieran saponificación

3. TERMINOLOGIA

3.1 Colesterol. Es un alcohol que acompaña a las grasas animales, bilis, cálculos, tejido nervioso, sangre, etc. Se presenta como substancia blanca cristalina e insoluble en agua. 3.2 Otros términos relacionados con esta norma están definidos en la Norma INEN 3.

4. DISPOSICIONES GENERALES

4.1 Para determinar el contenido de colesterol en productos considerados por esta norma, podrá usarse cualquiera de los dos métodos descritos en la misma. En caso de discrepancia o litigio deberá usarse el método referente a productos que requieran saponificación. 4.2 Las pipetas y todo el instrumental utilizados deberán estar debidamente estandarizados e inspeccionados.

5. METODO PARA PRODUCTOS CON PEQUEÑA CANTIDAD DE GRASA

5.1 Resumen.

5.1.1 La muestra seca disolver en cloroformo y determinar el contenido de colesterol por lectura en el espectrofotómetro o colorímetro a 625 n.m.

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  5.2 Instrumental. 5.2.1 Balanza analítica, sensible al 0,1 mg. 3

5.2.2 Erlenmeyer de 50 cm . 3

5.2.3 Probeta graduada de 10 cm . 3

5.2.4 Tubos de ensayo graduados hasta 15 cm . 3

3

5.2.5 Pipetas aforadas de 1 cm , 2 cm . 5.2.6 Estufa, con regulador de temperatura, ajustada a 100°C ± 1°C. 5.2.7 Espectrofotómetro o colorímetro a 625 n.m.

5.3 Reactivos.

5.3.1 Cloroformo lavado y desecado sobre sulfato de sodio anhidro. 5.3.2 Acido acético glacial, reactivo para análisis. 5.3.3 Anhídrido acético, reactivo pasa análisis. 5.3.4 Acido sulfúrico, reactivo para análisis.

5.3.5 Solución patrón de colesterol.. Pesar con aproximación al 0,01 mg, exactamente 0,05 g de colesterol; 3

transferirlo a un matraz aforado de 100 cm , completar el volumen con solución de cloroformo (ver 5.3.1)

y

3

disolverlo. Un cm de esta solución debe tener 0,0005 g de colesterol. (Preparar una serie de soluciones de concentración conocida) y hacer la curvado calibración transmitancia - densidad óptica.

5.4 Preparación de la muestra.

5.4.1 Si la muestra es líquida y presenta aspecto claro y sin sedimento, homogeneizarla invirtiendo varias veces el recipiente que lo contiene.

5.4.2 Si la muestra es líquida y presenta aspecto turbio o con sedimento, colocar el recipiente que la contiene en una estufa a 50°C, mantenerlo allí hasta que la muestra alcance tal temperatura, y proceder de acuerdo con lo indicado en 5.4.1. SÍ luego de calentar y agitar ¡a muestra no presenta aspecto claro y sin sedimento, filtrar dentro de la estufa a 50°C. El filtrado no debe presentar ningún sedimento.

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  5.4.3 Si la muestra es sólida o semi-sólida, proceder de acuerdo con lo indicado en 5.4.1, pero calentándola (y filtrándola si es necesario) a una temperatura comprendida entre 40°C y 60°C (la suficiente para

fundir

la muestra completamente). 5.4.4 Si la muestra es sólida, pulverizarla finamente, (de tal modo que pase a través de un tamiz de 80 maltas) secarla en estufa a 100°C y enfriarla. 5.4.5 Si quedan partículas de grasa adheridas a las paredes del recipiente, la determinación no dará resultadas exactos.

5.5 Procedimiento.

5.5.1 La determinación debe realizarse por duplicado sobre la misma muestra preparada. 3

5.5.2 Pesar, con aproximación al 0,1 mg, dos gramos de muestra y transferirlo al Erlenmeyer de 50 cm .

5.5.3 Colocar el Erlenmeyer y su contenido en la estufa a 100°C, hasta que la muestra esté seca y luego enfriar. 3

5.5.4 Una vez frió, agregar 5 cm de cloroformo, homogeneizar valiéndose de una varilla de vidrio y dejar en reposo durante 20 minutos. 3

5.5.5 Agregar 5 cm más de cloroformo, agitar, dejar sedimentar, filtrar cuidadosamente a través de un filtro seco, usando un embudo y papel filtro pequeño.

5.5.6 Recibir el filtrado en el tubo de ensayo graduado, lavar el residuo y papel filtro con pequeñas porciones 3

de cloroformo, hasta completar un volumen de 15 cm .

5.5.7 Luego, proceder de acuerdo con el numeral 7. Determinación del colesterol.

6. MÉTODO PARA PRODUCTOS QUE REQUIERAN SAPONIFICACIÓN

6.1 Resumen. 6.1.1

Saponificar la muestra con un exceso de solución etanólica de hidróxido de potasio, disolverlo en

cloroformo y determinar el contenido de colesterol por lectura en el espectrofotómetro o colorímetro a 625 nm.

6.2 Instrumental.

6.2.1 Balanza analítica. Sensible al 0,1 mg.

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6.2.2 Erlenmeyer de 100 cm . 3

6.2.3 Probeta graduada de 20 cm . 3

3

6.2.4 Embudo de separación de 250 cm y 150 cm . 3

6.2.5 Tubos de ensayo graduados, hasta 15 cm .

6.2.6

Embudo Erlenmeyer (de vidrio con placa porosa y con una capa de 2 g de sulfato de sodio anhi-

dro.).

6.2.7 Baño de agua. 3

3

6.2.8 Pipetas aforadas de 1 cm y 2 cm .

6.2.9 Desecador al vacío, con ácido sulfúrico u otro deshidratante.

6.2.10 Estufa con regulador de temperatura, ajustada a 100°C ± 1°C.

6.2.11 Reverbero eléctrico. 6.2.12 Espectrofotómetro o colorímetro a 625 nm.

6.3 Reactivos.

6.3.1 Solución de hidróxido de potasio al 1%.

6.3.2 Solución de ácido clorhídrico (1 +4).

6.3.3 Hidróxido de potasio, reactivo para análisis.

6.3.4 Eter etílico, exento de peróxidos, reactivo para análisis. 6.3.5 Cloroformo, lavado y desecado sobre sulfato de sodio anhidro, reactivo para análisis.

6.3.6 Acido acético glacial, reactivo para análisis.

6.3.7 Anhídrido acético, reactivo para análisis.

6.3.8 Solución patrón de colesterol (ver 5.3.5).

6.3.9 Acido sulfúrico, reactivo para análisis.

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  6.3.10 Agua destilada.

6.4 Preparación de la muestra. 6.4.1 Si la muestra es líquida y presenta aspecto claro y sin sedimento, homogeneizarla invirtiendo varias veces el recipiente que lo contiene. 6.4.2 Si la muestra es líquida y presenta aspecto turbio o con sedimento, colocar el recipiente que lo contiene en una estufa a 50°C, mantenerlo allí hasta que la muestra alcance tal temperatura y proceder de acuerdo con lo indicado en 6.4.1. Si luego de calentar y agitar la muestra no presenta aspecto claro y sin sedimento, filtrar dentro de la estufa a 50°C. El filtrado no debe presentar ningún sedimento. 6.4.3 SÍ la muestra es sólida o semisólida, proceder de acuerdo con lo indicado en 6.4.2 pero calentandolo (y filtrándolo si es necesario) a una temperatura comprendida entre 40°C y 60°C (la suficiente para fundir la muestra completamente). 6.4.4 Si la muestra es sólida, pulverizarla finamente (de tal modo que pase a través de un tamiz de 80 mallas), secarlo en estufa a 100°C y enfriarla. 6.4.5 Si quedan partículas de grasan adheridas a las paredes del recipiente, la determinación no dará resultados exactos.

6.5 Procedimiento.

6.5.1 La determinación debe realizarse por duplicado sobre la misma muestra preparada (ver 6.5.16). 3

6.5.2 Pesar con aproximación al 0,1 mg, dos gramos de muestra y transferirlo al Erlenmeyer de 100 cm .

6.5.3

3

Añadir 10 cm de ácido clorhídrico, agitar con varilla de vidrio y calentar en baño de agua por 30

minutos. Enfriar y añadir cuidadosamente 8 g de hidróxido de potasio (la reacción es fuertemente exotérmica).

6.5.4

Tapar el Erlenmeyer con vidrio de reloj y calentar en baño de agua, durante 30 minutos, agitando

de vez en cuando. 3

6.5.5 Lavar las paredes del Erlenmeyer con 5 cm de agua y continuar el calentamiento en baño de agua por 2h30 y enfriar hasta 40°C, 6.5.6

3

3

3

Añadir 6 cm de alcohol y 10 cm de agua, mezclar y luego agregar 20 cm de éter etílico y agi-

tar durante un minuto. 3

3

6.5.7 Transferir todo el contenido al embudo de separación de 250 cm , lavar el vaso con 10 y 15 cm de 3

éter; luego con 10 cm de la solución de hidróxido de potasio al 1 % ir colocando lentamente estas soluciones en el embudo de separación; luego, agitar durante 15 minutos y dejar en reposo 10 minutos.

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3

3

6.5.8 Transferir la capa inferior (solución de jabón) al embudo de separación de 150 cm , añadir 5 cm de alcohol, agitar y dejar en reposo hasta separación de las dos capas. 3

3

6.5.9 Lavar el contenido en el embudo de separación, de 250 cm con 2 cm de la solución de hidróxi3

do de potasio y transferir esta solución de lavado al embudo de 150 cm . 3

6.5.10 Añadir 10 cm de éter, agitar, dejar en reposo hasta separación de las dos capas. Transferir la ca3

3

pa etérea al embudo de separación de 250 cm . Lavar el embudo de separación de 150 cm con 2 por3

3

ciones de 5 cm de éter etílico y poner este líquido de lavado en el embudo de 250 cm . 3

3

6.5.11 Añadir al embudo de separación de 250 cm , 10 cm de la solución de hidróxido de potasio, agi3

3

tar, retirar la capa acuosa, luego añadir 2 cm de ácido clorhídrico (1+4). Agitar, añadir 10 cm de agua y agitar.

6.5.12

3

Retirar la capa acida y añadir 10 cm de la solución de hidróxido de potasio al 1%, agitar, reti3

rar la capa acuosa. Repetir el lavado con porciones de 10 cm de la solución de hidróxido de potasio al 1% hasta que la solución de lavado permanezca transparente, (cuando se neutralice con ácido clorhídrico (1+4), usar indicador de fenolftaleína). 3

6.5.13 Lavar la capa etérea sucesivamente con 5 cm de agua conteniendo una gota de ácido clorhídri3

co (1+4) y dos veces con 5 cm de agua.

6.5.14 Desechar la capa acuosa completamente. Filtrar la solución etérea usando el embudo Buchner (6.2.1) y recibir el líquido filtrado en el tubo de ensayo graduado.

6.5.15 Calentar la solución etérea en baño María, de modo que se evapore todo el éter. Colocar el tubo con el residuo en el desecador al vacío con ácido sulfúrico, hasta desecación del residuo (12 horas). Disol3

ver el residuo con cloroformo hasta obtener un volumen igual de 15 cm . 6.5.16 Debe realizarse un solo ensayo en blanco, usando agua, el mismo material, los mismos reactivos, las mismas cantidades y el mismo procedimiento, en igual forma que para la muestra.

7. DETERMINACIÓN DEL COLESTEROL

7.1

3

3

Al tubo que contiene la solución clorofórmica, añadir 1 cm de ácido acético glacial, 2 cm de anhí3

drido acético y 0,2 cm de ácido sulfúrico. Tapar el tubo, agitar. Colocar en baño María a 23°C, en un lugar obscuro, por 25 minutos.

7.2 Medir la coloración verde desarrollada en el espectrofotómetro a 625 nm y determinar la cantidad de colesterol, usando la curva patrón previamente establecida (ver 5.3.5).

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8. CALCULOS

8.1 El contenido de colesterol en la muestra, se calcula mediante la ecuación siguiente:

100 x m1 m

Colesterol =

Siendo: Colesterol

= contenido de colesterol en porcentaje de masa,

m

= masa de la lectura analizada, en g,

m1

= lectura en g de colesterol obtenida en la curva patrón.

9. ERRORES DE METODO

9.1 La diferencia entre los resultados de una determinación efectuada por duplicado no debe exceder de 0,001%, en caso contrario, debe repetirse la determinación.

10. INFORME DE RESULTADOS

10.1 Como resultado debe reportarse la media aritmética de las dos determinaciones.

10.2 En el informe de resultados debe indicarse el método usado y el resultado obtenido. Debe mencionarse además cualquier condición no especificada en esta norma o considerada como opcional, así como cualquier circunstancia que pueda haber influido sobre el resultado, y debe incluirse los detalles necesarios para la identificación de la muestra.

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APENDICE Z

Z.1 NORMAS A CONSULTAR Esta norma no requiere de otras para su aplicación.

Z.2 BASES DE ESTUDIO Método AOAC de análisis. Sterols (as Cholesterol) 14140 Bromination Method (48). Association of Official Analytical. Chemist. Washington, 1975. Norma Sanitaria de Alimentos OFSANPAN - IALUTZ. Norma Técnica de métodos físicos y químicos para determinación de colesterol. OPS/OMS. Oficina Sanitaria Panamericana. Washington, 1968. Vicente Villar P. — Carlos Villar P. Métodos seleccionados de análisis clínicos. Volumen I. Colesterol total y libre. Asociación Norteamericana de analistas clínicos. Madrid, 1956.

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INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA            

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