UNIVERSIDAD DE COLIMA DOCTORADO EN CIENCIAS. ÁREA: BIOTECNOLOGÍA

DISTRIBUCIÓN NATURAL DE NEMATODOS ENTOMOPATÓGENOS (NEMATODA: STEINERNEMATIDAE Y HETERORHABDITIDAE) EN SISTEMAS AGROECOLÓGICOS DE ZACATECAS

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS. ÁREA: BIOTECNOLOGÍA

PRESENTA

MIGUEL ÁNGEL SALAS LUÉVANO

ASESORES: DR. JAIME MOLINA OCHOA DR. HÉCTOR RENÉ VEGA CARRILLO

TECOMÁN, COLIMA, MÉXICO.

DICIEMBRE DEL 2002

C. MIGUEL ANGEL, SALAS LUÉVANO EGRESADO DEL DOCTORADO EN CIENCIAS AREA: BIOTECNOLOGÍA PRESENTE.

Con fundamento en el dictamen emitido por el jurado revisor del colegiado del área: de Biotecnología de esta Facultad a mi cargo, de su trabajo de tesis del Doctorado y en virtud de que efectuó las correcciones y acató las sugerencias que le habían indicado los integrantes del mismo, se le autoriza la impresión dc la tesis " Distribución natural de nematodos entomopatógcnos

(Nematoda: Steinernematidae y Heterorhabditidae) en sistemas agroecológicos de Zacatecas ", misma que ha sido dirigida por los C.C. Dr. Jaime Molina Ochoa, Profesor Investigador de esta Facultad y Dr. Héctor René Vega Carrillo de la Universidad Autónoma de Zacatecas. Este documento reunió todas las características apropiadas como requisito parcial para obtener cl grado de Doctor en Ciencias; Arca: Biotecnología y fue revisado en cuanto a forma y contenido por los C.C. Dr. Alfonso Pescador Rubio, Dr. Sergio Aguilar Espinosa, Dr. JoséGerardo López Aguirre, Dr. Roberto Lezama Gutierrez y el Dr. Jaime Molina Ochoa, ProfesoresInvestigadores dc la Universidad de Colima. Sin otro particular de momento, me despido de usted muy cordialmente.

ATENTAMENTE “ESTUDIA * LUCHA * TRABAJA” TECOMÁN, COL., A 21 DE NOVIEMBRE DEL 2002.

ING. RODOLF

NTÍN DELGADO

C.C.P. EXPEDIENTE ACADEMICO DEL ALUMNO C.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE. C.C.P. ARCHIVO. RVMD/gmg* * Of. No. 652/2002.

Km 40 Autopista Colima-Manzanillo • Tecomán, Colima, México • C.P. 28100 Tel. 01 (313) 322 94 05 • Est. 52251 • Fax 52252 • [email protected]

DEDICATORIAS A Dios

Por permitirme existir.

A mis Padres

Prof. Everardo Salas Marín | donde quiera que estés y Maria Soledad Luévano Guerrero, quienes por su ejemplo e inspiración he logrado mi mayor ilusión profesional y personal, para ellos mi amor eterno.

A mi esposa

Silvia por su paciencia, apoyo, comprensión incondicional y por compartir conmigo la felicidad de culminar esta meta.

A mis hijas

Karina, Silvia y Paloma mi adoración y luz de mi vida; mis mujeres, todo lo que puedo ser, es por ustedes.

A mi nieto

Luis Ángel mi adoración y alegría en mi vida, quien junto con tu mami y tías en un futuro lleven a feliz termino sus más caras ilusiones.

A mi hijo

Luis Manuel por su motivación sincera y compartir con mi familia este logro nuestro.

A mis hermanos Marco Antonio, Juan Manuel, Ma. Guadalupe, Mario Alberto, Ma. Soledad, Ma. de Lourdes, Isabel Cristina, Héctor Martín y Martha Araceli, por su apoyo y cariño fraternal siempre.

A la familia Don Ángel |, Doña Amparo, Ángeles, Lilia, José Ángel, Enrique, Muñoz Delgado Olivia | y Haydee por su ánimo fraterno.

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad Autónoma de Zacatecas a través de la Unidad Académica de Agronomía, por el apoyo institucional brindado en mi superación profesional.

Al Programa de Mejoramiento del Profesorado, PROMEP-UAZ por su apoyo económico para la realización de mi doctorado en ciencias.

A la Universidad de Colima a través de la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, por hacer posible mi formación académica.

Al I. Q. Rogelio Cárdenas Hernández Rector de la Universidad Autónoma de Zacatecas, por su confianza, apoyo incondicional y amistad brindada.

Al Dr. Jaime Molina Ochoa y el Dr. Héctor René Vega Carrillo, por su acertada asesoría, invaluables consejos y amistad brindada, mi agradecimiento sincero.

Al Dr. Roberto Lezama Gutiérrez, Dr. Sergio Aguilar Espinosa, Dr. Alfonso Pescador Rubio, Dr. José Gerardo López Aguirre, por su valiosa revisión y excelentes sugerencias para la composición final de mi tesis doctoral.

Al Dr. Miguel Arenas Vargas modelo íntegro a seguir por su enseñanza académica innovadora, así como por su amistad brindada, mi reconocimiento sincero.

A mis amigos Eduardo, Rómulo, Martín, Carlos, Víctor, Julían, Héctor y Adalberto por sus consejos, apoyo incondicional, por su grata convivencia y nuestra amistad siempre.

A mi Cuquis, José y mi compadre Avelar quienes siempre me han brindado amistad y apoyo incondicional. A todas aquellas personas que de alguna manera contribuyeron para la realización del presente trabajo.

2

ÍNDICE Página

I. INTRODUCCIÓN

1

II. ANTECEDENTES

7

2.1 Los nematodos parásitos de insectos

7

2.2 Los nematodos entomopatógenos Steinernematidae y Heterorhabditidae

7

2.3 Rango de hospederos

10

2.4 Taxonomía de los nematodos entomopatógenos

15

2.5 Identificacion de los nematodos entomopatógenos

18

2.5.1 Identificación morfológica y morfométrica

18

2.6 Biología de los nematodos

21

2.6.1 Comportamiento de los nematodos

21

2.6.1.1 Búsqueda de los hospederos susceptibles

21

2.6.1.2 Penetración a los hospederos

23

2.6.2 Ciclo de vida de los nematodos

24

2.6.3 Asociación mutualista nematodo-bacteria

28

2.7 Ecología de los nematodos entomopatógenos

32

2.7.1 Factores ambientales

32

2.7.2 Supervivencia de los nematodos entomopatógenos

33

2.7.3 Condiciones edafológicas

35

2.7.3.1 El medio ambiente del suelo

35

7.3.3.2 El pH del suelo

36

2.7.3.3 Aireación del suelo

36

2.7.3.4 Humedad del suelo

37

2.7.4 Dispersión de los nematodos en el suelo

39

2.7.5 Temperatura del suelo

41

2.7.5.1 Tolerancia a la desecación

41

2.7.5.2 Luz ultravioleta

44

2.7.5.3 Tolerancia al frío

44

3

2.8 Biodiversidad y poblaciones naturales de nematodos entomopatógenos

46

2.8.1 Aislamiento y distribución geográfica de Steinernema y Heterorhabtidis

47

2.8.2 Distribución natural y rango de hábitats de Steinernema y Heterorhabtidis 52

III. MATERIALES Y MÉTODOS

65

3.1 Lugar del experimento

65

3. 2 Descripción de los sistemas agrícolas de la región Centro-Sur de Zacatecas

65

3.3 Cría de Galleria mellonella

66

3.4 Áreas de muestreo

67

3.4.1 Recolección de las muestras

67

3.5 Aislamiento de los nematodos entomopatógenos

68

3.6 Pruebas de patogenicidad

69

3.7 Estudios taxonómicos

69

3.7.1 Identificación morfológica

70

3.8 Medición de los factores edafológicos y climáticos

70

3.9 Análisis de datos

71

IV. RESULTADOS

73

4.1 Determinación y distribución de los nematodos entomopatógenos

73

4.2 Pruebas de patogenicidad

78

4.3 Identificación de los nematodos Steinernema y Heterorhabtidis

78

4.4 Correlación entre los nematodos entomopatógenos y los sistemas

79

agroecológicos, factores edafológicos y climáticos 4.4.1 Asociación de Steinernema y Heterorhabtidis y los sistemas

80

agroecológicos 4.4.2 Asociación de Steinernema y Heterorhabtidis y los factores edafológicos

83

4.4.2.1 Tipo de suelo

83

4.4.2.2 Textura del suelo

85

4.4.2.3 pH del suelo

86

4.5 Asociación de Steinernema y Heterorhabtidis y los factores climáticos

88

4.5.1

Tipo

88

4.5.2

Temperatura

ambiental

4.5.3

Precipitación

pluvial

de

clima y

del

suelo

90 91

4

4.5.4 Altitud

92

V. DISCUSIÓN

95

5.1 Determinación y distribución de los nematodos entomopatógenos

95

5.2 Pruebas de patogenicidad

104

5.3 Identificación de los nematodos Steinernema y Heterorhabtidis

105

5.4 Correlación entre los nematodos entomopatógenos y los sistemas agroecológicos, factores edafológicos y climáticos 5.4.1 Asociación de Steinernema y Heterorhabtidis y los sistemas agroecológicos

106 106

5.4.2 Asociación de Steinernema y Heterorhabtidis y los factores edafológicos 106 5.4.2.1 Tipo de suelo

117

5.4.2.2 Textura del suelo

117

5.4.2.3 pH del suelo

118

5.5 Asociación de Steinernema y Heterorhabtidis y los factores climáticos

121

5.5.1 Tipo de clima

123

5.5.2 Temperatura ambiental y del suelo

123

5.5.3 Precipitación pluvial

126

5.5.4 Altitud

131

VI. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS DE INVESTIGACIÓN

133

VII. LITERATURA CITADA

134

VIII. ANEXO

137 161

5

TABLA DE CUADROS Y FIGURAS Cuadro 1 Especies descritas y reconocidas para el género Steinernema.

Pág. 16

2

Especies descritas y reconocidas para el género Heterorhabditis.

17

3

Inspecciones generales y objetivas de nematodos entomopatógenos.

48

4

Distribución de los sitios y muestras positivas con nematodos entomopatógenos en la región Centro-Sur del Estado de Zacatecas.

73

5

Distribución y existencia natural de nematodos entomopatógenos en la región Centro-Sur del Estado de Zacatecas.

75

6

Existencia de los hongos entomopatógenos Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana en la región Sur de Zacatecas, Zac.

78

7

Distribución y existencia natural de Steinernema y Heterorhabditis en los sistemas agroecológicos de la región Centro-Sur de Zacatecas, Zac.

82

8

Tipo de suelo de los sitios y muestras que dieron positivo a los géneros Steinernema y Heterorhabditis en la región Centro-Sur de Zacatecas.

84

9

Características edafológicas de los sistemas agroecológicos que confirmaron nematodos entomopatógenos Steinernema y Heterorhabditis en suelos zacatecanos.

88

10

Carácterísticas climáticas de los sistemas agroecológicos que registraron nemátodos entomopatógenos Steinernema y Heterorhabditis en Zacatecas.

94

Figura 1 Distribución y abundancia de nematodos entomopatógenos (Steinernema y Heterorhabditis) en la región Centro-Sur de Zacatecas

Pág. 74

2

Mapa de muestreo para nematodos entomopatógenos asociados en la región Centro-Sur de Zacatecas (Ä = Steinernema spp.; = Heterorhabditis spp.).

76

3

Hongos entomopatógenos Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana aislados en la región Sur de Zacatecas.

77

6

4

Géneros de nematodos entomopatógenos aislados en los agrosistemas de la región Centro-Sur de Zacatecas.

79

5

Asociación de los nematodos entomopatógenos en los agrosistemas (anuales y perennes) de la región Centro-Sur de Zacatecas. Asociación entre los nematodos entomopatógenos y el tipo de suelo de la región Centro-Sur del Estado de Zacatecas, Zac.

80

6

85

7

Asociación de Steinernema y Heterorhabditis y el pH en la región CentroSur de Zacatecas.

87

8

Estratificación

89

9

Asociación de Steinernema y Heterorhabditis y la temperatura ambiental en los agrosistemas inspeccionados.

91

10

Asociación de Steinernema y Heterorhabditis y la precipitación en los agrosistemas inspeccionados.

92

11

Asociación de Steinernema y Heterorhabditis y la altitud en los agrosistemas inspeccionados.

93

ambiental

del

Estado

de

Zacatecas.

7

RESUMEN Una inspección objetiva fue conducida en diversos sistemas agroecológicos en la región Centro-Sur de Zacatecas, para determinar la presencia de nematodos entomopatógenos. Esta fue evaluada por la técnica de cebado con Galleria. De las 142 muestras de suelo de 72 sitios, los nematodos fueron aislados de 28.1% de las muestras, representando el 50% de los sitios estudiados, de las cuales 12.7% contenían Steinernema spp. y 15.4% Heterorhabditis spp. A excepción de un solo sitio con cultivo de alfalfa, no se encontraron infecciones naturales, en cadáveres de ninfas de Brachystola ponderosa posiblemente infectado por Steinernema scapterisci. Los steinernematidos fueron más prevalecientes en maíz y alfalfa; suelos de textura franco, pH entre 6.0 a 8.4, áreas templadas situadas en altitudes altas, promedios de temperatura y precipitación anual baja. Mientras que los heterorhabditidos predominaron en guayabo, en suelos franco arenoso arcilloso, pH de 6.0 a 9.2, áreas cálidas localizadas en latitudes intermedias, promedios de temperatura anual alta y precipitación intermedia.

Palabras clave: Nematodos entomopatógenos, distribución geográfica, existencia natural, características ambientales, Zacatecas, Steinernematidae, Heterorhabditidae, inspección.

8

ABSTRACT A targeted survey was conducted in several agro-ecology systems in the central-south region of Zacatecas, and the presence of entomopathogenic nematodes was evaluated by Galleria baiting technique. Of the of 142 soil sample of 72 sites the nematodes were isolated form 28.1% of the samples, representing 50% of the sites studied, of which 12.7% of the samples contained Steinernema spp. and 15.4% contained Heterorhabditis spp. No natural infections were found except in one site of lucerne in cadavers of nymphs of Brachystola ponderosa posibility infected by Steinernema scapterisci. The steinernematids were more prevalent in corn and lucerne, soil loam, ph between 6.0 to 8.4, temperate areas situated in high altitud, lower annual median temperature and rain. While heterorhabditids predominated in guava, soil sandy loam and clay, pH of 6.0 to 9.2, warm areas localited in intermediate altitude, high annual median temperature and intermediate rain.

Key works: Entomopathogenic nematodes, geographical distribution, natural occurrence, environmental characteristics, Zacatecas, Steinernematidae, Heterorhabditidae, survey.

9

I. INTRODUCCIÓN Por décadas los plaguicidas químicos han sido el método de control de plagas más utilizado, pero sus efectos sobre organismos no objetivo, contaminación de agua, residuos en cosechas y alimentos, el desarrollo de resistencia de los insecticidas y el incremento a la degradación microbiana (Gaugler, 1988; Georgis, 1992) han originado un clima político y social en contra de ellos (Georgis y Hague, 1991). Como consecuencia, asociaciones ambientalistas han forzado la atención de la industria para el desarrollo e incremento de investigaciones, sobre otros métodos de control alternativo menos tóxicos para el manejo de insectos plagas (Georgis y Poinar, 1994).

El control microbiano se ha expandido con el descubrimiento y desarrollo de nuevos agentes de control. Por su selectividad y reducido impacto ambiental, algunos organismos entomopatógenos pueden ser componentes ideales en programas de manejo integrado de plagas en el principio y más allá del siglo XXI (Lacey y Goettel, 1995). Durante la última década, el interés sobre el control biológico de plagas agrícolas y forestales, se ha intensificado alrededor del mundo (Kaya y Gaugler, 1993). Entre la diversidad de agentes bioreguladores reconocidos ampliamente, numerosas especies de nematodos de las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae, pueden jugar un papel trascendental en la agricultura, al limitar las poblaciones de insectos plaga de importancia económica (Gaugler, 1981).

Como resultado de los progresos que durante los últimos 20 años se han hecho sobre la taxonomía, biología, genética, ecología, rango de hospederos, pruebas de laboratorio y de campo, aplicaciones tecnológicas, la comercialización de los nematodos entomopatógenos y sus bacterias simbióticas (Bedding, 1998), los nematodos del género Steinernema y Heterorhabditis han surgido como candidatos excelentes de biocontrol alternativo de insectos plaga, ya que posiblemente ellos ocupan una gran parte en conjunto con los depredadores/parasitoides y patógenos (Gaugler, 1988; Grewal y Georgis, 1999). Estos han recibido considerable atención como bioinsecticidas, por la combinación impresionante y única de los atributos que poseen (Gaugler y Kaya, 1990). Asimismo, por la asociación nematodo-bacteria que reúne muchos criterios para el control aumentativo de insectos a través

10

de liberaciones inundativas, entre los que se incluye: el amplio rango de hospederos; la capacidad para buscar y matar rápidamente a los ho spederos, un estadio infeccioso durable capaz de almacenarse, la distribución y persistencia, su disponibilidad para pruebas, la seguridad para las plantas y vertebrados, la disponibilidad de tecnologías baratas para la producción en masa, la existencia de equipos que facilitan la aplicación de rociado y la excención de requerimientos de registro y regulaciones estatales y federales en muchos países (Poinar, 1986; Gaugler, 1988; Kaya, 1990).

Además, debido a que los insectos del suelo son el objetivo lógico y como los nematodos también existen naturalmente aquí, pueden tener ventajas sobre los plaguicidas y otros patógenos microbianos (Gaugler, 1988). El uso potencial en el control biológico de diferentes especies de insectos plaga va en aumento (Miduturi et al., 1996). Por otro lado, a través de extensos programas de investigación en campo, se han estado desarrollando estrategias de aplicación que proporcionan niveles comparables al de los insecticidas convencionales (Georgis y Gaugler, 1991). Asimismo, con el desarrollo y producción de nematodos entomopatógenos a través de fermentaciones líquidas y formulaciones estables, se inició la introducción de un número de productos contra un amplio espectro de insectos plaga del suelo y de ambientes crípticos. Las investigaciones se han enfocado en la optimización del proceso de producción, para encontrar una mejor formulación, perfeccionar la aplicación tecnológica y utilizar especies/cepas más virulentos (nativos o por manipulación genética) que reduzcan la brecha entre los nematodos y los insecticidas sintéticos (Georgis y Hague, 1991).

En el futuro una oportunidad final de desarrollo notable, es la incorporación de los nematodos entomopatógenos en los programas de manejo integrado de plagas (Georgis, 1992), debido a que éstos generalmente son compatibles con la mayoría de los plaguicidas comerciales (Hara y Kaya, 1993; Rovesti et al., 1988; Zimmerman y Cranshaw, 1990), así como con hongos entomógenos (Kamionek et al., 1974), bacterias (Poinar et al., 1990) y virus (Kaya y Brayton, 1987). La combinación de los nematodos con los plaguicidas, patógenos y las medidas culturales, podrían resultar en una mayor mortalidad de las plagas y en una reducción en el importe de productos agroquímicos para su control (Kaya, 1985). De esta manera, presentarán una participación predominante en el mercado de control de ciertas plagas

11

y su participación continuará incrementándose (Smart, 1995) a mayor escala en el manejo integrado de plagas y en los sistemas de agricultura sustentable (Ehlers, 1996).

Complementariamente, con el incremento de las inspecciones y recuperación de aislamientos de numerosas poblaciones de nematodos entomopatógenos, el conocimiento de la biodiversidad de nuevos especímenes de steinernematidos y heterorhabditidos, se ha intensificado en el mundo. Mediante el método trampa de Galleria mellonella (L) es posible determinar la existencia y aislar especies y cepas en el suelo y en insectos infestados (Bedding y Akhurst, 1975). Sin embargo, en diversas regiones geográficas donde las condiciones bióticas y abióticas de cada sitio inspeccionado juegan un papel importante para su adaptación (Hominick et al., 1998), pueden ser diferentes completamente en su infectividad y supervivencia, de tal manera, que el potencial para obtener muchos y mejores aislados de nematodos entomopatógenos, es mayor, particularmente donde una especie conocida es eficaz contra insectos plagas en particular, con promedios más favorables para utilizarse en programas de control biológico (Bedding et al., 1983; 1998).

Por consiguiente, recuperar y aprovechar los aislamientos de entomopatógenos como agentes potenciales de control biológico, requiere de un gran entendimiento de los factores que determinan la existencia y abundancia de los nematodos en la naturaleza. La importancia de los estudios ecológicos de enemigos naturales, radica en ensayar y seleccionar la mayor cantidad de especies que exhiban mayor potencialidad en contra de un insecto plaga como problema particular. Estas investigaciones son fundamentales, en la determinación para el uso más efectivo de nuevos nematodos que tienen una o toda una gama de características biológicas deseables como agente de biocontrol (Gaugler et al., 1997).

De esta forma, diversas especies de nematodos entomopatógenos han sido promovidas para utilizarse en el mercado, para el control de una variedad de plagas de cultivos ornamentales y viveros, pastos, cultivos anuales y perennes y bosques, incluso para especies urbanas de importancia médica y veterinaria (Kaya y Gaugler, 1993). Igualmente, un rango de especies y cepas de Steinernema y Heterorhabditis son utilizadas como agentes de control biológico de plagas en cultivos industriales protegidos y cultivos intensivos de invernaderos

12

(Richardson, 1992). Asimismo, especies particulares son reconocidas ampliamente por su potencial como agentes de control biológico clásico, tal es el caso de Steinernema scapterisci Nguyen y Smart contra el grillo topo Scapteriscus vicinus (Nguyen y Smart, 1990), aplicaciones de Steinernema riobrave como un control biológico inundativo para la supresión de Helicoverpa zea Boddie (Feaster y Steinkraus, 1996), incluso se han registrado importantes epizootias ocasionadas por Heterorhabditis spp. (Sexton y Williams, 1981; Akhurst et al., 1992).

Por esta razón, es importante descubrir y caracterizar diversas especies y cepas de steinernematidos y heterorhabditidos y sus bacterias; debido a la promoción y facilidad de encontrar especies de nematodos adaptadas localmente, ya que estos us ualmente tienen una base geográfica. La realización de inspecciones acerca de los nematodos entomopatógenos que habitan naturalmente y en donde probablemente se puedan introducir, es de vital importancia para diseñar y perfeccionar estrategias de control de insectos. Además, el uso de nematodos endémicos como agentes de control biológico, pueden representar menos riesgos para organismos no objetivos, en comparación con la introducción de aislamientos exóticos (Blackshaw, 1988). Como consecuencia, en diversos países existen leyes cuarentenarias relacionadas para la importación de organismos exóticos, con la finalidad de proteger la fauna y la flora nativa, así como la agricultura (Bedding et al., 1996; Richardson, 1996).

Numerosas investigaciones han demostrado la amplia distribución y gran diversidad de especies y cepas de nematodos entomopatógenos. En América Latina y el Caribe diversos nematólogos han contribuido significativamente en la taxonomía y descubrimiento de especies de Steinernema y Heterorhabditis que han sido recuperados de muestras de suelos y de insectos plagas infectados naturalmente (Georgis y Hom, 1992). En México solamente se ha documentado la cepa Mexicana de Steinernema carpocapsae, que originalmente fue recuperada de larvas infectadas de la palomilla de la manzana [Cydia pomonella (L.)]: en Allende, Chihuahua por Caltagirone (Poinar, 1970). Sin embargo, es poca la información respecto a la distribución, identificación y potencial de otros nematodos nativos, que puedan permitir la selección de aislados o especies eficaces (Stock, 1995). Motivo por el cual, es necesario caracterizar su biodiversidad, para manipularlos y contribuir de esta manera con la

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agricultura sustentable, para promover la práctica de utilizar nematodos para el control biológico de insectos y otras plagas (Barker et al., 1994).

Por otro lado, en el Estado de Zacatecas el control de insectos plaga de interés económico, especialmente para cultivos de alta rentabilidad, se realiza mediante la aplicación de insecticidas convencionales, que han propiciado el incremento de restricciones para su uso debido al aumento de contaminación ambiental y problemas de resistencia de los insectos a estos productos químicos. La interacción con otros factores de carácter tecnológico, socioeconómico y cultural, impiden que las estrategias de control no den resultados favorables. Por consiguiente, es necesario la implementación de otros métodos de control alternativo y aprovechar los agrosistemas que ofrecen un gran potencial no explorado, por lo cual, se requiere buscar y caracterizar los nematodos entomopatógenos adaptados localmente, donde probablemente existen, interactúan y han logrado coevolucionar con insectos nativos, lo que permitirá establecer las bases para su uso en programas de manejo integrado de plagas, que posibiliten el desarrollo de nuevas tecnologías para su preparación y aplicación. El grado de adaptabilidad, persistencia, tolerancia, infectividad y variabilidad genética entre ellos, determinarán su potencial como agentes de control biológico sobre insectos plaga que afectan cultivos de importancia económica en el Estado.

Con base a lo anterior y ante la ausencia de estudios sobre la distribución natural de nematodos entomopatógenos (Steinernematidae y Heterorhabditidae) en Zacatecas, México, la pregunta científica de ésta investigación fue la siguiente: ¿Cuál es el efecto de las condiciones edafológicas y climáticas sobre la existencia, distribución natural y diversidad de los nematodos entomopatógenos en los sistemas agroecológicos de la región Centro-Sur del Estado de Zacatecas?

Como una posible respuesta a esta pregunta científica, la hipótesis de trabajo fue la siguiente: Las condiciones edafológicas y climáticas de los sistemas agroecológicos, son favorables para la existencia, distribución natural y diversificación de nematodos entomopatógenos de los géneros Steinernema y Heterorhabditis en la región Centro-Sur del Estado de Zacatecas.

14

Con el proposito de confirmar la hipótesis, el objetivo general del presente trabajo fue: Determinar

la

distribución

natural

de

nematodos

entomopatógenos

(Nematoda:

Steinernematidae y Heterorhabditidae) nativos en los sistemas agroecológicos de la región Centro-Sur de Zacatecas. En tanto que para lograr lo anterior, los objetivos particulares planteados fueron los siguientes:

1.- Determinar la distribución natural de los nematodos entomopatógenos (Steinernematidae y Heterorhabditidae) adaptados localmente en diversas áreas agroecológicas de Zacatecas. 2.- Confirmar la patogenicidad y postulados de Koch de los nematodos entomopatógenos aislados en contra de larvas de palomilla mayor de la cera Galleria mellonella. 3.- Determinar los géneros de nematodos entomopatógenos (Steinernema y Heterorhabditis) asociados en los cultivos de la región. 4.- Correlacionar la incidencia y distribución natural de los nematodos entomopatógenos con los sistemas agroecológicos, los factores edafológicos y climáticos de la región CentroSur del Estado de Zacatecas.

15

II. ANTECEDENTES 2.1 Los nematodos parásitos de insectos En la actualidad el parasitismo de los nematodos para los insectos es reconocido, de los cuales más de 30 familias están asociadas en alguna vía y de éstas, nueve muestran potencial para control biológico (Kaya, 1993). En orden ascendente aproximado las siguientes familias son Allantonematidae, Parasitylenchidae, Lotonchiidae, Tetradonematidae, Sphaerulariidae, Mermithidae, Phaenopsitylenchidae, Steinernematidae y Heterorhabditidae. Estos nematodos que infectan centenares de especies de insectos, de casi todos los Órdenes ocasionan esterilidad, reducción en la fecundidad, longevidad y actividad del vuelo, retardan el desarrollo y cambios de comportamiento, morfológicos o fisiológicos (Kaya et al., 1993).

2.2

Los nematodos entomopatógenos Heterorhabditidae

Steinernematidae

y

El parasitismo de insectos ocasionado por los nematodos pertenecientes a las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae y su asociación simbiótica natural, con bacterias específicas del género Xenorhabdus y Photorhabdus respectivamente, durante años ha llamado la atención por parte de los nematólogos y entomólogos de todo el mundo, el cual es atribuido al éxito como agentes de control biológico de insectos plaga de importancia económica. Entre las razones que justifican este extraordinario interés, destacan la amplia distribución geográfica, el alto grado de adaptabilidad, su variabilidad genética y diversidad ecológica. Por lo cual, diversas especies están siendo utilizadas en el control biológico clásico, en programas de liberaciones inundativas o inoculativas y en el manejo integrado de plagas, contra una variedad de insectos. Por otro lado, la necesidad de encontrar e implementar nuevas estrategias de control alternativas para los insecticidas convencionales, diversas compañías comerciales han desarrollado y obtenido nuevos productos basados en nematodos entomopatógenos, lo que viene a confirmar la importancia de su uso como bioinsecticidas.

Los nematodos entomopatógenos forman parte de un grupo variado de organismos, que virtualmente existen en cada medio ambiente del mundo. Donde la mayoría de sus especies

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han resultado ser aliados importantes en el control biológico de insectos plaga (Barker et al., 1994). Estos constituyen un grupo complejo y heterogéneo, en parte, por las diversas categorías taxonómicas que lo conforman, por las características biológicas de las diferentes especies y por los mecanismos variados de interacción con el medio ambiente donde habitan (Agüera y Laumond, 1993). Entre los insectos y nematodos, existen más de 3,000 asociaciones naturales clasificadas desde foresis a parasitismo y patogénesis; la mayoría de estas interacciones son dañinas o medianamente débiles; comparadas con algunos nematodos que causan mortalidad al hospedero (Poinar, 1990; Gaugler, 1981).

El Orden Rhabditida contiene a la mayoría de los nematodos de vida libre, donde están agrupadas las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae, parásitos facultativos (patógenos) de insectos y que representan la principal línea de patogenicidad, que ha dado origen a formas como Steinernema=Neoaplectana y Neosteinernema (Steinernematidae) y Heterorhabditis (Heterorhabitidae) (Poinar, 1990; Nguyen y Smart, 1994). Estos nematodos son denominados entomopatogénos, lo cual ha reforzando la vinculación entre la nematología de los insectos y la patología de insectos (Gaugler y Kaya, 1990; Tanada y Kaya, 1993). Esta relación entre el nematodo y la bacteria, es considerada mutualista, porque la bacteria no puede penetrar dentro del hemocele de los insectos hospederos sin el nematodo y estos no pueden crecer y reproducirse en ausencia de la bacteria (Georgis y Poinar, 1994). En la actualidad algunas de sus especies, son ampliamente reconocidas por su potencial como agentes de control biológico e inundativo (Downes y Griffin, 1996) y causantes de algunas importantes epizootias (Akhurst et al., 1992).

Kaya y Gaugler (1993) señalan que los juveniles infectivos de vida libre, no se alimentan, se asemejan y poseen atributos significativos tanto de insectos parasitoides o depredadores, como de patógenos, porque tienen quimioreceptores y son móviles, tienen un alto potencial reproductivo y una respuesta numérica pero no funcional y porque son altamente virulentos para sus hospederos. Después de su penetración en la cavidad del cuerpo de los insectos, rompen las reacciones de defensa, liberan su bacteria simbiótica que ocasiona una septicemia y la muerte del insecto objetivo. Además, porque estos nematodos actúan como vectores de las bacterias, tenemos que adoptar el término de nematodos

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entomopatógenos, más bien que “entomofílicos”, “entomógenos”, “entomófagos” o “nematodos parásitos de insectos”. De hecho estos nematodos ocupan una posición entre depredadores y agentes microbianos (Gaugler y Kaya, 1990; Boemare et al., 1997).

Los nematodos entomopatógenos son únicos porque poseen todos los atributos de un agente de control biológico “ideal”, debido al amplio rango de hospederos que presentan, capacidad de búsqueda, desarrollo e introducción de sus bacterias simbióticas dentro del cuerpo de los hospederos; al matar a los insectos dentro de las 24-48 horas siguientes para su desarrollo y reproducción; facilidad relativa de reproducción de los estadios infectivos a gran escala en medios artificiales, sólidos o líquidos, los cuales pueden ser almacenados por largos períodos y mantener su viabilidad y patogenicidad hasta cinco meses a temperaturas bajas, incluso durante 12 meses en refrigeración y ser aplicados por métodos convencionales, persistiendo en el medio ambiente natural (Poinar, 1990; Georgis y Hague, 1991; Kaya et al., 1993). Asimismo, los steinernematidos y heterorhabditidos y su bacteria simbiótica, a diferencia de otros patógenos de insectos, en pruebas extensivas han demostrado una comp leta ausencia de patogenicidad sobre mamíferos, plantas y entomofauna benéfica no objetivos (Gaugler y Boush, 1979; Gaugler, 1981, 1987; Poinar et al., 1982; Timper, et al., 1988).

Por consiguiente, la Representación Federal de Insecticidas, Fungicidas y Rodenticidas de la Agencia de Protección del Medio Ambiente de los Estados Unidos de Norteamérica, ha exentado a estos nematodos de registros y regulaciones gubernamentales para su desarrollo comercial (Gorsuch, 1982; Nickle et al., 1988; Georgis, 1992). También se han elaborado guías para la importación, movimiento y liberación de nematodos exóticos (Parkman et al., 1992; Smart, 1992). Igualmente, han sido adoptados por países de la Organización para el Desarrollo

y

Cooperación

Económica

en

Europa

(Ehlers

y

Hokkanen,

1996).

Consecuentemente, en ciertos países de América Latina y el Caribe no existen muchas leyes y normas regulatorias que hayan sido establecidas y que inspeccionen su liberación en campo (Georgis, 1992).

Sin embargo, existen importantes factores que afectan el nivel de riesgo por la introducción de estos nematodos, que incluyen: el potencial del rango de expansión, el rango

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de hospederos del nematodo candidato, el efecto de sus encuentros con organismos no objetivos; la permanencia de la introducción y la vulnerabilidad del hábitat objetivo, las relaciones de los nematodos y su bacteria asociada y su efecto dinámico en la comunidad del ecosistema. Por lo cual, debido a que nuevas especies de Heterorhabditis y Steinernema y su bacteria asociada se siguen aislando, la liberación de estos nematodos deberán esperar resultados de estudios de pre- liberación más rigurosos, sobre identificación y rango de hospederos, así como el efecto sobre organismos no objetivos (Jansson, 1993).

Bergley (1990) me nciona que los nematodos entomopatógenos han sido usados principalmente, contra estadios de ciertos insectos del suelo y de hábitat crípticos, incluso para diversas plagas que se encuentran en el estiércol y en hábitat acuáticos. Aunque, también se pueden desarrollar en muchas especies de diversos hospederos, observándose que el desarrollo óptimo es diferente con la especie o cepa de nematodo que se pretende desarrollar (Georgis y Gaugler, 1991). Esto sugiere una susceptibilidad particular del insecto, que es variable también dentro de los diferentes estadios de desarrollo del insecto y una virulencia intrínseca del nematodo o cepa (Fuxa et al., 1988; Simöes y Rosa, 1996; Molina-Ochoa et al., 1996).

Por lo tanto, Gaugler (1987) señala otra ventaja importante en ellos y sugiere la posibilidad de realizar estrategias de mejoramiento genético, que incluyan hibridación, selección artificial y manipulación genética. Entre los candidatos ideales destacan los heterorhabditidos debido a su simplicidad, transparencia, facilidad de cultivo, generación de corto tiempo y el tamaño pequeño de su genoma (Gaugler et al., 1997) que permitan incrementar su infectividad, virulencia, capacidad reproductiva y tolerancia a las temperaturas extremas y a la desecación (Glazer, 1996; Shapiro et al., 1997) para aumentar la eficacia de las especies y cepas de nematodos cuando son aplicadas en el campo (Gaugler et al., 1997).

2.3 Rango de hospederos Un aspecto importante que se debe considerar para que pueda realizarse una infección, es la coincidencia espacio temporal del complejo nematodo- insecto, lo que asegura el éxito de control. En este caso, una contribución significativa que proporcionan las especies y cepas de

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nematodos entomopatógenos, es su especificidad contra un amplio rango de hospederos. La mayoría de los Ordenes de insectos, son susceptibles de ser infectados bajo condiciones experimentales, aún recientemente, se reporta su parasitismo en el campo o que son severamente dañinas en el laboratorio. Este control se ha extendido a diferentes estadios metamórficos de diferentes categorías taxonómicas y tróficas, particularmente en insectos plaga del suelo y de hábitat crípticos.

El interés intenso en los steinernematidos y heterorhabditidos, es un reflejo de su impresionante potencial para el control biológico. Significativamente, debido a la bacteria asociada que mata rápidamente a los hospederos, los nematodos no están adaptados al ciclo de vida del hospedero específico y son capaces de parasitar cientos de insectos plagas, este espectro de actividad, es más característico de un insecticida químico que de un biológico (Gaugler, 1988). Al respecto, Forschler et al. (1990) afirman que el mayor factor que determina la susceptibilidad, es la capacidad de los nematodos para penetrar a los insectos. Generalmente, la mayoría de estos hospederos susceptibles son aquellos más fácilmente penetrados por los nematodos (Georgis y Manweiler, 1994).

De este modo, el complejo nematodo-bacteria altamente adaptado, mata súbitamente a los insectos, así como aquellos nematodos que no realizan formas íntimas, relaciones características de hospederos-parásitos y otras asociaciones insecto-nematodo, por ejemplo, los mermítidos. Esta mortalidad rápida permite a los nematodos explorar un rango de hospederos que alcanzan aproximadamente a todos los Ordenes de insectos; un buen espectro de actividad más allá que de cualquier otro agente de control microbiano. Sin embargo, los nematodos poseen una especificidad estrecha o amplia, según se tengan en cuenta los datos provenientes de parasitismo natural o en condiciones de laboratorio, respectivamente. En efecto, pocos son los registros referidos al parasitismo en condiciones naturales; los insectos descubiertos parasitados naturalmente, pertenecen principalmente a coleópteros y lepidópteros que en algún momento de su ciclo de vida deben permanecer en el suelo. El éxito de los nematodos en campo es limitado por la sensibilidad a los factores intrínsecos (genéticos, fisiológicos y el comportamiento característico de los juveniles infectivos) y los factores extrínsecos, como los abióticos y bióticos que afectan la supervivencia de los nematodos

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(Curran, 1993a). Entre los factores abióticos que perjudican su persistencia, se encuentran principalmente la humedad y textura del suelo, temperaturas extremas, luz ultravioleta y salinidad (Kaya, 1990; Smits, 1996; Thurston et al., 1994). Mientras que los factores bióticos que pueden destruir un número significativo de nematodos, restringir su uso como agentes de control biológico y afectar adversamente la supervivencia de ellos y su bacteria simbiótica, incluyen la antibiosis, competencia y enemigos naturales (depredadores, parásitos y patógenos) (Ishibashi y Kondo, 1986; Kaya, 1990; Kaya y Thurston, 1993).

Por otro lado, la efectividad del rango de hospederos en el campo es limitada, debido al bajo número de nematodos que buscan el hospedero (Smits, 1996) y por mecanismos de defensa efectivos de los insectos hospederos potenciales (Akhurst y Dunphy, 1993; Simöes y Rosa, 1996). La respuesta defensiva de los insectos, mediante la prevención de la infección, por la vía pasiva de barreras estructurales para la penetración del hemocele (Dunn, 1986). También existen barreras fisiológicas igualmente condicionantes, entre las que destacan la encapsulación de las larvas infectantes y las respuestas humorales contra las bacterias endosimbióntes que portan los nematodos (Dunphy y Thurston, 1990).

Gaugler (1988) señala que en la naturaleza, el rango de hospederos puede ser restringido por las barreras ecológicas y de comportamiento que existen para la infección. Evidencia considerable indica que el rango de hospederos de los nematodos en los sistemas naturales es menor y por consiguiente, infectan menos especies (Poinar, 1989; Kaya y Gaugler, 1993) debido a su corta persistencia (Curran, 1993b). Donde la inactivación es más sensible en heterorhabditidos, que impide su utilización como bioinsecticidas a su máxima ventaja bajo estas condiciones (Bedding, 1981). No obstante, el rango de hospederos (que es dependiente en la favorable penetración por los nematodos en los diferentes insectos) limita las posibilidades de reunirse en cada uno de los hábitat (por ejemplo, los insectos consumidores de hojas no pueden ser realmente atacados en la naturaleza) y por la densidad de poblaciones naturales de los nematodos (Peters, 1996). Entre los muchos hospederos favorables como larvas agregadas que dispausan o ivernan, representan grandes concentraciones de hospederos adecuados para el parasitismo y la reproducción rápida de los nematodos. Las agregaciones naturales de los insectos puede proporcionar importante

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conocimiento sobre la distribución de los nematodos, su existencia en los hábitat, así como, en v

el impacto en la variación de la abundancia de los hospederos (Mrácek y Sthurhan, 2000).

Agüera y Laumond (1993) sugieren que sí se consideran las estrategias de aplicación y el conocimiento preciso de la etología de los insectos, destacan los resultados obtenidos en el control de insectos del suelo y el ámbito natural de acción de los juveniles infectivos. Donde cualquier insecto hospedero podría ser controlado en el propio cultivo en el que causan daño, a condición de que no existan barreras ecológicas y de comportamiento que limite su especifícidad. Al respecto, Bedding et al. (1983) consideran que el potencial actual para su uso en una variedad de plagas de cultivos es grande, porque diversos aislamientos muestran diferencias en la supervivencia e infectividad en plagas particulares, con promedio más favorables en algunos para utilizarse en programas de control biológico.

Sin embargo, los registros de infecciones naturales del número total de especies de Steinernema y Heterorhabditis reconocidas, se carece de información al menos de la mitad de ellas (Peters, 1996). Excepto para S. carpocapsae y S. feltiae ampliamente distribuidas la mayoría de las especies parecen tener un rango de hospederos restringido, infectando a pocas especies de insectos de dos Ordenes. Por ejemplo, solamente ha sido encontrado infectando larvas de escarabajos, mientras que en S. rara únicamente se ha observado en especies de Heliothis (Peters, 1996). En cambio, el rango de hospederos naturales de S. carpocapsae es amplio y frecuentemente cubre a cuatro Órdenes de insectos (Coleoptera, Hymenoptera, Diptera y Lepidoptera) y 10 familias, sin embargo, los escarabajos no son considerados en formar una parte significativa de su rango de hospederos. Igualmente S. feltiae se ha encontrado

infectando

a

Coleoptera

(Scarabaeidae,

Curculionidae)

y

Lepidoptera,

principalmente Noctuidae. En cambio S. glaseri únicamente se ha detectado en larvas de escarabajos. Mientras que H. bacteriophora se ha descubierto en asociación con Lepidoptera (Noctuidae) y Coleoptera (Scarabaeidae, Crysomelidae y Curculionidae). En tanto que H. megidis solamente ha sido aislado en Scarabaeidae y Curculionidae (Peters, 1996). Diversos experimentos en laboratorio y campo han demostrado que los heterorhabditidos son mejores para controlar larvas de escabajos que S. carpocapsae (Klein, 1990; 1993). Entre estos, S.

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carpocapsae, S. feltiae y H. bacteriophora son apreciados como generalistas lo que refleja su amplia distribución global (Peters, 1996).

Por el contrario, bajo condiciones de laboratorio el número de insectos susceptibles de ser parasitados parecen ilimitados (Poinar, 1990; Laumond et al., 1979), en éstas condiciones son capaces de invadir y en muchos casos de matar un gran número de especies de insectos, puesto que se asegura el contacto del hospedero, las condiciones ambientales son óptimas y no existe ninguna barrera ecológica o de comportamiento a la infección (Gaugler, 1981; 1988). Las evaluaciones de S. carpocapsae han reportado que infecta a más de 250 especies de insectos (Poinar, 1979; 1990) pertenecientes aproximadamente de 75 familias que se extiende a casi 11 Ordenes de insectos: Coleoptera, Lepidoptera, Diptera, Hymenoptera, Homoptera, Isoptera, Saltatoria y Odonata, entre otros (Poinar, 1979; Peters, 1996); que pueden atacar a los estadios biológicos de larva, pupa e insectos adultos (Kaya, 1981), con una alta densidad de nematodos y sin posible escape de los hospederos (Poinar, 1986). Aunque una variedad de entomopatógenos que predominantemente infectan insectos larvas, también son observados normalmente en insectos adultos, tal es el caso de los steinernematidos (Lacey et al., 1993).

También destacan los resultados obtenidos por algunas especies de Steinernema para el control de poblaciones de lepidópteros barrenadores en hábitat crípticos (Bergley, 1990); moscas minadoras Liriomyza trifolii en plantas ornamentales de invernadero (LeBeck et al., 1993); moscas caseras Musca domestica en estiércol de gallineros (Belton et al. 1987) y en otras unidades intensivas de animales (Renn, 1998) y aquellas que parasitan únicamente grillos, termitas y otros orthópteros específicos (Nguyen y Smart, 1990; 1992; 1994). Por otro lado, epizootias naturales ocasionadas por nematodos entomopatógenos son raras, las cuales no han sido reportadas por miembros del gé nero Steinernema, parece ser que desarrollan una asociación relativamente balanceada con sus hospederos naturales (Peters, 1996). En cambio, para Heterorhabditis únicamente existen dos registros de epizootias y estas fueron limitadas en campos de menos de seis hectáreas, con una densidad alta de hospederos (Akhurst et al., 1992; Peters, 1996), mismas que fueron descubiertas en el picudo de las franjas blancas Graphognathus leucoloma (Sexton y Williams, 1981) y sobre larvas de escarabajos de la caña de azúcar (Akhurst et al., 1992).

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Este extraordinario rango de hospederos, es una de las principales razones, por el intenso interés en el desarrollo de nematodos para el control biológico de plagas (Kaya y Gaugler, 1993). Evidentemente, diversas compañías han exp lorado el control biológico potencial de los nematodos entomopatógenos, cuya comercialización ocurrió en 1983 con la formación de Biosys enfocada en la eficiencia para su producción tecnológica in vitro (Friedman, 1990). Subsecuentemente, ha continuado su producción en el mercado contra una diversidad de plagas de frutales (manzano y durazno), en pastizales (grillo topo), champiñones (moscas sciaridas) y muchas otras plagas agrícolas y ornamentales (Gaugler et al., 2000).

2.4 Taxonomía de los nematodos entomopatógenos Los nematodos entomopatógenos forman parte de la diversidad de formas de vida que habitan el planeta. Debido al extenso y complejo grupo que lo conforman, la clasificación taxonómica provee una sistematización para su estudio y organización, lo que permite ubicarlos jerárquicamente en grupos taxonómicos con base a sus relaciones morfológicas, biológicas y filogenéticas, de acuerdo a los principios, reglas y procedimientos del Código Internacional de Nomenclatura Zoológica.

Hominick et al. (1997) señalan con claridad la posición correcta de los diversos nombres propuestos y los establecidos por las autoridades en las especies de Steinernema, Neosteinernema y Heterorhabditis acordados por el Código Internacional de Nomenclatura Zoológica. La no menclatura y clasificación de los nematodos entomopatógenos Steinernema Travasos, 1927, Neosteinernema Nguyen y Smart, 1994 y Heterorhabditis Poinar, 1976 (Nematoda: Rhabditida: Rhabditoidea) es la siguiente: la familia Steinernematidae Chitwood y Chitwood, 1937 comprende a dos géneros, Steinernema Travasos, 1927 con un total de 22 especies y Neosteinernema Nguyen y Smart, 1994, con una sola especie. Mientras que la familia Heterorhabditidae Poinar, 1976 contiene un solo género Heterorhabditis con ocho especies (Poinar, 1990; Hominick et al., 1997). Las especies descritas y reconocidas para ambos géneros se muestran en los Cuadros 1 y 2, respectivamente.

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Cuadro 1 Especies descritas y reconocidas para el género Steinernema Especie

Hospedero/Hábitat 1

Localidad/País

Autoridades

Steiner (1923) Westphalia, Alemania Cephalia habietis S. kraussei* Steiner (1929) New Jersey, EE.UU. Popilia japonica S. glaseri Filipjev (1934) Dinamarca Bibio spp. S. feltiae Bovien (1937) Skive, Dinamarca Bibio spp. S. affinis Weiser (1955) República Checa Cydia pomonella S. carpocapsae Kozodoi (1984) Ryazan, Rusia Central Phyllophaga sp. S. anomali Poinar (1985) Carolina Norte, EE.UU. Suelo S. intermedia Doucet (1986) Córdoba, Argentina Suelo S. rara Hamakita, Shizuoka, Japón Mamiya (1988) Anomala cuprea S. kushidai Doucet y Doucet (1990) Suelo S. ritteri Córdoba, Argentina Nguyen y Smart (1990) Scapteriscus vicinus S. scapterisci Uruguay Xu et al. (1991) Suelo S. caudatum Japón y China Nguyen y Smart (1992) Neocultilla hexadactyla Florida, EE.UU. S. neocurtillae Shen y Wang (1992) S. longicaudum Suelo China Cabanillas et al. (1994) S. riobrave Texas, EE.UU. Helicoverpa zea Román y Figueroa (1994b) S. puertoricensis Suelo Puerto Rico v Mrácek et al. (1994) Cuba Suelo S. cubanum Tallosi et al. (1995) Vojvodina, Yugoslavia Suelo S. bicornutum Liu y Berry (1996) Oregon, EE.UU. Suelo S. oregonense Stock et al. (1997) Gyeongnam, Korea Suelo S. monticolum Jian et al. (1997) Liaoning y Jining, China S. ceratophorum Suelo Waturu et al. (1997) Provincia Central, Kenia Suelo S. karii Elawad et al. (1997) Sultanato de Oman Suelo S. abbasi Stock et al. (1998) Lohmsak, Tailandia Suelo S. siamkayai Phan et al. (2001a) Hatinh, Vietnam Suelo S. loci Phan et al. (2001a) Thanhhoa, Vietnam Suelo S. thanhi Phan et al. (2001b) Thanhhoa, Vietnam Suelo S. sangi 1 Especies aisladas del suelo usando larvas de Galleria mellonella (Bedding y Akhurst, 1975). * Especie tipo del género Steinernema

En tanto que el género Neosteinernema Nguyen y Smart, 1994 ubicado en la familia Steinernematidae, contiene una sola especie tipo, N. longicurvicauda Nguyen y Smart, 1994 recuperada de la termita Reticulitermes flavipes en Florida, EE.UU. Sin embargo, difiere morfológica y biológicamente del género Steinernema.

En cambio, existen algunas cepas o aislamientos tanto de steinernematidos como de heterorhabditidos que se encuentran aún sin describir o no han sido asignadas a especies conocidas (Kaya y Gaugler, 1993).

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Cuadro 2 Especies descritas y reconocidas para el género Heterorhabditis Hospedero/Hábitat 1

Especie

Localidad/País

Autoridades

Poinar (1975) Brecon, Sur de Australia H. bacteriophora* Heliothis punctigera Poinar et al. (1987) Jeromesville, Ohio, EE.UU. Popillia japonica H. megidis Poinar (1990) Auckland, Nueva Zelanda Scarabaeidae H. zealandica Poinar et al. (1992) Scirpophaga excerptalis Coimbatore, India H. indica Liu (1994) China Suelo H. brevicaudis Gardner et al. (1994) Islas Hawaii, EE.UU. Suelo H. hawaiiensis Stock (1995) Rafaela, Argentina Suelo H. argentinensis Liu y Berry (1996) Oregon, EE.UU. Suelo H. marelatus 1 Especies aisladas del suelo usando larvas de Galleria mellonella (Bedding y Akhurst, 1975). * Especie tipo del género Heterorhabditis

Los nombres propuestos para muchos gr upos de estos nematodos parásitos de insectos, especialmente de steinernematidos, han sido propuestos en consideración a pioneros que contribuyeron en el desarrollo de la Nematología de Insectos y su Sistemática. Por ejemplo, la familia Steinernematidae y el género Steinernema fueron designadas en honor a Gotthold Steiner (1886-1961) considerado el “padre de los Nematodos Entomopatógenos” en América. De igual forma S. glaseri en reconocimiento a Rudolf W. Glaser (Poinar, 1990). Así como S. siamkayai Stock et al. (1998) en honor del Dr. Harry K. Kaya. Asimismo, el nombre de algunas especies se ha designado por el insecto hospedero del que se colectó, por ejemplo: S. scapterisci Nguyen y Smart (1990) y S. neocurtillae Nguyen y Smart (1992) de grillos topos Scapteriscus

vicinus

y

Neocurtilla

hexadactyla,

respectivamente;

Neosteinernema

longicurvicauda Nguyen y Smart (1994) de la termita Reticulitermes flavipes, y H. hepialus Stock et al. (1996) de larvas de la palomilla fantasma Hepialus californicus. También por el país o ciudad donde se han localizado, por ejemplo, H. zealandica Poinar (1990), H. indica Poinar et al. (1992), H. argentinensis Stock (1993), H. hawaiiensis Gardner et al. (1994), S. v

puertoricensis Román y Figueroa (1994), S. cubanum Mrácek et al. (1994) y S. oregonense Liu y Berry (1996).

En cambio, otras especies se han nombrado de acuerdo a la presencia de un carácter morfológico en particular, tal es el caso de N. longicurvicauda Nguyen y Smart (1994), S. bicornutum Tallosi et al. (1995), H. brevicaudis Liu (1994), S. ceratophorum Jian et al. (1997). Incluso por el hábitat particular donde se han aislado, por ejemplo, S. riobrave

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Cabanillas et al. (1994), H. marelatus Liu y Berry (1996). Finalmente, S. karii Waturu et al. (1997) nombre asignado después, en honor al Instituto de Investigaciones Agrícolas de Kenia. Del mismo modo, diversas especies de nematodos han sido referidas generalmente como cepas o aislamiento. Por ejemplo, muchas cepas de Steinernema carpocapsae después han sido designadas individualmente (All, Hamm, Breton, Pye); también a los países donde se han aislado (Mexicana, Argentina, Italiana); por los insectos hospederos (Agriotos, Rhagoletis) o por códigos (DD-136, HP 88, P7) (Poinar, 1990; Kaya y Gaugler, 1993).

2.5 Identificacion de los nematodos entomopatógenos La identificación de nuevas especies y cepas de nematodos entomopatógenos, representa una mayor diversidad genética. Existen diversos métodos que facilitan y permiten la determinación de steinernematidos y heterorhabditidos, entre las que destacan principalmente las claves taxonómicas basadas en caracteres morfológicos. Aunque, debido a la considerable variación de la morfología entre espécimenes del mismo género o especie y la dificultad para observar carácteres taxonómicos de ciertos nematodos, el análisis morfométrico, también es utilizado. Para observaciones más detalladas de ciertos carácteres, comúnmente a través de microscopía electrónica se obtienen microfotografias de estructuras específicas. La técnica de cruzamiento-cría es realizada principalmente para nematodos heterorhabditidos. Así como diversas técnicas moleculares que han contribuido a la identificación exacta.

2.5.1 Identificación morfológica y morfométrica

Sosa et al.(1998) señalan que un estudio cualitativo y cuantitativo de caracteres que definen a un organismo se denomina caracterización, que puede ser realizada por la identificación de caracteres morfológicos, fisiológicos, de comportamiento y genéticos. La cual es de gran valor en los estudios de epizootiología y de distribución espacio-temporal, que permiten evaluar su capacidad de recombinación. También posibilita un reconocimiento de los aislados más adaptados a una localidad específica y facilita un entendimiento de las relaciones patógeno-hospedero a través de informaciones relacionadas a la variación de la estructura

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poblacional. Estos aspectos son importantes cuando se pretende introducir o establecer un patógeno para un control permanente de una plaga o cuando se quiere evaluar el impacto ambiental resultante de la aplicación de un organismo.

Hirschmann (1985) menciona que los caracteres taxonómicos tienen una doble función: a) en microtaxonomía (identificación) tienen un aspecto del diagnóstico como indicadores de categorías al nivel de especie o más inferiores, y b) en macrotaxonomía (clasificación), como indicadores de las relaciones que ayudan en la correcta delimitación y clasificación jerárquica de taxas superiores. El uso de datos cuantitativos (medidas y conteos de caracteres), a menudo son importantes porque especies relacionadas no difieren por la presencia o ausencia de una estructura, pero sí más bien, por el tamaño, proporciones o número, son estandarizadas y exactas. Los estudios morfológicos detallados son esenciales para identificar bajo un procedimiento estándar la separación de especies (Poinar et al., 1972). Tales estudios deberán establecer la identidad de las especies y ayudar entre las comparaciones coespecíficas individuales. El descubrimiento y producción de una línea específica o tipo que es particularmente virulenta para ciertas plagas, deberán ser apremiantes. El estado taxonómico de las especies de nematodos, es enfocado más allá por la existencia de cepas, las cuales muestran rasgos morfológicos o de comportamiento que aparentemente segregan tales cepas de la serie del tipo específico (Simser, 1986).

Durante los últimos años, el número de nuevos aislamientos se ha incrementado enormemente (Glazer et al., 1991; Amarashinge et al., 1994; Liu y Berry, 1995). Los métodos morfológicos clásicos han sido aplicados sucesivamente para la descripción, identificación y clasificación de nematodos entomopatógenos para género y especie. La identificación correcta es esencial para que otros trabajos puedan ser replicados y comparados significativamente (Curran, 1990). Al respecto, Poinar (1990) sugiere algunos caracteres morfológicos y las proporciones para medir juveniles de estadios infectivos de especies de Heterorhabditis. Asimismo, Nguyen y Smart (1997) recomiendan la siguiente simbología común y abreviaciones usadas, en la morfometría de juveniles infectivos de 1ª y 2ª generación de Steinernema y Heterorhabditis: L = Longitud total del cuerpo; W = Anchura mayor del cuerpo; EP = distancia de la cabeza al poro excretor; NR = distancia de la cabeza al anillo

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nervioso; ES = distancia de la cabeza a la base del esófago; T = distancia del ano a la punta de la cola; a = Longitud total del cuerpo/anchura mayor del cuerpo; b = Longitud total del cuerpo/distancia de la cabeza al esófago; c = Longitud total del cuerpo /longitud de la cola; D% = distancia de la cabeza al poro excretor/distancia de la cabeza a la base del esófago X 100; E% = distancia de la cabeza al poro excretor/longitud de la cola X 100.

Por otro lado, existen diversas claves taxonómicas basadas en juveniles infectivos de tercer estadio para especies de Steinernema (de Doucet y Doucet, 1990) y para juveniles infectivos y machos de especies de Steinernema y Heterorhabditis (Nguyen y Smart, 1996; Stock y Kaya, 1996). Especies sin describir han sido identificadas en la literatura (Smits et al. 1991; Dix et al., 1992) otras probablemente permanecen sin ser descritas e identificadas y se requieren estudios taxonómicos más detallados (Stuart y Gaugler, 1994). Wright (1990) y Joyce et al. (1994) afirman que es difícil encontrar un buen diagnóstico de caracteres morfológicos para la identificación de especies. Sin embargo, los estudios morfológicos deben continuar por formar el centro esencial de la taxonomía de los nematodos entomopatógenos (Curran, 1990). La identificación correcta de los nematodos deberá ser una prioridad en futuros trabajos, para prevenir la duplicación innecesaria de investigaciones (Hominick, 1990).

Hominick et al. (1997) reportan que en un taller donde participaron aproximadamente 40 especialistas europeos de 17 países y dos de América, el grupo de trabajo sobre aislamientos e identificación de nematodos entomopatógenos, proporcionaron detalles precisos de los métodos usados para obtener especímenes para descripciones taxonómicas. En donde, se recomendó que los métodos y protocolos detallados serán adoptados para las descripciones taxonómicas de steinernematidos y heterorhabditidos, como una línea base para la taxonomía en futuros trabajos. Esta incluye observaciones sobre disección de insectos hospederos; preparación de nematodos para su examinación en microscopio de luz y electrónico, resguardo y disposición de los especímenes tipos; la valoración de los caracteres taxonómicos de adultos y juveniles para estudios morfológicos y morfométricos usados, claves para las especies, así como diversas técnicas moleculares.

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2.6 Biología de los nematodos entomopatógenos Los nemátodos entomopatógenos son usados exitosamente contra una variedad de insectos plaga, pero los resultados contra ciertos insectos son muy diferentes. Esta variabilidad enfatiza la necesidad de obtener más información sobre los aspectos fisiológicos, genéticos, etológicos y ecológicos, que influyen en su eficacia, así como las interacciones que ejercen en la biología de los nematodos.

2.6.1 Comportamiento de los nematodos La capacidad para encontrar y atacar hospederos susceptibles, es la clave precisa para determinar la actividad bioinsecticida de los nematodos entomopatógenos y probablemente, es la principal fuente de inconsistencia de los resultados en campo.

2.6.1.1 Búsqueda de los hospederos susceptibles El comportamiento de búsqueda es la medida por la cual los animales localizan y adquieren los recursos necesarios para crecer, desarrollarse, mantenerse y reproducirse. Para los nematodos entomopatógenos de la familia Steinernematidae, donde todos los recursos se obtienen de un solo hospedero, el éxito para localizar un hospedero es de gran importancia (Lewis et al., 1993). La caracterización de especies/cepas de nematodos y su hábitat correspondiente en las zonas de actividad de los insectos objetivos, deberá ser el proposito para realizar la eficiencia incrementada (Gaugler, 1988).

Algunas especies, incluyendo S. glaseri y heterorhabditidos particularmente Heterorhabditis del grupo NW Europeo (Smits et al., 1991), migran activamente a través del suelo. Otras, tales como S. carpocapsae, migran menos y pueden zigzaguear sobre superficies sólidas cuando la humedad relativa es alta, esto es una conducta a través de diversos pasos guiados para la infección de un hospedero (Ishibashi et al., 1994). Comportamiento que ha sido estudiado en un período de tiempo, con los juveniles infectivos aplicados al suelo, antes de que emerjan directamente del cadáver dentro o fuera del suelo, lo que ha sugerido que ellos reflejan dos diferentes tipos de estrategias (Downes y Griffin, 1996). Estas estrategias

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hallazgo- hospedero han sido denominadas navegadores-cazadores (aquellos que se mueven alrededor para hallar a los hospederos) y emboscadores (aquellos que esperan los hospederos que vienen a ellos) (Lewis et al., 1992). Al respecto, Cui et al. (1993) mencionan que los juveniles de S. glaseri y H. bacteriophora, son navegadores altamente móviles que buscan activa mente los hospederos y son más eficaces contra presas subterráneas sedentarias (Gaugler et al., 1989; Timper et al., 1991). En contraste, los juveniles de S. carpocapsae parecen tener una estrategia emboscadora (posarse y esperar) y son más efectivos contra presas móviles que habitan la superficie (Kaya y Gaugler, 1993). Sin embargo, estas especies acechadoras tendrán más dificultad en localizar los hospederos, principalmente a los sedentarios, tales como los gusanos blancos (Lewis et al., 1992, 1993). Mientras que S. feltiae y Steinernema sp. son intermedios en la búsqueda continua de compartir algunas características de búsqueda de navegadores y emboscadores (Grewal et al., 1994).

Georgis y Poinar (1983) señalan que las observaciones apoyadas por estudios avanzados, muestran que los infectivos tienen una tendencia para permanecer en el sitio de aplicación, aunque el insecto hospedero esté presente. Ishibashi y Kondo (1986b) mencionan que los juveniles de S. carpocapsae se vuelven inactivos en el suelo en ausencia del hospedero y se presume que esto, es una estrategia para conservar energía.

Grewal et al. (1994) consignan que las estrategias de búsqueda de cada especie de nematodo entomopatógenos, se predice de su respuesta a las señales volátiles del hospedero y del comportamiento de dispersión. Frecuentemente, parecen seguir vías favorables a través del suelo. Viajan menos a través de los espacios de poro pequeño (Molyneux y Bedding, 1984), una situación en la cual, probablemente las raíces de las plantas forman vías importantes. Para emigrar son agudamente sensibles en respuesta directa a la liberación de dióxido de carbono del hospedero (Gaugler et al., 1980; Gaugler y Campbell, 1988) y gradientes térmicos (Burman y Pye, 1980), también son atraídos por materiales de sus hospederos o heces fecales y la bacteria simbiótica y pueden ser activados por estrés térmico, mecánico y por ciertos químicos como el ácido úrico, xantina, alantoina, amonia y arginina (Schmidt y All, 1978; Kondo y Ishibashi, 1986; Gaugler y Campbell, 1991).

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2.6.1.2 Penetración a los hospederos Algunos autores enfatizan la importancia de la penetración en la susceptibilidad del insecto al nematodo, considerada como un factor clave en el proceso patogéno (Ishibashi y Kondo, 1990). Esta capacidad, unida con la existencia natural de estos nematodos en todos los suelos, sugiere que es una presión considerable de selección para los insectos del suelo, en desarrollar estrategias para evitar el parasitismo. Entonces, la tendencia de muchos insectos en el suelo, es la quiescencia, especialmente en las pupas, para liberar dióxido de carbono en tasas que continuamente rompen, con el período de emergencia de hasta 7 horas (Chapman, 1982) y puede ser en parte una respuesta coevolucionaria para escapar de la detección y además evitar el parasitismo del nematodo (Gaugler, 1988). Sin embargo, durante el período de emergencia los espiráculos están estrechamente cerrados, evitando el acceso del nematodo. Otros insectos se mueven casi constantemente a través del suelo, incrementando la dificultad de orientación a los hospederos potenciales. Los insectos estacionarios deberán ser objetivos fáciles, pero muchas especies de escarabajos consumidores de raíces, construyen las celdas pupales de partículas de suelo densamente apretadas que pueden presentar una formidable barrera física para la infección (Gaugler, 1988).

La señal del hospedero específico es necesaria para inducir el proceso de penetración. Si los nematodos no pueden reconocer el insecto como un hospedero potencial, resultará una baja en la actividad de la penetración (Simöes y Rosa, 1996). Poinar (1979) señala que los nematodos entomopatógenos para encontrar a los hospederos y vencer el sistema ínmune, a igual que muchos otros parásitos y patógenos, penetran varias barreras físicas para entrar al hemocele y causar la infección. Los juveniles infectivos usan como rutas las aberturas bucales y anales de los insectos, para entrar antes de penetrar a través de la pared del intestino. Triggiani y Poinar (1976) manifiestan que los JIs de S. carpocapsae penetran al insecto a través de los espiráculos, boca y ano. Los espiráculos son una ruta alternativa de entrada, en las cuales los nematodos penetran a través de la pared traqueal (Georgis y Hague, 1981; Nguyen y Smart, 1990).

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Bedding y Molyneux (1982) reportan que los juveniles infectivos (la L2 ) de Heterorhabditis al eclosionar, se desprenden de la cutícula ante la presencia de un insecto hospedero y muestran un diente largo, anterior y terminal, el cual es usado para facilitar la ruptura de las membranas intersegmentarias, al raspar y romper la cutícula de sus hospederos. Estos pueden ser capaces de entrar fácilmente en algunos insectos que son menos vulnerables v

a especies de Neoaplectana, los cuales no tie nen un diente terminal. También, Mrácek et al. (1988) confirman que la boca, ano y espíraculos son los sitios de entrada, a través de los cuales las larvas infectivas entran a sus hospederos. Nguyen y Smart (1991) afirman que los sitios de penetración de S. scapterisci en los grillos topo, se realiza por la boca y los espiráculos, pero probablemente no por el ano y se desarrollan primero en la cabeza y el tórax.

2.6.2 Ciclo de vida de los nematodos El ciclo de vida de los nematodos entomopatógenos es similar, aunque el esquema entre las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae varía un poco. En general comprende seis estadios, el huevo, cuatro estadios larvales y los adultos. Existen diferencias complejas debido a que en steinernematidos incluyen dos ciclos amfimícticos separados del hospedero, mientras que en heterorhabditidos su ciclo es heterogónico, con hembras hermafroditas en el primero. El conocimiento de este patogenicidad.ciclo es de vital importancia, ya que está estrechamente relacionado con la

Los juveniles infectivos o larvas dauer son comúnes entre las especies de parásitos (de animales y plantas) y de vida libre (Bird y Bird, 1991) y son una adaptación común para el estrés ambiental entre diversas familias de nematodos rhabditidos (Evans y Womersley, 1980; Womersley, 1990), los cuales no se alimentan debido a su tracto digestivo colapsado y la boca y ano cerrados, posiblemente para limitar la pérdida de agua o el acceso de patógenos (Poinar, 1990). Una vez que los juveniles infectivos de tercer estadio de Steinernema y Heterorhabditis inician el ciclo de vida, son los responsables para localizar e invadir las larvas de una variedad de insectos hospederos favorables (Grewal y Georgis 1999). Todos los otros estadios de los nematodos existen solamente dentro del insecto. Mientras que estos existen únicamente en el suelo, los cuales suspenden su desarrollo, morfología y fisiología y están

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adaptados para sobrevivir por largos períodos en el suelo, cubiertos por la cutícula firme del segundo estadio (Campbell y Gaugler, 1991). Esta “doble piel” protege a los nematodos de la desecación y otro tipo de estrés ambiental. Las larvas dauer durante la búsqueda de un nuevo hospedero en el suelo, no se alimentan, pero usan sus reservas de grasa. El metabolismo se reduce al mínimo, permitiendo a éstos sobrevivir por varias semanas a meses. Los nematodos de segundo estadio pierden la cutícula durante la penetración en un nuevo insecto hospedero.

Después de la penetración, el nematodo libera la bacteria, la cual conduce en su lumen intestinal (Bird y Akhurst, 1983; Endo y Nickle, 1991) y el insecto muere. Dependiendo del tamaño del insecto, dos o tres generaciones pueden desarrollarse dentro del hospedero muerto. Cuando la población de nematodos ha alcanzado un umbral de una cierta densidad y las condiciones nutricionales disminuyen, un camino alterno conduce el desarrollo para la formación de los juveniles infectivos de tercer estadio, los cuales dejan a los cadáveres de los insectos para buscar nuevos hospederos (Poinar, 1990).

Los nematodos al iniciar la alimentación sobre las células y el tejido de los hospederos, se desarrollan en adultos por la vía de cuatro juveniles. Los adultos de Steinernema son siempre hembras y machos, la reproducción amfimíctica toma lugar, mientras que los juveniles infectivos de Heterorhabditis se desarrollan en hermafroditas, reproducción automíctica, aunque la fertilización misma toma lugar (Poinar, 1975). Asimismo, Wouts (1979) en poblaciones de Heterorhabditis criadas en G. mellonella reconoce dos ciclos, uno con una serie completa de cuatro estadios larvales y una solamente con el primer o cuarto estadio larval. Las L4 en el ciclo de vida completo, son siempre hembras grandes. Las L4 en el ciclo de vida corto son hembras y machos. La segunda generación de Heterorhabditis spp. consiste de machos y hembras amfimícticas (Poinar, 1990). Wouts (1980) describe el ciclo de vida de Neoaplectana bibionis, y también observa cuatro estadios larvales, la L1 sale del huevo, de un hospedero conveniente, sin embargo, cuando la densidad poblacional es baja, se desarrollan directamente en L4 ; pero cuando es alta, se desarrollan en L2 , estas son un estadio que no se alimenta y que procede el infectivo resistente, la L3 es de vida libre. Los primeros adultos se desarrollan en un hospedero fresco y usualmente son largos.

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El estudio sobre el ciclo de vida de una población específica de Heterorhabditis sp., fué detallado por de Doucet y Poinar (1985), destaca que el ciclo es heterogónico, en la primera generación son hembras hermafroditas (generación hermafrodita) y la segunda machos y hembras (generación anfimíctica). De ambas generaciones se originan larvas infectivas. En cada generación existen cuatro estadios larvales, de los cuales el tercero, puede o no ser infectivas según abandone o no el cadáver del insecto. Igualmente, Glazer et al. (1994) reportan el ciclo de vida y reproducción de Heterorhabditis bajo condiciones in vitro e in vivo. En ambos casos, cuando el desarrollo es iniciado por los estadios juveniles, únicamente se desarrollan hermafroditas en la primera generación y los machos aparecen solo en la segunda. Los juveniles se encontraron también in vivo en cadáveres de larvas disectadas de G. mellonella siete días después de la infección.

Por otro lado, Nguyen y Smart (1992) señalan que el ciclo de vida de S. scapterisci, es similar a las descripciones de otras especies de Steinernema, el cual está compuesto por dos ciclos uno largo o normal (con dos generaciones de adultos) y el otro corto (con una generación de adultos). Este consiste en un estadio de huevo, cuatro estadios juveniles y un estado adulto (machos y hembras). El ciclo de los JIs (tercer estadio juvenil infectivo) a JI puede proceder de dos vías. Si los nutrimentos son suficientes y la población no es excesiva, los JIs se desarrollan en machos y hembras de la primera generación. La mayoría de los huevos de estas hembras son incubados y los juveniles se desarrollan a través de cada estadio de vida, para convertirse en hembras y machos de la segunda generación. El ciclo toma de 810 días (ciclo largo) a 24o C. En cambio, sí los nutrimentos son insuficientes o excesivos, los JIs se desarrollan en machos y hembras de la primera generación, y los huevos producidos por éstas hembras se desarrollan directamente en JIs. Este ciclo toma de 6-7 días (ciclo corto).

Asimismo, Selvan et al. (1993) indican que los nematodos de las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae tienen ciclos de vida similares. Dicho ciclo es directo y viven dentro de un solo insecto, los cuales emergen de los cadáveres de los insectos y entran a insectos vivos, únicamente el tercer estadio de vida libre, es un juvenil especializado, llamado después como juvenil infectivo JI o dauer (Koppenhöfer y Kaya, 1995), que conduce las especies de bacterias simbióticas específicas en su intestino (Akhurst, 1986). El tercer estadio

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de los juveniles infectivos (dauers) en los géneros de nematodos Steinernema y Heterorhabditis, es el único estadio encontrado fuera del hospedero y son envainados en las cutículas de su segundo estadio y además es el estadio resistente ambientalmente (Poinar y Leutenegger, 1968; Timper y Kaya, 1989).

Del mismo modo, Downes y Griffin (1996) destacan que el ciclo de vida de Heterorhabditis y Steinernema difieren en una vía importante: los JIs de heterorhabditidos se vuelven a desarrollar en adultos fértiles sí invaden un insecto, en un período de tiempo los JIs de los steinernematidos se convierten en hembras y machos. Esta diferencia ha significado implicaciones para la ecología de estos géneros. Obviamente, la mayoría de Heterorhabditis en un período de tiempo se multiplican, si un solo JI se establece sucesivamente en un hospedero. En contraste, Steinernema requiere que al menos un juvenil infectivo de cada sexo pueda entra al insecto. Cada uno de los dos géneros después produce generaciones dióicas dentro del hospedero.

Otros estudios sobre el ciclo de vida de las especies de heterorhabditidos han sido explicados en detalle. Al respecto, Dix et al. (1992) demuestran que la progenie de la segunda generación de Heterorhabditis spp. fué amfimíctica y demuestran que ésta fue posible para el cruzamiento-cría de los nematodos. En contraste, Glazer et al. (1991) propagan H. bacteriophora aunque la fertilización misma, en todas las generaciones, dieron líneas intercría. Zioni et al. (1992) reportan solamente hermafroditas en la primera generación y los machos en la segunda. Strauch et al. (1994) demuestran que ambas reproducciones, la amfimíctica y la automíctica, pueden ocurrir en la segunda generación de hermafroditas. La descendencia de la primera generación hermafrodita, puede desarrollar en adultos amfimícticos o en hermafroditas automícticas y ambas pueden ocurrir simultáneamente. El desarrollo de adultos amfimícticos es inducido por la baja concentración de nutrimentos; también se sugiere, que las condiciones nutricionales es un fenómeno que induce el desarrollo de los juveniles dauer.

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2.6.3 Asociación mutualista nematodo - bacteria La asociación mutualista entre los nematodos y las bacterias, es única y altamente específica, que involucra una serie de procesos biologícos similares, que les confieren características de mayor virulencia. Los nematodos actúan como vectores y protegen a la bacteria de las condiciones ambientales del suelo y contribuyen significativamente en la patogénesis durante la liberación e invasión del hospedero. Mientras que las bacterias juegan un papel nutricional para el nemátodo, al crear condiciones favorables para su desarrollo y reproducción y antibiosis contra otros organismos extraños. En la actualidad el conocimiento de estas interacciones y los efectos detrimentales que ocasionan, también ha estimulado a los científicos y compañías comerciales para su desarrollo, producción y aplicación en programas de control biológico y manejo integrado.

Barbercheck y Wang (1996) señalan que en contraste con otros grupos de nematodos, los steinernematidos y heterorhabditidos son referidos como entomopatógenos, por su asociación

mutualista

con

bacterias

del

género

Xenorhabdus

y

Photorhabdus,

respectivamente. También esta estrecha relación es ilustrada por el hecho de que la mayoría de las especies de nematodos, están asociadas con una sola especie de bacteria (Akhurst y Boemare, 1988; Smits y Ehlers, 1991). El género Xenorhabdus consiste de bacterias simbiontes de los nematodos entomopatógenos específicos de la familia Steinernematidae y fue separado del género Photorhabdus, el cual consiste casi completamente de simbiontes de los nematodos entomopatógenos de la familia Heterorhabditidae (Thomas y Poinar, 1970; Akhurst, 1982; Akhurst y Boemare, 1990; Boemare et al., 1993; Forst y Nealson, 1996).

Por consiguiente, cada especie de Steinernema está asociada con sus propias especies de Xenorhabdus. De esta forma, S. carpocapsae está asociado con X. nematophilus; S. glaseri con X. poinarii; S. feltiae y S. affinis con X. bovieni, etc. Mientras que todos los Heterorhabditis spp. poseen a Photorhabdus luminescens como la simbionte. Sin embargo, estudios específicos han demostrado que P. luminescens puede ser un taxón de multiespecies, con cuatro de cinco especies (Akhurst y Boemare, 1990; Han et al., 1990; Pütz et al., 1990; Smits y Ehlers, 1991; Boemare et al., 1993). Este proceso de coevolución aparente,

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probablemente es debido a la transmisión vertical del simbionte de una generación a otra. Aunque los nematodos no conducen la bacteria en el huevo (Lunau et al., 1993), los juveniles al eclosionar entran a la hemolinfa del insecto, el cual es infectado por la bacteria con sus descendientes que están asociados. Por lo tanto, los juveniles toman la misma cepa de bacteria así como sus descendientes. La especificidad de la asociación entre los nematodos y las bacterias opera en tres niveles (Grewal et al., 1997): i) suministran los factores que aumentan a los juveniles infectivos la recuperación de la fase dauer; ii) suministran los nutrimentos esenciales de los nematodos por la bacteria y iii) la retención de la bacteria dentro del intestino de los JIs no alimenticios.

Las especies tipo para ambos géneros de nematodos, son Xenorhabdus nematophilus (Poinar y Thomas) comb. nov. (sinónimo: Acromobacter nematophilus (Poinar y Thomas), y Photorhabdus luminescens (Poinar y Thomas) Boemare, Akhurst y Mourant comb. nov., respectivamente. Los cuales están estrechamente relacionados y presentan las siguientes características comunes: son bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, las cuales son Gram negativo, bacilos grandes y móviles, peritricas y anaeróbicas facultativas. La mayoría de las cepas producen colonias pigmentadas de color rojo, rosa o amarillas. Dentro de los aislados, los dos géneros, pueden ser muy variables en la morfología de las colonias y las propiedades bioquímicas. Ambas son patógenas de insectos, el hábitat natural es el lumen del intestino de los nematodos entomopatógenos y los insectos infectados. Sin embargo, las características diferentes son: que Photorhabdus es luminescente y en Xenorhabdus no. Los cultivos de Photorhabdus resplandecen y en los cadáveres de insectos infectados puede ser detectada en la obscuridad. Además, Xenorhabdus es catalasa negativa, mientras que Photorhabdus es positiva. (Thomas y Poinar, 1979; Akhurst y Boemare, 1988; Smits y Ehlers, 1991; Boemare et al., 1993). La bioluminiscencia de Photorhabdus puede ser para proteger el cadáver de los saprófitos fotobióticos del suelo y de esta manera ser repelidos por el cadáver luminiscente (Akhurst y Boemare, 1990).

Un dauer, el estadio infectivo de los nematodos, es un juvenil de tercer estadio el que conduce únicamente su bacteria simbionte (Akhurst, 1983; Bird y Akhurst, 1983). Estas bacterias son conducidas monoxénicamente en la porción ventricular del estadio juvenil de los

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nematodos Steinernema, modificada especialmente para almacenar la bacteria simbiótica y es llamada vesícula intestinal (Bird y Akhurst, 1983), mientras que en los estadios infectivos de Heterorhabditis su bacteria simbiótica es localizada en el esófago y en la porción ve ntricular del intestino (Endo y Nickle, 1991), conduciéndola dentro del hemocele de los insectos hospederos (Boemare et al., 1992). Los nemátodos proporcionan protección a la bacteria del medio ambiente del suelo, donde es incapaz de sobrevivir en vida libre y sirven como vectores (Poinar, 1979; Burnell et al., 1996).

Cuando los juveniles infectivos son atraidos a los hospederos potenciales (Gaugler et al., 1980) y mediante las amfidias detectan las huellas químicas (Perry, 1996), a través de las aberturas naturales penetran diferentes larvas de insectos (Grewal y Georgis, 1999), emigran e invaden el hemocele, donde liberan las bacterias simbiontes, las cuales se multiplican en la hemolinfa rica en nutrimentos-trealosa (Friedman, 1978; Akhurst, 1982), probablemente a las cinco horas al entran al insecto (Dunphy y Thurston, 1990), rápidamente se propagan y matan al hospedero en 48 horas, por septicemia letal, estableciendo condiciones favorables para el desarrollo de los nematodos (Akhurst, 1982; Akhurst y Dunphy, 1993) al producir antibióticos que previenen e inhiben el crecimiento de muchas bacterias y especies de levaduras en el cadáver (Poinar y Thomas, 1966; Akhurst, 1981, Maxwell et al., 1994). Posteriormente, los nematodos se alimentan de las células de la bacteria y los productos de los tejidos descompuestos del hospedero, que sirven como nutrimentos para su reproducción, subsecuentemente se producen de dos a tres generaciones, antes de que se desarrollen en juveniles infectivos que emergen en el suelo desde el cadáver mermado. Estos infectivos buscan y parasitan nuevos hospederos para iniciar un nuevo ciclo de vida (Poinar, 1990; Kaya y Gaugler, 1993; Choo et al., 1995), convirtiéndose en estadios de vida libre cuando los nutrimentos del hospedero se agotan (Grewal et al., 1994).

Simöes y Rosa (1996) mencionan que Steinernematidae y Heterorhabditidae son patógenos intra-hemocélicos de insectos. La infección del hemocele de los hospederos es un paso crítico durante la patogénesis, e involucra dos etapas: La invasión de la cavidad hemocélica y la evasión del nematodo infectivo de las reacciones del hospedero, permitiendo su establecimiento y nuevo desarrollo. Lysenko (1985) destaca que este grupo de bacterias es

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usualmente patógeno, la destrucción de los hemocitos y órganos internos del insecto es resultado de la producción de enzimas extracelulares y lipopolisacáridos. Además, ambos géneros secretan lipasa, lecitinasa y proteasa (Bedding y Akhurst, 1988; Clarke y Downe, 1995). La dosis letal de la bacteria sobre los hemocitos del hospedero, es atribuida a los ácidos grasos del lípido A, mitad asociada con los lipopolisacáridos liberados desde la bacteria en la hemolinfa del hospedero (Dunphy y Webster, 1988). Además, la bacteria tiene bacteriocinas y bacteriofagos que inhiben las especies simbióticas de otras especies de steinernematidos y heterorhabditidos (Boemare et al., 1993).

Por otro lado, Xenorhabdus y Photorhabdus muestran una forma fenotípica inestable, conocida como fase de variación (Burnell y Downs, 1996). Las formas de estas colonias son indicativas de dos fases que difieren en algunas características bioquímicas y fisiológicas (Akhurst, 1986a,b; Boemare y Akhurst, 1988; Akhurst y Boemare, 1990). Normalmente, la forma primaria se encuentra en los estadios infectivos de los nematodos, pero son capaces de conducir cualquier forma en su intestino, que es inestable in vitro y ocasionalmente in vivo, produciendo la segunda forma (Akhurst, 1980). La forma primaria produce proteínas antibacterianas que reducen la competencia y previenen la infección de otros agentes biológicos (Akhurst, 1982b; Dunphy, 1994). La bacteria se multiplica, una vez que mata al insecto hospedero y establece condiciones satisfactorias para la reproducción de los nematodos, ya que le proporciona los nutrimentos y promueve su reproducción in vivo e in vitro que la segunda forma (Kaya et al., 1993; Akhurst, 1980). Smigielski et al. (1994) sugieren que la fase II puede tener mejores condiciones para adaptarse en el suelo como un organismo de vida libre.

El complejo nematodo-bacteria muestra gran potencial como un agente de control biológico de insectos nocivos en ambientes crípticos (Klein, 1990). Esta asociación es de fundamental importancia (Aguilera y Smart 1993), porque Xenorhabdus y Photorhabdus son especies altamente patógenas de una diversidad de larvas de insectos (Dunphy y Webster, 1988). La bacteria también es capaz de representar una amplia variedad de medios artificiales, adecuados para la reproducción de los nematodos, que permiten su producción en masa (Bedding, 1976). Un prerequisito para desarrollar la aplicación de estos agentes, es un sistema

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de producción in vitro de los nematodos a bajo costo. En los sistemas de producción in vitro, por el método de Bedding (Bedding, 1981) y el sistema de fermentación líquida (Buecher y Poipiel, 1989), las variaciones en Photorhabdus y Xenorhabdus, son la causa mayor de fracaso, principalmente para una producción baja y cantidad subóptima de los nematodos (Akhurst, 1980; Ehlers et al., 1990). Sin embargo, este grupo de entomopatógenos inusuales está siendo desarrollado comercialmente como un agente de control biológico de insectos plaga (Ng y Webster, 1997). Adicionalmente, ciertos metabolitos antimicrobianos producidos por la bacteria, también tienen propiedades antifungales (McInerney et al., 1991; Li et al., 1995), antibiótica, nematicida e insecticida y ahora su uso en campo, puede ser realizado eficientemente y jugar un papel clave en las estrategias de manejo integrado de plagas (Webster, 1998).

2.7 Ecología de los nematodos entomopatógenos Los nematodos entomopatógenos han sido recuperados del suelo y de insectos infectados naturalmente. Para poder aplicarlos como agentes de control biológico, es necesario conocer las múltiples interacciones con su medio ambiente. El impacto que ejercen sobre ellos los factores bióticos y abióticos, es una limitante para su comportamiento, eficacia, dispersión y superviviencia. Este conocimiento establece las bases para futuros estudios sobre la dinámica poblacional y la epizootiología de las enfermedades, lo que permite optimizar su potencial bioinsecticida en programas de control biológico y manejo integrado de plagas.

2.7.1 Factores ambientales La Ecología es el estudio de las relaciones entre los organismos y su medio ambiente. Las relaciones ecológicas pueden ser consideradas a través y en varios niveles de organización biológica. Estos estudios pueden proveer información sobre el potencial de introducir organismos tales como agentes de control biológico (Ferris, 1993).

Los nematodos Steinernematidae y Heterorhabditidae tienen una distribución mundial, y han sido aislados de una amplia variedad de ecosistemas desde los climas sub-árticos al árido y tropical (Poinar, 1990; Hominick et al., 1997). De esto se especula que las poblaciones

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naturales de los nematodos deben estar adaptadas a sus ambientes locales (Glazer, 1996). Sin embargo, un entendimiento de su biogeografía es impedido por la dificultad de la identificación al nivel de especie, particularmente para Heterorhabditis. Puesto que éstos parecen estar más limitados que los steinernematidos por los factores abióticos, tales como la textura del suelo y la temperatura. En ciertas áreas como Hawai, Irlanda y Reino Unido, pueden estar completamente restringidos a suelos de arena costera, mientras que en otras partes existen en el interior (Griffin y Downes, 1991). No obstante, la distribución excepcional de ambos géneros sugiere una alta capacidad para persistir en su hábitat natural (Gaugler, 1988).

2.7.2 Supervivencia de los nematodos entomopatógenos Como en todos los organismos, las condiciones ambientales limitan la supervivencia, reproducción y desarrollo de los nematodos. Sin embargo, la extinción de las poblaciones de estos nematodos raramente se realiza en la naturaleza. Normalmente, sí el hábitat es inconveniente para el desarrollo durante una parte del período estacional, los nematodos tienen un amplio rango de mecanismos para todas las condiciones ambientales desfavorables en el suelo, al adoptar estrategias de supervivencia en los períodos adversos. No obstante, los niveles pueden caer drásticamente como un resultado de las especies de hospederos y el tamaño de la población y diversos factores bióticos y abióticos (Poinar, 1991; Glazer, 1996).

Wharton (1986) señala que bajo condiciones ambientales moderadamente adversas, los organismos se vuelven quiescentes. Mientras que en el estrés ambiental más severo, los organismos pueden entrar en un estado de anabiosis o criptobiosis. Por consiguiente, la humedad del suelo es considerada central, porque afecta la actividad y superviviencia de los nematodos (Wallace, 1966). Pero un número considerable de especies de nematodos sobreviven a cierto grado de deshidratación, sí el proceso de desecado es gradual (Womersley, 1987). El control en la tasa de desecado, es un factor importante en la supervivencia para la desecación en varias especies de nematodos capaces de entrar en anhidrobiosis, que tienen mecanismos para disminuir la tasa de pérdida de agua y otras especies son solamente capaces de sobrevivir, sí las condiciones ambientales, tales como una humedad alta, asegura el secado

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lento (Evans y Perry, 1976). Diversos trabajos han enfatizado sobre el uso de estos nematodos en su reservorio natural, el suelo. Sin embargo, el entendimiento de su comportamiento en el suelo es necesario para permitir su uso efectivo, donde las condiciones ambientales son caracterizadas por una rápida desecación en la superficie y una desecación gradual (Gaugler, 1988; Campbell y Gaugler, 1991).

Los juveniles infectivos de los nematodos entomopatógenos son encontrados en el suelo o dentro de un cadáver. Durante el desarrollo dentro del cadáver las condiciones ambientales extremas pueden cambiar drásticamente. Tales condiciones de desecado son comúnes en el suelo, debido a la humedad relativa (RH) en los espacios intersticiales permanecen estrechos al 100% y declina radicalmente sólo en condiciones extremadamente secas (Koppenhöfer et al., 1997). El declive rápido de la humedad puede ocurrir en las capas superficiales, especialmente en los suelos arenosos con poca capacidad de retención de agua; los nematodos son aislados muy frecuentemente de tales suelos (Hara et al., 1991; Stock, 1995; Strong et al., 1996). En adición, los hospederos infestados se pueden mover en áreas con suelos de baja humedad, antes de que mueran por la infección. En tales situaciones, los cadáveres pueden retener mejor humedad que alrededor del suelo y proteger a los JIs de la deshidratación, hasta que las condiciones de humedad vuelvan a conducir a los juveniles y se dispersen al encuentro de nuevos hospederos (Koppenhöfer et al., 1997). La desecación gradual en el suelo puede proveer tiempo suficiente para adaptarse fisiológicamente en un estado parcial de desecación quiescente e inmovilizado (Womersley, 1990).

Por otro lado, las respuestas de comportamiento, tales como enrrollado de los individuos y la agregación en masas grandes, aseguran la oportunidad de supervivencia. En adición, este comportamiento reduce gradualmente la humedad o preacondiciona a las altas humedades, antes de exponerse a humedades bajas, subsecuentemente también asegura la supervivencia (Menti et al., 1997). El cadáver del insecto hospedero también puede servir como un hábitat protectivo favorable. Puede proveer alguna protección física de condiciones ambientales adversas, tales como las temperaturas extremas (Brow y Gaugler, 1995a) y baja humedad (Brow y Gaugler, 1995a; Koppenhöfer et al., 1995).

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De igual forma, la presencia de dos capas de membranas externas presentes en el estadio de vida libre de los nematodos entomopatógenos, un juvenil infeccioso de tercer estadio, que permanece envainado por la cutícula del segundo estadio, proporciona protección adicional (Poinar, Epsky et al., 1988; Timper y Kaya, 1989) y a menudo puede ofrecer protección contra ciertos factores abióticos. Womersley (1990) especula que la vaina de S. carpocapsae aumenta la supervivencia durante la desecación para actuar como una barrera a la pérdida lenta de agua. La tolerancia a la desecación puede ser mejorada por la presencia de la vaina y el grado de beneficio puede ser afectado por las propiedades de dicha vaina, cuando está menos acomodada (S. carpocapsae) o construida sólida y fuertemente arreglada (H. bacteriophora) (Campbell y Gaugler, 1991). Por otro lado, también se incluyen los mecanismos de evasión que presentan algunos individuos, que los hace capaces para evitar el estrés y moverse simplemente dentro de un micro hábitat protegido (Glazer, 1996).

2.7.3 Condiciones edafológicas 2.7.3.1 El medio ambiente del suelo El suelo es un sistema dinámico que responde a los cambios ambientales y al abastecimiento de energía (Moore et al., 1988) donde las relaciones ecológicas entre los organismos están influenciadas por su estructura (Elliot y Coleman, 1988). La mayoría de las investigaciones sobre los efectos en el control biológico han sido concernientes con la textura del suelo. Los diferentes tamaños de los organismos, tienen diferente suma de disponibilidad de espacio en ellos, debido a la textura. Las partículas de tamaño pequeño y la textura fina del suelo, pueden impedir el movimiento de los organismos e incrementar la distancia de traslado desde un punto a otro. Basada en la sola textura, generalmente los suelos arenosos tienen poros grandes, menor tortuosidad y aireación que los suelos arcillosos (Barbercheck, 1992). También son importantes la textura y estructura del suelo, debido a que determinan las frecuencias de los diferentes tamaños de poro. Puesto que, la mayoría de los poros en una arcilla no estructurada son de 20 µm en diámetro o pequeños. Consecuentemente, hasta cuando el suelo está saturado, los organismos dependen de la movilidad en poros más grandes que 20 µm serán inmóviles en arcillas, porque los poros de tamaño adecuado son infrecuentes en suelos de textura fina (Wood, 1989).

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2.7.3.2 El pH del suelo El suelo es un sistema heterogéneo y el pH de los micrositios puede variar considerablemente del promedio de la masa de suelo. La alcalinidad ocurre en suelos con saturación base o en la presencia de sales y es característico de la mayoría de las regiones áridas y semiáridas. En suelos salinos los microorganismos enfrentan problemas de altas concentraciones de iones, arriba de sus concentraciones normales intracelulares, los cuales pueden conducir al rompimiemto de la función celular (Barbercheck, 1992). El pH de la solución del suelo puede afectar el control biológico. Los suelos ácidos con niveles de pH arriba de 4.0 limita la infección de Cephalia abietis por S. kraussei (Fisher y Führer, 1990). En suelos franco arenosos el pH entre 4, 6, 8 y 10, la supervivencia y retención de la infectividad de S. carpocapsae y S. glaseri fue mayor a pH de 8. La supervivencia de ambas especies disminuye agudamente después de una semana a un pH de 10. Georgis y Poinar (1983) reportan que N. carpocapsae penetra en arena de sílica pura a una profundidad de 10 cm y recorre el franco arenoso para infectar pupas, pero el porcentaje de penetración disminuye cuando los porcentajes de arcilla y limo aumentan.

2.7.3.3 Aireación del suelo Los nematodos son organismos aerobios y la disponibilidad baja de oxígeno puede reducir su supervivencia (Evans y Perry, 1979; Wharton, 1986). El promedio de este elemento en el aire atmosférico es de 21% y en la capa arable del suelo 20.3%. Bajo condiciones extremas en la capa arable ha sido reportado más bajo del 1%. La aireación es dependiente de la fracción de los poros llenos de aire y los poros macroscópicos que drenan rápidamente. Por lo tanto, la falta de oxígeno limita la actividad biológica a bajos potenciales de agua. Sin embargo, muchos de los poros en potenciales altos de agua están llenos y puede hacerse limitante. También los organismos agregados en suelos de textura fina pueden ser adversamente afectados por localizadas condiciones anaerobiosis (Barbercheck, 1992).

El porcentaje de oxígeno en el suelo disminuye con la profundidad y la tasa disminuye más rápido en suelos arcillosos o limosos que en los arenosos (Brady, 1974). De este modo, puede ser un factor limitante en los suelos con un alto contenido de materia orgánica o de

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arcilla (Kaya, 1990). En un estudio de la supervivencia e infectividad de especies de steinernematidos en suelo franco arenoso a concentraciones de oxígeno entre 1 a 20%, la supervivencia disminuyó significativamente de 20 a 1%. La patogenicidad de los nematodos no fue reportada a concentraciones de 1, 5, o 10% después de 2 semanas o a 20% después de 16 meses (Kung et al., 1990b).

Por otro lado, bajo condiciones normales en campos agrícolas donde conservan altos niveles de humedad suficientes para apoyar el crecimiento de los cultivos, la atmosfera del suelo está siempre cercanamente a vapor saturado. Esta condición es físicamente apropiada para el control biológico de insectos del suelo por organismos que requieren humedad relativa alta, tales como los nematodos y hongos entomopatógenos. Los steinernematidos y heterorhabditidos pueden sobrevivir a 10) disminuyen drásticamente la superviencia y afectan adversamente la capacidad patógena, debido a que un efecto nematicida puede ser esperado. Aunque el pH de 4 a 8 no limita significativamente la supervivencia y la patogenicidad de los nematodos (Kung et al., 1990a). En esta inspección tres steinernematidos fueron encontrados a un pH de 8.2, 8.5 y 8.6, respectivamente, en la región Central, hallazgo que coincide con los de estos autores. Una posible explicación a los valores de estos suelos, es que pueden tener alguna fuente de carbonato de calcio.

Por otro lado, la mayoría de los heterorhabditidos fueron asociados con suelos cálcicos, hecho que concuerda por lo reportado en la mayoría de las inspecciones costeras, donde están más o menos restringidos a suelos cálcicos con coral y conchas (Choo et al., 1995; Liu y Berry, 1995; García y Palomo, 1996; Constant et al., 1998), sin embargo, difiere totalmente por el hecho de aquí no existen playas y no se registraron suelos arenosos. Una posible explicación a este hallazgo, puede ser debido al tipo de suelo cálcico que predomina en la región del Sur y debido a que algunas muestras colectadas al márgen del río Juchipila, también contenían pequeñas conchas, que pueden ser semejantes a las encontradas en las áreas insulares donde estos nematodos están adaptados. Por consiguiente, esta inspección demuestra que los valores de pH están dentro del espectro de supervivencia y patogenicidad de ambos géneros de nematodos (Kaya, 1990; Kung et al., 1990). Esto sugiere que la persistencia y eficacia de los steinernematidos y heterorhabditidos, es improbable que sean afectadas adversamente por el espectro de pH de la mayoría de los suelos agrícolas, además, demuestra que mientras las condiciones de campo no excedan un pH de 10 estos nematodos seguirán infectando insectos de la región.

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5.5 Asociación entre Steinernema y Heterorhabditis y los factores climáticos 5.5.1 Tipo de clima En la región Centro-Sur el mayor porcentaje de los sitos positivos para nematodos entomopatógenos, fue en el tipo de clima subtrópico semiárido cálido (22.2%), seguidos por el subtrópico árido templado y el subtrópico semiárido semicálido con 19.5% y 8.3%, respectivamente. En general, la mayoría de Heterorhabditis fueron recuperados en la región cálida (19/22). Mientras que en la semicálida, se lograron aislar mayormente a Steinernema y en una menor proporción Heterorhabditis (5 y 1, respectivamente). En tanto que, Steinernema fueron aislados principalmente de las áreas de clima templado (13/18), incluyendo a S. scapterisci, aunque en estas, también se lograron obtener dos heterorhabditidos. Los resultados de esta inspección demuestran que los aislados de heteorhabditidos fueron ligeramente más prevalentes que los steinernematidos, con tendencias semejantes a las reportadas en previas investigaciones en el pasado y recientemente, lo que sugieren que las diferencias en la supervivencia de los nematodos a diferentes temperaturas, puede reflejar en parte, su hábitat climático original (Molineux, 1985).

Generalmente, los nematodos heterorhabditidos y/o steinernematidos existen en todos o en gran parte de los países inspeccionados, sin embargo, existen variaciones considerables en la prevalencia de los nematodos entomopatógenos (Boag et al., 1992). Al respecto, diversa literatura ha destacado que la prevalencia de los heterorhabditidos, parece ser más común en países con climas calientes y secos y en regiones calientes y tropicales semejantes a Carolina del Norte y las Islas Hawaii, y la mayor parte de Australia (Akhurst y Brooks, 1984; Hara et al., 1991; Akhurst y Bedding, 1986), así como en Puerto Rico (Roman y Beavers, 1982), Hawai (Hara et al., 1991), Egipto (Shamseldean y Abd-Elgawad, 1994) e Islas Guadalupe (Constant et al., 1998).

Mientras que los steinernematidos están ampliamente distribuidos y la prevalencia fue mayor en regiones con climas templados y fríos (Hominick y Briscoe, 1990; Poinar, 1990; Glazer et al., 1991). Inspecciones previas en Suiza (Burman et al., 1986), Finlandia (Vänninen et al, 1989), Checoslovaquia (Mrácek, 1980), Alemania (Ehlers et al., 1991) e Irlanda del v

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Norte (Blackshaw, 1988) han corroborado la existencia de hasta el 100% de estos nematodos entomopatógenos aislados. A diferencia de Irlanda (Griffin et al., 1991) y Bretaña (Hominick y Briscoe, 1990b) donde solamente una muestra contenía un Heterorhabditis. Así como en Reino Unido y los Países Bajos aislaron más steinernematidos que heterorhabditidos v

(Hominick et al., 1995). Incluso en Canadá (Mrácek y Webster, 1980), Carolina del Norte, EE.UU. (Akhurst y Brooks, 1984) y Australia (Akhurst y Beding, 1986) donde los steinernematidos también fueron prevalecientes, pero una mayor o menor presencia de heterorhabditidos fue detectada. En general, los resultados obtenidos en Zacatecas con relación al tipo de clima, concuerdan con las inspecciones realizadas en los países de diversos continentes y apoyan el punto de que la familia Heterorhabditidae es endémica de climas calientes, mientras que la familia Steinernematidae prevalece en regiones caracterizadas por clima templado o frío (Poinar, 1990; Hominick y Briscoe, 1990a,b; Griffin et al. 1991).

Sin embargo, en esta inspección, aún y cuando no fueron identificados los aislados al nivel de especie, estas observaciones apoyan la sugerencia de Constant et al., (1998) de que la adaptación de los steinernematidos y heterorhabditidos a las condiciones climáticas, es más para una especie característica que para un género. Por ejemplo, en el caso de los heterorhabditidos fueron encontrados en áreas frías, de Irlanda, Escocia y Gales (Griffin et al., 1994) y Nueva Jersey, EE.UU. (Stuart y Gaugler, 1994). Además, Griffin et al. (1994b) documentan que Heterorhabditis está ampliamente distribuido en las islas británicas e Irlanda y que también existe en temperaturas frías. Por otro lado, H. indica fue reportada en regiones más calientes como en la India (Poinar et al., 1992), Sri Lanka (Amaransighe et al., 1994) y el Norte de Australia, EE.UU. (Akhurst, 1987), pero en contraste H. megidis ha sido encontrado v

solamente en regiones frías (Poinar et al., 1987; Mrácek y Webster, 1993), esta última especie puede estar presente en la región templada del Estado, de donde se lograron recuperar a dos aislados de este género.

Asimismo, nuevas especies de Steinernema han sido identificadas en países tropicales y cálidos, por ejemplo, S. scapterisci en Uruguay (Nguyen y Smart, 1990), S. cubanum en v

Cuba (Mrácek et al., 1994) S. puertoriscensis en Puerto Rico (Roman y Figueroa, 1994) y S. riobrave en Texas, EE.UU. (Cabanillas et al., 1994). Además, diversas especies de

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Steinernema originalmente encontradas en países fríos han sido reportadas en regiones más calientes, como S. glaseri en España (Aguera y Gabarra, 1994). Los resultados obtenidos en esta inspección y los encontrados por García y Palomo (1996), así como en conjunción con aquellos de Raulston et al. (1992) sobre S. riobrave, apoyan el punto de la generalización amplia la cual contiene, que los steinernematidos son templados, mientras que los heterorhabditidos son tropicales, debe ser cuestionada. En parte, por el hecho de que dos aislados de Heterorhabditis fueron encontrados en áreas predominantemente templadas en Zacatecas y por otro lado, debido a que en Diciembre del 2000 en esta región dichos aislados lograron sobrevivir a temperaturas ambientales de menos 10o C manteniéndose activos hasta el momento de las colectas de suelos en esta inspección realizada durante 2001. No obstante, que Molyneux (1986) señala que temperaturas bajas de 15o C, son el rango bajo de desarrollo de steinernematidos y sus bacterias simbióntes, los dos heterorhabditidos que preferentemente sobreviven en temperaturas altas, rebasaron significativamente dicha temperatura, por consiguiente los argumentos previamente señalados son apoyados. Además, con base a lo anterior, se coincide con Liu y Berry (1995) quienes señalan que la temperatura baja no puede ser un factor limitante de todos los nematodos heterorhabditidos.

Molyneux (1986) considera que el origen geográfico y la temperatura asociada, son los factores importantes que influencían la actividad de los nematodos, la penetración al hospedero y la mortalidad del hospedero. Es probable que el carácter climático donde un aislado es encontrado, tiene un impacto esencial sobre la temperatura óptima para la v

v

infectividad del aislado (Mrácek et al., 1997). Por otro lado, Mrácek et al. (1998) destacan que generalmente, los steinernematidos son más bien parásitos no específicos de insectos. Sin embargo, los diferentes aislados de las especies pueden estar más o menos adaptados para algunos insectos hospederos. Esta especificidad puede jugar un papel importante en el proceso de parasitismo en las diferentes especies de insectos. Nguyen y Smart (1991) encuentran que S. scapterisci fue más patógeno a insectos del Orden Orthoptera (mortalidad del 100%).

Estas son algunas indicaciones de que las especies de nematodos entomopatógenos, las cuales existen en distintas regiones geográficas, son más específicos a los hospederos, que algunos más ampliamente distribuidos (Peters, 1996). También, es importante considerar lo

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mencionado por Capinera y Epsky (1991) quienes señalan que la mayoría de los aislados, tienen una existencia en climas templados, pero esto parece ser más un resultado al esfuerzo que a la disponibilidad, donde la mayoría localmente encontrados son exitosos.

5.5.2 Temperatura ambiental y del suelo La temperatura promedio anual reportada para la región Centro-Sur, fluctuó de 16.0 a 20.7o C (18.35 ± 2.35oC) respectivamente, estas temperaturas promedio fueron cercanas a la normal en la mayoría de los casos de todas las áreas de este estudio. Asimismo, la temperatura ambiental tomada en el momento de los muestreos de los sitios inspeccionados en la región Central, registraron poca variación y fluctuaron de 26 a 30o C (28 ± 2o C). Mientras que en la región del Sur, revelaron significativa variación y oscilaron de 26 a 40o C (33 ± 7o C). Consecuentemente, en la región Central 13 aislados se detectaron en sitios donde las temperaturas son esencialmente templadas, de condiciones climáticas típicamente para steinernematidos, no obstante, en esta misma región también se encontraron dos aislados de heterorhabditidos. En tanto que, en la región del Sur fueron aislados en los sitios donde las temperaturas fueron primordialmente semicálidas y cálidas (27 aislados), de condiciones climáticas preferentemente para heterorhabditidos, aunque se aislaron cinco steinernematidos.

El rango de temperatura tiende a ser correlacionado con la región de origen del aislado. Por consiguiente, las diferencias en la superviviencia de los nematodos a varias temperaturas, pueden reflejar, en parte, su original hábitat climático (Molyneux, 1984; 1985). Sin embargo, la temperatura puede ser el mayor factor que influya sobre la movilidad, superviviencia, infectividad, desarrollo, reproducción y longevidad de los juveniles infectivos de los nematodos (Kaya, 1990; Richardson y Grewal, 1992; Selvan et al., 1992). La temperatura del suelo tomada a 5 cm de profundidad durante la colecta, los sitios de la región Central, fluctuó de 25 a 28o C (26.5 ± 1.5o C), mientras que en la región del Sur se presentaron de 26 a 39 (32.5 ± 7.5o C). Dichos rangos coinciden con los observados por Kaya (1990) y Kung et al. (1990) quienes al momento de los muestreos, reportaron temperaturas del suelo que fluctuaron de 22.2 a 28.8o C, la cual es considerada como buena para el rango de actividad de los juveniles

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infectivos de los nematodos, para el primer caso (26.5o C) estos resultados coinciden, mientras que para el segundo (32.5o C) difieren ligeramente.

Por otro lado, la temperatura media y máxima reportada durante esta inspección, fue baja, considerando que la temperatura sólo se midió en Mayo, Agosto y Octubre. Estos datos justificaron el uso de 25o C en los bioensayos, ya que estas son las temperaturas típicas de los suelos zacatecanos. Las temperaturas bajas (15o C), especialmente en los agrosistemas de la región Central, son el rango bajo del desarrollo de steinernematidos y sus bacterias simbióntes (Molyneux, 1986).

La existencia común de nematodos entomopatógenos en diversos sistemas agroecológicos de Zacatecas, indica que pueden ser importantes en la regulación de poblaciones de insectos plaga y pueden proveer de material para seleccionar aislados nativos más favorables, para utilizarse en programas de control biológico. La frecuencia de recuperación de los nematodos puede ser influenciada por la temperatura y humedad del suelo, debido a que la frecuencia varía con las estaciones (Akhurst y Bedding, 1986; Blackshaw, 1988; Griffin et al., 1991). En las Islas de Gran Bretaña e Irlanda, la frecuencia de recuperación fue menor en el período de Junio a mediados de Agosto, y alta a mediados de Agosto y Noviembre. Aunque en esta inspección no fueron considerados muestreos estacionales, estos se realizaron durante Mayo, Agosto y Octubre. En el presente estudio, estos resultados coinciden con los obtenidos en las inspecciones antes mencionadas. Futuros estudios de dinámica de poblaciones en períodos más largos, deberán conducirse para revelar un posible patrón estacional del desarrollo y supervivencia, de estos nematodos en los agrosistemas de Zacatecas.

La gran frecuencia de los nematodos principalmente de steinernematidos en áreas situadas en altitudes intermedias o altas y consistentemente con temperaturas media anual baja y bajas precipitaciones, parecen sugerir que estas condiciones climáticas, son más favorables para la supervivencia de steinernematidos en las áreas de la región Central de Zacatecas. Esta hipótesis es apoyada por la prevalencia observada de los nematodos en aquellos suelos con un régimen de temperatura templada, común en los suelos de las áreas secas que predominan en

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esta región. Bajo estas condiciones de temperatura deberan retrasar o prolongar el ciclo de vida y aumentar la persistencia de los nematodos en estos suelos (Hominick y Briscoe, 1990a).

Las temperaturas bajas del suelo también pueden explicar la rareza de Heteterorhabditis en la región Central de Zacatecas. Los heterorhabditidos se vuelven inactivos antes que los steinernematidos a bajas temperaturas (Molyneux, 1986) y generalmente mantenidas a 12o C por ser el límite más bajo para el desarrollo de los heterorhabditidos. Algunas cepas son capaces de matar hospederos a bajas temperaturas (Griffin et al., 1989). Dado que la mayoría de las explicaciones en las relaciones parásitov

hospedero, son las mismas condiciones favorables en el suelo (Mrácek, 1982). También, algunas especies de Steinernema son conocidas por ser capaces de adaptarse a cambios ambientales y pueden sobrevivir 2-9 meses en el suelo (Georgis y Hara, 1981; Moore y Kaya, 1981). Además, Gaugler et al. (1992) señalan que el tercer estadio de los juveniles infectivos de steinernematidos y heterorhabditidos, son similarmente protejidos por la cutícula del segundo estadio. Sin embargo, la tolerancia al estrés ambiental en hábitat expuesto, es mayor en los steinernematidos. Por consiguiente, estas observaciones pueden ser ratificadas para la mayoría de los steinernematidos encontrados en la región Central del Estado. Incluso para los dos aislados de Heterorhabditis que aunque fueron muy escasos en esta región, pueden ser consideradas como uno de los resultados más importantes de esta inspección en un clima templado, donde ambos lograron sobrevivir a temperaturas de menos 8 - 10o C.

Estos resultados pueden haber estado influenciados por la adaptabilidad a las temperaturas templadas de los steinernematidos en la región Central. En esta consideración estos nematodos están mejor adaptados que los heterorhabditidos para sobrevivir a temperaturas bajas. Tales aislados activos a temperaturas templadas, pueden tener el potencial para ser utilizados sobre un interés particular en algunas temperaturas agrícolas para el control de insectos plaga.

Cepas co-específicas colectadas de diferentes localidades, difieren en el potencial de la virulencia y reproductividad a diferentes temperatur as, pero no en sus rangos de actividad de las temperaturas. Por ejemplo, Grewal et al. (1994) sugieren que cada especie de nematodo

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tiene relativamente bien definido el amplio nicho termal en el cual puede ser inafectado por su localidad. La conservación natural del amplio nicho termal deberá apoyar la hipotesis de que los rangos de actividad de la temperatura de diferentes especies representan las condiciones climáticas de su localidad original (Molyneux, 1986). No obstante, que en esta inspección S. scapterisci fue encontrado en un ambiente árido semicálido, en parte este resultado corrobora lo encontrado por Grewal et al. (1993) quienes reportan que dicho nematodo está adaptado a climas calientes.

La adaptación termal de los nematodos entomopatógenos también puede ser auxiliada a través de estrategias efectivas de supervivencia. S. carpocapsae es inactivada a bajas temperaturas (Molyneux, 1986) y generalmente no se reproduce arriba de los 15o C, pero prevalece firme y ampliamente en Europa (Hominick y Briscoe, 1990). Se ha observado que S. carpocapsae penetra insectos abajo de los 10o C, permanece dentro del hospedero vivo por períodos extensos (infección latente), y empieza de nuevo un desarrollo normal cuando las temperaturas se elevan. Por lo tanto, en climas templados, S. carpocapsae puede ser capaz de pasar el invierno en los hospederos (Grewal et al., 1994). Dado estas consideraciones no se descarta la existencia de esta especie en la región Central. Asimismo, diferencias en la adaptación termal pueden resultar en la especialización entre el hospedero y los nematodos entomopatógenos. Especies que están adaptadas a temperaturas frías, como S. feltiae, la reproducción deberá ser efectiva cuando son más activos los parásitos de insectos durante el invierno. Las especies que están adaptadas a temperaturas calientes, tales como S. riobrave y S. scapterisci deberán parasitar insectos que son más prevalecientes durante el verano (Grewal et al., 1994).

Por otro lado, estudios previos han señalado poca supervivencia de Heterorhabditis sp. a bajas temperaturas (Kaya, 1990). Sin embargo, Griffin y Downes (1991) reportan una penetración rápida en sus hospederos por algunos aislados de heterorhabditidos adaptados al frío. También, Glazer et al. (1996) destacan que H. bacteriophora IS-5 tolerante al calor puede ser sensible al frío. La supervivencia de los juveniles forzados y reproducidos de esta cepa IS5 es mayor a 30o C o más. Por lo tanto, esto puede ser relacionado a su origen climático y probablemente tiene una sensibilidad al frío basada genéticamente. Dicha cepa fue aislada en

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Negev Israel, de clima semi-árido con temperaturas del suelo que promediaron entre los 32 y 35o C en el verano, en un huerto con un sistema de riego, donde los nematodos parecen estar adaptados a las temperaturas altas (Glazer et al., 1996). Un mecanismo bioquímico involucrado en la producción de proteinas de choque calórico (Hsp) es conocido, por ser el responsable de la tolerancia al calor en otros organismos, incluidos ciertos nematodos (Lindquist, 1986). Estas observaciones también pueden ser atribuibles para los dos heterorhabditidos aislados en el clima templado y para la mayoría de Heterorhabditis en clima cálido de la región del Sur.

Por consiguiente, Grewal et al. (1996) apoyan la hipótesis de que los rasgos funcionales de una variable ambiental distribuida contínuamente (temperatura) son genéticamente correlacionados. Al observar una fuerte respuesta de los nematodos adaptados al medio ambiente frío o caliente y debido a los mejoramientos en la tasa de crecimiento de la bacteria simbiótica, ya que éstos organismos en simbiósis pueden co-evolucionar en respuesta a los cambios de un ambiente termal. La incapacidad de los nematodos para infectar a temperaturas extemas (Molyneux, 1986; Kung et al., 1991; Grewal et al., 1994) ha sido destacada por los resultados impredecibles en campo (Kaya, 1985, 1990; Georgis y Gaugler, 1991). Esto también ha proporcionado fuerte impetu para investigar la existencia natural de cepas de nematodos adaptados al frío o calor (Hominick y Birscoe, 1990; Griffin y Downes, 1991). Sin embargo, los cambios rápidos en la sensibilidad y respuesta termal a la virulencia de los nematodos para la reproducción a temperaturas extremas, pueden proporcionar nuevas oportunidades para la construcción de nuevas cepas de nematodos Grewal et al. (1996).

La temperatura baja puede limitar la patogenicidad de un aislado de cualquier Heterorhabditis, por su influencia en la actividad del mismo nematodo, o en la bacteria simbiótica, X. luminescens, o ambos. Por ello, se sugiere que el mayor elemento que separa a los aislados, en la temperatura alta, es la tasa de acción (del nematodo, bacteria o ambos), mientras que las bajas temperaturas, en adición a tasas diferentes, pocos individuos al menos los aislados activos al frío penetran y matan (Griffin y Downes, 1991).

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Como se ha mencionado, las temperaturas registradas en cada una de las regiones inspeccionadas, son diferentes dadas sus características climáticas, por consiguiente su influencia puede ser determinante para la existencia y distribución de los géneros de nematodos entomopatógenos. Sin embargo, las mediciones de las temperaturas señaladas en el Cuadro 8, no pueden ser consideradas como datos comparativos, no obstante estas indican que los nematodos entomopatógenos son capaces de sobrevivir a temperaturas relativamente bajas que el promedio registrado en la región Central (28o C) para el caso de los steinernematidos y significativamente altas como las reportadas en la del Sur (33o C), para los heterorhabditidos, particularmente en el municipio de Apozol, en donde al momento de los muestreos se registraron temperaturas hasta de 40o C durante el mes de Mayo.

5.5.3 Precipitación pluvial Bajo condiciones naturales los 36 sitios positivos presentaron una precipitación media anual de 407.6 mm y fluctuó de 236 a 503 mm registradas en la región Central y Sur respectivamente. La precipitación media en los sitios donde se recuperaron steinernematidos fue de 296 mm considerada relativame nte baja y por lo tanto de suelos de baja humedad, en tanto que para los heterorhabditidos fue 478.7 mm estimada como moderada en el Estado. En general, la región del Sur fue donde se recuperaron la mayoría de los nematodos entomopatógenos en sitios con precipitaciones de 468 mm y las máximas ocurrieron entre los 1,335 m de elevación.

En términos de recuperación la mayoría de los Steinernema se presentaron en una región con precipitación media anual baja, los cuales se detectaron por debajo del rango de la precipitación encontrada para los sitios positivos con Heterorhabditis. Solamente, seis aislados del primer género se localizaron dentro del rango de la precipitación registrada para los sitios positivos con Heterorhabditis. Estos hallazgos son equivalentes con los reportados por Hara et al. (1991) quienes destacan la existencia de steinernematidos en áreas de menor precipitación. Mientras que los Heterorhabditis fueron más comunes en sitios con precipitación media anual moderada, lo anterior sugiere que la actividad del nematodo se incrementa significativamente con el incremento de la humedad del suelo (Fujiie et al., 1996). Con excepción de dos sitios

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positivos para estos nematodos con una precipitación media anual de 344 y 236 mm respectivamente, los cuales están fuera del rango de la precipitación encontrada para los sitios positivos de la mayoría de los aislados de este género, resultados que son similares a los observados por Hara et al. (1991). Lo anterior sugiere que un medio ambiente húmedo, en este caso moderado, es esencial para su persistencia y que no pueden resistir las condiciones secas de las regiones áridas (Glazer et al., 1991). Sin embargo, Menti et al. (1997) mencionan que poblaciones de S. feltiae y H. megidis pueden tener adaptaciones de comportamiento para evitar desecación severa y pueden residir a profundidades en el suelo para evitar las condiciones ambientales extremas en la superficie del suelo. Estas observaciones posiblemente se pueden atribuir a los aislados de ambos géneros que fueron detectados fuera de sus rangos de precipitación en las dos regiones de Zacatecas.

Los muestreos fueron realizados en campos agrícolas y frutales, bajo estas condiciones la humedad del suelo al momento de la colecta fue considerada media, posiblemente por ello el 50% de los sitios dieron positivo, sin embargo, no fueron detectados en parcelas con humedad excesiva y en suelos muy secos. Ante esto se considera la posibilidad planteada por Womersly (1990) quien destaca que los estadios infectivos de steinernematidos y heterorhabditidos, están asociados exclusivamente con el microambiente dado por los espacios intersticiales del suelo, los cuales dependen de la disponibilidad de humedad.

Por consiguiente, Shetlar et al. (1988) señalan que los steinernematidos en condiciones de campo pueden ser usados efectivamente en la mayoría de los suelos agrícolas bien aireados, sin riegos excesivos o frecuentes inundaciones. Por otro lado, pueden ser capaces de resistir una desecación gradual (Simons y Poinar, 1973) dado que juveniles infectivos de Neoaplectana han sido recuperados de suelos extremadamente secos (Poinar, 1986). Incluso, logran sobrevivir por considerable tiempo sin desecación en los cadáveres de los hospederos en suelos secos, debido a que existen debajo de la superficie donde las condiciones de humedad son más estables que las cercanas a la superficie (Koppenhöfer et al., 1997).

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5.5.4 Altitud La mayoría de los aislados fueron recuperados en muestras de suelo localizadas entre 1,200 y 2,200 msnm. Los sitios de recuperación de menor y mayor elevación fueron a 1,193 m y 2,280 m, respectivamente. De acuerdo con estos resultados, la incidencia de los nematodos no avanza gradualmente con relación a la altitud, mismos que coinciden con los hallazgos de v

Mrácek (1980). También, no fueron observadas diferencias significativas en la presencia de nematodos a diferentes altitudes (Prueba de X2 , P < 0.05). En general, los juveniles infectivos fueron encontrados mayormente en muestras de cultivos anuales y perennes, así como en huertos de frutales. La distribución vertical de los steinernematidos se extendió desde las tierras bajas de los valles agrícolas hasta algunas montañas bajas, favorablemente en suelos de maíz y alfalfa situados entre 2,097 - 2,280 msnm de la región central; en tanto que los heterorhabditidos predominaron en tierras montañosas bajas en huertos de guayabo localizados entre 1,193-1,365 msnm en la región del Sur. En general, posiblemente estos hallazgos son los primeros reportes sobre la existencia tanto de steinernematidos y heterorhabditidos por arriba de los 2,000 msnm y en clima templado.

En términos altitudinales estos resultados son semejantes a estudios europeos, en los cuales el mayor número de steinernematidos fueron recuperados en elevaciones altas (1,500 y v

2100 m) en la región alpina (Steiner, 1996), así como en Alemania S. kraussei (Mrácek et al., 1992). También, recientemente S. kraussei fue la especie más común aislada alrededor de los 7000 pies en California (Stock et al., 1999). Respecto a los heterorhabditidos el análisis del nicho ecológico de la región del Sur demuestran que la textura el suelo, el pH, la vegetación cubierta, la presencia de hospederos favorables y su altitud orientada hacia los litorales costeros, así como la existencia de dos muestras positivas que contenían conchas, posiblemente podría ser relacionado a las características y condiciones climáticas de las zonas calientes que pueden estar influyendo la distribución de estos nematodos.

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VI. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS DE INVESTIGACIÓN 1.- Los resultados obtenidos en esta inspección demuestran la existencia natural de nematodos entomopatógenos de las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae y reflejan su adaptabilidad en una diversidad de sistemas agroecológicos de la región Centro-Sur de Zacatecas.

2.- La presente inspección confirma que de los nematodos entomopatógenos (Steinernematidae y Heterorhabditidae), están ampliamente distribuidos en diversos sistemas agroecológicos de la región Centro-Sur del Estado de Zacatecas, México. Los aislados fueron recuperados de muestras de suelo y solamente una de infección natural sobre un ortóptero fue detectada. De las muestras de suelo aproximadamente 12.7% contenían steinernematidos y 15.4% heterorhabditidos. Con una frecuencia de recuperación mayor en la región del Sur.

3.- Con base a la sintomatología observada a través de los cambios característicos en el color de los cadáveres debido a la bacteria simbiónte, el patrón de desarrollo típico en la emergencia de los juveniles infectivos o incubación prologada y examinaciones morfológicas de montajes temporales, los nematodos encontrados fueron identificados como Steinernema y Heterorhabditis. Mientras que el aislado encontrado en la naturaleza, posiblemente como Steinernema scapterisci. Mismos que fueron capaces de multiplicarse en Galleria mellonella y orthópteros específicos respectivamente, lo que confirma la patogenicidad y postulados de Koch de los aislamientos nativos.

4.- La asociación de los géneros de nematodos entomopatógenos y los sistemas agroecológicos, fue más significativa en los cultivos perennes y la frecuencia de recuperación más notables en guayabo (Psidium guajava L.), maíz (Zea mays L.) y alfalfa (Medicago sativa L.), donde el impacto humano es substancial o moderado y la incidencia de insectos plaga que pasan una parte de su ciclo de vida en el suelo, principalmente en la región del Sur.

5.- La asociación de los géneros de nematodos entomopatógenos y los factores edafológicos, fue variada, el tipo de suelo más usual para aislados de Heterorhabditids fueron

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los cambisoles cálcicos en la región del Sur, y los xerosoles y fluvisoles para aislados de Steinernema, en la región Central.

6.- En general los nematodos entomopatógenos fueron más prevalecientes en suelos de textura franco (9.9%), franco arenosos (7.0%) y arcillosos (5.6%). El contenido de materia orgánica que varió de 1.8% a 9.4%, pH equivalente de ligeramente ácido a alcalino (6.0 a 9.2). Los aislados de Steinernema fueron encontrados principalmente en los francos con un contenido de materia orgánica que varió de 1.8% a 8.6% en la región Central. Mientras que los aislados de Heterorhabditis fueron recuperados en los franco arenoso y arcilloso, con un contenido de materia orgánica que fluctuó de 1.8% a 9.4% en la región del Sur.

7.- La asociación de los géneros de nematodos entomopatógenos y los factores climáticos, también fue diferente, el tipo de clima más favorable para la existencia de los nematodos fueron el subtrópico cálido, subtrópico árido templado y subtrópico semiárido semicálido. Los aislados de Heterorhabditis predominaron en la región cálida, principalmente en áreas montañosas bajas, en gradientes altitudinales entre los 1,860 a 2,172 msnm en la región del Sur. Mientras que los aislados de Steinernema prevalecieron en las áreas templadas, en los valles agrícolas y montañas bajas, en gradientes altitudinales entre los 2,097 a 2,280 msnm en la región Central.

8.- En adición a los nematodos fueron recuperados hongos entomopatógenos nativos de Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana, preferentemente en suelos arcillosos cultivados con maíz en la región del Sur.

Los hallazgos de esta investigación son alentadores ya que los nematodos aislados, pueden contribuir en la implementación de programas de control biológico en el Estado y otras regiones con condiciones edafológicas y climáticas similares.

La inspección ha demostrado que los steinernematidos son comunes en la región Central y los heterorhabditidos en la del Sur; sin embargo, un número limitado de muestras fue tomado en un área específica y en un período corto, esto únicamente proporciona una idea de

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la distribución de los géneros de nematodos presentes en un tiempo particular. Adicionalmente, muestreos estacionales y extensivos podrían incrementar el conocimiento acerca de su ecología y la representación de las especies en el Estado de Zacatecas.

Futuras inspecciones deberán continuar para identificar y seleccionar los aislados nativos promisorios, que por su adaptabilidad a las condiciones de las regiones estudiadas y virulencia sobre insectos plaga específicos sean potencialmente valiosos, así como para determinar sí estos nematodos solos o combinados con otra fauna benefica del suelo, suprimen significativamente poblaciones de insectos plaga en cultivos de alta rentabilidad, que los posibiliten como agentes de biocontrol ideal alternativo para apoyar programas de manejo integrado en el Estado.

Una contribución relevante es la prevalencia de Heterorhabditis en la región del Sur, donde las condiciones ambientales son más favorables para los nematodos entomopatógenos, con potencial exitoso en el combate de insectos plagas de importancia económica en el guayabo. También, este estudio con base a las reinfecciones múltiples de Steinernema scapterisci en sus hospederos específicos, posiblemente demuestra por primera vez su hallazgo en Zacatecas, sin embargo, es necesario realizar morfometría de este aislado

y

estudios moleculares para su confirmación e identificación taxonómica definitiva. Resultados que en caso de ser corroborados, posibilitaría la implementación de futuros trabajos que incluyan investigaciones para su utilización en programas de control biológico sobre Brachystola ponderosa y B. magna, insectos plagas endémicas en el Estado y de la región, ya que está comprobado ser un excelente agente de biocontrol en contra orthopteros.

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168

VI. ANEXO Anexo 1 Asociación entre las regiones geográficas y la frecuencia de recuperación de los nematodos entomopatógenos Estadística Frecuencias Observadas vs. Frecuencias Esperadas No Paramétrica Chi-Square = 5.218077 df = 7 P < .633372 Nota. Suma desigual de las frecuencias observadas y las esperadas Región geográfica Observados Esperados O–E (O – E) 2 Grupo A Grupo B E – 5.30900 1.539433 Central (S) 13.0000 18.3090 .87400 .678398 Central (H) 2.0000 1.1260 – .35200 .023151 Sur (S) 5.0000 5.3520 4.78900 1.507759 Sur (H) 20.0000 15.2110 5.31000 .603900 Central (S) 52.0000 46.6900 .265273 2.8730 – .87300 Central (H) 2.0000 .009131 13.6470 .35300 Sur (S) 14.0000 .591032 38.7880 – 4.78800 Sur (H) 34.0000 Suma 142.0000 141.9960 .00400 5.218077 Abreviaciones: (S) = Steinernema; (H) = Heterorhabditis

1.- Planteamiento de la hipótesis: Ho: La cantidad de nematodos entomopatógenos observada en función de las regiones geográficas es igual a la cantidad de nematodos entomopatógenos esperada. Ha: La cantidad de nematodos entomopatógenos observada en función de las regiones geográficas no es igual a la cantidad de nematodos entomopatógenos esperada. 2.- Estadístico de prueba: La χ 2 , para un nivel de confianza del 95%. 3.- Criterio de rechazo: Si χ 2C ≥ χ 2T rechazar Ho y aceptar Ha 4.- Calcule el valor de la ji-cuadrada calculada: De los datos experimentales (ver el cuadro anterior) el valor de χ 2C = 5.218077 5.- De tablas obtenga el valor de la ji-cuadrada, para á = 0.95 y g.l. = 7 De tablas (Kokoska y Nevison, 1989) se obtuvo el valor de χ 20.95, 7 = 2.1673 6.- Conclusión: Como χ 2C > χ 2T rechazamos Ho y aceptamos Ha para p < 0.05.

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Anexo 2 Asociación entre los agrosistemas y la frecuencia de recuperación de los nematodos entomopatógenos Estadística Frecuencias Observadas vs. Frecuencias Esperadas No Paramétrica Chi-Square = 3.699961 df = 7 P < .813606 Nota. Suma desigual de las frecuencias observadas y las esperadas Agrosistema Observados Esperados O–E (O – E) 2 Grupo A Grupo B E Anual (RC) 5.0000 9.0140 – 4.01400 1.787464 Perennes (RC) 11.0000 10.4220 .57800 .032056 Anual (RS) 10.0000 7.6050 2.39500 .754244 Perennes (RS) 14.0000 12.9570 1.04300 .083958 Anual (RC) 27.0000 22.9850 4.01500 .701337 Perennes (RC) 26.0000 26.5770 – .57700 .012527 Anual (RS) 17.0000 19.3940 – 2.39400 .295516 Perennes (RS) 32.0000 33.0420 – 1.04200 .032860 Suma 142.0000 141.9960 .00400 3.699961 Abreviaciones: (RC )= Región Central; (RS) = Región Sur

1.- Planteamiento de la hipótesis: Ho: La cantidad de nematodos entomopatógenos observada en función de los agrosistemas es igual a la cantidad de nematodos entomopatógenos esperada. Ha: La cantidad de nematodos entomopatógenos observada en función de los agrosistemas no es igual a la cantidad de nematodos entomopatógenos esperada. 2.- Estadístico de prueba: La χ 2 , para un nivel de confianza del 95%. 3.- Criterio de rechazo: Si χ 2C ≥ χ 2T rechazar Ho y aceptar Ha 4.- Calcule el valor de la ji-cuadrada calculada: De los datos experimentales (ver el cuadro anterior) el valor de χ 2C = 3.699961 5.- De tablas obtenga el valor de la ji-cuadrada, para á = 0.95 y g.l. = 7 De tablas (Kokoska y Nevison, 1989) se obtuvo el valor de χ 20.95, 7 = 2.1673 6.- Conclusión: Como χ 2C > χ 2T rechazamos Ho y aceptamos Ha para p < 0.05, sin embargo, la Ho puede ser aceptada para una p < 0.886.

170

Anexo 3. Asociación entre el tipo de suelo y la frec uencia de recuperación de los nematodos entomopatógenos Estadística Frecuencias Observadas vs. Frecuencias Esperadas No Paramétrica Chi-Square = 9.819125 df = 15 P < .830931 Nota. Suma desigual de las frecuencias observadas y las esperadas Tipo de suelo Observados Esperados O–E (O – E) 2 Grupo A Grupo B E Xerosol lúvico Fluvisol eutrico Castañozen haplico Planosol haplico Phaenozen haplico Cambisol eutrico Regosol cálcico Vertisol pelico haplico Xerosol lúvico Fluvisol eutrico Castañozen haplico Planosol haplico Phaenozen haplico Cambisol eutrico Regosol cálcico Vertisol pelico haplico Suma

8.0000 8.0000 1.0000 1.0000 2.0000 16.0000 3.0000 1.0000 36.0000 16.0000 4.0000 7.0000 4.0000 25.0000 2.0000 8.0000 142.0000

12.3940 6.7600 1 4080 2.2530 1.6900 11.5490 1.4080 2.5350 31.6050 17.3940 3.5910 5.7460 4.3090 29.4500 3.5910 6.4640 142.1470

– 4.39400 1.24000 – .40800 – 1.25300 .31000 4.45100 1.59200 – 1.53500 4.39500 – 1.39400 .40900 1.25400 – 1.30900 – 4.45000 – 1.59100 1.53600 –.14700

1.557789 .227456 .118227 .696853 .056864 1.715421 1.800045 .929477 .611170 .021113 .046583 .273671 .022159 .672411 .704896 .364990 9.819125

1.- Planteamiento de la hipótesis: Ho: La cantidad de nematodos entomopatógenos observada en función del tipo de suelo es igual a la cantidad de nematodos entomopatógenos esperada. Ha: La cantidad de nematodos entomopatógenos observada en función del tipo de suelo no es igual a la cantidad de nematodos entomopatógenos esperada. 2.- Estadístico de prueba: La χ 2 , para un nivel de confianza del 80%. 3.- Criterio de rechazo: Si χ 2C ≥ χ 2T rechazar Ho y aceptar Ha 4.- Calcule el valor de la ji-cuadrada calculada: De los datos experimentales (ver el cuadro anterior) el valor de χ 2C = 9.819125 5.- De tablas obtenga el valor de la ji-cuadrada, para á = 0.80 y g.l. = 15 De tablas (Kokoska y Nevison, 1989) se obtuvo el valor de χ 20.80, 15 = 10.307 6.- Conclusión: Como χ 2C > χ 2T aceptamos Ho y rechazamos Ha para p < 0.05.

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Anexo 4. Asociación entre la textura del suelo y la frecuencia de recuperación de los nematodos entomopatógenos Estadística Frecuencias Observadas vs. Frecuencias Esperadas No Paramétrica Chi-Square = .6680089 df = 5 P < .984677 Nota. Suma desigual de las frecuencias observadas y las esperadas Textura de suelo Observados Esperados O–E (O – E) 2 Grupo A Grupo B E Suelos ligeros 10.0000 8.4500 1.55000 .284320 Suelos medios 20.0000 21.9710 – 1.97100 .176817 Suelos finos 10.0000 9.5770 .42300 .018683 Suelos ligeros 20.0000 21.5490 – 1.54900 .111346 Suelos medios 58.0000 56.0260 1.97400 .069551 Suelos finos 24.0000 24.4220 – .42200 .007292 Suma 142.0000 141.9950 .00500 .668009 1.- Planteamiento de la hipótesis: Ho: La cantidad de nematodos entomopatógenos observada en función de la textura del suelo es igual a la cantidad de nematodos entomopatógenos esperada. Ha: La cantidad de nematodos entomopatógenos observada en función de la textura del suelo no es igual a la cantidad de nematodos entomopatógenos esperada. 2.- Estadístico de prueba: La χ 2 , para un nivel de confianza del 95%. 3.- Criterio de rechazo: Si χ 2C ≥ χ 2T rechazar Ho y aceptar Ha 4.- Calcule el valor de la ji-cuadrada calculada: De los datos experimentales (ver el cuadro anterior) el valor de χ 2C = 6.68009 5.- De tablas obtenga el valor de la ji-cuadrada, para á = 0.95 y g.l. = 5 De tablas (Kokoska y Nevison, 1989) se obtuvo el valor de χ 20.95, 5 = 1.1455 6.- Conclusión: Como χ 2c < χ 2T aceptamos Ho para una p < 0.05.

172

Anexo 5. Asociación entre el tipo de clima y la frecuencia de recuperación de los nematodos entomopatógenos Estadística Frecuencias Observadas vs. Frecuencias Esperadas No Paramétrica Chi-Square = 5.391614 df = 11 P < .910712 Nota. Suma desigual de las frecuencias observadas y las esperadas Tipo de clima Observados Esperados O–E (O – E) 2 Grupo A Grupo B E Subtrópico árido templado (S) 13.0000 18.3090 – 5.30900 1.557789 Subtrópico árido temp lado (H) 2.0000 1.1260 .87400 .227456 Subtrópico semiárido semicálido (S) 5.0000 5.3520 – .35200 .118227 Subtrópico semiárido semicálido (H) 1.0000 .6530 .43700 .696853 Subtrópico semiárido cálido (S) 0.0000 .0000 0.00000 .056864 Subtrópico semiárido cálido (H) 19.0000 14.6470 4.35300 .012527 Subtrópico árido templado (S) 52.0000 46.6900 5.31000 1.715421 Subtrópico árido templado (H) 2.0000 2.8730 – .87300 .929477 Subtrópico semiárido semicálido (S) 14.0000 13.6470 .35300 .611170 Subtrópico semiárido semicálido (H) 1.0000 1.4360 – 4.43600 .111719 Subtrópico semiárido cálido (S) 0.0000 .0000 0.00000 .046583 Subtrópico semiárido cálido (H) 33.0000 37.3520 – 4.35200 .273671 Suma 142.0000 141.950 .00500 5.391614 Abreviaciones: (S) = Steinernema; (H) = Heterorhabditis

1.- Planteamiento de la hipótesis: Ho: La cantidad de nematodos entomopatógenos observada en función del tipo de clima es igual a la cantidad de nematodos entomopatógenos esperada. Ha: La cantidad de nematodos entomopatógenos observada en función del tipo de clima no es igual a la cantidad de nematodos entomopatógenos esperada. 2.- Estadístico de prueba: La χ 2 , para un nivel de confianza del 90%. 3.- Criterio de rechazo: Si χ 2C ≥ χ 2T rechazar Ho y aceptar Ha 4.- Calcule el valor de la ji-cuadrada calculada: De los datos experimentales (ver el cuadro anterior) el valor de χ 2C = 5.391614 5.- De tablas obtenga el valor de la ji-cuadrada, para á = 0.90 y g.l. = 11 De tablas (Kokoska y Nevison, 1989) se obtuvo el valor de χ 20.90, 11 = 5.5778 6.- Conclusión: Como χ 2c < χ 2T aceptamos Ho.

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS POSGRADO EN BIOTECNOLOGÍA ING. RODOLFO V. MORENTÍN DELGADO DIRECTOR DE LA F.C.B.A. PRESENTE En atención a que el C. Miguel Ángel Salas Cuévano, alumno egresado del Doctorado en Ciencias, área Biotecnología, con número de cuenta 97-3976, ha realizado todas las correcciones al manuscrito de tesis que presentó al cuerpo académico de revisores, constituido por: -Dr. Alfonso Pescador Rubio, Dr. Sergio Aguilar Espinosa, Dr. José Gerardo López Aguirre, Dr. Roberto Lezama Gutiérrez y Dr. Jaime Molina Ochoa profesores - investigadores de la Universidad de Colima, me dirijo respetuosamente para solicitarle la autorización de impresión de la tesis titulada: “Distribución natural de nematodos entornopatógenos (Nematoda: Steinernematidae y Heterorhabditidae) en sistemas agroecológicos de Zacatecas”.

Esta tesis ha sido dirigida por el Dr. Jaime Molina Ochoa de la Universidad de Colima y el Dr. Héctor René Vega Carrillo de la Universidad Autónoma de Zacatecas. Sin otro asunto más que tratar, reciba saludos.

Atentamente

Tecomán, Colima a 21 de Noviembre del 2002

Responsable del Posgrado

Expediente Académico del Alumno Interesado

Km. 40 Carretera Colima-Manzanillo. Tecomán Colima. México Cp 26100 Tels. (313) 3229409, 01 (312) 3161000 exts 52500. 52500 Tel-fax 01 (313) 3229405 Email: [email protected]

DR. SERGIO AGUILAR ESPINOSA COORDINADOR DEL POSGRADO EN BIOTECNOLOGÍA UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS PRESENTE.-

Me dirijo respetuosamente a Usted para presentarle el manuscrito de tesis del C. MIGUEL ÁNGEL SALAS LUÉVANO, estudiante del programa de Doctorado en Ciencias Área Biotecnología de nuestra Facultad. La tesis está titulada: “Distribución natural de nematodos entornopatógenos (Nematoda: Steinernematidae y Heterorhabditidae) en sistemas agro-ecológicos de Zacatecas”. La tesis fue dirigida por el Dr. René Vega Carrillo de la Unidad Académica de Estudios Nucleares, de la Universidad Autónoma de Zacatecas y por el que suscribe, miembro de la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Colima. Apruebo esta tesis para su autorización de impresión, su posterior defensa y obtención del grado correspondiente. Reciba mi agradecimiento por anticipado y mi consideración distinguida.

Atentamente

“ESTUDIA*LUCHA*TRABAJA" Tecomán, Colima a 21 de Noviembre del 2002.

D

c.c.p. Ing. Rodolfo Valentino Morentín Delgado. Director de la FCBA. c.c.p. Dr. Héctor René Vega Carrillo. c.c.p. Interesado

Zacatecas, Zac. a 21 de Noviembre de 2002

Dr. Sergio Aguilar Espinosa Coordinador del postgrado en Biotecnología Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias Presente Universidad Autónoma de Zacatecas

Estimado Dr. Aguilar, UNIDAD ACADÉMICA ESTUDIOS NUCLEARES Cuerpo Académico Radiobiología

n del Sr. Miguel

Héctor R. Vega Carrillo

Ángel

Salas

Apdo. Postal 336

natural de rnematidae y

98000 Zacatecas, Zac. México

Heterorhabdifid

de Zacatecas”,

Teléfono y FAX:

(492) 922 7043

Buzón electrónico: [email protected]

RL: http://contera.reduaz.mx/~rvega

Atentamente,

Dr. Héctor René Vega Carrillo Investigador Nacional nivel I Ccp. Interesado

DR. SERGIO AGUILAR ESPINOSA COORDINADOR DEL POSGRADO EN BIOTECNOLOGÍA, UNIVERSIDAD DE COLIMA PRESENTE:

Por medio de la presente me permito informar a usted que he revisado las correcciones del documento de TESIS DOCTORAL del C. M.C. MIGUEL ANGEL SALAS LUEVANO, que “DISTRIBUCIÓN NATURAL DE NEMATODOS lleva como título Y ENTOMOPATOGENOS (NEMATODA: STFINERNEMATIDAE HETERORBADITIDAE) EN SISTEMAS AGROECOLOGICOS DE ZACATECAS” y se realizaron las recomendaciones hechas durante su Examen Predoctoral, por lo que expreso a usted mi aprobación para que se imprima y pueda seguir con los trámites académicos, necesarios para que sustente su examen doctoral. Sin otro particular por el momento, agradezco la distinción y la oportunidad brindada, para la lectura del anterior documento y me permito enviarle un cordial saludo.

ATENTAMENTE Tecomán, Col. 19 de Noviembre de 2002

DR. ROBERTO LEZAMA GUTIÉRREZ PROFESOR-INVESTIGADOR DE LA FCBA

ccp. Dr. Carlos Salazar Silva. Rector de la Universidad de Colima. ccp. Dr. Francisco I. Lepe Aguayo. Coordinador Gral. de Docencia. ccp. Dr. Ramón A. illo Nakay.. Dir. Gral. Educ. Superior, Covarrubias. Directora General de Posgrado Delegado Regional No. 2. Delgado. Director de la FCBA. ccp. Archivo.

UNIVERSIDAD DE COLIMA CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO AGROPECUARIO

DR SERGIO AGUILAR ESPINOZA COORDINADOR DEL POSGRADO EN BIOTECNOLOGIA PRESENTE.

Me permito informar a usted que como revisor del documento final. del trabajo de investigación doctoral del alumno MIGUEL ANGEL SALAS LUEVANO, doy mi aprobación para que el sustentante continúe con los trámites correspondientes para llevar a cabo la defensa de su tesis doctoral. Esto en virtud de que fueron hechas las correcciones correspondientes a dicho documento, y se considera que reúne los requisitos para obtener el grado de Doctor en Ciencias. Sin otro particular aprovecho la oportunidad para enviarle un cordial saludo.

ATENTAMENTE “ESTUDIA * LUCHA * TRABAJA” Tecomán, Col., noviembre del 2002. I

/

. ALFONSO PESCADOR RUBIO PROFESOR INVESTIGADOR

C.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE.C.C.P. INTERESADO C.C.P. A R C H I V O .APR/amv*

UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS

Tecomán, Col., a 19 de Noviembre de 2002 Asunto: Aprobación de Tesis de Doctorado DR. SERGIO AGUILAR ESPINOSA

RESPONSABLE DEL POSGRADO EN BIOTECNOLOGÍA PRESENTE. Por este medio me dirijo a Usted, para informarle que, una vez que he concluido la revisión del documento titulado: “DISTRIBUCIÓN NATURAL DE NEMATODOS ENTOMOPATÓGENOS (NEMATODA: Steinernematidae y Heterorhabditidae) SISTEMAS AGROECOLOGICOS DE ZACATECAS”, que presenta el C. Miguel Ángel

Salas Leuvano como requisito para obtener el grado de Doctor en Ciencias, verifiqué que las observaciones que se le hicieron al documento han sido incorporadas y por lo tanto no tengo ningún inconveniente para otorgar mi autorización para que se realice su impresión final y de esta manera continúen los tramites académicos correspondientes. Agradezco de antemano la oportunidad brindada en la revisión de este documento, y al mismo tiempo me pongo a sus respetables órdenes para continuar apoyando la formación de recursos humanos de alta calidad. Sin más por el momento, reciba un cordial saludo. ATENTAMENTE

LÓPEZ AGUIRRE Profesor-Investigador c.c.p. c.c.p. c.c.p. c.c.p.

Dr. Carlos E. Izquierdo Espinal. Delegado Regional No. 2 Ing. Rodolfo V. Morentín Delgado. Director de la F.C.B.A. M.C. Miguel Angel Salas Luevano. Alumno Archivo

UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS

DR. SERGIO AGUILAR ESPINOSA RESPONSABLE DEL POSGRADO EN BIOTECNOLOGÍA-FCBA PRESENTE.Por este conducto, me permito comunicar que he revisado el documento doctoral "Distribución natural de nematodos entonopatógenos (Nematoda: Steinernematidae y Heterorhabditidae) e n sistemas agroecológicos de Zacatecas", que presenta el C. Miguel Ángel Salas Luevano, mismo que considero que incluyó las

revisiones que el comité revisor recomendó, por lo que expreso mi para que se sigan los tramites académicos que aprobación correspondan. Sin otro particular, le saludo cordialmente

ATENTAMENTE Tecomán, Colima, a 19 de Noviembre de 2002

Profesor-Investigador

c.c.p. c.c.p. c.c.p.

Ing. Rodolfo V. Morentín Delgado.- Director de la F.C.B.A. Interesado Archivo Personal

Km 40 Autopista Colima-Manzanillo • Tecomán, Colima, México • C.P. 28100 Tel. 01 (313) 322 94 05 • Ext. 52251 • Fax 52252 • [email protected]