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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 234 013

51 Int. Cl. : A01N 1/02

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A61K 31/728

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 97916438 .1

86 Fecha de presentación: 04.04.1997

87 Número de publicación de la solicitud: 0891133

87 Fecha de publicación de la solicitud: 20.01.1999

54 Título: Fluido de almacenamiento corneal que comprende ácido hialurónico.

30 Prioridad: 04.04.1996 IT PD960084

73 Titular/es: FIDIA S.p.A.

Via Ponte della Fabbrica, 3-A 35031 Abano Terme, Padova, IT

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

72 Inventor/es: Ponzin, Diego

16.06.2005

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Durán Moya, Carlos

ES 2 234 013 T3

16.06.2005

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 234 013 T3 DESCRIPCIÓN Fluido de almacenamiento corneal que comprende ácido hialurónico. 5

Objetivo de la invención El objetivo de la presente invención es mejorar y simplificar el almacenamiento de córneas destinadas a una queratoplastia penetrante en el intervalo de tiempo entre la extracción del donante y el transplante, mediante la utilización de formulaciones de fluidos de almacenamiento que contienen ácido hialurónico.

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Antecedentes y sector de la invención

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La queratoplastia penetrante se utiliza ampliamente para recuperar la visión en un gran número de enfermedades corneales. En procesos corneales severos de distrofia, inflamación o degenerativos, la queratoplastia penetrante es la única terapia eficaz para obtener la rehabilitación visual. Una de las cuestiones principales en esta terapia es el método utilizado para conservar un tejido corneal viable después de su extracción del donante. La córnea es un tejido avascular con una organización bien definida, con 1 mm de grosor periférico y 0,5 mm de grosor central. La parte expuesta al medio externo está cubierta por epitelio estratificado no queratinizado formado por 3 ó 4 capas de células escamosas planas, de 1 a 3 capas de células aladas y una única capa de células basales columnares unida a la membrana basal y al estroma subyacente mediante un complejo de adhesión. Durante el almacenamiento corneal, se puede perder el epitelio, pero si la membrana basal no se daña, la reepitelización tras el transplante suele ser rápida. El estroma se organiza en tres capas diferentes de matriz extracelular. Empezando por el epitelio, éstas incluyen una capa fina de Bowman, un estroma medio lamelar y una membrana basal (membrana de Descemet) que se genera por las células endoteliales que se alinean en la parte del tejido dirigida hacia el humor acuoso. Las otras partes del estroma se producen y se mantienen mediante los fibroblastos estromales, que son células planas denominadas normalmente como queratocitos. Debido a la presencia de sales, colágeno y proteoglicanos, el estroma es hipertónico con respecto tanto a las lágrimas como al humor acuoso. El agua está menos concentrada en la zona epitelial debido, probablemente, al secado a través de las capas epiteliales. De forma similar, la glucosa está menos concentrada en la zona epitelial debido a que este metabolito fluye desde el humor acuoso para ser utilizado, en su mayor parte, por el epitelio. El estroma contiene proteoglicanos (sulfato de dermatano y queratano) con el primero más concentrado en la zona epitelial y el segundo, en la zona endotelial. El endotelio corneal es un endotelio de una sola capa, cuboidal, que forma un mosaico hexagonal que se sitúa sobre la membrana de Descemet vista desde la cámara anterior. Las células hexagonales se unen mediante uniones estrechas que, sin embargo, no forman un sellado completo alrededor de las células. En cambio, se concentran en la membrana apical de la célula. La integridad de las uniones depende de la presencia de 2+ Ca en el medio circundante. Esta organización permite que el humor acuoso y sus solutos tengan acceso al espacio paracelular. En condiciones normales, tras el influjo del fluido no se produce el hinchamiento de la córnea debido a que un volumen equivalente de fluido es extraído activamente por el complejo de bombeo del endotelio. La Na+ - K+ ATPasa es una parte esencial de este sistema de bombeo que, por tanto, requiere del ATP producido por la actividad metabólica de las células endoteliales. Para evaluar completamente la función de las células endoteliales, es de interés observar que estas células tienen, en la zona dirigida hacia el humor acuoso, el miembro de la familia de las inmunoglobulinas, ICAM-1 (molécula-1 de adhesión intercelular), que actúa como correceptor para la integrina LFA-1 (α L, β 2), localizada en la superficie del leucocito. La ICAM-1 también puede funcionar como receptor del ácido hialurónico (McCourt, P.A.G. y otros (1994) J. Biol. Chem. 269, 30081-30084). Esto indica que las células endoteliales interaccionan con los leucocitos cuando alcanzan el humor acuoso. También puede indicar que, en condiciones normales y en ausencia de leucocitos, el ácido hialurónico se asocia con este receptor para preservar la integridad de la capa endotelial. Hinchamiento de córneas: Cuando se pierde la función de bombeo del endotelio, la hipertonicidad del estroma provoca que el tejido corneal se hinche. Este hinchamiento da lugar al incremento del grosor corneal y una disminución de la claridad. Además, hay una pérdida de proteoglicanos desde el estroma hacia el medio circundante. La pérdida de la función endotelial es la consecuencia de cuadros patológicos (por ejemplo, distrofias, degeneraciones, glaucoma). El envejecimiento puede favorecer la descompensación endotelial, ya que el número de células endoteliales disminuye con la edad (aproximadamente el 50% desde el nacimiento hasta la vejez). Dado que las células endoteliales tienen una capacidad regenerativa limitada, el daño a la integridad del endotelio sólo puede compensarse mediante el aumento de las células residuales que se vuelven más estrechas. El daño endotelial es también el principal riesgo en el almacenamiento de córneas antes del transplante. Este hecho da lugar a un hinchamiento corneal con pérdida de claridad y la muerte progresiva de las células endoteliales. La conservación de una capa endotelial intacta es, de hecho, un objetivo principal en la creación de métodos para conservar córneas antes de la queratoplastia penetrante. Almacenamiento de córneas: Los globos oculares completos de los donantes se pueden almacenar en una cámara de humedad a 4ºC, pero deberían utilizarse en 24 horas. La conservación de córneas en estado congelado se ha explotado satisfactoriamente (Kaufman, H.E. y Capella J.A. (1968) J. Cryosurg. 1, 125-129). Antes de congelarse, las córneas se tratan con concentraciones crecientes de DMSO y sacarosa para evitar la formación de hielo intracelular. Las dificultades en la manipulación y el transporte de córneas congeladas a una temperatura baja constante impiden la 2

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difusión de esta técnica. Alternativamente, las córneas se pueden almacenar a 37ºC en un medio de cultivo de órgano (Doughman D.J. y otros (1976) Trans. Am. Acad. Ophtalmol. Otolaringol. 81, 778-793). Dado que los medios de cultivo se complementan con suero para una conservación óptima de la célula, este método tiene la desventaja de que el ojo receptor se expone a una cantidad residual de suero transportado por la córnea en el momento del transplante. El suero animal puede provocar una respuesta inmune mientras que el suero humano puede transmitir enfermedades virales. Actualmente, el método más adecuado para la conservación corneal parece ser el almacenamiento a corto plazo en un medio sin suero a 4ºC. A esta temperatura, la actividad metabólica de las células endoteliales es mínima. De este modo, se pierde la función de bombeo. El hinchamiento de la córnea se puede evitar mediante la adición de compuestos retenedores de agua del medio de conservación. Entre éstos, uno de los más utilizados es el compuesto deturgescente, dextrano, solo (McKarey, B.E. y Kaufman, H.E. (1974) Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 13, 165) o bien en asociación con el glucosaminoglicano, sulfato de condroitina (Kaufman H.E. y otros (1991) Arch. Ophtalmol. 109, 864-868). Sin embargo, el sulfato de condroitina es un compuesto heterogéneo debido a la variada distribución de las moléculas de sulfato en el interior del polímero (Scott, 1995). Como resultado, las composiciones a utilizar para el almacenamiento corneal pueden variar entre lotes. Además, debido a las moléculas de sulfato, el sulfato de condroitina transporta una fuerte carga negativa. Recientemente se ha sugerido que esta fuerte carga negativa es perjudicial para la conservación de la córnea debido a que las fuertes cargas negativas disminuyen la capacidad de adhesión del endotelio corneal (Chen y otros 1996). Además, se ha observado que el sulfato de condroitina puede penetrar en la córnea y favorecer su hinchamiento, particularmente tras el recalentamiento del tejido desde 4ºC hasta temperatura ambiente, antes del transplante (Kaufman y otros 1992). En un intento por disminuir el hinchamiento corneal inducido por el sulfato de condroitina, se formularon composiciones para la conservación de la córnea, que contenían agentes deturgescentes, tales como el dextrano, en combinación con el sulfato de condroitina (Patente EP 0 517 972). Sin embargo, el dextrano puede penetrar en el estroma durante el almacenamiento y puede incrementar la presión de hinchamiento en el recalentamiento. Además, actualmente, también está claro que el dextrano puede ser tóxico para la córnea, induciendo la senescencia y la degeneración (Chen y otros 1996).

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Ogino y otros (Nokugan Zan-shi, Effect of a Newly Developed Corneal Storage Medium on Corneal Endothelium - Morphological Study by Scanning Electron Microscopy, 1995) describen un medio de almacenamiento que contiene ácido hialurónico (AH). Sin embargo, el ácido hialurónico utilizado por Ogino y otros tenía un peso molecular de 800.000. Un AH con un peso molecular tan elevado es demasiado viscoso para ser adecuado como componente del medio de almacenamiento y se debe utilizar en combinación con otros componentes retenedores de agua para evitar el hinchamiento de la córnea sin aumentar la viscosidad de la solución.

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Böhnke y otros dan a conocer la utilización de ácido hialurónico con un peso molecular de 250.000 ó 500.000 como aditivo osmótico para un medio de conservación corneal. Böhnke y otros muestran que el ácido hialurónico con un peso molecular de 500.000 Da tiene propiedades equivalentes al ácido hialurónico con un peso molecular de 250.000 Da, tal como se demuestra en la Tabla 1. De este modo, Böhnke y otros no dicen nada con respecto a la elección de un peso molecular deseado del ácido hialurónico.

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La Patente JP 107 538 muestra que cuando el ácido hialurónico se utiliza como una solución de conservación del ojo para el transplante de córnea, debería tener un peso molecular superior a 600.000 Da y una presión osmótica ajustada dentro del intervalo de 260 a 350 mOsm.

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Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención proporcionar un fluido para el almacenamiento de córnea capaz de proporcionar unas condiciones de almacenamiento adecuadas para córneas viables, a la vez que se evitan las desventajas de los fluidos anteriores. Descripción detallada de la invención

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Por tanto, la presente invención está dirigida a una composición del fluido de la córnea que comprende ácido hialurónico, y a la utilización de una formulación que comprende ácido hialurónico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, presente en una concentración de un 2% p/v, sobre el total de la solución, y con un peso molecular promedio de 50.000 a 150.000 Da y a la utilización de esta formulación de ácido hialurónico para la conservación de córnea viable a bajas temperaturas, especialmente entre 2-8ºC. La presente invención se basa en las siguientes suposiciones, las cuales están en línea con las consideraciones sobre la organización y la función corneal descritas anteriormente: (i) Durante el almacenamiento de las córneas a bajas temperaturas, la actividad metabólica de las células endoteliales se muestra silenciosa. De este modo, no se necesitan los nutrientes ni los factores de crecimiento (suero u otros). La función de bombeo no se realiza y no se necesita soporte.

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(ii) Debería ser suficiente una solución salina equilibrada complementada con un compuesto retenedor de agua para mantener la integridad de la córnea. Si un único compuesto retenedor de agua es apropiado, otros compuestos, tales como el dextrano, ya no son necesarios. 3

ES 2 234 013 T3 (iii) Se necesita una película protectora sobre las células endoteliales para evitar que se dañen durante el almacenamiento. Parece adecuado utilizar un ligando natural capaz de asociarse con el coreceptor ICAM-1. 5

Tal como se indicó anteriormente, se ha identificado el ÁCIDO HIALURÓNICO como el compuesto apropiado que cumple los requisitos para un almacenamiento óptimo de la córnea a bajas temperaturas.

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El ácido hialurónico pertenece al grupo de los glucosaminoglicanos que también incluye a compuestos que contienen grupos sulfatos (condroitinas, queratanos y los heparanos). Como consecuencia de la distribución variable de los residuos de sulfato, este grupo de glucosaminoglicanos es un ensamblaje heterogéneo de diferentes moléculas. En cambio, el ácido hialurónico sólo contiene la unidad de disacárido N-acetil glucosamina y glucuronato. De este modo, el ácido hialurónico es un compuesto homogéneo con una estructura primaria definida: cadenas lineales que contienen centenares de unidades de disacáridos y centenares de aniones fijados a cada cadena (los grupos carboxilato).

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Recientemente, se ha identificado una estructura secundaria ordenada en el ácido hialurónico (Scott, J.E. (1995) Eur. J. Rheumatol. Inflamm. 15, 3-8). Esto se apoya en la existencia de extensos enlaces de hidrógeno entre las unidades de azúcar y una estructura de doble hélice provocada por el giro de 180º entre las unidades de disacáridos. La estructura secundaria produce amplias zonas hidrofóbicas en las cadenas de ácido hialurónico de aproximadamente 8 unidades de CH (la longitud de un ácido graso de cadena corta), que son capaces de asociarse con los fosfolípidos de membrana u otros lípidos. De hecho, el efecto beneficioso del ácido hialurónico en articulaciones inflamadas puede ser resultado de su asociación con citocinas inflamatorias similares a lípidos, tales como el factor activador de plaquetas. A concentraciones diluidas de ácido hialurónico en medio acuoso (1 µg/ml o más), se forma una estructura terciaria (Scott, J.E. y otros (1991) Biochem. J. 274, 699-705). Esta es una malla en forma de panal formada mediante la agregación de las cadenas de ácido hialurónico que establecen un contacto dinámico entre todas las moléculas de ácido hialurónico. La malla atrapa en su interior agua y solutos, restringiendo así su interacción con el medio externo. Las células con receptores para el ácido hialurónico pueden anclar extensas mallas alrededor de ellas mismas. Esto puede tener un efecto protector ya que se evita que las sustancias químicas se aproximen a las células. Resulta interesante la observación de que esta organización se vuelve menos compacta y puede ser realmente interrumpida por la acción de radicales libres OH que inducen a la degradación de las cadenas de ácido hialurónico. En conclusión, a continuación se muestran las propiedades del ácido hialurónico relacionadas con la presente invención y con el objetivo de mantener una córnea viable. 1. La presencia de aniones fijos en las cadenas de ácido hialurónico, los cuales actúan como intercambiadores de cationes solubles y, por tanto, limitan el movimiento de cationes monovalentes y divalentes hacia el tejido corneal. 2. La presencia de zonas hidrofóbicas en la estructura secundaria de las cadenas de ácido hialurónico que permiten al compuesto entrar en contacto y proteger los puntos hidrofóbicos posiblemente expuestos en la membrana celular.

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3. La formación de una red por parte de las cadenas de ácido hialurónico que encierra agua y solutos y produce un efecto retentivo de agua máximo. 4. La interacción con la ICAM-1 localizada en la superficie de las células endoteliales que asegura la formación de una película protectora de ácido hialurónico alrededor de las propias células.

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En principio, estas propiedades son suficientes para obtener la conservación de las células endoteliales a bajas temperaturas y para evitar el hinchamiento corneal. Dado que el ácido hialurónico de peso molecular elevado (1.000.000 Daltons o más) forma soluciones viscosas, se debería utilizar ácido hialurónico con un peso molecular inferior. En particular, el ácido hialurónico debería tener un peso molecular promedio dentro del intervalo de 50.000 a 150.000 Daltons. Con este tamaño molecular aún se forma una malla de ácido hialurónico, aunque que la organización puede ser menos compacta. Para las soluciones médicas que abarca la presente invención, los ácidos hialurónicos se pueden obtener a partir de varias fuentes. Por ejemplo, el ácido hialurónico se puede purificar a partir de fuentes convencionales, tales como crestas de gallo, utilizando los procesos descritos en la Patente EP 0 138 572. Alternativamente, el ácido hialurónico se puede obtener a través de un proceso de fermentación, tal como se describe en la Patente WO 95/04132, o mediante una síntesis enzimática utilizando un factor proteico purificado que contiene hialuronato sintasa, tal como se describe en la Patente WO 95/24497. Ejemplos de formulaciones La solución médica sin suero propuesta en la presente invención debería contener:

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1. Una solución de electrolitos equilibrada tamponada a pH 7,2-7,4 con fosfato, bicarbonato y Hepes (ácido hidroxietilpiperazina etanosulfónico). Para los objetivos de la presente invención, es satisfactorio un medio esencial mínimo (por ejemplo TC 199, tal como el obtenible de Gibco BRL, Maryland; Signa, Missouri; Flow Laboratories, Maryland). Este medio se utiliza ampliamente en el cultivo de tejidos y en su formulación contiene sales inorgánicas esenciales, aminoácidos, vitaminas y precursores de ATP. 4

ES 2 234 013 T3 2. Antibióticos, tales como, pero no limitados a, gentamicina, estreptomicina, penicilina G y combinaciones de los mismos, para evitar contaminaciones microbianas. 5

3. Una sal sódica del ácido hialurónico con un peso molecular de 50.000-150.000 Da, en un 2% p/v en base al total de la solución. Se pueden realizar variaciones en la elección de las soluciones salinas tamponadas y en los antibióticos. Esta composición sencilla debería ser suficiente para cumplir todos los requisitos de un almacenamiento corneal óptimo a bajas temperaturas durante, como mínimo, una semana.

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Evaluaciones biológicas 1. Materiales y métodos 15

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La composición de medio sin suero que comprende la sal sódica del ácido hialurónico se describe en la Tabla 1, en comparación con el medio de almacenamiento corneal disponible comercialmente que contiene sulfato de condroitina y dextrano (Optisol-GS) o únicamente dextrano (McKarey-Kaufman). Se extrajeron una pareja de ojos de donante humano dentro de las 9-10 horas posteriores a la muerte. Se aislaron las córneas de los globos con un borde escleroso de 2 mm y se comprobaron la viabilidad de células endoteliales, la densidad de células endoteliales, el grosor corneal y la claridad. La viabilidad de células endoteliales se valoró mediante la tinción con azul de tripano al 0,3%. La muerte celular normalmente se distribuye en dos patrones: conjuntos regulares de células teñidas que corresponden a pliegues producidos mediante la tensión mecánica de las córneas durante la extracción y una mortalidad difusa, indicativa de una disfunción metabólica de las células endoteliales. El análisis se completó al final de cada experimento mediante la tinción con rojo de Alizarina para evaluar la morfología de la célula y las áreas de la membrana de Descemet no cubiertas por el endotelio. La muerte celular se expresó como el porcentaje de las células teñidas en relación con el total de células. La densidad de células endoteliales se evaluó contando las células en 5 campos de la parte central de las córneas utilizando un microscopio óptico ajustado con una retícula cuadrada de 10x10 mm. Cuando la muerte celular era inferior a un 2% y el número de células endoteliales era >2000 mm2 , las córneas se consideraban adecuadas para el transplante. El grosor corneal se midió por medio de un microscopio vertical ajustado con un micrómetro digital para evaluar la distancia entre el epitelio y el endotelio. Se obtuvieron tres lecturas centrales para cada córnea. Se evaluó la claridad con un microscopio vertical y se clasificó tal como se indica a continuación: grado 3, excelente; grado 2, buena con alguna irregularidad en la membrana de Descemet; grado 1, insatisfactorio debido a un edema estromal o irregularidades pronunciadas en la membrana de Descemet. Después del análisis, las córneas se sumergieron en el medio de almacenamiento a 4ºC para las posteriores pruebas de conservación o utilización en una queratoplastia penetrante. Estudios in vitro: Estos experimentos se llevaron a cabo con córneas de donantes bien conservadas no adecuadas para el transplante debido a contraindicaciones o enfermedad del donante.

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Se extrajeron una pareja de ojos de donante humano dentro de las 10 horas posteriores a la muerte. Se aislaron las córneas de los globos con un borde escleroso de 2 mm y se comprobaron la viabilidad de células endoteliales, la densidad de células endoteliales, el grosor corneal y la claridad. La viabilidad de células endoteliales se valoró mediante la tinción con azul de tripano al 0,3%. La muerte celular normalmente se distribuye en dos patrones: conjuntos regulares de células teñidas que corresponden a pliegues producidos mediante la tensión mecánica de las córneas durante la extracción y una mortalidad difusa, indicativa de una disfunción metabólica de las células endoteliales. El análisis se completó al final de cada experimento con la tinción con rojo de Alizarina para evaluar la morfología de la célula y las áreas de la membrana de Descemet no cubiertas por el endotelio. La muerte celular se expresó como el porcentaje de las células teñidas en relación con el total de células. La densidad de células endoteliales se evaluó contando las células en 5 campos de la parte central de las córneas utilizando un microscopio óptico ajustado con una retícula cuadrada de 10x10 mm. Se consideró que una muerte celular por encima del 10% y una claridad de grado 1 eran incompatibles con el experimento. El grosor corneal se midió por medio de un microscopio vertical ajustado con un micrómetro digital para evaluar la distancia entre el epitelio y el endotelio. Se obtuvieron tres lecturas centrales para cada córnea. Se evaluó la claridad con un microscopio vertical y se clasificó tal como se indica a continuación: grado 3, excelente; grado 2, buena con alguna irregularidad en la membrana de Descemet; grado 1, insatisfactorio debido a un edema estromal o irregularidades pronunciadas en la membrana de Descemet. Después del análisis, las córneas se almacenaron en 10 ml del medio de prueba (una sal sódica de ácido hialurónico, Optisol-GS o McKarey-Kaufman) a 4ºC durante 7-14 días.

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Estudios clínicos: Se dirigió un estudio abierto, no controlado, con córneas evaluadas tal como se describió anteriormente, y se almacenaron en el medio que contenía ácido hialurónico. Las córneas almacenadas en un medio Optisol-GS actuaron como control. Los donantes tenían de 46 a 86 años de edad. Sus córneas, recogidas entre las 2 y 9 horas posteriores a la muerte, se encontraban en una excelente condición de conservación, tal como se puede juzgar por su claridad, grosor, viabilidad de células endoteliales (falta de células positivas por azul de tripano) y densidad (2200-3000 células/mm2 ). El tiempo de almacenamiento a 4ºC fue de 25-96 horas (ver tabla 2). Las córneas se calentaron a temperatura ambiente en el momento del transplante. Se admitieron un total de 16 receptores que requerían de queratoplastia penetrante para queratoconos, queratopatía bullosa, distrofia de Groenow, distrofia endotelial 5

ES 2 234 013 T3 adquirida, y leucomas. El cuidado operatorio y postoperatorio fue el mismo en todos los casos. Dos semanas después del transplante se registraron la extensión de la reepitelialización, la claridad corneal, el grosor (medido mediante una paquimetría ultrasónica) y la densidad de células endoteliales (evaluada mediante un análisis de imagen fija de fotografías especulares). Los pacientes se volvieron a examinar después de dos meses. 5

2. Resultados

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Estudios in vitro: Se almacenaron cinco pares de córneas en un medio McKarey-Kaufman, Optisol-GS o de una sal sódica del ácido hialurónico. Se evaluaron la claridad, el grosor y la mortalidad de células endoteliales a los 3, 7 ó 14 días y se muestran los resultados en la Tabla 3. Se observó una excelente conservación de córnea en medio Optisol-GS y de ácido hialurónico. Incluso después de 14 días la pérdida de células endoteliales no sobrepasaba el 7%. La tinción con rojo de alizarina y azul de tripano a los 7 días confirmó la integridad del endotelio. De acuerdo con esto, la claridad corneal y el grosor estaban bien conservados. En cambio, el medio McKarey-Kaufman era menos eficaz. La claridad empezó a perderse el día 3, mientras que el grosor se incrementó hasta un máximo del 40% el día 7. La pérdida de células endoteliales alcanzó el 22-25% el día 14. Estos resultados confirmaron el pobre carácter del dextrano para actuar como conservante corneal e indicaban la mayor eficacia tanto del sulfato de condroitina como de la sal sódica del ácido hialurónico. Sin embargo, la sal sódica del ácido hialurónico era capaz de conseguir una conservación corneal satisfactoria en ausencia de dextrano, el cual se requiere en el medio Optisol-GS. Tal como se afirmó anteriormente, el dextrano puede penetrar el tejido corneal y puede incrementar la presión de hinchamiento tras el recalentamiento. Estudios clínicos: Un grupo de ocho pacientes programados para una queratoplastia penetrante recibieron córneas almacenadas en el medio de ácido hialurónico, un grupo paralelo de ocho pacientes recibieron córneas almacenadas en Optisol-GS. Tras la intervención quirúrgica, la reepitelialización de las córneas se completó en 3 días. Después de dos semanas, la claridad y el grosor de las córneas se conservaban bien. En 10 pacientes se llevó a cabo un análisis de la densidad de las células endoteliales y se confirmó la eficacia de los dos medios. Después de dos meses, todos los injertos estaban en buenas condiciones cuando mostraron una reepitelialización y una claridad de grado 3 (Tabla 4). Conclusiones

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En general, los resultados del presente estudio demuestran que el ácido hialurónico es una agente eficaz para la conservación corneal, incluso en ausencia de otras sustancias en el medio de almacenamiento. Su principal ventaja es la eficacia en ausencia de otras adiciones al medio de almacenamiento. Esto hace que la composición del medio sea sencilla y barata, evitando mezclas de nutrientes complejas. Además, la ausencia de componentes lábiles, tales como péptidos o proteínas (factores de crecimiento), incrementa la estabilidad del medio de almacenamiento y evita la formación de productos de degradación. Una ventaja adicional del medio de ácido hialurónico es que se conserva un tejido fino en el momento de la intervención quirúrgica. Esto permite una evaluación precisa de las condiciones del tejido y una mejor manipulación durante el transplante. Estando la presente invención descrita de este modo, quedará claro que la misma se puede variar de muchas maneras. Dichas variaciones y todas las modificaciones, como sería obvio para un técnico del sector, se pretende que se incluyan dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

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ES 2 234 013 T3 REIVINDICACIONES 5

1. Solución de almacenamiento corneal que comprende ácido hialurónico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo presente en una concentración del 2% p/v en base al total de la solución y que tiene un peso molecular promedio de 50.000 a 150.000 Da. 2. Solución de almacenamiento corneal, según la reivindicación 1, que además comprende

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una solución de electrolitos equilibrada y, como mínimo, un antibiótico. 3. Solución, según la reivindicación 2, en la que el pH de la solución de electrolitos equilibrada es 7,2-7,4.

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4. Solución, según la reivindicación 2, en la que el antibiótico es, como mínimo, un miembro seleccionado del grupo que consiste en gentamicina, penicilina G y estreptomicina. 20

5. Método de almacenamiento de tejido corneal que comprende la exposición del tejido corneal a la solución, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4. 6. Método, según la reivindicación 5, en el que dicha solución médica se mantiene a una temperatura de 2-8ºC.

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7. Utilización de la solución, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para el almacenamiento de tejido corneal. 8. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para el almacenamiento de tejidos corneales a una temperatura de 2-8ºC.

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