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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

G01N 33/569 (2006.01) C07K 16/12 (2006.01)

ESPAÑA

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11 Número de publicación: 2 283 129

51 Int. Cl.:

TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 99943941 .7

86 Fecha de presentación : 25.08.1999

87 Número de publicación de la solicitud: 1107773

87 Fecha de publicación de la solicitud: 20.06.2001

54 Título: Método para detección de bacteria de Legionela empleando anticuerpos específicos de antígeno pu

rificados. 30 Prioridad: 25.08.1998 US 139720

73 Titular/es: Binax, Inc.

217 Read Street Portland, Maine 04103, US

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.10.2007

72 Inventor/es: Moore, Norman, James;

Molokova, Elena, Valentin y Koulchin, Vladimir, Andrei

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Izquierdo Faces, José

ES 2 283 129 T3

16.10.2007

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid

ES 2 283 129 T3 DESCRIPCIÓN Método para detección de bacteria de Legionela empleando anticuerpos específicos de antígeno purificados. 5

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Esta invención se refiere a carbohidrato libre de proteína, que incluye antígenos polisacáridos separados de la bacteria Legionela, y especialmente a serogrupos y/o cepas de Legionela neumófila, que incluye el antígeno O-polisacárido de L. Neumófila serogrupo 1, y al uso de estos antígenos en la purificación de afinidad de anticuerpos polivalentes correspondientes a organismos Legionela. Más en particular, la invención comprende la unión del carbohidrato o antígeno polisacárido separados de una bacteria Legionela con una columna cromatográfica activada y el uso de esta columna para purificación de afinidad de los anticuerpos policlonales con las mismas especies, o el mismo serogrupo de una especie, de Legionela. La invención además comprende el uso de los anticuerpos polivalentes purificados por afinidad producidos en ensayos inmunoquímicos para la detección de enfermedades causadas por Legionela tales como enfermedad de los Legionarios y fiebre de Pontiac en pacientes humanos y para la detección de fuentes medioambientales de agentes infecciosos de Legionela.

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Contexto

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La enfermedad de los Legionarios, una infección humana similar a la neumonía causada por la bacteria gramnegativa del género Legionela, resulta virtualmente imposible de diferenciar sobre una base clínica fiable (que implica el análisis de los síntomas del paciente sin pruebas de laboratorio) de la neumonía u otras infecciones similares del pulmón. Debido a que la enfermedad puede provocar abscesos de pulmón, infecciones en otros órganos del cuerpo o bacteriemia, y debido también a que su tasa de mortalidad aumenta considerablemente por retrasos en el inicio de una apropiada terapia, existe la necesidad de crear pruebas de diagnóstico rápidas y fiables que hasta la fecha sólo se han conseguido parcialmente. Stout, J. E y Yu, V.L, “Legionellosis”, 337, N. Eng. J. Med. 682-687 (1997). Los esfuerzos por desarrollar tales pruebas se han visto dificultados por el hecho de que hay un número de especies Legionela, algunas de las cuales parecen tener un número de distintos serogrupos. La enfermedad de los Legionarios se reconoció por primera vez en el verano de 1976 y en el ínterin se han desarrollado una serie de técnicas para detectar Legionela (L) neumófila que ahora se sabe que corresponde al 90% de los casos (Stout y Yu, supra). En general, estas pruebas han supuesto demasiado tiempo y han sido de incapaces de identificar más de un serogrupo de los 15 serogrupos conocidos hasta ahora correspondientes a la especie L. Neumófila. Sin embargo, hay que indicar que, tal y como afirmaron Stout y Yu, supra, más del 80% de los casos detectados como enfermedad de los Legionarios se atribuyen a L. Neumófila serogrupo 1, un hecho que provocó el desarrollo de un rápido y fiable inmunoensayo para esa entidad de particular importancia que ha llevado a los científicos a centrarse en ella como una prioridad. Los primeros esfuerzos para establecer la identidad del agente causativo de la enfermedad de los Legionarios dependieron en gran parte del cultivo de bacterias durante 5 o 6 días y del examen de los cultivos microscópicamente. Los esfuerzos por acelerar el proceso de identificación llevaron a numerosas pruebas inmunoquímicas de variación de sensibilidad y especificidad que incluían, entre otros, el inmunoensayo disponible actualmente en el mercado EQUATETM (“RIA”), y el inmunoensayo de enzima Binax (“EIA”), y ambos se venden en forma de kit por el cesionario del solicitante, Binax, Inc. Como se indica por Hackman, B.A. et al. En “Comparison of Binax Legionella Urinary Antigen EIA Kit with Binax RIA Urinary Antigen Kit for Detection of Legionella pneumophila Serogroup I Antigen”, 34 J. Clin. Microbiol. 1579-1580 (1996), estos dos ensayos resultaron ser específicos para L. Neumófila Serogrupo 1 antígeno. La sensibilidad mostrada por EIA fue del 77%; la del RIA fue más elevada. El artículo indica que cada uno puede llevarse a cabo en menos de 3 horas desde el inicio hasta el final; en las propias pruebas de Binax, cada uno precisa de al menos 2 horas y media para llevarse a cabo. Más información sobre este ensayo EIA se puede encontrar en Kazandjian. D. Et al., “Rapad Diagnosis of Legionella pneumophila Serogroup I Infection with Binax Enzyme Immunoassay Urinary Antigen Test”, 35. J. Clin. Inmunobiol. 954-956 (1997), en resúmenes de la reunión general de la sociedad americana de microbiología, The Society, Washington DC, US, Vol. 98, mayo 1998 (1998-05), p. 203, Moore N. et al. Que trataba sobre “el desarrollo de un ensayo inmunocromatográfico (ICT) para la detección de Legionela neumófila” por Binax, Inc. El ensayo se ha desarrollad en formato de membrana de lujo lateral (ICT) y se dirige al análisis de Legionela neumófila serogrupo 1. El antígeno de carbohidrato de pureza 95% fue aislado y se unió con una matriz Sefarosa 4B. Se cultivaron anticuerpos para conejos, se purificaron para afinidad, se inmovilizaron y se conjugaron con oro coloidal para obtener un ensayo ICT. Breve descripción de la invención

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Quizás la ventaja más significativa del test inmunocromatográfico (ICT) aquí descrito es su habilidad para dar un resultado en un lapso de tiempo de 15 minutos para la presencia o ausencia de L. Neumófila Serogrupo 1 (o su antígeno), cuyo resultado es de elevada especificidad y sensibilidad. Esta velocidad con la que la prueba puede ser llevada de manera fiable y segura para producir un resultado de elevada especificidad y sensibilidad se cree que se debe a la naturaleza fuertemente reactiva de los anticuerpos purificados de afinidad preparados de acuerdo con la invención. Las propiedades superiores reactivas de estos anticuerpos, sin embargo, pueden atribuirse al uso de purificación de afinidad de la novedad, esencialmente antígeno O-polisacárido libre de proteína de L. Neumófila Serogrupo 1, que es también parte de esta invención.

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También ha sido posible otra prueba ICT mediante la separación, de acuerdo con esta invención, de un antígeno de L. Neumófila Serogrupo 5 que no es proteínico, de naturaleza carbohidrato y es común a múltiples serogrupos de L. Neumófila. La presencia de tal antígeno ha sido sugerida en varias publicaciones científicas; ver por ejemplo, Nolte, F. S. Et al. “Electrophoretic and Serological Characterization of the Lipopolysaccharides of Legionella pneumophila”, 167 J. Bacterial. 893-904 (1986); Barthe, C. Et al., “Common Epitope on the Lipopolysaccharide of Legionella pneumophila Recognized by a Monoclonal Antibody”, 26 J. Clin. Microbiol. 1016-1023 (1994). Hasta este momento, no ha habido ningún informe claro sobre ninguna separación de tal antígeno para uso en el desarrollo de un ensayo inmunoquímico de amplio espectro útil. Esta invención comprende la extracción de la bacteria Legionela, y especialmente de una bacteria de cualquiera de los serogrupos L. Neumófila de antígeno de carbohidrato libre de proteína, la preparación de un conjugado de este antígeno con una proteína separadora, la unión del conjugado con una columna de afinidad, el uso de tal columna para la purificación de anticuerpos polivalentes correspondientes a la bacteria Legionela, tal como una bacteria de un serogrupo de L. Neumófila y el uso de los anticuerpos purificados en un inmunoensayo ICT para la detección de bacteria Legionela o sus antígenos, que incluyen antígenos de L. Neumófila serogrupos o sus correspondientes bacterias, como se describirá con más detalle a continuación. En particular, la invención incluye la separación de antígeno O-polisacárido libre de proteína de L. Neumófila Serogrupo 1, su uso en la purificación de afinidad del anticuerpo polivalente específico al mismo microorganismo y el uso de tal anticuerpo purificado de afinidad en un inmunoensayo ICT de elevada especificidad y sensibilidad que se lleva a cabo en un espacio de tiempo de 15 minutos. En otra realización, la invención incluye la separación de L. Neumófila Serogrupo 5 de un antígeno de carbohidrato libre de proteína y su uso en la purificación de afinidad del anticuerpo policlonal específico al antígeno L. Neumófila Serogrupo 5 (es decir, un anticuerpo que se obtuvo de un conejo inmunizado con el citado antígeno); este anticuerpo mostró una habilidad para reaccionar de manera cruzada con antígenos L. neumófila de serotipos 1, 2 y 4 además del antígeno de serotipo 5. Descripción de los dibujos

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La Figura 1 y sus Figuras relacionadas 1A, 1B y 1C muestran la estructura de un dispositivo ICT típico que se adapta de manera adecuada para llevar a cabo el ensayo específico L. Neumófila Serogrupo 1, como se describe en los Ejemplos VII, VIII y IX. 35

La Figura 2 muestra los resultados de los análisis Western blot de extractos de salina fosfato-tampón de L. Neumófila Serogrupos 1, 2, 4 y 5 con L. Neumófila Serogrupo 5, carbohidrato libre de proteína anticuerpo policlonal purificado de afinidad de antígeno específico del antígeno serogrupo 5, cuyo análisis se describe en el Ejemplo X. Descripción detallada de la invención

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La experiencia previa en la técnica, incluyendo la experiencia con el ensayo RIA Binax para L. Neumófila Serogrupo 1 antígeno vendido bajo la marca EQUATE y le ensayo EIA Binax para el mismo antígeno, ha demostrado que los antígenos de la especie Legionela, incluyendo antígenos de varios grupos L. Neumófila, se detectan de manera más sencilla en especimenes de la orina de pacientes infectados con un microorganismo Legionela que en especimenes de sangre, esputo u otros fluidos. Este se debe en parte porque los antígenos de Legionela normalmente aparecen en la orina tras 1-3 días después de la infección de un paciente humano mientras que su aparición a un nivel detectable en sangre suele ocurrir más tarde, y también en parte porque los pacientes infectados con la enfermedad de los Legionarios a menudo no producen mucho esputo. La prueba ICT que forma parte de la presente invención puede realizarse en sangre, esputo u otro fluido como fluido cerebroespinal, o sobre muestras acuosas de origen medioambiental. Se observa que la orina es generalmente el fluido de muestra preferente para diagnóstico de pacientes humanos porque puede obtenerse de manera no invasiva y de modo sencillo, incluso en la consulta del médico, y no se contamina fácilmente con otros microorganismos, como por ejemplo la microflora oral presente en el esputo, que son inocuos pero pueden afectar los resultados obtenidos. Hablando en general, la prueba ICT para antígeno L. Neumófila Serogrupo 1 que es específicamente parte de la presente invención puede diseñarse para realizarse en cualquier dispositivo ICT desechable conocido descrito en la técnica. Preferentemente, la prueba se realiza empleando un dispositivo ICT del tipo descrito en la Solicitud de Serie copendiente U.S No. 07/706,639 de Howard Chandler, o uno de sus solicitudes continuación-en-parte, todas por SmithKline Diagnostics, Inc pero exclusivamente bajo la licencia de Binax, Inc. en una amplia área de aplicaciones que incluye el presente campo de diagnóstico, es decir, enfermedades del sistema respiratorio. El dispositivo se impregna adecuadamente con los anticuerpos polivalentes purificados de afinidad aquí descritos que son específicos a antígeno L. Neumófila Serogrupo 1. Los resultados positivos del ensayo se muestran por la aparición de un color tras la reacción de anticuerpos adecuadamente etiquetados con antígeno. Las etiquetas adecuadas pueden ser cualquiera de las conocidas en la técnica, que incluyen etiquetas metálicas divididas de manera muy fina y otros varios materiales de etiquetado. El oro coloidal es la etiqueta preferente. La invención comprende que el carbohidrato libre de proteína o antígenos pueden separarse de manera similar de cada una de las bacterias Legionela, incluyendo bacterias de otras especies de Legionela de otros serogrupos de L. 3

ES 2 283 129 T3 Neumófila, y que tales antígenos pueden utilizarse de manera similar en la purificación de afinidad de anticuerpos polivalentes con las correspondientes especies de Legionela o bacterias de serogrupo y sus antígenos, y que estos anticuerpos purificados por afinidad pueden utilizarse en ICT y en otros inmunoensayos como aquí específicamente se describen para anticuerpos purificados por afinidad con L. Neumófila Serogrupo 1. 5

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Antes de preparar el dispositivo se obtienen los anticuerpos y se efectúa su purificación de afinidad. Los anticuerpos que pueden emplearse en esta invención son anticuerpos polivalentes (también llamados “policlonales”) convencionales que se obtienen por el bien conocido proceso de inmunización de un conejo, cabra u otro animal con un antígeno Legionela, es decir, antígeno L. Neumófila de serogrupo conocido y haciendo sangrar al animal tras el paso de un periodo apropiado para obtener suero que contenga los anticuerpos deseados. Ver, por ejemplo, Cherry, U.B. y McKinney, R.M., ps. 91-104 en Jones, G.L. y Herbert, G.A (Eds). “Legionnaires” the diseasase, the bacterium and the methodology, (Center for Disease Control, Atlanta, 1979). En esta invención, relativa al inmunoensayo ICT para L. neumófila serogrupo 1 aquí descrito, el conejo u otro animal se inmuniza para el antígeno L. neumófila serogrupo 1 y los anticuerpos polivalentes recuperados de su sangre son anticuerpos L. neumófila serogrupo 1.

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Los anticuerpos polivalentes que se emplean en esta invención son además sometidos a purificación de afinidad en una columna cromatográfica especialmente preparada que emplea el carbohidrato libre de proteína incluyendo antígeno polisacárido de la misma bacteria contra la cual los anticuerpos son reactivos como el agente purificador para ellos. 20

Antes de la purificación de afinidad de los anticuerpos, es por lo tanto necesario de acuerdo con esta invención preparar antígeno de carbohidrato purificado libre de proteína de un cultivo de bacteria Legionela conocida de las especies deseadas o serogrupo de una especie. 25

Los siguiente ejemplos I y II explican cómo se obtiene el antígeno de carbohidrato purificado libre de proteína. Ejemplo I

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Bacterias de L. neumófila serogrupo 1(cepa Philadelphia-1) se obtuvieron de Centros para Control y Prevención de Enfermedades (Atlanta, GA) y se cultivaron en placas de agar con extracto de charcoal-levadura obtenidas del Norhteast Laboratory (Waterville, ME) durante un periodo de 72 horas a 37◦ C. Las células se cultivaron con salina tapón de fosfato (“PBS”) a pH 7.2 que contenía 0.2% de NaN3 y se recogió por centrifugación a 8000 rpm durante 25 minutos. El gránulo de célula resultante se almacenó a -20◦ C hasta su uso.

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Las células mojadas de este gránulo se suspendieron en 20 ml 0.1 M NaOH por gramo de células mojadas y se agitaron a temperatura ambiente durante 45 minutos. El pH de la solución se ajustó a continuación con ácido acético concentrado a 3.0 y la solución se sometió a centrifugación a 8000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante de este paso se neutralizó con NaOH acuoso y se dializó contra agua destilada.

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El dializado resultante se concentró 10 veces en un evaporador de vacío rotatorio y después se sometió a ultrasonido durante 5 minutos en un baño ultrasónico.

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Se añadió Proteinasa K, en una concentración de 0.2 mg por ml. del producto concentrado, para digerir las proteínas restantes y la mezcla se incubó a 40◦ C durante la noche. El siguiente paso fue la adición de más Proteinasa K, en una concentración de 0.2 mg por ml., a la mezcla, seguido de una incubación adicional a 40◦ C durante la noche. La segunda incubación fue seguida por concentración del producto en un evaporador rotatorio a un volumen pequeño, ajuste de su pH a 10-11 con 0.2% trietilamina y aplicación de la mezcla tratada a una columna de Sephacryl S-200 de Pharmacia, equilibrado con 0.02% trietilamina. El material se extraído con disolvente en el primer pico se reunió, se ajustó con 0.1 NHCl a aproximadamente pH neutral y se dializó contra agua destilada durante 18 horas, seguido de liofilización.

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La producción de antígeno O-polisacárido de 16.5 gramos de células mojadas de L. neumófila serogrupo 1 cepa Philadelphia-1 fue 62 mg. 55

Debe observarse que en lugar de Proteinasa K, cualquier preparación de proteasa de amplio espectro puede emplearse. Lo que es importante es este proceso es la máxima posible eliminación de proteína desde el antígeno dentro de los límites razonables de viabilidad de tiempo. Ejemplo II

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El Ejemplo I se repitió usando L. neumófila serogrupo 5 cepa Dallas IE como la bacteria en el paso de cultivo. 11.5 gramos mojados produjeron 21 mg. de un antígeno carbohidrato. Posteriormente, el proceso se volvió a repetir, esta vez usando L. neumófila serogrupo 5 (cepa U8W) como la bacteria en el paso de cultivo. Se encuentra dentro del campo de esta invención el paso de repetir los pasos de cultivo y extracción tal y como aquí se describe en cualquier bacteria Legionela y especialmente en bacterias de otros serogrupos diferentes a L. Neumófila, es decir, cualquiera de los serogrupos 2, 3, 4 y 6-15 incluidos, para obtener un antígeno carbohidrato libre de material proteínico. 4

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Con el fin de enlazar el producto O-polisacárido libre de proteína del Ejemplo I o el carbohidrato del Ejemplo II con una columna cromatográfica para usarlo en purificación de afinidad de anticuerpos polivalentes con la correspondiente bacteria desde la cual el antígeno carbohidrato se extrae, resulta necesario hacerlo más complejo con una molécula separadora de proteína adecuadamente preparada para asegurar que esté establemente unida al antígeno carbohidrato y a la columna u que permanezca inerte durante el paso de purificación de afinidad. Se eligió una albúmina de suero bovino modificado (“BSA”) como molécula separador preferente y se preparó como en el Ejemplo III: Ejemplo III

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Preparación de Molécula Separadora de Proteína Una solución acuosa 0.5 M de dihidrocloruro de hidracina de Aldrich Chemical Co., Inc. (Milwaukee, WI) se preparó y su pH se ajustó a 5.2 con NaOH seco. Posteriormente, la solución se mezcló con BSA seco de Sigma Chemical Co. para una concentración final de 25 mg. por ml. de BSA. Después de que BSA se disolviera por completo, se añadió N-(dimetilaminopropil)-N1 -etilcarbodiimida hidrocloruro obtenido de Fluka Chemical Co. (St. Louis, MO) a la concentración final de 25 mg. por ml. La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente y a continuación se dializó durante un periodo de aproximadamente cinco días contra agua destilada a 4◦ C, con cambios diarios de agua. En lugar de este BSA modificado, se contempla que pueden usarse otras moléculas separadoras apropiadas.

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La conjugación de antígeno O-polisacárido del serogrupo 1 de L. neumófila con la molécula espaciadora se llevó a cabo del siguiente modo: Ejemplo IV 25

Conjugación de Antígeno O-polisacárido con Moléculas Espaciadoras

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Antígeno O-polisacarido libre de proteína de L. neumófila serogrupo 1 se disolvió en agua destilada en una concentración de 4-5 mg/ml y el pH se ajustó a 5.0 con 1 M HCL. La solución de BSA modificada preparada como se ha explicado en el Ejemplo III s e ajustó a pH 5.0 con 1 M HCL y lentamente se añadió, en un radio de peso de 4-a1 de la solución de antígeno O-polisacarido, a ésta. Después de 5 minutos de agitación, se añadieron aproximadamente 100-200 mcl de agua destilada que contenía el N-(dimetilaminopropil)-N1 -etilcarbodiimida hidrocloruro referido en el Ejemplo III en un radio de peso 1:2 al antígeno O-polisacárido/solución BSA. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche.

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Para separar el conjugado de antígeno O-polisacárido con BSA modificado de cualquier material no reactivo presente, la mezcla de reacción se sometió a cromatografía en una columna Sefarosa CL-4B equilibrada con un búfer de 0.1 M Nah2 po4 :0.5 M NaCl. Todas las fracciones de cromatografía se sometieron a prueba para actividad de antígeno usando el test comercial Bincha EIA como se ha mencionado anteriormente. Todas las fracciones que mostraron actividad de antígeno en las pruebas se reunieron y se usaron para preparación de columna de afinidad como se muestra en el Ejemplo V. Ejemplo V

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Enlace de Conjugado con Columna Cromatográfica Activada Se preparó un gel inmunoabsorbente mediante activación convencional de Sefarosa CL-4B con bromuro de cianogeno. El ligando de antígeno O-polisacárido con BSA modificado, preparado como se ha explicado en el Ejemplo IV, se enlazó con él para usando procesos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describió en Hermanson, G.T, et al. en Immobilized Affinity Ligand Techniques, 53-56 (Academia Press, Inc. 1992). A continuación, el gel fue empaquetado en una columna y se lavó sucesivamente con 5-10 volúmenes por volumen de gel de PBS de pH 7.2, triple fuerza de PBS de 7.2 y 0.2 M glicina-HCl de pH 2.5. La columna activada resultante se usó, como se ha descrito previamente, para purificación de afinidad de anticuerpos polivalentes con antígeno L. neumófila serogrupo 1. Tras la extracción con disolvente, la columna debería almacenarse en PBS u otro búfer neutral hasta su uso.

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En vez de Sefarosa activada de bromuro de cianogeno, sferelosa y varias columnas activadas comercialmente disponibles pueden usarse en este paso. Ejemplo VI 60

Purificación de Afinidad de Anticuerpos

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La columna activada descrita en el Ejemplo V se usó para la cromatografía de afinidad de conejo-anti- L. neumófila serogrupo 1 anticuerpos polivalentes con antígeno L. neumófila serotipo 1 de acuerdo con el método descrito por Harlow E. y Lane, D. En Antibodies: a Laboratory Manual en 313-315 (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). La elución de los anticuerpos de la columna fue efectiva con 0.2 M glicina-HCL búfer de pH 2.5. Eluantes alternativos como 3 M NaSCN o 0.1 M Et3N también pueden emplearse. 5

ES 2 283 129 T3 Los anticuerpos purificados por afinidad se utilizaron en un test ICT específico para L. neumófila serogrupo 1 como de describe en el siguiente ejemplo. Ejemplo VII 5

Dispositivo ICT y Su Preparación A. Preparación del Dispositivo del Test 10

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Se preparó un dispositivo de test que comprende una carcasa articulada de cartón equipada con una ventana que permite la vista de los resultados del test y el control de los resultados, tal y como se muestra en la Figura 1. El dispositivo tiene una ranura dentro de la cual se coloca un hisopo de plástico preformado para recibir el hisopo mojado de muestra a la derecha (con la etiqueta 1 en el dibujo). A continuación, se coloca una sobreetiqueta mostrada en la Figura 1A sobre todo el lado derecho del dispositivo. La sobreetiqueta está provista de dos agujeros- uno en la parte inferior (marcado A en la Figura 1A) dentro del cual se insertará el hisopo saturado y otro en la parte superior (marcado B en la Figura 1A) hacia el cual es hisopo será empujado después de la inserción del mismo en el agujero B. La posición de la sobreetiqueta con sus agujeros A y B, y el pozo hisopo cooperan para mantener al hisopo en la posición correcta durante el ensayo y para provocar la expulsión del líquido absorbido desde el hisopo. Una tira de prueba premontada (marcada C en la Figura 1) descrita a continuación, se inserta en la ranura (etiquetada con el 2 en la Figura 1) y se sujeta en su lugar por un adhesivo aplicado al fondo del mismo. Una sobreetiqueta mostrada en la Figura 1B se coloca encima del lado de la izquierda. Se ha provisto de un único agujero (marcado D en la Figura 1 B) que coincide con el agujero A del lado de la derecha cuando el dispositivo está cerrado para llevar a cabo el ensayo.

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El dispositivo montado se almacena en una bolsa sellada con desecante hasta su uso. Antes de sellar la bolsa y almacenarla, se coloca con suavidad una cinta adhesiva el borde externo de la mitad derecha del dispositivo. B. Construcción y Preparación de la Tira de Test Premontada 30

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La Figura 1C muestra la construcción de la tira premontada. Consiste en una almohadilla conjugada de material absorbente en el cual se han impregnado un conjunto de partículas de oro y los anticuerpos anti-Legionela neumófila serogrupo 1 purificados por afinidad de conejo descritos anteriormente. En contacto con esta almohadilla se encuentra una almohadilla de nitrocelulosa en la cual se ha establecido una línea de captura para la muestra que reacciona con el conjugado mediante unión de una línea de anticuerpos anti-Legionela neumófila serogrupo 1 de conejo purificados por afinidad, preparados como se ha descrito anteriormente. La almohadilla de nitrocelulosa también tiene una línea de control en dirección descendente desmontando o deshaciendo la almohadilla con inmunoglobulina de cabra anticonejo (IgG). Tras las almohadilla de nitrocelulosa, la tira se acaba por una almohadilla absorbente que sirve como una reserva para líquido. Todas estas almohadillas están apoyadas por una tira adhesiva cuando el dispositivo está listo para ser transportado. La almohadilla conjugada está normalmente hecha de poliéster no tejido o acetato de celulosa extrudido. Para preparar esta almohadilla para el ensayo, se conjugan partículas de oro de 50 nm. de diámetro con anticuerpos antiLegionela neumófila serogrupo 1 de conejo purificados por afinidad, preparados como se ha descrito anteriormente. Esta conjugación se hace efectiva utilizando un método conocido como el descrito por DeMay in Polar, J. M. Y Van Norden, S (Eds.), Inmunochemistry: Modern Methods and Application, (Wright, Bristol, England, 1986). Las partículas de conjugado de oro se mezclan con un agente secante consistente en teraborato de sodio 5 mM acuoso de pH 8.0 que contiene 1.0% BSA, 0.2% Triton X-100, 2.0% Tween 20, 6.0% sacarosa y 0.02% azida sódica. La almohadilla se calienta lo suficiente como para retirar todo el líquido presente y se almacena en un ambiente de baja humedad, quedando pendiente el montaje de la tira de test. Se eligen precisamente estas almohadillas y su tratamiento para que las almohadillas que sujeten el conjugado seco y lo liberen sólo cuando más tarde se humedezca por la muestra. La almohadilla de nitrocelulosa es tratada en primer lugar por la unión de una raya de anticuerpos anti-Legionela neumófila serogrupo 1 de conejo purificados por afinidad en una primera porción de la misma, usando una solución portadora de salina de búfer fosfato. Estos anticuerpos actúan como la línea de captura. En una secunda porción de la almohadilla, en la parte inferior de la primera parte en el dispositivo del test montado, se establece la línea de control deshaciendo IgG de cabra anti-conejo en la misma solución portadora sobre la superficie de la almohadilla. La almohadilla de nitrocelulosa es posteriormente sometida a desecación a 18-25◦ C para aumentar la absorción permanente de las tiras de proteína de la misma. La almohadilla absorbente usada es de un material de celulosa comercialmente disponible bajo el nombre Ahlstrom 39. Esta almohadilla no requiera un tratamiento especial.

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C. Preparación del Kit Tal y como se vende en el mercado, el dispositivo del test que contiene la tira de test acabada está montado. En la práctica, un número de dispositivos están empaquetados con un número proporcional de hisopos creados a partir de 6

ES 2 283 129 T3 Dacron fibroso y una botella de “Reagente A” equipado con una parte superior adaptada para enviar el Reagente A en dirección descendente. “Reagente A” es una solución de 2.0% Tween 20, 0.05% azida sódica y 0.5% sulfato dodecil sódico en un búfer de fosfato citrato-sodio sódico 0.05 M de pH 6.5. Controles positivos y negativos también están incluidos en cada kit. 5

El uso de los dispositivos de test finalizados para identificar antigeno O-polisacárido de L. Neumófila serogrupo 1 se ilustra en el siguiente ejemplo VIII: Ejemplo VIII 10

Realización del ICT Test para antígeno O-polisacárido de L. Neumófila serogrupo 1

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En la práctica, el hisopo facilitado con cada dispositivo se baña en la muestra líquida, introduciendo por completo la cabeza del hisopo. El uso del hisopo para actuar como un filtro para sólidos no disueltos, semisólidos y coloides presentes en muestras biológicas líquidas como orina, sangre, linfa, etc. y también en muestras ambientales líquidas es el tema de la Solicitud copendiente No. de Serie 09/044,677 de Norman Moore y Vencen Sy presentada el 19 de marzo de 1998, que en breve será asignada a Binax, Inc. El hisopo se inserta en el agujero en el fondo del dispositivo (agujero B de la Figura 1A) y con suavidad se presiona hacia arriba hasta que la punta del hisopo sea visible en el agujero superior (agujero A de la Figura 1A). El Reagente A vial se sujeta verticalmente sobre el agujero B y se añaden lentamente dos gotas de Reagente A. La línea adhesiva es posteriormente despegada del borde derecho del dispositivo y el dispositivo se cierra y se sella de manera segura, presionando por lo tanto el hisopo en la pared del hisopo contra al almohadilla de conjugado de oro. Después de 15 minutos, el resultado puede leerse en la ventana del dispositivo. Una muestra negativa, es decir, una que no contenga antigeno O-polisacárido de L. Neumófila serogrupo 1, sólo mostrará la línea de control en la mitad de la parte superior de la ventana. Una muestra positiva que contenga el antígeno objetivo mostrará dos líneas, la inferior es la línea del paciente (o muestra); incluso una línea débil de muestra indica la presencia del antígeno objetivo en la muestra. Si no aparece línea en la ventana después de 15 minutos, o sólo una línea de muestra aparece en la parte inferior de la ventana, el test no es válido y hay que repetirlo. Usando el procedimiento descrito que se acaba de describir, los dispositivos preparados como se ha descrito en el Ejemplo VII se probaron en el procedimiento ICT que se acaba de describir con 300 muestras de orina de pacientes, 100 de las cuales habían sido previamente diagnosticadas por tener infección L. Neumófila serogrupo 1. Estas pruebas ICT de acuerdo con la invención se llevaron a cabo bajo circunstancias tales que los diagnósticos previos resultaron desconocidos por el personal encargado de llevar a cabo las pruebas ICT. En total, el 98% de las pruebas coincidieron con los diagnósticos positivos previos. También en total, el 98% de las muestras de orina previamente diagnosticadas como negativas para antigeno O-polisacárido de L. Neumófila serogrupo 1 dieron resultados de acuerdo con lo que se comprobó mediante el proceso ICT aquí descrito, usando el dispositivo ICT descrito en el Ejemplo VII. Ejemplo IX Uso del ICT para Muestras Ambientales de Prueba

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La aplicación de esta misma prueba a muestras ambientales sospechosas de contener L. Neumófila serogrupo 1 también se investigó del siguiente modo: Se cultivó agua con la bacteria L. Neumófila serogrupo 1 obtenida a partir de una fuente comercial. La mezcla se concentró filtrándolo por medio de un filtro de 0.22 µm. Se aplicó un hisopo bañado en la muestra al dispositivo, éste se cerró y el ensayo prosiguió. Se observó un resultado positivo en menos de 15 minutos.

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Ejemplo X Inmunoensayo Western Blot para Detección de Antígenos de Carbohidrato Crosreactivo de L. Neumófila Serogrupos 1, 2, 4 y 5 55

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Con el fin de llevar a cabo el inmunoensayo Western Blot usando un kit adquirido en Laboratorios Bio-Rad, células de L. Neumófila serogrupo 5 se cultivaron como en el Ejemplo II. Una suspensión de dichas células se solubilizó con 1% de dodecilsulfato de sodio en la presencia de 10 mM mercaptoetanol a 100◦ C durante 5 minutos. Las células solubilizadas fueron tratadas con proteasa K y a continuación se sometieron a separación de proteína electroforética de acuerdo con los procedimientos estándar proporcionados por Bio-Rad. El antígeno de carbohidrato de L. Neumófila serogrupo 5 se conjugó con la molécula espaciadora descrita en el Ejemplo III de la manera descrita en el Ejemplo IV y se aplicó a una columna de Sefarosa activada como se ha descrito en el Ejemplo V. Esta columna se usó a continuación para la purificación por afinidad de anticuerpos de conejo polivalentes específicos al antígeno de carbohidrato de L. Neumófila serogrupo 5 (que se obtuvieron de manera convencional de suero de un conejo previamente inyectado con la proteína que contiene L. Neumófila serogrupo 5) usando el procedimiento del Ejemplo VI. 7

ES 2 283 129 T3

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El análisis Western inmunoblot se llevó a cabo usando un kit reagente de Bio-Rad de acuerdo con las directrices del fabricante. En resumen, el extracto PBS de células de antígenos L. Neumófila 1, 2, 4 y 5 se sometieron a SDS-PAGE en 12% gel poliacrilamida bloqueado con 1% BSA con PBS transferido a una membrana de nitrocelulosa. Tras este paso, la membrana se incubó con anticuerpos purificados por afinidad específicos al antígeno de carbohidrato de L. Neumófila serogrupo 5. La membrana, lavada del modo recomendado por el fabricante, e incubada con peroxidasa de rábano picante se conjugó con anticuerpos cabra-anti-conejo provistos por Bio-Rad. Después del lavado, la membrana se desarrolló con un sistema de sustrato de 0.022 M 4-cloro-1 naftol y 0.0012 M N,N-dimetil-p-fenileno-diamina monohidrocloruro en 0.1 M búfer de citrato de sodio de pH 6.9 que contenía 2.9 mM de peroxidasa de hidrógeno. La Figura 2 del mismo muestra los resultados del el ensayo Western Blot comparados con los del estándar premanchado SDS-PAGE (en Ruta 5) para los anticuerpos purificados por afinidad de serogrupo 5 de L. Neumófila contra extractos PBS que contenían antígenos de L. Neumófila que indican lo siguiente: Rutas 1 y 7 - L. Neumófila serogrupo 2 (cepa Togus-1)

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Rutas 2 y 8 - L. Neumófila serogrupo 4 (cepa Los Angeles-1) Rutas 3 y 6 - L. Neumófila serogrupo 1 (cepa Philadelphia-1) Rutas 4 y 9 - L. Neumófila serogrupo 5 (cepa U8W).

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Se debe señalar que los anticuerpos purificados por afinidad le las rutas 1-4 se purificaron por afinidad en una columna en la cual antígeno de carbohidrato de L. Neumófila serogrupo 5 (cepa U8W) se unión mientras que los de las Rutas 6-9 se purificaron por afinidad del mismo modo sobre una columna que se había unido al antígeno de carbohidrato de L. Neumófila serogrupo 5 (cepa Dallas IE). 25

La figura 2 demuestra claramente que los anticuerpos purificados por afinidad aquí descritos de L. Neumófila serogrupo 5 reaccionan con antígenos de L. Neumófila serogrupo 1, 2 y 4 además de con los del serogrupo 5. 30

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Se considera o contempla un ensayo ICT como se ha descrito anteriormente en el cual los anticuerpos purificados por afinidad de L. Neumófila serogrupo 5 se sustituyen por anticuerpos purificados por afinidad de L. Neumófila serogrupo 1. Aquellos expertos en la técnica de inmunoquímica en general, y especialmente aquellos expertos en inmunoensayos, reconocerán que otros materiales e ingredientes y en ocasiones, otros pasos de procedimiento, pueden fácilmente sustituir a aquellos recomendados aquí específicamente. Una vasta colección de literatura, tanto patentes como no patentes, describe y debate el diseño y uso de dispositivos fiables, de un solo uso y desechables que puedan sustituir el dispositivo ICT preferente aquí descrito y recomendado. No se desea que la presente invención se limite con respecto a dispositivos, materiales, ingredientes o pasos de procedimientos sustituibles en la medida en que las siguientes reivindicaciones podrían limitarlo.

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ES 2 283 129 T3 REIVINDICACIONES

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1. Un método de ensayo de la presencia de una bacteria Legionela o su componente antigénico de carbohidrato en un fluido, cuyo método comprende los siguientes pasos: (a) Cultivar células bacteriales de un cultivo de una especie conocida, un serogrupo de una especie, de bacteria Legionela en la forma de un gránulo de célula húmedo.

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(b) Suspender el gránulo de célula húmedo en un gramo por 20 ml en una solución alcalina acuosa, conteniendo dicha solución alcalina acuosa 0.1 M de hidróxido sódico acuoso, y mezclándolo durante 45 minutos, seguido de la adición de ácido fuerte para ajustar el pH al pH ácido y centrifugar. (c) Separar el sobrenadante del paso (b), ajustar su pH a la neutralidad y añadirle una preparación de enzima de proteasa de amplio espectro, (d) Digerir la enzima de proteasa de amplio espectro - mezcla sobrenandante neutralizada del paso (c) para destruir las proteínas residuales,

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(e) Añadir a la mezcla digerida del paso (d) de una solución acuosa ligeramente alcalina para ajustar el pH al lado alcalino, separando un antígeno de carbohidrato libre de proteína sobre una columna de exclusión de tamaño equilibrada con una solución ligeramente alcalina y reuniendo material eluído en el primer pico y ajustar su pH a la neutralidad, (f) Recuperar el antígeno carbohidrato libre de proteína de la solución acuosa neutral del paso (e) y enlazar este antígeno con una molécula espaciadora para forma un conjugado; (g) Enlazar el conjugado del paso (f) a una columna de afinidad cromatográfica,

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(h) Purificar anticuerpos sin tratar con la misma especie o serogrupo de una especie de bacteria de Legionela usada en el paso (a) pasándolos por la columna de afinidad cromatográfica del paso (g) habiéndose unido a la misma el conjugado de molécula separadora y antígeno de carbohidrato libre de proteína del paso (f), produciendo así anticuerpos específicos de antígeno purificados, y; (i) Usar los anticuerpos purificados del paso (h) para detectar la presencia de una pareja de enlace antigénica para estos anticuerpos en una muestra de test de fluido sospechosa de contenerlo. 2. El método de la reivindicación 1 en el cual la bacteria es L. Neumófila serogrupo 1 y el antígeno O-carbohidrato libre de proteína recuperado en el paso (f) en el antígeno O-polisacárido libre de proteína de L. Neumófila serogrupo 1. 3. El método de la reivindicación 1 en el cual la bacteria es L. Neumófila serogrupo 5 y el antígeno libre de proteína recuperado en el paso (f) en el antígeno O-carbohidrato de L. Neumófila serogrupo 5.

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4. Un antígeno de carbohidrato libre de proteína obtenido de una bacteria que es una especie, o un serogrupo de especies de Legionela neumófila de acuerdo con el método de pasos (a) a (e) incluidos en la reivindicación 1. 5. Un antígeno de carbohidrato libre de proteína de acuerdo con la reivindicación 4 que es un antígeno O-polisacárido obtenido de L. Neumófila serogrupo 1.

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6. Un antígeno de carbohidrato libre de proteína de acuerdo con la reivindicación 4 que es un antígeno O-carbohidrato obtenido de L. Neumófila serogrupo 5. 7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en el cual en el paso (b) el ácido pH ajustado es 3.0.

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8. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en el cual en el paso (e) el pH se ajusta a un pH entre 10 y 11. 9. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en el cual, después del paso (e), se lleva a cabo un paso de liofilización.

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10. Un método para la purificación de anticuerpos sin tratar con una especie, o serogrupos de especies, de bacteria de Legionela que comprende los siguientes pasos: (a) Separar de la misma especie, o serogrupo de una especie, de bacteria de Legionela, un antígeno de carbohidrato libre de proteína usando losa pasos (a) y (f) del método incluidos en la reivindicación 1, (b) Enlazar el conjugado con una columna cromatográfica activada;

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ES 2 283 129 T3 (c) Someter a dichos anticuerpos sin tratar a cromatografía de afinidad sobre la columna del paso (c) para obtener anticuerpos específicos de antígeno purificados, y (d) Someter a elución los anticuerpos específicos de antígeno purificados de dicha columna. 5

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10 en el cual los anticuerpos no tratados son anticuerpos para L. Neumófila serogrupo 1 y el antígeno de carbohidrato libre de proteína es el antígeno O-polisacárido libre de proteína de la reivindicación 5. 10

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12. Un método de acuerdo a la reivindicación 10 en el cual los anticuerpos sin tratar son anticuerpos para L. Neumófila serogrupo 5 y el antígeno de carbohidrato libre de proteína es el antígeno de carbohidrato libre de proteína de la reivindicación 6. 13. Los anticuerpos específicos de antígeno purificados para L. Neumófila serogrupo 1 y su antígeno O-polisacárido, que se producen mediante el método de la reivindicación 11. 14. Los anticuerpos específicos de antígeno purificados para L. Neumófila serogrupo 5 y su antígeno O-polisacárido, que se producen mediante el método de la reivindicación 12.

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15. Los anticuerpos purificados para una bacteria de al menos una especie, o serogrupo de especies, de L. Neumófila obtenidos por medio del método de la reivindicación 10, cuyos anticuerpos purificados muestran especificidad con el antígeno de carbohidrato de la mencionada especie, o serogrupo de especies. 16. El método de la reivindicación 1 donde la molécula espaciadora del paso (f) es una molécula de proteína.

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17. El método de la reivindicación 1 donde las conocidas bacterias de Legionela son bacterias de uno de los serogrupos de Legionela neumófila. 30

18. El método de la reivindicación 17 en el cual las conocidas bacterias de Legionela son bacterias de uno de los serogrupos de Legionela neumófila serogrupo 1, el antígeno obtenido en el paso (e) es su antígeno O-polisacárido libre de proteína y los anticuerpos purificados para bacterias L. Neumófila serogrupo 1 obtenidos en el paso (h) se usan en el paso (i) para comprobar la presencia o ausencia de bacterias L. Neumófila serogrupo 1 o su antígeno O-polisacárido. 19. El método de la reivindicación 18 donde el fluido del paso (i) es agua.

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20. El método de la reivindicación 18 donde el fluido del paso (i) es un fluido natural de origen mamífero. 21. El método de la reivindicación 20 donde el fluido es orina humana. 40

22. El método de la reivindicación 21 en el cual el fluido se obtiene de un paciente que muestra signos clínicos de una enfermedad del tipo neumonía. 23. El método de la reivindicación 22 en el cual el paso (i) es un proceso inmuno-ensayo.

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24. El método de la reivindicación 23 en el cual el paso (i) es un proceso de ensayo inmuno-cromatográfico (“ICT”). 25. El método de la reivindicación 23 donde una parte de los anticuerpos específicos al antígeno purificados del paso (h) se conjugan con un agente etiquetador conocido para exponer o visualizar un color visible cuando dichos anticuerpos reaccionan con el antígeno correspondiente.

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26. El método de la reivindicación 25 donde el agente etiquetador es oro coloidal.

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27. El método de la reivindicación 17 en el cual las conocidas bacterias de Legionela son bacterias de Legionela neumófila serogrupo 5, el antígeno obtenido en el paso (e) es su antígeno de carbohidrato libre de proteína y los anticuerpos purificados obtenidos en el paso (h) son capaces de detectar en fluidos bacterias L. Neumófila de serogrupos 1, 2, 4 y 5 o sus componentes antigénicos. 28. El método de la reivindicación 27 en el cual los anticuerpos polivalentes purificados para L. Neumófila serogrupo 5 se utilizan para comprobar la presencia de alguna o todas las bacterias de L. Neumófila serogrupos 1, 2, 4 o 5 o sus antígenos en un fluido. 29. El método de la reivindicación 28 donde el fluido es agua. 30. El método de la reivindicación 29 en el cual el paso (i) es un procedimiento inmuno-ensayo.

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31. El método de la reivindicación 30 en el cual el paso (i) es un proceso de ensayo inmuno-cromatográfico (“ICT”).

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ES 2 283 129 T3 32. El método de la reivindicación 31 donde una parte de los anticuerpos específicos al antígeno purificados del paso (h) se conjugan con un agente etiquetador conocido para exponer o visualizar un color visible cuando dichos anticuerpos reaccionan con el antígeno correspondiente. 5

33. El método de la reivindicación 32 donde el agente etiquetador es oro coloidal. 34. Un ensayo ICT para la detección de al meno una especie o serogrupo de especie de bacteria Legionela, o un antigeno de carbohidrato de dicha bacteria, que comprende:

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(a)

poner en contacto una muestra de un fluido sospechoso de contener dicha bacteria o su componente de antígeno carbohidrato con un dispositivo ICT que consta de una banda de material absorbente, cuya banda tiene (i)

una zona a la que se ha unido un conjugado de

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(ii)

(1)

un agente etiquetador que visualiza un cambio visible de color tras la reacción de anticuerpos con sus respectivas parejas de enlace antigénico y

(2)

anticuerpos específicos de antígeno purificados para la especie Legionela, o serogrupo de una especie, que se busca detectar, habiéndose purificado dichos anticuerpos mediante el paso sobre una columna de afinidad cromatográfica a la cual se conjuga por medio de una molécula espaciadora un antígeno de carbohidrato libre de proteína de la especie Legionela, o serogrupo de una especie, que se busca detectar, cuyo antígeno de carbohidrato se obtuvo a partir de un cultivo de la misma especie de Legionela, o serogrupo de una especie tras llevar a cabo los pasos (a)a (e) del método incluidos en la reivindicación 1.

una segunda zona habiendo unido a la misma los mismos anticuerpos específicos de antígeno purificados en forma no conjugada, cuya zona está equipada con una ventana para visualizar los cambios de color,

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(b)

permitir a dicha muestra fluir de manera lateral a lo largo de dicha banda hasta la mencionada primera zona,

(c)

permitir a dicha muestra, junto con dicho conjugado de anticuerpos y etiqueta, fluir de manera lateral a lo largo de dicha banda de test hasta dicha segunda zona, y

(d)

tras 15 minutos a partir del comienzo del paso (a) observar a través de dicha ventana si una línea de color ha aparecido en dicha segunda zona, indicando de este modo la presencia en la muestra de la especie de bacteria Legionela, o serogrupo de especie, que busca detectarse o el antígeno de carbohidrato de dicha especie o serogrupo de especie.

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35. El método de la reivindicación 34 donde el fluido sospechoso de contener al menos una especie, o serogrupo de especie, de bacteria Legionela es agua. 45

36. El método de la reivindicación 34 donde el fluido sospechoso de contener al menos una especie, o serogrupo de una especie, de bacteria Legionela es un fluido de origen mamífero. 37. El método de la reivindicación 36 donde el fluido natural de origen mamífero es orina humana.

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38. El método de la reivindicación 37 donde el agente etiquetador que muestra un cambio visible de color tras la reacción de anticuerpos con sus correspondientes parejas de enlace antigénicos es metal dividido de manera muy fina. 39. El método de la reivindicación 38 donde el agente etiquetador es oro coloidal.

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40. El método de la reivindicación 36 donde la bacteria o antígeno del mismo a ser detectada es L. Neumófila serogrupo 1 o su antígeno O-polisacárido y el antígeno libre de proteína conjugado con la columna cromatográfica usado en la purificación de anticuerpos es el antígeno 1 O-polisacárido libre de proteína del grupo L. Neumófila de un cultivo de L. Neumófila serogrupo 1 llevando a cabo los pasos (a) a (e) de la reivindicación 1.

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41. El método de la reivindicación 36 donde los anticuerpos específicos de antígeno purificados son anticuerpos para L. Neumófila serogrupo 5, y el antígeno libre de proteína conjugado con la columna cromatográfica usado en la purificación de anticuerpos es un antígeno de carbohidrato libre de proteína de L. Neumófila serogrupo 5 obtenido de un cultivo de L. Neumófila serogrupo 5 llevando a cabo los pasos (a) a (e) de la reivindicación 1.

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