Rev Cubana Angiol y Cir Vasc 2000;1(1):10-4

MODELO EXPERIMENTAL DE DIABETES EN CONEJOS Dr. Andrés S. Fleitas Estévez,1 Lic. Rafael Simón Carballo,2 Dra. Gisela Almeida,3Lic. Ana M. Quintela Pena4 y Dra. María Antonia Alfonso5

RESUMEN: Desarrollar un modelo experimental de diabetes en conejos utilizando alloxan

como sustancias. Material y Métodos: 10 conejos Nueva Zelandia fueron utilizados para inducir una diabetes mellitus. Se midieron los niveles de glicemia una semana antes de comenzar el estudio y los días 1, 2, 6, 7, 8, 9, 15, 17, 21, 22, 26 y 42 después de la inoculación del alloxan. La administración de Insulina comenzó a partir del tercer día. Fueron medidos también algunas variables lipídicas. Resultados: La condición de diabetes se mantuvo durante el tiempo que duro la experimentación. Los niveles de CT, C-HDL y de TG mostraron un ligero aumento al mes de tratamiento con una tendencia a normalizarce una vez concluido el estudio. No se encontraron alteraciones anatomopatológicas en ninguna de las piezas estudiadas. Conclusión: Se obtuvo un modelo de diabetes en conejos que pudiera ser útil para estudios experimentales. Descriptores DeCS: DIABETES MELLITUS; CONEJOS; INSULINA; PÁNCREAS /patología.

El estudio de la etiología, patogénesis y posibles complicaciones de una enfermedad, así como su prevención y tratamiento, se realiza al menos inicialmente a través de diferentes modelos de animales. En el caso de la diabetes, el modelo en perros pancreatectomisados ha cumplido este objetivo durante mucho tiempo, ejemplo de ello son los trabajos de Merring, en 1889. Sin embargo, en los últimos tiempos se han utilizado diversas sustancias para provocar esta afección en

1

2 3 4 5

otras especies de animales, tales como perros, ratas y gatos.1 Entre las sustancias más empleadas se encuentran el alloxan, las ditiazonas y la hidroxiquinolona.2-4 En angiología, la macro y la microangiopatía diabéticas son temas actuales de investigación, así como también los trastornos del metabolismo lipídicos y la enfermedad aterosclerótica. En el estudio de estas entidades nosológicas se hacen necesarios modelos experimentales que reproduzcan estas

Especialista de II Grado en Bioquímica Clínica. Jefe de Laboratorio de Radioisotópos y Medicina Nuclear. INACV. Licenciado en Bioquímica. Investigador Auxiliar. Jefe del Dpto. de Cirugía Experimental. INCV. Especialista de I Grado en Anatomía Patológica. HMCQ «Carlos J. Finlay». Licenciada en Bioquímica. Investigador Auxiliar. INACV. Médico Veterinario. INACV.

10

afecciones, nos ayudan a conocerlas mejor y aplicar un tratamiento adecuado. La aterosclerosis y los trastornos lipídicos que la favorecen son muy similares a los humanos cuando se provocan experimentalmente en conejos. El propósito del presente trabajo es desarrollar un modelo experimental de diabetes en conejos, con la utilización de alloxan como sustancia inductora, que permita estudiar posteriormente el efecto de tratamientos hipoglicemiantes.

Se midieron las concentraciones séricas de glucosa los días antes señalados, así como los niveles de colesterol total (CT), colesterol unido a las lipoproteínas de alta densidad (C-HDL), triglicéridos (TG) y fructosamina (FA) los días previos al estudio, el día 22 y del día 42 después de la inoculación de alloxan. Se realizó además de un estudio anatomopatológico de las principales arterias, del riñón y del hígado después de sacrificados los animales. Esquema de aplicación del alloxan en los conejos:

Métodos Se estudiaron 10 conejos machos Nueva Zelandia con un peso promedio de 2 kg, se comprobó previamente la condición de ser normoglicémicos después de 20 h de ayuno. Los animales se distribuyeron al azar en jaulas individuales una semana antes de comenzar el estudio; se limpiaron las mismas todos los días y se mantuvieron condiciones ambientales naturales de temperatura, humedad e iluminación. Los conejos fueron observados por un especialista quien seguía el récord del peso corporal y anotaba cualquier alteración visible que pudiera aparecer. Los animales recibieron una dieta normal de 100 g/día de pienso para conejos. Se realizó un seguimiento estricto de los animales para determinar las variaciones de glicemia durante el estudio. Se tomaron 7 mL de sangre para la obtención del suero mediante extracciones sanguíneas que se realizaron de la vena marginal de la oreja en el horario de la mañana, después de 12 h de ayuno con la frecuencia siguiente:

Se administró por vía endovenosa alloxan monohidratado fresco al 10 % en dosis única de 160 mg/kg de peso del animal. Posterior a la inoculación se administró a cada animal dextrosa al 20 % (10mL/2 h) durante las primeras 24 h por vía intraperitoneal. Al tercer día de inoculado el alloxan se comenzó por las mañanas a inyectar insulina por vía subcutánea a cada animal. Esta dosis se ajustó de acuerdo con los niveles de glicemia del animal, la cual fue como promedio de 1,1 unidades. No se realizó ningún análisis estadístico.

Resultados En la tabla 1 se observan los niveles de glicemia a través del estudio, para cada animal, notándose la ausencia de 4 animales que murieron el día 1 (1), el día 8 (2) y el dia 26 (1) de la investigación. El resto de los animales llegaron al final del estudio con una diabetes mellitus insulino dependiente que requería tratamiento con insulina para así mantener los niveles de glucosa sanguínea controlados en determinado nivel.

1. Una semana antes de comenzar el estudio. 2. Un día después de inoculado el alloxan. 3. Los días 2, 6, 7, 8, 9, 15, 17, 21, 22, 28 y 42 del experimento.

11

TABLA 1. Valores de glicemia durante el desarrollo del modelo experimental de diabetes en conejos

Animales 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Basal

2

3

7

8

9

4,1 3,6 3,9 3,5 4,3 3,8 3,2 3,2 3,8 4,2

5,0 2,8 4,4 7,2 3,0 5,5 2,7 * 7,5 3,8

16,5 25,0 25,5 26,0 27,5 19,0 34,0 * 7,5 9,0

10,0 23,0 22,5 17,5 28,0 15,5 23,0 * 20,0 14,0

5,7 25,0 19,0 10,0 25,0 20,0 8,0 * 7,5 9,0

* * 28,0 20,0 18,2 17,5 18,1 * 6,0 17,5

Días 10 * * 14,0 16,0 22,5 20,0 17,0 * 5,5 17,0

16

18

22

23

29

42

* * 22,0 11,0 26,2 24,5 26,0 * 7,5 10,2

* * 20,0 13,5 19,0 21,0 21,0 * 5,5 15,3

* * 22,0 18,3 26,7 20,5 25,5 * 9,3 20,5

* * 25,0 18,0 20,8 23,5 22,7 * ** 18,0

* * 18,6 11,0 15,0 13,4 14,4 * 5,5 *

* * 19,2 14,1 17,4 18,6 20,1 * 7,3 *

Resultados expresados en mmol/L. Leyenda: *: Animales muertos. **: No se pudo realizar la determinación. Fuente: Informes de laboratorio.

En la tabla 2 se muestran los resultados de la determinación de colesterol antes, a los 22 días de comenzado y al final del estudio, de la misma manera se presenta en las tablas 3, 4 y 5 las determinaciones de C-HDL, TG y FA respectivamente.

de este momento se hacen francamente elevados como suele suceder en los pacientes diabéticos mal controlados. El CT presenta una ligera elevación, algo similar sucede con el C-HDL, mientras que los TG aumentan ligeramente al principio del estudio para luego disminuir; los niveles de FA mostraron durante todo el estudio una tendencia a elevarse. Los resultados del estudio anatomopatológico de aorta, riñón e hígado no mostraron diferencias apreciables.

TABLA 2. Concentraciones de colesterol total antes y a los días 22 y 42 de la aplicación del alloxan Animales 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Media

Antes

Día 22

Día 42

1,40 1,08 1,01 1,40 0,73 2,13 1,74 0,66 0,98 2,46 1,35

* * 2,71 1,24 2,87 2,74 2,74 * 1,16 2,61 2,29

* * 1,96 1,12 3,16 1,36 1,41 * 1,29 * 1,71

Discusión La estreptozotocina es el producto más utilizado como agente diabetógeno en la actualidad, éste presenta el inconveniente de ser de un elevado costo en el mercado.5 El alloxan es otro producto químico empleado en la inducción de la diabetes en animales desde 19416 hasta ahora quizás sea el más utilizado a pesar de los inconvenientes señalados anteriormente. El mecanismo de acción diabetogénico del alloxan y la estreptozotocina son muy parecidos.

Valores expresados en mmol/L. Leyenda:* Animal muerto. Fuente: Informe de laboratorio.

Los niveles de glucosa en sangre del día 2 del estudio son bajos, pero a partir

12

Segun Okamoto7 el alloxan o sus metabolitos interactúan con el zinc pancreático provocando una destrucción de las células beta de los islotes de Langhergans pancreáticos.8,9 Sin embargo, otras observaciones dan sustento a la teoría de la formación de radicales de oxígeno que desempeñan una función significativa en la acción diabetógena de esta sustancia. En este trabajo se toma la misma especie animal y la misma dosificación del alloxan que utilizó Alan Golay en su trabajo publicado en 1987.10 En un trabajo anterior realizado por Fleitas y colaboradores, en 1988, se establece un modelo de diabetes experimental en ratas, con buenos resultados. Las ratas permanecieron en esta condición por más de 45 días, a éstas se les inyecto 0,32 U de insulina lenta diaria por vía intraperitonial. En este estudio se encontró además de los niveles elevados de glicemia en ayunas una elevación de los niveles de triglicéridos lo cual no se observó en los conejos de este estudio. Se tomó como referencia 14 mmol/L de glucosa en ayunas para declarar diabético al animal, se comprobó que al tercer día del ensayo todos los conejos, exceptuando al animal # 9, tenían niveles de glicemia superiores a la concentración prefijada. Posteriormente este animal alcanzó niveles más altos aunque siempre las cifras fueron inferiores al resto. La dosis de 1,1 U de insulina lenta aplicada a los animales no fue absoluta para todos, aunque de manera general todos los animales tuvieron necesidades semejantes que se ajustaron según los niveles de glicemia. Se puede afirmar que el tratamiento aplicado con alloxan fue efectivo para convertir a los animales en diabéticos. Un conejo murió (el # 8) antes de las 24 h después de inyectado el alloxan, probablemente debido a una hipoglicemia ini-

cial descrita por otros autores.10 También murieron 2 conejos el día 8 del estudio, aparentemente de hipoglicemia pues se inoculó la insulina indicada y se demoró el suministro de alimentos. Otro animal murió a los 40 días, la causa de esta muerte pudo haber sido las complicaciones del tratamiento como la infección. Según se observa en la tabla 1 los niveles de glicemia están elevados en todos los animales para los diferentes momentos de las determinaciones. Se puede afirmar que los animales mantuvieron la condición de diabéticos durante este período. En la tabla 2 se observan los niveles de CT al inicio, en una etapa intermedia y al final de la investigación se observa un ligero aumento de este parámetro al mes de tratamiento con una tendencia a normalizarse al final del estudio que pudiera corresponder con un reajuste metabólico. La tabla 3 muestra cómo el C-HDL tenía un comportamiento similar al que presentó el CT. Lo mismo sucede con los TG séricos (tabla 4). TABLA 3. Niveles del colesterol de las HDL en tres momentos de la investigación Animales 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Media

Antes

Día 22

Día 42

0,82 0,66 0,52 0,65 0,46 0,61 0,8 0,42 0,63 1,00 0,65

* * 0,97 0,57 0,71 0,71 0,58 * 0,62 0,82 0,71

* * 0,6 0,53 0,46 0,6 0,65 * 1,06 * 0,65

Valores expresados en mmol/L. Leyenda: *: Animal muerto. Fuente: Informes de laboratorio.

13

TABLA 5. Niveles de fructosamina en tres momentos de la investigación

TABLA 4. Niveles de triglicéridos en tres momentos de la investigación Animales 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Media

Antes

Día 22

Día 42

1,10 1,19 1,17 1,18 1,13 1,11 1,22 0,39 1,06 1,06 1,06

* * 0,83 1,66 1,22 3,17 1,05 * 0,78 1,53 1,46

* * 0,56 0,41 3,12 0,39 0,45 * 0,10 * 0,84

Animales 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Media

Antes

Día 22

Día 42

2,43 2,47 2,7 2,82 2,3 3,22 2,55 2,74 2,83 3,35 2,74

* * 3,87 4,51 4,8 4,77 3,87 * 2,02 3,48 3,9

* * 3,32 4,9 5,95 3,84 3,35 * 2,85 * 4,06

Valores expresados en mmol/L. Leyenda: *: Animal muerto. Fuente: Informe de laboratorio.

Valores expresados en mmol/L. Leyenda: *: Animal muerto. Fuente: Informes de laboratorio.

Los estudios anatomopatológicos no mostraron alteraciones de la aorta, los riñones y el hígado. Esto parece indicar que no fue suficiente el tiempo para poder observar cambios en estos órganos. Los resultados obtenidos permiten plantear que se logró un modelo experimental de diabetes en conejo tratados con alloxan que fue efectivo, ya que se mantuvo el animal diabético durante 42 días, controlando la hiperglicemia con insulina.

La FA presentó una tendencia marcada a elevarse durante la investigación y estos niveles elevados pudieran estar relacionados con el tiempo que permanece aumentado los niveles de glucosa en sangre, lo cual trae aparejado de la Glicosilación no enzimática (GNE) de proteínas (tabla 5).

SUMMARY: Materials and methods: 10 New Zealand rabbits were used for inducing diabetes

mellitus. Glycemia levels were measured a week before beginning the study and at 1,2,6,7,8,9,15,17,21,22,26 and 42 days after alloxan innoculation. Insuline administration begins on the third day. Some lipidic variables were also measured. Results:diabetic condition kept throughout the whole experiment. Levels of CT, C-HDL and TG showed a slight increase after one month of treatment,tending to become normal once the study is concluded. No anatomopathological alterations were found in any rabbits. Conclussions: an experimental diabetes model in rabbits was devised that could be useful for experimental studies. Subject headings: DIABETES MELLITUS; RABBITS; INSULINE; PANCREAS/pathology.

Referencias Bibliográficas

3. Bar-On, H.,and S. Eisenber. The metabolic fate of high density lipoprotein (HDL) in diabetic rat. Diabetologia 1978;14:65-9. 4. Duff GL. The pathology of the pancreas in experimental diabetes mellitus. Am J Med Sci 1945;210:301-87. 5. Maeda CY, Fernandez TG. Strectozotocin diabetes modifies arterial pressure and

1. Serichire T. Animal model assessing the scope of their use in biomedical research. 1987:21123. 2. Van Tol A. Hipertrighlyceride in the metabolic rat. Atherosclerosis 1977;26:11728.

14

6.

7. 8.

9.

baroreflexs insitivity in rats. J Med Biol Res 1995;28(4):497- -501. De Mello MA, Luciane E. Effects of protein malnutrition on glucose tolerance in rats with alloxan induced diabetes. Med Biol Res 1995;28(4):467-70. Okamoto KT. Diabetes experimental. Sec Pathol Ispan 1942;32:99-105. Maeda CY, Fernández TG. Autonomic dysfunction in short-term experimental diabetes. Hypertension 1995;26(6 pt 2):1100410. Fernand N, Astesano A, Phan HH, Lelong C, Rosselin G. Dynamic of pancreatic cell growth

and differentiation during diabetes reversion in ST2-treated newborn rats. Am j Physiol 1995;28:269-72. 10. Alain G, Loben Z. Role of insulin in regulation of high density lipoprotein metabolism. J Lipid Res 1987;28:10-7. Recibido: 27 de noviembre de 1999. Aprobado: 6 de enero del 2000. Dr. Andrés Samuel Fleitas. Instituto Nacional de Angiología y Cirugía Vascular (INACV) MINSAP. Calzada del cerro No. 1551, esq. Domínguez, Cerro, Ciudad de La Habana, Cuba. CP 12000. Teléf. 57 6493. e-mail: [email protected]

15