Re p u b l i co fEc u a d o r ≠ EDI CTOFGOVERNMENT± I no r d e rt op r o mo t ep u b l i ce d u c a t i o na n dp u b l i cs a f e t y ,e q u a lj u s t i c ef o ra l l , ab e t t e ri n f o r me dc i t i z e n r y ,t h er u l eo fl a w,wo r l dt r a d ea n dwo r l dp e a c e , t h i sl e g a ld o c u me n ti sh e r e b yma d ea v a i l a b l eo nan o n c o mme r c i a lb a s i s ,a si t i st h er i g h to fa l lh u ma n st ok n o wa n ds p e a kt h el a wst h a tg o v e r nt h e m.

NTE INEN 1644 (1988) (Spanish): Alimentos zootécnicos. Determinación de carotenos y xantofilas en vegetales deshidratados y mezclas de alimentos

CDU: 636.085

Norma Técnica Ecuatoriana Obligatoria

AL 06.01-304

ALIMENTOS ZOOTÉCNICOS. DETERMINACIÓN DE CAROTENOS Y XANTOFILAS EN VEGETALES DESHIDRATADOS Y MEZCLAS DE ALIMENTOS.

INEN 1 644 1988-04

Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN – Casilla 17-01-3999 – Baquerizo Moreno E8-29 y Almagro – Quito-Ecuador – Prohibida la reproducción

1. OBJETO 1.1 Esta norma establece el método de ensayo para la determinación de carotenos y xantofilas en los alimentos destinados a la alimentación animal.

2. FUNDAMENTO 2.1 Determinar la absorbancia de las soluciones de carotenos y xantofilas previamente extraídas de la muestra en una columna cromatográfica mediante disolventes de elución adecuados.

3. INSTRUMENTAL 3.1 Columna cromatográfica, constituida por una columna de vidrio termo-resistente de 12,5 mm de diámetro interno por 30 cm de altura, terminada en un tubo capilar de 2 mm de diámetro interno 3

por 10 cm de altura, el cual se introduce dentro del cuello de un matraz volumétrico de 25 cm . 3.2 Equipo de filtración al vacío, (Para la recolección de la elución en un matraz volumétrico) el cual se fija a la columna cromatográfica por medio de un tapón de caucho. 3.3 Espectrofotómetro, con capacidad de variación de longitud de onda y ancho de rendija en el intervalo visible del espectro electromagnético.

4. REACTIVOS 4.1 Acetona anhidro, libre de alcohol. Se destila en presencia de zinc granular (de aproximadamente 2,80 mm). 4.2 Hexano, de alta pureza o equivalente. 4.3 Solución de extracción, mezclar en volumen, hexano-acetona-alcohol absoluto-tolueno (10+7+6+7). 4.4 Adsorbente I, mezclar mecánicamente hasta que la mezcla sea homogénea (durante 1 - 2 h), silica gel y tierra de diatomeas en proporción (1 + 1) (m/m).

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4.5 Adsorbente II, mezclar mecánicamente hasta que la mezcla sea homogénea (durante 1 - 2 h), magnesio activado y tierra de diatomeas en proporción (1 + 1) (m/m). 4.6 Solución al 40% de hidróxido de potasio y metanol. Disolver 40 g de hidróxido de potasio y metanol 3

caliente; se enfría y diluye a 100 cm con este mismo alcohol. 4.7 Solución al 10% de sulfato de sodio. Disolver 10 g de sulfato de sodio anhidro en 100 cm

3

de agua destilada. 4.8 Disolventes de elución 4.8.1 Para carotenos, solución de hexano-acetona (96 + 4). 4.8.2 Para monohidroxi-pigmentos (M H P), solución de hexano-acetona (90 + 10). 4.8.3 Para dihidroxi-pigmentos (D H P), solución de hexano-acetona (80 + 20). 4.8.4 Para xantofilas totales (XT), solución hexano-acetona-metanol (80 + 10+ 10). 4.9 Solución colorante estándar, de 1 - (fenilazo) - 2 - naptol 4.9.1 Solución madre 1,0 milimolar. Recristalizar la solución 1 - (fenilazo) - 2 - naptol con alcohol absoluto °

caliente. Secar los cristales hasta obtener peso constante en una estufa de vacío de 70 C.. Disolver 3

0,1241 g en 500 cm de una solución de acetona -isopropano (1+1). Esta solución debe graduarse en un lugar oscuro. 3

3

4.9.2 Solución patrón 0,04 milimolar. Diluir 20 cm de la solución madre en 500 cm de la solución de acetona-isopropanol (1 + 1). Esta solución debe guardarse en un lugar oscuro.

5. PREPARACION MUESTRA

5.1 Pulverizar la muestra de tal forma que pase por un tamiz de abertura de 425 µm (ver INEN 154). Pesar exactamente 4 g de muestra tamizada (2 g si es gluten de maíz o harina de alfalfa) dentro de un 3

3

matraz volumétrico de 100 cm . Agregar con una pipeta, 30 cm de la solución de extracción (4.3), tapar y agitar durante 1 minuto. 5.1.1 Para muestras de baja humedad, por ejemplo harina de alfalfa deshidratada (no de muestras 3

secadas al aire). Con la ayuda de una pipeta colocar 1 cm de agua destilada en el matraz volumétrico que contiene 2 g de muestra. Tapar y agitar durante 1 minuto. Para muestras de alta humedad (secadas al aire), omitir la adición de agua destilada.

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5.1.1.1 Saponificación en caliente, (para rápida extracción y para muestras que contengan ésteres de 3 3 xantofilas). Con la ayuda de una pipeta colocar 2 cm (4 cm para 4 g de muestra de mezcla de alimentos) de la solución 40% de hidróxido de potasio y metanol dentro del matraz, agitar por 1 minuto y colocar al matraz en un baño de agua por 20 minutos. Unir el condensador de aire o enfriador al cuello del matraz para prevenir las pérdidas de solvente. Enfriar la muestra y guardar en 3 un lugar oscuro durante 1 hora. Pipetear 30 cm de hexano dentro del matraz, agitar por 1 minuto y diluir a volumen con la solución al 10% de sulfato de sodio agitando fuertemente durante 1 minuto. Mantener en un lugar oscuro por una hora antes de cromatografiar. La fase superior en la 3 columna es de 50 cm . 5.1.1.2 Saponificación en frío (durante la noche), (para muestras que no contienen ésteres de xantofilas). La muestra se deja en reposo en el matraz volumétrico, en la oscuridad, por 16 horas. Luego, 3 con una pipeta agregar 2 cm de la solución al 40% de hidróxido de potasio y metano) (4.6) dentro del matraz y agitar durante 1 minuto dejando en reposo en la oscuridad durante 1 hora. Luego se procede con la adición del hexano como se indica en (5.1 .1.1).

6. PROCEDIMIENTO

6.1 Cromatografía, Empacar la parte inferior de la columna con algodón adsorbente o lana de vidrio y agregar adsorbente I hasta formar una capa de aproximadamente 12 cm de altura. Colocar en el aparato de filtración y aplicar vacío; agregar más adsorbente hasta obtener una capa de 7 cm de altura; emplear una varilla de vidrio con un corcho invertido para compactar y nivelar la superficie del adsorbente. Colocar una capa de 2 cm de sulfato de sodio anhidro sobre el adsorbente y presionar firmemente. 3

6.1.1 Carotenos totales, Colocar en un matraz volumétrico de 25 cm bajo la columna para recoger el 3 3 disolvente de elución; con una pipeta tomar 5 cm (o 10 cm si los pigmentos son bajos) de la fase superior de la columna y aplicar vacío hasta lograr un flujo de 2 a 3 gotas por segundo. Con la ayuda de una válvula de paso en la línea de vacío controlar la cantidad de flujo. Adicionar el disolvente de elución de los carotenos hasta que todo el disolvente penetre en el adsorbente y continuar mientras la banda de carotenos se recolecte dentro del matraz. El adsorbente debe mantenerse cubierto con la solución durante todo el tiempo. Suspender el vacío, y colocar la solución de carotenos en la oscuridad hasta que alcance la temperatura ambiente, y diluir a volumen con el mismo disolvente de elución de carotenos. Invertir el matraz varias veces para mezclar y luego determinar la absorbancia (A) inmediatamente, como en el numeral (6.2). Las xantofilas quedan en la columna. Para separar los monohidróxidos pigmentos de los dihidroxipigmentos (epoxi y polioxi) o para las xantofilas totales, proceder como en (6.1.2) o (6.1.3). 6.1.2 Separación de xantofilas. 3

6.1.2.1 Colocar un matraz volumétrico de 25 cm bajo la columna y aplicar vacío o ésta para que el nivel de disolvente de elución se aproxime a la superficie de la capa adsorbente; inmediatamente adicionar el disolvente de elución para los monohidroxi-pigmentos (M H P). La banda de pigmentos monohidróxidos (zeinoxantinas o criptoxantinas) y algunos mono o diésteres persistentes, deben descender antes que otras bandas. Cuando se completa la elución de la banda de MHP, colocar el matraz en la oscuridad hasta que alcance la temperatura ambiente, antes de diluir a volumen con el disolvente de elución de MHP y determinar la absorbancia (A).

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 6.1.2.2 Proceder en la misma forma indicada en el numeral anterior, usando el disolvente de elución de los D H P para recoger los pigmentos de la banda siguiente (luteína, zeaxantina y sus isómeros) en 3

un matraz volumétrico de 25 o 50 cm . La violaxantina, neoxantina y otros polioxipigmentos (POP) permanecen en la columna. 6.1.3 Xantofilas totales. Si se desea conocer el contenido total de xantofilas, se agregará con una pipeta una alícuota fresca de la fase superior del extracto original a la columna de 7 cm de altura del adsorbente II y se extraerán los carotenos con el disolvente de elución de los monohidroxipigmentos, solución de hexano-acetona (90 + 10) y las xantofilas totales con el disolvente de elución hexanoacetona-metanol (80 + 10 +10). 6.2 Determinación de la absorbancia. Medir rápidamente la absorbancia (A) para minimizar la isomerización y las pérdidas por autoxidación. Verificar la calibración del espectrofotómetro efectuando lecturas con la solución patrón de colorantes 0,04 milimolar entre 469 - 479 nm con intervalos de 1 nm. Si el valor máximo no es de 479 nm, se deberá volver a calibrar el instrumento. Si por el contrario el instrumento registra el máximo valor de la absorbancia a 474 nm y el ancho de la rendija es 0,03, las lecturas de absorbancia de la solución colorante patrón 0,04 milimolar deben ser 0,561 (474 nm) y 0,460 (436 nm). Los resultados que se obtengan se corregirán de acuerdo con el factor de corrección del equipo. Si el instrumento carece de rendija regulable se asumirá que la concentración de la solución colorante patrón tiene la misma 3

absorbancia que una solución que contenga 2,35 mg de carotenos /dm a 436 nm y la de una solu3

ción que contenga 2,38 mg de xantofilas/dm a 474 nm. Determinar la absorbancia de la fracción de carotenos a 436 nm y de las fracciones de MHP y DHP a 474 nm. Para mayor seguridad de los resultados, controlar el volumen de las soluciones para que la absorbancia quede entre 0,25 y 0,75. 7. CALCULOS

7.1 Las siguientes ecuaciones se aplicarán para valores de absorbancia obtenidos en espectrofotómetros calibrados para que operen con estrechos rangos de abertura. Valores de 196 y 236 son para Trans-B- caroteno y Trans-luteina para longitud de onda preestablecida: 

C =

A436 x f x 1 000 196 x b x d





X=

A 474 x f x 1 000 236 x b x d

d =

m x V1 50 x V2

(Continua) -4-

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f = 0,460/observado a A4 3 6 ó 0,561/observado a A 4 7 4 Siendo: C

= Concentración de la fracción de carotenos totales, en mg/kg;

X

= concentración de xantofilas totales ó MHP o DHP, en mg/kg;

d

= factor de dilución;

m

= cantidad de muestra, en g; 3

V1 = volumen de extracto usado en la columna, en cm ; 3

50 = fase superior de la muestra, en cm ; b

= longitud de la celda, en cm;

f

= factor de corrección del equipo.

8. INFORME DE RESULTADOS

8.1 Como resultado final, debe indicarse la media aritmética de las determinaciones realizadas por duplicado. 8.2 El reporte del ensayo deberá indicar el método empleado y el resultado obtenido. Deberá, además, mencionarse cualquier condición de operación no especificada en esta norma o considerada como opcional, así como cualquier detalle o incidente que pudo influenciar en el resultado. 8.3 El reporte del ensayo debe incluir toda la información necesaria para la completa identificación de la muestra.

(Continua) -5-

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APENDICE Z

Z.1 NORMAS A CONSULTAR INEN 154 Tamices de ensayo. Tamaños nominales de las aberturas.

Z.2 BASES DE ESTUDIO Método AOAC de análisis. AOAC 43.018 a 43.023. Carotenes and Zanthophylls in Dried Plant Materials and Mixed Feeds, 14 th, ed. Association of Official Analytical Chemists. Arlington: Virginia, 1984. Norma Colombiana ICONTEC 972. Alimentos para animales. Determinación de carotenos y xantofilas. Instituto Colombiano de Normas Técnicas, Bogotá, 1975.

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

INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA Documento: NTE INEN 1 644

TITULO: ALIMENTOS ZOOTECNICOS. DETERMINACIÓN Código: DE CAROTENOS Y XANTOFILAS EN VEGETALES AL 06.01-304 DESHIDRATADOS Y MEZCLAS DE ALIMENTOS. ORIGINAL: REVISIÓN: Fecha de iniciación del estudio: Fecha de aprobación anterior por Consejo Directivo Oficialización con el Carácter de por Acuerdo No. de publicado en el Registro Oficial No. de Fecha de iniciación del estudio: Fechas de consulta pública: de a Por recomendación de diversas empresas privadas y del Estado y considerando la necesidad de regular la producción y comercialización de alimentos para consumo animal, la direcciñon General dispuso la elaboración de esta norma. Subcomité Técnico: AL 06.01 ALIMENTOS ZOOTECNICOS Fecha de iniciación: 1987-09-03 Fecha de aprobación: 1987-10-29 Integrantes del Subcomité Técnico: NOMBRES:

INSTITUCIÓN REPRESENTADA:

Dr. César Narváez (Presidente) Ing. Amable Villacrés Ing. Washington Gaibor Dr. Horacio Morales Dra. Blanca Núñez Dra. Dolores Carriel Sr. Romeo Almeida Dr. Gilberto Tenesaca Sr. Alfonso Coronel Ing. Alberto Espinosa (Secretario Técnico)

MAG PRONACA C.A. MICIP CENDES MOLINOS CHAMPION S.A. MOLINOS CHAMPION S.A. BALANFARINA S.A. BALANFARINA S.A. ALFAPASTO INEN

Otros trámites: 4 Esta norma sin ningún cambio en su contenido fue DESREGULARIZADA, pasando de OBLIGATORIA a VOLUNTARIA, según Resolución de Consejo Directivo de 1998-01-08 y oficializada mediante Acuerdo Ministerial No. 235 de 1998-05-04 publicado en el Registro Oficial No. 321 del 1998-05-20 El Consejo Directivo del INEN aprobó este proyecto de norma en sesión de 1988-04-13 Oficializada como: OBLIGATORIA de 1988-06-02

Por Acuerdo Ministerial No. 220 de 1988-05-20 Registro Oficial No. 948

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