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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD LICENCIATURA EN BIOLOGIA EXPERIMENTAL
ESTUDIO COMPARATIVO DE LA ACTIVIDAD HEMATOPOYÉTICA In vitro DE Hypericum perforatum y Tagetes lucida ”
LUZ MARIA MEJIA HERNANDEZ
LABORATORIO DE HEMATOLOGIA EXPERIMENTAL
ASESORES M en B.E Rodolfo Velasco Lezama Q.B.P Rafaela Tapia Aguilar
MAYO-2002
INTRODUCCION
Las células de la sangre derivan de una célula precursora común denominada “célula tallo”, que reside en en la médula ósea .En 1961 Till y McCulluch definieron a las células tallo hematopoyéticas a partir de estudios dirigidos a la formación de células progenitoras en el bazo de ratones irradiados, a las colonias formadas se les conoce como Unidades formadoras de colonias de células de bazo ( CFU-S ) . Se definió a las HCSs como células capaces de ronovarse a si mismas
y diferenciarse para dar
origen a células precursoras de la sangre. La célula stem hematopoyética existe en la Médula ósea en una proporción de una por cada cien mil células nucleados . La mayoría de estas células se encuentran la fase Go del ciclo celular. Una vez de que la célula se ha diferenciado puede migrar desde la médula ósea hacia cualquiera de los órganos linfoides y así dar origen a precursores de linfocitos T o B , o se queda en la médula ósea psara poder difrenciarse hacia la línea eritroide, granulocítica/magrofagos y megacariocitos. Las células linfoides, que participan en la respuesta inmune específica, estas células salen de la médula ósea
con diferentes grados de competencia inmunológica. Los monocitos pasan a la
circulación en estado inmaduro . Los linfocitos dejan la médula ósea también en un estado relativamente inmaduro y completa su maduración o diferenciación en otros órganos. Existen varios mecanismos que regulan de la hematopoyesis, algunos conocidos como factores de crecimiento hematopoyético como la Epo, GSF-1, GM-CSF, G-CSF, IL-3, IL-7. Estas citocinas son objeto de estudio desde hace varias décadas
debido a la influencia que tienen sobre la
diferenciación y maduración de las células sanguíneas. En Hypericum perforatum, una planta utilizada en la medicina popular, se identificó un compuesto denominado hipericina, del cual se conoce que posee propiedades antirreumáticas, antidiuréticos y antidepresivas. La hipericina ha sido evaluada en la regulación de algunas citocinas, lo que motiva a realizar estudios invitro sobre las células que dan origen a la respuesta inmune. En México la comercialización de la Hierba de San Juan o hipérico se ofrece en formas farmaceúticas de tabletas o cápsulas, es escasa la compra de la planta en su forma natural. En los
mercados de la Ciudad de México se ofrece como hierba de San Juan otra planta ; Tagetes lucida. Tagetes lucida es conocida también con el nombre de Hierbanis o pericón, se puede encontrar en varios estados de la República Mexicana y es una planta utilizada en la Medicina tradicional Mexicana, se recomienda contra la diarrea, “empacho”, reumatismo, disentería y otros veintiocho males estomacales. Se ha detectado en Tagetes lucida
actividad antibacteriana e
inhibidora de agregación
de
plaquetaria. Ambas plantas
pertenecen a diferentes
familias botánicas y se
puede pensar que a razón
principal por lo que se vende a Tagetes lucida como Hypericum perforatum es el color y tamaño de sus flores. Aún no se encuentra referencia de la actividad sobre las células de médula ósea o bazo de estas plantas , por lo que el objetivo de este trabajo es realizar un estudio comparativo sobre actividad en la proliferación de células de médula ósea y de bazo in vitro Hypericum perforatum
la
de Tagetes lucida e
ANTECEDENTES Al proceso de formación de las células de la sangre se le llama hematopoyesis, y a los lugares donde tiene lugar se les denomina órganos hematopoyéticos. Los órganos hematopoyéticos principales de los mamíferos son la médula ósea, el bazo y los ganglios linfáticos La médula ósea es un tejido blando, densamente poblado, formado por los precursores de las células sanguíneas, macrófagos, células adiposas, células y fibras reticulares. Es en la médula ósea donde se produce mayoritariamente la renovación celular de tejido hematopoyético, que se encuentra organizado jerárquicamente en tres compartimentos: el de células madre o de precursores totipotenciales, el de precursores comprometidos (precursores unipotenciales o bipotenciales con amplia capacidad de prolIferación ) y el de células maduras. Los elementos celulares de los compartimentos de precursores totipotenciales y comprometidos difieren del compartimento de células maduras en que estas últimas son reconocibles morfológicamente. Todas las células de la sangre se originan a partir de un precursor común, denominado célula madre hematopoyética, si bien el concepto de un origen común para todas las células de la sangre fue sugerido desde principios del siglo pasado, en 1961 James Till y Ernest McCulloch, empleando un sistema experimental en ratones irradiados, demostraron la existencia de esas células a las que llamó células S, se observó la formación de colonias de células hematopoyéticas en el bazo de los ratones receptores recibiendo el nombre de unidades formadoras de colonias de bazo CFU-S Bradley y Metcalf, en 1966 encontraron que al cultivar células de médula ósea en medio de cultivo con agar sangre, se podían formar también colonias hematopoyéticas (Spangrude y Heimfeld , 1987). En 1970, se logró dar la primera definición de la célula totipotencial hematopoyética: entidad dotada de un amplio potencial de automantenimiento y de capacidad de diferenciarse en todos los linajes hematopoyéticos. Dos décadas más tarde, ese criterio se ha ampliado y se le designa como célula capaz de automantenerse, proliferar y producir una progenie diferenciada y funcional (López, 1989). La célula madre hematopoyética (CT) presenta dos características fisiológicas fundamentales: primera, son capaces de renovarse, es decir, de dar origen a células idénticas a ellas mismas y segunda, son capaces también de producir los distintos tipos celulares sanguíneos esto es: neutrófilos, eosinófilos y basófilos, monocitos y plaquetas, así como los linfocitos T , B y las células plasmáticas de linaje linfoide (Spangrude y Heimfeld, 1987). La médula ósea y el timo constituyen los órganos linfoides primarios; los órganos linfoides secundarios son el bazo, gánglios linfáticos y tejido linfoide asociado a mucosas. En los órganos linfoides secundarios los linfocitos maduran entremezclados con células del sistema fagocítico mononuclear (Butcher 1987)
Existen diferentes mecanismos de regulación de la hematopoyesis; algunos comprenden el contacto directo entre células de distintos tipos, mientras que otros son mediados por factores solubles denominados factores de crecimiento hematopoyético, que regulan de manera directa la producción de eritrocitos, leucocitos y plaquetas (López, 1989). Entre los factores de crecimiento hematopoyéticos descubiertos, destacan de manera particular: la eritropoyetina (Epo), la interleucina 3 (IL-3), el factor estimulante de colonias de granulocitos / macrófagos (GM-CSF), el factor estimulante de colonias granulocitos (G-CFS-1) y el factor estimulante de colonias de macrófagos (CFS-2). La producción de dichos factores está a cargo de los monocitos, linfocitos T, fibroblastos y células endoteliales (Clark y Kamen, 1987). Los factores de crecimiento han sido objeto de diversos estudios en los últimos años , debido fundamentalmente a dos razones: su importancia para el entendimiento de los mecanismos de proliferación y diferenciación celular, tanto en condiciones normales como patológicas, y por su aplicación en el tratamiento de enfermedades tales como leucemias y anemias e inmunodeficiencias entre ellas las originadas por el virus de la inmuno deficiencia humana (Hoffbrand, 2000). La hematopoyesis en algún momento de la vida del individuo puede ser modificada por agentes físicos, químicos o biológicos que pueden modificar el patrón de replicación celular y causar alguna hematopatología, es así como la población mexicana recurre al uso de las plantas o ”hierbas” para curar o controlar enfermedades de pronóstico fatal para las que la medicina alopática no tiene una cura definitiva. El empleo de plantas medicinales con fines curativos es una práctica que se ha utilizado durante mucho tiempo, los remedios naturales , fueron el principal, e incluso el único recurso de que disponían los médicos. A principios del siglo pasado, el desarrollo de la química y el descubrimiento de procesos complejos de síntesis orgánica desembocaron en la producción de medicamentos y la búsqueda de sustancias activas de las plantas reconocidas con propiedades medicinales es otra vez importante. Ya se había olvidado que la mayoría de los fármacos provenían en su gran mayoría , de plantas medicinales que cuyas propiedades terapéuticas fueron conservadas por culturas de muchos países (plantas indígenas) La impresionante evolución de la química parecía augurar que en el futuro todos los recursos en materia de salud provendrían de la síntesis de compuestos obtenidos en los laboratorios y de alguna manera, el uso de las plantas medicinales quedaría como una práctica empírica realizada por herboristas o charlatanes y por tal motivo era riesgoso su uso. Cada día se presta más atención al estudio de las plantas medicinales, de forma tal que la etnobotánica y la fitoterapia están tomando un gran auge en el mundo actual, tanto en la medicina aplicada como en la investigación experimental. El 80 % de la población mundial, aproximadamente unos cuatro mil millones de personas, utiliza las plantas como principal remedio medicinal en muchas de sus dolencias.
Llama la atención la creciente demanda de esta terapia sobre todo en los países de mayor desarrollo donde resurge la necesidad de lo natural y el rechazo a una medicina iatrogénica; por su parte en los países de menor desarrollo constituye un recurso ancestral trasmitido de generación en generación como parte de las tradiciones enraizadas en cada uno de ellos. En relación con las planta utilizadas en el tratamiento de enfermedades hematológicas, se ha determinado que algunos compuestos vegetales tienen la capacidad de aglutinar eritrocitos y estimular la proliferación de los linfocitos, entre ellos se encuentran compuestos extraídos de semillas, hojas o raíces de algunas plantas llamados lectinas, algunas de ellas son obtenidas de especies como: Ulex europaeus, Vicia graminea, Dolichos biflorus, entre otras, que se han convertido en una herramienta valiosa de laboratorio para comprender la estimulación de células totipotenciales ( Miale, 1985). Se han estudiado las propiedades inmunomodulatorias de algunas plantas medicinales del norte de América y la bioactividad de sus compuestos detectando en ellas la capacidad de modular el sistema inmune (Borchers et al., 2000). Existen estudios que indican que Equinacea , Propóleo, Eleuterococo, Cola de caballo, Sauco, Tila, Loto y manzanilla, estimulan las defensas en el organismo. Los investigadores han centrado su atención en las flores púrpuras en forma de cono de especies como Echinecea purpurea por su actividad sobre el sistema inmunológico y su relación con algunas enfermedades infecciosas. Por otra parte, la medicina herbolaria le atribuye diversas propiedades a Hypericum perforatum, también conocida como Hierba de San Juan, planta herbácea ampliamente distribuida en Europa. Los estudios fitoquímicos de H. perforatum datan de 1830 cuando Buchner extrajo de ella la hipericina, llamándole hypericum rojo; se identifican posteriormente otros compuestos como los flavonoides, quercitrina, carotenoides, xantonas, glicósidos e hiperforina (Dias, et al., 1998).
La hierba de San Juan es utilizada ampliamente por la medicina tradicional en los tratamientos de la depresión moderada, ansiedad y alteraciones del sueño; donde la hipericina probablemente sea el principio activo, pues es capaz de inhibir los niveles de serotonina y dopamina. Otros compuestos de Hypericum perforatum como los flavonoides y xantonas se han relacionado con la inhibición de la monoaminoxidasa (MAO) plaquetaria y granulocítica (Pepping , 1999). Se ha publicado el mecanismo de acción y potencial terapéutico de Hypericum perforatum como agente antiretroviral in vivo e in vitro de la hiperforina y la pseudohiperforina debido a que influyen directamente en la maduración de los retrovirus (Grad et al .,1989). Actualmente se evalúa también como medicamento adjunto en pacientes con HIV y SIDA (Axarlis et al., 1998).
También se ha detectado actividad bactericida de la hiperforina en cultivos de Staphylococcus aureus y en otras bacterias gram-positivas. (Schempp et al., 1999). Evstifeeva y colaboradores en 1996, estudiaron las propiedades inmunológicas de Hypericum perforatum, obtuvieron dos fracciones, una polifenólica que exhibe la propiedad estimulante del sistema de fagocitos mononucleares y una fracción lipofílica, la cual muestra actividad inhibitoria con respecto a la respuesta inmune celular y humoral . La hipericina fue evaluada como reguladora de la interleucina 12 (IL-12) producida en macrófagos de ratones, se estableció que la hipericina inhibe significativamente la producción de Il-12, además inhibe la activación del gen promotor de IL-12 sugiriendo esto que la producción de esta interleucina esta regulada negativamente a un nivel de transcripción. Aún se desconoce la actividad de Hypericum perforatum sobre la capacidad de proliferación células hematopoyéticas pero con base en los antecedentes citados es probable detectar Hipérico efecto sobre el desarrollo de colonias hematopoyéticas, sin embargo esta planta comercializa en México en forma de tabletas y cápsulas, en México se expende en el mercado Sonora en lugar de hipérico otra planta , Tagetes lucida
de en se de
El mercado de Sonora, de la Ciudad de México, es el lugar de máxima distribución de plantas medicinales en nuestro país, ahí se venden plantas tanto de origen mexicano como extranjeras, se pueden encontrar frescas o secas, acuden a él tanto distribuidores en otros mercados como familiares de pacientes o los mismos enfermos. En este lugar se expende y comercializa a Tagetes lucida como equivalente a Hiperícum perforatum, debido a que Tagetes lucida tiene un aspecto similar al hipérico y comparten un nombre un mismo nombre común “Santa María”. (Campos 1995) Tagetes lucida es una hierba aromática conocida también con los nombres de hierbanís, pericón o Santa María; pertenece a la familia de las Asteráceaes, se encuentra ampliamente distribuida en la República Mexicana en los estados de Chiapas, Morelos, Jalisco, Oaxaca, Puebla, Estado de México, Tlaxcala, D.F., Durango y Chihuahua. Es una planta herbácea perenne, erecta, tallos que miden hasta los 80 cm , hojas simples , elípticas, con márgenes aserrados, flores liguladas de 3 o 4 de color amarillo de 4 a 6 mm de largo Su utilidad medicinal data de la época prehispánica, en el lenguaje Nahuatl es conocida como Yautli o hierba nube. Francisco Hernández en su obra del siglo XVI reporta su uso en el tratamiento de un gran número de casos. Se toma como un té ligero para aliviar dolores corporales y como té concentrado para el tratamiento del reumatismo, como estimulante de la menstruación, incrementa la producción de leche, dolor de cabeza, fiebre y en caso de diarrea e infecciones ( Cano, 1997 ). De acuerdo con los estudios fitoquímicos hechos a Tagetes lucida se han encontrado algunos aceites especiales como el linolol, estragol, metileugenol, 7 metoxicumarina, 6-7 dimetoxicumarina (Bicchi et al 1997). Se ha detectado que la composición del extracto hexánico de tallos y hojas contiene alfatertienilo y betienilos sustancias a las que se les atribuyen propiedades antihelmínticas . Los tiofenos, grupo al que pertenecen las sustancias anteriores , son tóxicos para algunos hongos y bacterias ( Arnaz 1991 )
Dentro del Programa de colaboración sobre medicina indígena y herbolaria tradicional (PROCOMITH) los grupos étnicos de Chiapas Tzotzil y Tzetzal señalaron con propiedades medicinales a Tagetes lucida . El Centro de Investigación en Plantas Medicinales de Xochitepec Morelos ha reportado actividad antibacteriana contra E. coli, Candida Albicans, Vibrio Cholerae, Salmonella enteritiditis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri . Además se ha registrado su actividad como inhibidora de agregación de plaquetaria (Caceres et al 1995 ). En la fracción hexánica de tallo y hojas se han localizado sustancias con propiedades nematicidas y larvicidas. Por cromatografía de alta resolución se encontró alfatertienilo y bitienilos. Los tiofenos, grupo al que pertenecen las sustancias anteriores , son fototóxicos frente a bacterias y hongos, encontrándose positiva la actividad antibacteriana en Bacillus subtilis ( Arnaz et al 1991)
JUSTIFICACIÓN
El empleo de las plantas medicinales en nuestro país se registra desde la época prehispánica, algunos de los trabajos más importantes que describen la enorme riqueza de en herbolaria en nuestros país datan del siglo XVI, durante ese siglo tiene lugar el primer intento para conocer las propiedades de los recursos naturales encontrados en el nuevo continente . Se pueden mencionar obras como la de Fray Bernardino de Sahagún , EL Códice Badiano y la de Francisco Hernández. En las últimas décadas del siglo XVIII aparecen las obras de José Mariano Mociño, Luis Montaña y Martín Sessé. Al finalizar el siglo XIX hay una gran producción bibliográfica sobre el uso de las plantas medicinales, instituciones de gran prestigio como el Instituto Médico Nacional se dedican entonces al estudio de la herbolaria. En la última década del siglo pasado y en este siglo que comienza se ha vuelto a considerar el potencial de la medicina herbolaria, como una esperanza tanto para los países desarrollados en la búsqueda de nuevos medicamentos como en los países donde todavía impera la pobreza y la dependencia tecnológica, la herbolaría se ha considerado como una medicina alternativa ante el alto costo de las terapias innovadoras de los países ricos. Es decir, que a pesar
de los avances tan grandes de la industria farmacéutica , las plantas
medicinales siguen siendo un recurso fundamental para obtener nuevos fármacos tal y como sucedió en el pasado. Debido a la tendencia económica que impera en el ámbito mundial para algunos pueblos no existe otra alternativa que producir sus propios medicamentos, resolviendo así sus necesidades de salud y terapéutica, en los mercados de la ciudad de México se comercializa un gran número de plantas con propiedades medicinales, algunas personas acuden a estos mercados para encontrar un remedio más barato y de fácil administración para la cura de sus males y otras buscan un remedio para enfermedades de las que no han podido restablecerse o que son hasta el momento incurables con los recursos de la ciencia médica actual. Acerca de ellas, se encuentran las patologías mieloproliferativas como la anemia aplástica o la leucemia, incluso la inmunodeficiencia conocida como V.I.H, en la literatura sobre plantas medicinales existen referencias respecto a
la utilidad de
Hypericum perforatum sobre
“enfermedades de la sangre” o como inmunoestimulante es así que propone determinar las
propiedades hematopoyéticas in vitro del hipérico y de la planta que se expende en México como su igual aunque en la literatura etnobotánica mexicana Tagetes lucida es una planta con amplia tradición de uso entre la población, no existe referencia de que esta planta tenga propiedades para aliviar este tipo de enfermedades o de su actividad hematopoyética. En el presente trabajo
se evalúan
las propiedades hematopoyéticas de
Hypericum perforatum mediante ensayos
Tagetes Lucida
in vitro y determina la proliferación
e
de células
hematopoyéticas de médula ósea y del bazo de ratones sanos, para validar si existe fundamento que justifique su comercialización en los mercados mexicanos como plantas con propiedades equivalentes. Las adelantos alcanzados hasta el momento en el conocimiento acerca de la estructura y función de las células totipotenciales hematopoyéticas han permitido el tratamiento de ciertas enfermedades hematológicas, de acuerdo a esto se pretende que con los resultados de este proyecto en primer lugar, se evalúe la actividad hematopoyética de Hypericum Perforatum y se contribuya en el campo del conocimiento de la etnobotánica de plantas mexicanas, revalorar así la herbolaria medicinal que ya posee la sociedad y propiedades terapeúticas en Tagetes lucida.
además
determinar si existen otras
OBJETIVO GENERAL Determinar y comparar la actividad hematopoyética de Hypericum perforatum y Tagetes Lucida en cultivos de células de bazo y médula ósea de ratones sanos.
OBJETIVOS ESPECIFICOS -
Adquirir Hypericum perforatum dos presentaciones comerciales y determinar su actividad hematopoyética
-
Adquirir e identificar Tagetes lucida
-
Obtener el pulverizado de la planta completa de T. lucida
-
Obtener el extracto acuoso de las estructuras aéreas de Tagetes lucida y determinar su actividad hematopoyética de los dos materiales preparados de T. lucida
-
Comparar la actividad hematopoyética de H. Perforatum y T. lucida
HIPOTESIS
Si Tagetes lucida e Hypericum perforatum se utilizan como inmunoestimulantes , su presencia en cultivos de bazo y médula ósea deberá inducir la proliferación en células de cultivo.
MATERIAL Y METODO 1.- OBTENCION DEL MATERIAL DE PRUEBA B) Hypericum perforatum Se utilizó la planta procesada en las presentaciones farmaceúticas ( Comercializadora MD, S.A. de C.V.)
de tabletas y cápsulas
Tabletas de extracto estandarizado de 333 mg de la planta, conteniendo 0.3% de hipericina, preparada por la Comercializada MD, S.A de C.V. lote DS2N01, con caducidad junio de 2002) Cápsulas de 500 mg de la planta completa preparada y comercializada por General Nutritión Coor. (GNC), lote 77858 con caducidad de marzo de 2003 Las tabletas y el contenido de las cápsulas se molieron para ser utilizados como material de prueba, se guardaron en un lugar fresco y sin exposición al sol hasta su uso. B) Tagetes lucida La planta fue adquirida en el mercado de Sonora de la Ciudad de México, se envió un ejemplar al Herbario Metropolitano (U.A.M.I) para la identificación de la planta, de las partes aéreas de la planta se dejaron secar protegidas del polvo y de la luz solar y posteriormente se molieron . Se tomaron 100g y se le adicionaron 250 ml de agua, se calentó a reflujo durante tres horas a una temperatura no mayor de 60°C. Se dejó enfriar y por filtración en maya se eliminó la materia orgánica gruesa, se prosiguió con filtración con papel para obtener el filtrado limpio. Se eliminó el solvente del filtrado por evaporación y por último se liofilizó y conservó en refrigeración hasta su uso. Además del extracto acuoso de T. lucida también se empleó el polvo la planta 2.- PREPARACION DE LAS SOLUCIONES DE PRUEBA Se preparó por separado una solución inicial de 20 mg de cada material en 1 ml de DMSO puro y en condiciones de esterilidad se realizaron las diluciones necesarias, hasta obtener las concentraciones de 2000, 200 y 20 µg/mL del material de prueba en una solución de dimetil sulfóxido al 10%, las diluciones se guardaron en congelación hasta su uso. Las diluciones se emplearon para determinar la actividad hematopoyética en cultivos de células de médula ósea y bazo de ratón.
3.- CULTIVO IN VITRO DE CELULAS DE MEDULA OSEA DE RATON Se sacrificó un ratón macho de la cepa D1, de 8-12 semanas de edad por dislocación cervical y se disecta el fémur en condiciones de esterilidad. Se eliminó el músculo del fémur y se hizo pasar 1ml de solución salina fisiológica a través del canal medular, las células se recibieron en un tubo de plástico y se dispersaron mediante pipeteo lento con pipeta de plástico. En la campana de flujo laminar y en condiciones de esterilidad se tomó una pequeña alícuota de las células de médula ósea para cuantificar las células con el hemocitómetro, utilizando como diluyente solución de Turk, también se determinó la viabilidad celular con azul tripano al 0.2%. El cultivo se realizó en placas multipozos de 96, en un sistema de cultivo que consiste de medio RPMI 1640 , suero de ternera neonato al 10% y células de médula ósea a una concentración final de 2 X 105 células /ml. Se distribuyeron 190 µl del sistema de cultivo por pozo en varios pozos y se agregó por duplicado 10µl del material de prueba, de esta forma se realizó una dilución 1:20 de cada una de las diluciones del material de prueba, quedando a una concentración final de 100, 10 y 1 µg/mL . En los pozos testigos se agregó 10ul de DMSO al 10% en lugar del material de prueba. Se incubaron 3 días a 37° C con humedad relativa de 90-100% y atmósfera CON 5% de CO2. Las células de cada uno de los pozos se cosecharon con pipetas de plástico y se colectaron en tubos de plástico para centrífuga, cada pozo se enjuagó con 0.5 mL de solución salina fisiológica, lo que también fue colectado en el tubo correspondiente, Los tubos se centrifugaron a 1200 RPM/5 min., se decantó el líquido y se resuspendió el paquete celular en 0.2 mL de solución salina fisiológica y se contaron las células en forma directa en la cámara de Neubauer con el microscopio de campo claro.
3.- CULTIVO DE CELULAS DE BAZO DE RATON Se sacrificó un ratón macho de la cepa CD1 de 8-12 semanas por dislocación cervical , se disecto el bazo en condiciones de esterilidad y se colocó sobre un caja petri , se hizo pasar la aguja de una jeringa de 3ml con 2ml del medio RPMI-160 a lo largo del bazo sin romper la cápsula , se regresó la aguja hacia la pulpa del bazo y se hizo un corte en el extremo distal , se dejó pasar lentamente el medio en el interior del bazo y se recolectó el medio ya con células en un tubo de plástico. Las células se dispersaron mediante pipeteo lento, se centrifugaron a 1200 RPM por 5 minutos. Después del lavado del paquete celular, las células se resuspenden en 5 ml de medio RPMI-160 con 10% de STN y se cuantificó vibilidad celular con azul tripano al 2%. El cultivo se realizó en placas multipozos de 96, en un sistema de cultivo que contiene medio RPMI 1640 , suero de ternera neonato al 10% y células de bazo a una concentración final de 2 x 10 5 células /ml
Se distribuyeron 190 µl del sistema de cultivo en varios pozos y se agregó por duplicado 10 µl del material de prueba, así también para los pozos testigos que contienen DMSO al 10%. Se incubó durante 2 días a 37° C con humedad relativa de 90-100% y atmósfera al 5% de CO2. Las células de los pozos se cosecharon con pipetas de plástico y se colectaron en tubos también de plástico para centrifuga, cada pozo se enjuagó con 0.5 ml de solución salina fisiológica. Los tubos se centrifugaron a 1200 rpm, se decantó el líquido y se resuspendió el paquete celular en 0.2 ml de solución salina fisiológica y se realizó la cuantificación celular en forma directa en la cámara de Neubauer con el microscopio de campo claro.
RESULTADOS A) Actividad hematopoyética de T. lucida sobre células de bazo y médula ósea En el Cuadro 1 se muestran los valores de las concentración celular de cultivos de médula ósea y bazo expuestos a Tagetes lucida Especie
Presentación
Tagetes lucida
POLVO EXTRACTO ACUOSO
14.15x104
10.90x104
10.75x104
4.68x104
10.96x104
8.75x104
8.15x104
4.75x104
POLVO EXTRACTO ACUOSO
11.93x104
7.40x104
8.71x104
3.93x104
12.91x104
11.03x104
8.43x104
3.93x104
Tagetes lucida
Concentraciones probadas 100µg/mL 10 µg/mL 1µg/mL
Testigo DMSO 10%
Figura 1. Efecto estimulante de T. lucida en cultivos de células de bazo y médula ósea
CELULAS X 104
25 20 15 10 5 0 100 ug/ml
10ug/ml
1ug/ml
DMSO
CONCENTRACION EN ug/mL T.lucidaPOLVO (BAZO)
T. lucida DECOCCION (BAZO)
T.lucidaPOLVO (M. OSEA)
T. lucida DECOCCION (M. OSEA )
En la figura 1 se observa que las muestras probadas de T. lucida (pericón) en general en todas las concentraciones probadas presentan actividad estimulante de proliferación en las células de bazo con respecto al testigo, esta actividad es estadísticamente significativa (p>0.995) para la muestra de pericón totalmente pulverizado, para la muestra de T. lucida en decocción también hay una actividad significativa pero solo para las concentraciones de 100 y 10 ug/mL Con respecto a su actividad en cultivos de células de médula ósea en ambos materiales de pericón probados se expresa actividad proliferativa a la concentración de 100 y 10 ug/mL (p>0.995)
B) ACTIVIDAD HEMATOPOYÉTICA DE H.perforatum SOBRE CÉLULAS DE BAZO Y MÉDULA ÓSEA En el Cuadro 2 se muestran los valores de las concentración celular de cultivos de médula ósea y bazo expuestos a H. perforatum
Especie
Presentación
Concentraciones probadas 100µg/mL 10 µg/mL 1µg/mL
Testigo DMSO 10%
Hypericum perforatum
TABLETA
7.40x104
6.78x104
6.09x104
4.53x104
CÁPSULA
7.75x104
7.46x104
6.96x104
4.53x104
Hypericum perforatum
TABLETA
9.96x104
6.96x104
8.43x104
3.93x104
CÁPSULA
8.68x104
5.58x104
5.31x104
3.93x104
Figura 2. Comparación de la actividad de la proliferación celular en cultivos expuestos a H. perforatum
CELULAS X104
25 20 15 10 5 0 100 ug/ml
10ug/ml
1ug/ml
DMSO
CONCENTRACION ug/mL H. perforatumTABLETA (BAZO)
H. perforatum CÁPSULA (BAZO)
H. Perforatum TABLETA (M. ÓSEA)
H. Perforatum CÁPSULA (M. ÓSEA )
La figura 2 permite determinar que H. Perforatum para ambas presentaciones en general, solo muestra actividad estimulante sobre las células de médula ósea (p>0.995) y a la concentración de 100 ug/mL en la presentación de tabletas. También hay que señalar que en la presentación de cápsulas solo hay actividad significativa a la concentración de 100 también en médula ósea ug/mL.
C) ACTIVIDAD HEMATOPOYETICA DE H. perforatum y T. lucida SOBRE CÉLULAS DE BAZO
En el cuadro 3 se muestran los valores de los incrementos con respecto al testigo de los cultivos expuestos a Tagetes lucida e Hypericum perforatum sobre células de bazo Especie
Presentación
Tagetes lucida
POLVO EXTRACTO ACUOSO
Hypericum perforatum
TABLETA
Concentraciones probadas 100µg/mL 10 µg/mL 1µg/mL 2.32 2.29 3.03 1.56 1.73 2.3
Testigo DMSO 10% 1 1
1.6
1.49
1.34
1
1.71
1.64
1.53
1
CÁPSULA
Figura 3. Efecto de Hypericum perforatum yTagetes lucida en la inducción de proliferación de células de bazo en cultivo
CÉLULAS X10 4
25 20 15 10 5 0 100 ug/ml
10ug/ml
1ug/ml
DMSO
CONCENTRACION EN ug/ml T.lucida POLVO
T. lucida DECOCCION
H. perforatumTABLETA
H. perforatum CÁPSULA
En la figura 3 se muestra claramente la actividad estimulante sobre células de bazo de T. lucida en comparación a la actividad presentada por el hipérico, la concentración máxima utilizada en esta prueba causa niveles de máxima proliferación, de 3.02 veces con respecto al testigo , mientras que en las cápsulas de la hierba de San Juan la proliferación solo es mayor 1.71 veces con respecto al testigo y a la concentración de 100 ug/mL aunque en ninguna de las dos presentaciones se presenta una actividad estadísticamente significativa.
A) ACTIVIDAD HEMATOPOYETICA EN CÉLULAS DE MEDULA ÓSEA
En el cuadro 4 se muestran los valores de las incrementos con respecto al testigo de cultivos expuestos a Tagetes lucida e Hypericum perforatum sobre células de médula ósea Especie
Presentación
Tagetes lucida
POLVO EXTRACTO ACUOSO
Hypericum perforatum
TABLETA
Concentraciones probadas 100µg/mL 10 µg/mL 1µg/mL 3.03 2.21 1.88
Testigo DMSO 10% 1
3.28
2.8
2.14
1
2.53
1.77
2.14
1
2.2
1.41
1.35
1
CÁPSULA
Figura 4. Actividad proliferativa de Hipericum perforatum yTagetes lucida sobre células de médula ósea en cultivo. 25
CÉLULAS X 10 4
20 15 10 5 0 100 ug/ml 10ug/ml 1ug/ml CONCENTRACION EN ug/ml T.lucida POLVO
T. lucida DECOCCIÓN
H. perforatumTABLETA
DMSO
H. perforatum CÁPSULA
En la figura 4 se muestran los resultados obtenidos en el cultivo de médula ósea, T. lucida nuevamente presenta un importante incremento de proliferación con respecto al hipérico, ambos frente al testigo. A la concentración de 100 ug/mL, la decocción de pericón es 3.28 veces más que el testigo e hipérico en tabletas registra un aumento de 2.53 , además hay que señalar que esta actividad de la hierba se San Juan solo es significativa a una concentración de 100ug/mL
DISCUSION De los resultados obtenidos se puede decir que el polvo de Tagetes lucida presenta actividad mitógena sobre células de bazo y en médula ósea, lo que indica una probable actividad estimulante en el sistema hematopoyético y quizá tenga la capacidad de inducir la producción linfocitos los que se encuentran ligados a la respuesta inmune específica, ese efecto observado puede ser el causante de las propiedades medicinales que se le atribuyen (antiparasitario, antimicrobiano, antimicótico, relajante). Por otra parte, la decocción de T. lucida tuvo su efecto estimulante a la concentración de 100 y 10 ug/ml en médula ósea, lo que muestra diferencias entre los materiales probados de pericón, es decir que la decocción de pericón presenta una aparente pérdida de actividad proliferativa, sin embargo, es importante mencionar que la gente la utiliza en forma de infusión pero no como material en polvo, de lo que se deduce que aún con esa pérdida aparente de actividad se podría asegurar que la manera como se ingiere permite conservar algunas de sus propiedades medicinales. Aunque se podría considerar que las concentraciones utilizadas en este experimento para ambas plantas no son relativamente significativas , la concentración de 100 ug/mL comparada con una dosis de 250 mg parecería ser inespecífica, sin embargo, si se ingiere una tableta o cápsula de esta planta a esa dosis equivaldría a 38 ug de la droga por ml de sangre, por lo tanto la concentración de 100 ug es tres veces mayor que una dosis normal A pesar de que no se ha registrado en la literatura etnobotánica que T. lucida presente propiedades estimulantes de las defensa, a partir de los resultados obtenidos quizá puedan existir compuestos que actúen como aceleradores de la división celular en el bazo. Debido a que esta propiedad no se pude atribuir a que existió una transformación de los compuestos de la planta al ser calentada, pues el material preparado de polvo de pericón es quien exhibe fuertemente la capacidad de proliferación. Considerando los propiedades que se le atribuyen a Hypericum perforatum, por ejemplo el uso de la hipericina como medicamento adjunto en pacientes con VIH , SIDA y enfermedades reumáticas, se esperaba que en cultivo de bazo se encontrara un efecto mitógenico para linfocitos, sin embargo, las presentaciones farmacéuticas empleadas no muestran actividad ni para células hematopoyéticas ni para células del sistema inmune, es decir que los resultados obtenidos no permitieron validar el conocimiento popular de que Hypericum perforatum sea una planta con propiedades estimuladoras de las células hematopoyeticas, aunque se debe considerar que en el presente estudio no se trabajó con la planta en su forma natural y se desconoce si los preparados de hipérico sean de la planta completa, hojas, tallos o raíces , la época de recolección de la planta y la forma en que fue procesada por lo que no se puede decir que se trabajó con preparaciones equivalentes de ambas plantas.
CONCLUSIONES
La planta completa de T. lucida tiene una actividad inductora de la proliferación sobre las células de bazo en cultivo en todas las concentraciones probadas , mientras que en las células de médula ósea solo a las concentraciones de 100 y 10 ug/mL
La decocción
de T. lucida a la concentración presentó una actividad significativa de la
proliferación en células en cultivo a los 100 y 10 ug/mL
La presentación farmacéutica de Hypericum perforatum
en forma de tabletas
presentó
actividad inductora de proliferación en células de bazo a la concentración de 100 ug/ mL.
Las presentaciones comerciales probadas de hipérico en forma de tabletas y cápsulas no validan su uso popular como inmunoestimulante
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