UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA IZTAPALAPA TRABAJO DE INVESTIGACIÓN:

EFECTO DE LA NORETISTERONA Y DE SUS METABOLITOS REDUCIDOS SOBRE LA CAPACIDAD FERTILIZANTE DE LOS OVOCITOS DE RATÓN. LUGAR DE REALIZACIÓN:

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR. INSTITUTO NACIONAL DE PERINATOLOGÍA. PRESENTA:

PAOLA BANESSA DÍAZ CERVANTES. MATRICULA:

97335376 ASESORES: BIO. EXP. HÉCTOR FLORES HERRERA DR. PABLO DAMIÁN MATSUMURA

FIRMA DE LOS ASESORES

11 DE JUNIO DEL 2003

INDICE

Introducción................................................................................................

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Antecedentes..............................................................................................

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Hipótesis...................................................................................................

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Objetivo....................................................................................................

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Material y Método..................................................................................

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Resultados..............................................................................................

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Discusiones............................................................................................

27

Bibliografía..........................................................................................

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TITULO DEL PROYECTO

EFECTO

DE

METABOLITOS

LA

NORETISTERONA

REDUCIDOS

(NET)

SOBRE

LA

Y

DE

SUS

CAPACIDAD

FERTILIZANTE DE LOS OVOCITOS DE RATÓN.

INTRODUCCIÓN

El proceso de fecundación en los mamíferos puede definirse como una secuencia de acontecimientos celulares y moleculares coordinados en los que participan los gametos masculinos (espermatozoide) y femeninos (ovocito). Consiste en la fusión y penetración de un espermatozoide en un ovocito y finaliza con la primera división normal del cigoto. Para que este proceso natural se pueda llevar a cabo con éxito, es necesario que ambos gametos hayan llevado a cabo el proceso de maduración antes de ponerse en contacto, este proceso tiene como finalidad la preservación de la especie (Buch, 1999).

A pesar de que la fecundación es uno de los procesos indispensables para la preservación de la especie uno de los problemas más complejos en la

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actualidad es la sobrepoblación, especialmente en los países en desarrollo, en donde se incluye México, cuya tasa de natalidad sigue siendo alta (PérezPalacios y cols., 1987) a pesar de que se han implementado importantes campañas para promover la planificación familiar, desafortunadamente las tasas de nacimiento, han bajado a un ritmo menor al esperado (Rosenfield A. y Fathalla M., 1994).

Los métodos anticonceptivos se pueden dividen en dos grandes grupos: mecánicos y hormonales, que se usan solos o en combinación. Dentro del primer grupo tenemos a los anillos vaginales, dispositivos intrauterinos (DIU’s), espermaticidas, espumas, condón, diafragmas y tapón cervical, mientras que en el grupo de los anticonceptivos hormonales se encuentran los orales,

píldoras,

inyectables

e

implantes

subdérmicos

(fíg.1).

Las

formulaciones orales por lo general presentan un componente estrogénico y un componente progestacional, el cual es una progestina sintética (Rosenfield A. y Fathalla M., 1994) cuyo mecanismo de acción radica en la supresión de la secreción preovulatoria de LH y FSH y por lo tanto inhibe la ovulación eficazmente (Rudel, HW., 1967).

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Fig.1. Muestra algunas de las presentaciones de los métodos anticonceptivos.

De acuerdo a la estructura química las progestinas sintéticas se han clasificado en dos grupos: las que derivan de la l7-hidroxi-progesterona y aquellas que derivan de la l9-nortestosterona.(Pérez-Palacios y cols, 1981).

La Noretisterona (NET); 17α- etinil- 17ßhidroxi- 4 estrene- 3 ona), es una progestina sintetica de la serie 19-nortestosterona que presenta

la

incorporación de un grupo etinilo en el C 17, con ordenación alfa, lo que genera que pierda la actividad androgénica y adopte una actividad progestacional (Pérez-Palacios y col., 1991). Esta progestina sintética fue producida en la ciudad de México en 1951, obra de tres distinguidos investigadores, los doctores Jorge Rosenkranz, Luis Ernesto Miramontes y Carl Djerassi (Lemus, y cols., 1998).

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A partir de su síntesis, NET ha sido la progestina sintética más empleada en formulaciones anticonceptivas hormonales orales, inyectables y subdérmicas. A través del uso clínico de NET y de estudios

experimentales, se han

acumulado evidencias que indican que además del potente efecto progestacional, la NET es capaz de producir, después de su administración efectos estrogénicos, androgénicos

en diferentes especies de mamíferos,

incluyendo al humano (Pérez- Palacios y cols., 1981).

La Noretisterona puede sufrir biotransformaciones en órganos blancos como útero, hipotálamo, hipófisis anterior y próstata ventral de rata (Larrea, et. Al., 1987). Estas biotransformaciones son debidas a la reducción en el anillo A, de dicho compuesto, pasando de NET a 5α-dihidroNET (5α-NET), 3β,5α tetrahidroNET (3β,5α-NET) y 5α,3α-tetrahidroNET (5α, 3 α-NET) (Chávez y cols., 1985).

El efecto anticonceptivo de NET se ejerce en la unidad hipotálamo- hipófisis en donde inhibe la ovulación al evitar la liberación cíclica de gonadotropinas hipofisiarias. Por otro lado posee un efecto directo sobre el endometrio, debido a que durante la terapia con este compuesto se origina un desequilibrio en los niveles hormonales de estrógenos- progesterona, en consecuencia se

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afecta el crecimiento y maduración idónea del endometrio (Goebelsman y cols., 1979).

Flores y colaboradores (1999) han observado que al incubar a los espermatozoide de ratón previamente capacitados, con 5α- NET se inhibe la reacción acrosomal (RA); mientras que la incubación simultánea con Progesterona y 5α- NET reduce el porcentaje de gametos reaccionados y este efecto está en función de la dosis de 5α- NET, efecto que no es revertido por la progesterona. Estos mismos autores observaron que al incubar a los ovocitos fertilizados en presencia de 5α- NET se ocasionan daños en su desarrollo hasta la etapa de mórula (Flores y cols.,1999), sin embargo, no se conoce si dicho compuesto afecta la integridad del ovocito o la madurez del mismo, la cual se alcanza dentro del folículo.

Al ser liberados del folículo, los ovocitos lo hacen rodeados de un complejo de células, denominado células cúmulo que son importantes ya que sin éstas el esperma no podría penetrar el óvulo y por lo tanto además la fecundación no se podría llevar a cabo (Fig.2), sin embargo, estas capas de células cúmulo están fuertemente compactadas a su alrededor, por lo que se comportan como barreras selectivas que dificultan a la mayoría de los espermatozoides a que

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alcancen las membranas del óvulo y evitar la polispermia. Además, los óvulos inmaduros no pueden ser fertilizados adecuadamente hasta que alcanzan la madurez final y el indicador de la madurez del óvulo es la presencia del "cuerpo polar", el cual se visualiza como una pequeña célula que sobresale del óvulo primario, liberando así la mitad de su carga genética (cromosomas), lo que le permitirá al esperma aportar la carga genética faltante, indispensable para un desarrollo embrionario normal (Burks y cols., 1995). Cuerpo Polar

Células Cúmulo

Fig.2- Muestra la estructura de un ovocito maduro.

ANTECEDENTES

Los estudios realizados para esclarecer el modo de acción de Noretisterona han demostrado que la biotransformación de este compuesto, a nivel de los

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órganos blanco, modula la expresión de sus diferentes actividades biológicas, ya que sus productos de transformación metabólica interactúan con los diferentes

receptores

intracelulares

y

esto

se

debe

a

que

estas

biotransformaciones le confieren al compuesto 5α reducido (5α−NET) afinidad por los receptores intracelulares de progesterona (RP) y andrógenos (RA) con

constantes de afinidad de 2.6 x 10-7M y 1.0 x 10-8M

respectivamente

(Chávez

y

cols.,

1985),

además

de

los

efectos

antiprogestacionales (Pérez-Palacios y cols., 1991). Mientras que los metabolitos tetrahidro-reducidos (3α, 5α− y 3ß, 5α- NET) presentan afinidad por los receptores a estrógenos (RE), (Chávez y cols., 1985) confiriéndoles efectos estrogénicos (Larrea y cols., 1987).

5α- Esteroide reductasa

3β- Esteroide deshidrogenasa

Fig.2: Muestra la estructura química de la NET y sus metabolitos 5α reducido.

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Castro y colaboradores (1995) demostraron que al administrar NET en dosis altas (5mg/kg) a conejas gestantes, se reduce la expresión del gene de la uteroglobina (UTG; proteína que es regulada por progesterona), la implantación del ovocito fecundado y el factor temprano de embarazo (FET). Claros ejemplos de efectos antiprogestacionales, por otro lado, al administrar 5α- NET a dosis menores (1.5mg/kg) se produce el mismo efecto antiimplantación, la inhibición en la síntesis del FET y de UTG, así como de su mRNA, en una magnitud similar al encontrado con RU-486, componente antiprogestacional muy potente (Castro y cols., 1995).

En cuanto al efecto de la NET y de su metabolitos reducidos sobre los espermatozoides capacitados de ratón, se observó que al incubarlos en presencia de 5α- NET no se induce la reacción acrosomal (RA), mientras que la incubación simultánea con Progesterona y 5α- NET reduce el porcentaje de gametos reaccionados en un efecto dependiente de la dosis. Dado que la RA es un paso importante para la fertilización y como la 5α- NET reduce el porcentaje de los espermatozoides reaccionados, se estudio la capacidad fertilizante de los mismos tratados con 5α- NET y se encontró que la adición de este compuesto reduce la proporción de los ovocitos fertilizados en forma dependiente de la dosis.

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Flores y colaboradores (1999), han observado que al incubar a los ovocitos fertilizados en presencia de 5α- NET se ocasionan daños en el desarrollo hasta la etapa de mórula, los cuales se caracterizan por la falta de unión entre los blastómeros, la pérdida de integridad de sus membranas, así como una reducción en el tamaño de sus blastómeros, a diferencia del grupo que recibió progesterona que se desarrollaron de manera normal. Durante este estudio no se exploró la posibilidad de que la NET y sus metabolitos afectan en la capacidad fertilizante de los ovocitos, por lo que en el presente trabajo se quiere determinó si NET y su 5α NET puede interaccionar con los ovocitos, alterando su capacidad de ser fertilizado y el papel que tienen las células cúmulo en la interacción con 5α NET fertilización.

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y sobre el porcentaje de

HIPOTESIS: El compuesto 5α-NET reduce el porcentaje de fertilización y las células cúmulo juegan un papel importante en este proceso .

OBJETIVO GENERAL: Determinar la capacidad antifertilizante de 5α NET y el papel de las células cúmulo en el porcentaje de fertilización de los óvulos de ratón.

OBJETIVOS PARTICULARES: 1) Analizar la capacidad de 5α−NET para inhibir el porcentaje de fertilización en óvulos. 2) Evaluar el efecto de las células cúmulo en la capacidad antifertilizante de 5α−NET. 3) Determinar la interacción de 5α−NET con proteínas de membrana que unen a P4.

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MATERIAL Y MÉTODO Esteroides Noretisterona y sus metabolitos fueron proporcionados por el Dr. Gustavo García de la Mora de la Facultad de Química, UNAM.

Animales: Se utilizaron ratones hembras de la cepa Balb/c de 12-16 semanas de edad y ratones machos de la cepa C57bl/6j de 16 semanas de edad. Estos animales se mantuvieron a temperatura ( 22 ± 1ºC ) y humedad ( 55 ± 5 % ) constantes, agua y comida ad libitum y con ciclos de luz / oscuridad de 12/12 horas.

Obtención de los espermatozoides: Con la finalidad de extraer los espermatozoides, ratones machos fueron sacrificados por dislocación cervical. Se disectó el epidídimo y se depositó en el medio Tyrode (T6) compuesto de NaCl 124.5 mM, KCl 2.6 mM, MgCl2 0.49 mM, NaH2PO4 0.39 mM, glucosa 5.5 mM, NaHCO3 25.0 mM, CaCl2 1.7 mM a un pH 7.2 y suplementado con 0.4 g/100 ml de albúmina de suero de bovino. Posteriormente los espermatozoides fueron incubados en este medio

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para su capacitación por 90 minutos a 37 °C, en una atmósfera de 5 % CO2 y 95 % aire (Mann, 1988; Eppig, 1995).

Obtención de los ovocitos A las ratones hembras se les administró intraperitonealmente 5 UI de PMSG (Intevert International B.V boxmeer-Holland). Después de 48 horas se les inyectaron 5 UI de hCG (Hoechst Marion Roussel) y se sacrificaron por dislocación cervical 19 horas después de la ultima inyección para obtener los ovocitos, la región del ovario-oviducto fue disectada y transferida al medio T6-BSA. Posteriormente, con la ayuda de un microscopio de disección 16 X (Zeiss) se localizó en el ámpula al complejo de los ovocitos-células cúmulo y fue puncionada una aguja de insulina para permitir la salida de estos. Este complejo fue aspirado por medio de una pipeta Pasteur adelgazada de la punta y los ovocitos se incubaron en medio T6-BSA por 30 minutos. La eliminación de las células cúmulo se realizó mediante el desacoplamiento de las mismas con Hialuronidasa (1 µg/ml). Los ovocitos con y sin células recibieron los siguientes tratamientos durante una hora:

Tabla1 : Tratamiento a los que fueron sometidos los ovocitos por un periodo de 60 minutos.

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GRUPO

TRATAMIENTO

vehículo

T6-BSA (500 µl)

vehículo

ETOH (5.5%) (10-5M - 500 µl)

Testigo positivo

Progesterona (P4) (10-5M – 500 µl)-

Muestra problema

Noretisterona (NET 1x10-3 M) Distintas concentraciones de 5α−NET

Muestra problema

( 1X10-5 a 1X10-12M) – 500 µl Distintas concentraciones de P4

Muestra problema

P4 (1x10-5M a 1x10-12M) + 5α-NET (1x10-5M) – 500 µl

Testigo negativo

RU-486 (1x10-5M) – 500 µl

Concluido el tiempo de incubación se adicionaron los espermatozoides, previamente capacitados (1 X 106 espermatozoides/ ml), para que se lleve a cabo la fertilización in vitro durante un lapso de 90 minutos (Eppig, 1995). Al término de este período los ovocitos fueron lavados con el medio T6-BSA y se transfirieron al medio M16 – BSA que contiene NaCl 94.7 mM, KCl 4.7 mM, KH2PO4 1.19 mM, MgSO4 1.18 mM, lactato de sodio 0.011 mM, glucosa 5.5 mM, penicilina 200 unidades / ml, estreptomicina 200 µg / ml, NaHCO3 25.0

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mM, y ácido pirúvico 0.036 mM ajustado a un pH de 7.2 y suplementado con 0.4% BSA

(M16-BSA). Después de 15 horas de exposición a los

espermatozoides se contó el porcentaje de los ovocitos que se desarrollaron hasta una etapa de 2 células, el cuál fue utilizado como índice de fertilización (Mann, 1988).

Evaluación de la Viabilidad Tanto a los ovocitos sin fertilizar como los fertilizados (caracterizados por su desarrollo hasta en el estadio de 2 células) se transfirieron al medio T6 ajustado a un pH de 2.5 por 10 minutos con la finalidad de eliminar la zona pelúcida (ZP). Posteriormente los ovocitos libres de la ZP se incubaron por 10 minutos con azul tripano al 1%. Concluido este tiempo se colocaron en medio T6 y se contó el número total de los ovocitos viables y no viables, donde las células muertas incorporan el azul tripano al citoplasma por difusión pasiva y los viables lo eliminan por transporte activo (Hutz, 1985).

Unión a Proteínas de Membrana Los ovocitos tanto en presencia como en ausencia de células cúmulo se colocaron en portaobjetos los cuales contenía 5µl de formaldehído, dejándose secar a temperatura ambiente por 30minutos, concluido este tiempo se les 17

adicionó 5µl de PBS con la finalidad de lavar los ovocitos, posteriormente se sometieron a los siguientes tratamientos:

GRUPO

TRATAMIENTO

Control

P4-BSA-ITFC

Muestra problema

P4 (1X10-3M- 1X10-5M) + P4-BSAITFC

Muestra problema

5α-NET (1X10-3M- 1X10-5M) + P4BSA-ITFC

Después de 30minutos se visualizaron en un microscopio de fluorescencia, con la finalidad de observar si nuestros compuestos interaccionaban con proteínas membranales.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO: Se utilizó la prueba de ANOVA (análisis de varianza). Cabe destacar que se manejo por cada grupo una n total de 75.

RESULTADOS Al incubar a los ovocitos con P4, tanto en presencia de células cúmulo como en ausencia de estas, ( de 73.7% y 76.2% respectivamente), se aprecia un

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incrementó significativo en el porcentaje de fertilización en comparación con T6-BSA (con células 48.6% y 57.2% sin células) y ETOH (con células 47.2% con células y 52.2% sin células). Sin embargo al incubar a los ovocitos con NET (82.8% con células cúmulo y 85.3% sin células cúmulo) se aprecia un incremento en el porcentaje de fertilización mayor que el observado con progesterona . También se puede observar que el porcentaje de fertilización en presencia de células cúmulo es ligeramente menor, esto en comparación con

% Fertilización

los ovocitos que presentan células cúmulo (gráfica 1).

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

a b

a

b Con células sin células

T6

ETOH

P4

NET

Tratamiento

X + DE p