UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA

UNIDAD IZTAPALAPA

DIVISIÓN DE CIENCIAS DE LA SALUD

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD HEMATOPOYÉTICA

DE Plantago

major EN CULTIVO DE CÉLULAS DE BAZO DE RATÓN EN MEDIOS LIBRES DE SUERO.

PASANTE DE BIOLOGÍA EXPERIMENTAL OCTAVIO GODÍNEZ MARAVILLA

MÉXICO. D. F. Noviembre de 2003

1

EL PRESENTE TRABAJO SE REALIZÓ EN EL LABORATORIO DE HEMATOLOGÍA EXPERIMENTAL, BAJO LA ASESORÍA DEL DR. RODOLFO VELASCO LEZAMA Y LA Q.B.P. RAFAELA TAPIA AGUILAR.

2

A MIS PADRES: MARIO GODÍNEZ RODRÍGUEZ GRACIELA MARAVILLA SÁNCHEZ

A MIS AMIGOS: ARMANDO, RAÚL, ISAAC, JUAN CARLOS, LORENA Y JAIME.

POR SU TOTAL APOYO.

GRACIAS.

3

CONTENIDO.

MARCO TEÓRICO.

5

ANTECEDENTES.

11

JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO.

15

OBJETIVO GENERAL.

16

OBJETIVOS ESPECÍFICOS.

16

HIPÓTESIS.

17

METODOLOGÍA.

18

RESULTADOS.

23

DISCUSIÓN.

26

CONCLUSIONES.

29

BIBLIOGRAFÍA.

30

4

MARCO TEÓRICO.

La sangre, es un tejido formado por componentes celulares y no celulares. Los cambios en los constituyentes de la sangre, reflejan los cambios corporales incluyendo los estados de enfermedad. La sangre contiene muchas de las células y moléculas implicadas en la respuesta inmune (Brock, 1998). La mayoría de las células de la sangre son los eritrocitos, células carentes de núcleo cuya función es el intercambio gaseoso. Otros son los leucocitos, en los que se incluyen a los polimorfonucleares (fagocitos), los eosinófilos y basófilos que participan en reacciones de hipersensibilidad (alergias), los monocitos, y linfocitos que participan en la producción de anticuerpos y en la inmunidad celular. Las plaquetas son otro de los constituyentes de la sangre; su papel está orientado a impedir la pérdida de sangre, promoviendo la coagulación sanguínea.

Las células sanguíneas tienen su origen en la médula ósea; al proceso mediante el cual se forman estas se le denomina hematopoyesis (Hoffbrand y Pettit, 1993). En este proceso, la diferenciación origina células maduras en grandes cantidades (Figura 1), lo cual está modulado por un grupo de moléculas denominadas genéricamente citocinas (Brock, 1998).

Existe otro sistema similar al sanguíneo, denominado linfatico, cuyo líquido es similar en composición a la sangre, pero carente de eritrocitos.

5

Figura 1

CÉLULA TALLO TOTIPOTENCIAL

CÉLULA TRONCO LINFOIDE (UFCL - BT

SCF

CÉLULA MULTIPOTENCIAL RESTRINGIDA (UFC - GEMMeg) M IL-3, IL-6 TPO

UFB - E

UFC - LT

UFB - Meg

MIELOBLASTO

E R I T R O P O Y E T I N A

ERITROBLASTO

ERITROBLASTO BASÓFILO

ERITROBLASTO POLICROMÁTICO

T R O M B O P O Y E T I N A

UFC-M

IL-3

UFC - Meg

UFC-Eritro

É

UFC - GM

UFC-G

LINFOBLASTO

UFC - LB

UFB - EMeg

D U

F E C G M

L MONOBLASTO

A

PROMEGACARIOBLASTO

Ó

PROMIELOCITO

S

MEGACARIOBLASTO MIELOCITO BASÓFILO

MIELOCITO EOSINÓFILO

MIELOCITO NEUTRÓFILO

E

F E C M

A

PROMONOCITO

PROMEGACARIOCITO ERITROBLASTO ORTOCROMÁTICO

METAMIELOCITO BASÓFILO

METAMIELOCITO EOSINÓFILO

NEUTRÓFILO META

NORMOCITO MEGACARIOCITO

LINFOCITO B

LINFOCITO T

RETICULOCITO

BASÓFILO

EOSINÓFILO NEUTRÓFILO BANDA

LINFOCITO T COOPERADOR

MONOCITO

PLAQUETAS

LINFOCITO T SUPRESOR

ERITROCITO

CÉLULA PLASMÁTICA

UFB= Unidad Formadora de Células en Brote, UFC= Unidad Formadora de Colonias, SCF= Factor Estimulante de Células Tallo, FEC= Factor Estimulante de Colonias de (GM) Granulocitos/Monocitos, (M), IL= Interleucina, EPO= Eritropoyetina, TPO= Trombopoyetina

CÉLULA CEBADA

POZA DE CÉLULAS COMPROMETIDAS O COMISIONADAS ALTAMENTE REPLICATIVAS POZA DE CÉLULAS MADURANTES SIN POTENCIALIDAD Y CAPACIDAD DE REPLICACIÓN LIMITADA

NEUTRÓFILO SEGMENTADO

MACRÓFAGO

S A N G R E

Una característica importante del sistema linfático es que está conectado a estructuras

linfáticas

(ganglios)

y

órganos

linfoides,

cuya

función

radica

principalmente en permitir la maduración de ciertos tipos celulares; el timo es el órgano donde maduran los linfocitos T.

Otro órgano linfoide es el bazo, el cual actúa como un filtro; su función consiste en retener partículas y desechos celulares que lleva el torrente sanguíneo, capta los antígenos y puede ser sitio de reacciones inmunitarias de tipo B o T. En algunos invertebrados, el sistema linfático interviene además en la formación de granulocitos, eritrocitos y plaquetas (Batch, 1984).

El sistema hematopoyético puede manifestar una serie de alteraciones, los cuales afectan la homeostasis del organismo provocando enfermedades como las anemias y las leucemias. Este tipo de problemas ha llevado a investigar y desarrollar tratamientos ya sea para su cura o control. Para el caso concreto de la restauración de la hematopoyesis, en pacientes con anemia aplástica, se administran los siguientes tratamientos, dependiendo del curso de la enfermedad y reacción del paciente: -

Andrógenos: testosterona, oximetolona, fluoximesterona y nandrolona.

-

Glucocorticoides: metilprednisolona.

-

Litio.

-

Inmunosupresores: ciclosporina A, ciclofosfamida, globulina antilinfocitaria y globulina antitimocitaria. 7

-

Reguladores hematopoyéticos de acción positiva: Interleucinas, factor estimulante de colonias de granulocitos (CSF-G), factor estimulante de colonias de macrófagos (CSF-M) y factor estimulante de granulocitos y macrófagos (FEC-GM), eritropoyetina (EPO) y trombopoyetina (TPO).

-

Transplante de médula ósea (Muñoz, 2001).

Sin embargo, excepto el último, ofrecen por si solos una alternativa de restauración

definitiva

de

la

hematopoyesis,

ya

que

pueden

causar

hepatotoxicidad, nefropatía e hipertensión arterial, por mencionar algunas (Muñoz, 2001). Además, estos tratamientos no siempre son del todo exitosos. El transplante de médula ósea es el tratamiento más exitoso, sin embargo por su costo es prácticamente inaccesible para la mayoría de los pacientes de países en vías de desarrollo, razones por las que se buscan alternativas terapéuticas para estos padecimientos, lo cual ha llevado al uso de plantas con propiedades restauradoras de la hematopoyesis.

El empleo de las plantas medicinales con fines curativos es una práctica que se ha utilizado desde tiempo inmemorial. Durante mucho tiempo los remedios naturales, y sobre todo las plantas medicinales fueron el principal recurso del que disponían los médicos. Esto permitió que se profundizara en el conocimiento de las especies vegetales con propiedades medicinales y el empleo de los productos que de ellas se extraen.

8

La fitoterapia, nombre que se aplica al uso medicinal de las plantas, nunca ha dejado de tener vigencia. Muchas de las especies vegetales curativas entre los antiguos egipcios, griegos y romanos pasaron a formar parte de la farmacopea medieval, que más tarde se vio enriquecida por el aporte de los conocimientos de las culturas americanas. Dichas plantas medicinales y algunos remedios que entonces utilizaban se siguen usando hoy en día.

Por otra parte, la evaluación de las propiedades curativas de alguna planta no siempre puede ser por medio de la administración a seres humanos, por lo que se tiene que recurrir a otros seres vivos, para conocer las propiedades terapéuticas que pudieran tener las plantas. Para este caso, se emplean: Ratones, ratas, conejos, hámsteres, etc o el cultivo de células de las especies mencionadas. Para poder tener un crecimiento en estas condiciones, es necesario imitar el entorno celular. Así pues, los sistemas de cultivo están diseñados para imitar las condiciones in vivo. De esta manera se han empleado medios de cultivo complementados con suero sanguíneo como fuente nutricional o extractos de órganos animales. Los medios de cultivo que se utilizan hoy en día incluyen una mezcla compleja de carbohidratos, aminoácidos, sales, vitaminas, hormonas y factores de crecimiento y en la mayoría de los casos es necesario adicionar suero sanguíneo cuyo empleo tiene ciertas desventajas como: 1. Químicamente es una mezcla indefinida en la que puede haber variaciones entre diversos lotes, provocando variaciones en los resultados 2. Los suplementos de sueros son costosos (Smith, 1998). 9

Por estos motivos se han hecho esfuerzos considerables para establecer medios de cultivo libres de suero, los cuales presentan ciertas ventajas: 1. Carecen de factores citostáticos como la hidrocortisona, que limitan el crecimiento celular 2. No hay contaminación por virus o micoplasmas, los cuales pueden estar presentes en los lotes de suero empleado, 3. Es posible recobrar algún o algunos productos del metabolismo celular liberados al medio de cultivo para su estudio posterior (Freshney, 1994).

Como información previa para la formulación de medios libres de suero en el presente trabajo, se consideró el realizado por Iscove y Gilbert, quienes cultivaron células hematopoyéticas remplazando el suero por selenito de sodio, transferrina, albúmina y lecitina, como principales sustitutos y demostrando que la combinación de estas sustancias favorecía el crecimiento de células de bazo para la producción de factores estimulantes de colonias de granulocitos /macrófagos y eritrocitos,

sin necesidad de agregar suero sanguíneo (Iscove y

Guilbert, 1976).

Para desarrollar nuestro trabajo se realizó una revisión sobre el uso de medios libres de suero para el cultivo de células hematopoyéticas (Sandstrom et al., 1993) y se consideró el trabajo de Velasco (1992), quien diseñó un sistema de cultivo para la producción, aislamiento y caracterización del factor estimulante de colonias de megacariocitos in vitro.

10

ANTECEDENTES.

El uso de plantas con propiedades medicinales, ha tenido una gran tradición, ya que este ha sido transmitido de generación en generación, ya sea de forma oral o escrita. El uso de plantas para curar alguna enfermedad, está bastante

extendido

en

México.

Sin

embargo,

al

carecerse

de

estudios

farmacológicos que apoyen dicha actividad, estos recursos en ocasiones han quedado en entre dicho. A pesar de ello, se ha conseguido despertar un interés en cuanto a las propiedades curativas que puedan tener las plantas.

Sin embargo, algunas se han usado tradicionalmente en la restauración de la

hematopoyesis,

entre

ellas:

el

muicle

(Justicia

spicigera),

manrubio

(Manrubium vulgare), zarzaparrilla (Smilax aristolochiaefolia), nogal (Juglans regia), hierba de San Juan (Hypericum perforatum), llantén (Plantago major) y sosa (Solanum torvum) (Argueta et al., 1994). De entre ellas se seleccionó Plantago major para la realización de este estudio, debido a que es una planta frecuentemente

utilizada

para

el

tratamiento

de

la

anemia

y

de

inmunodeficiencias como la ocasionada por el virus de la inmunodeficiencia humana, esto es, la estimulación de los sistemas hematopoyéticos e inmune.

Como antecedente inmediato de las propiedades hematopoyéticas de P. major

se

tiene

el

realizado

por

Mora

y

colaboradores

(1998),

quienes

determinaron el efecto del extracto metanólico de Plantago major, en la 11

proliferación de células hematopoyéticas in vivo e in vitro. En dicho estudio se reportó que el llantén en concentraciones de 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005 g/mL del extracto, estimula la proliferación de células de médula ósea de ratón, lo cual fue corroborado por Velasco y colaboradores, quienes reportan que los extractos acuoso y metanólico de las partes aéreas de P. major estimulan la proliferación in vitro de células del bazo y de la médula ósea de ratones sanos (Velasco et al., 2002).

Plantago major (Plantaginaceae) es una planta anual o perenne de 10 a 30 cm. de altura, tiene hojas ovales que surgen desde el nivel del suelo, forman una roseta y envuelven parte del tallo. Presenta flores pequeñas de color blancoverdoso acomodadas en una espiga larga, dando la apariencia de una mazorca delgada. Las semillas son pequeñas y ovales (0.4-0-8 x 0.8-1.5), de sabor ligeramente amargo, están localizadas en cápsulas (8-16 por cápsula), en el ambiente húmedo se hidratan, se hacen pegajosas y se adhieren a los animales y al hombre lo que facilita su distribución (Figura 2).

12

Figura 2. Hojas y espigas de Plantago major. Esta planta es originaria del norte de Europa y Centro de Asia y está distribuida a nivel mundial, crece en forma silvestre en clima cálido, semicálido y templado desde el nivel del mar hasta los 3500 m de altitud (Márquez y Esquivel, 1999). Popularmente se emplea como antiinflamatorio, analgésico, antifúngico, antibacteriano, antigiardiásico y antitumoral; se aplica para quitar manchas en la piel (Márquez y Esquivel, 1999). También se ha reportado con actividad inmunomoduladora sobre los neutrófilos (Samuelsen, 2000).

Los estudio fitoquímicos de Plantago major, han reportado la distribución de 14 iridoides (como la aucubina) en 14 especies de Plantago, lo cual ha servido para su clasificación filogenético-evolutiva (Tuscova et al., 2002; Sampaio-Santos y Kaplan, 2001). Contiene además, taninos, ácidos grasos, plantagósidos, alcaloides monoterpénicos y flavonoides (Samuelsen, 2000).

13

Para la formulación de los medios usados en este estudio, se consideraron como punto de partida los trabajos de Iscove y Gilbert (1976) y Nakeff y Velasco, (1981).

14

JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO.

El llantén es una planta que ha sido estudiada extensamente, sin embargo los trabajos referentes a su actividad hematopoyética son escasos, y en cuanto a las sustancias que pueden influir en la proliferación de células de este tipo no se conoce aún ningún trabajo al respecto, por lo que el propósito del presente, es conocer el papel que tiene la planta en la proliferación de células de bazo (linfocitos). También se quiere conocer si el extracto acuoso además de estimular la proliferación de estas células, las capacita para la producción y liberación de citocinas al medio, lo que sugeriría un papel inmunoestimulante de la planta.

15

Objetivo General.

•

Establecer las condiciones de cultivo que apoyen la actividad hematopoyética de Plantago major en cultivos de células de bazo de ratón en sistemas libres de suero.

Objetivos Específicos.

•

Obtener un extracto acuoso de las partes aéreas de Plantago major.

•

Comprobar la capacidad de Plantago major para estimular la proliferación de células de bazo de ratón en medios con suero y en medios libres de suero.

•

Preparar medios condicionados del bazo de ratón en medios de cultivo con suero y en medios libres de suero.

•

Determinar el efecto que tiene el medio condicionado, sobre la proliferación en células de bazo de ratón cultivadas en medios libres de suero y en ausencia del extracto de prueba.

16

HIPÓTESIS.

Considerando que Plantago major estimula la proliferación de células de bazo de ratón en cultivos con suero sanguíneo y que existen medios sustitutos libres de suero que favorecen el cultivo de estas células, la adición de un extracto acuoso de Plantago major en un medio libre de suero deberá estimular la proliferación de las células en cultivo.

17

METODOLOGÍA.

Preparación del extracto de P. major Se adquirió la planta en el mercado de Sonora de la ciudad de México, se separó un ejemplar para su identificación (estudio realizado previamente), los ejemplares restantes se dejaron secar a temperatura ambiente protegidos de la luz solar directa y del polvo. Se molieron las partes aéreas de la planta hasta obtener un polvo fino. Se preparó una decocción colocando 200 g del polvo en 2.5 L de agua caliente (90ºC) manteniéndose en ebullición durante 15 minutos. Posteriormente, el extracto se filtró, se eliminó el agua por evaporación y liofilización; el material obtenido se guardó en congelación. A partir del liofilizado, se preparó una disolución acuosa de 0.2 g/mL, se esterilizó por filtración con membranas Millipore de 0.8 a 0.2 µm y se distribuyó en viales.

Selección del lote de suero de trabajo. El paso siguiente fue hacer un cultivo de células de bazo de ratón para comprobar la actividad hematopoyética del extracto preparado, ensayando con cuatro diferentes lotes de suero, con el objeto de seleccionar el que proporcionara las mejores condiciones de cultivo. Los sueros utilizados fueron: A (suero de ternera neonato, In vitro, lote 011101), B (suero de ternera neonato, In vitro, lote 020203), C (suero de caballo, Microlab, lote M-9219) y D (suero de caballo, In vitro, lote 021053). Los sueros fueron inactivados mediante calentamiento en baño de agua a 560 C, durante 30 minutos. 18

Ensayos de actividad hematopoyética. Se utilizaron ratones machos de la cepa CD1 de 8 a 12 semanas de edad, procediendo de la siguiente manera. En cada ensayo se sacrificó un ratón por dislocación cervical, se hizo la disección de la cavidad abdominal en condiciones de esterilidad, se extrajo el bazo y se pasaron 3 ml de Medio RPMI-1640 por su interior mediante una jeringa, para obtener una suspensión de células la cual se centrifugó a 1500 rpm por 10 minutos, el paquete celular se resuspendió en 3 ml de medio RPMI-1640, se separó una alícuota para cuantificar células nucleadas totales y la viabilidad con azul tripan al 0.2% en un hemocitómetro y mediante microscopía en campo claro. Posteriormente se ajustó la concentración a 2x105 células vivas/mL, 0.1 ml de la suspensión celular se adicionó a tubos que contenían 0.6 ml del medio RPMI-1640, 0.2 ml del suero inactivado (A, B, C o D) y 0.1 ml del extracto acuoso de P. major a una concentración de 0.2 g/mL. En cada caso la mezcla se depositó en una placa multipozos (96 pozos). En los cultivos testigo se sustituyó solución salina (0.85%) o medio RPMI-1640 en lugar del extracto. Todos los cultivos se incubaron por 48 horas a 37ºC, en una atmósfera con 5% de CO2 y humedad relativa. Se cosecharon las células, se determinó la proliferación mediante la cuenta celular en un hemocitómetro por microscopía óptica. Para determinar la significancia estadística se aplicó la prueba t para pares de datos no agrupados. Cada suero se evaluó al menos en cinco ensayos con su duplicado correspondiente. Una vez seleccionado el mejor lote de suero, se preparó un medio libre de suero que semejara o igualara los resultados obtenidos con el medio con suero. 19

Para lograrlo, se formularon tres medios de cultivo libres de suero (I, II y III), cuya composición se muestra a continuación:

Medio I. Libre de suero INSULINA TRANSFERRINA Na2SeO3 FeCl3

25 µg /mL *

25 µg/mL...………………………………………… 0.05 ml 0.025 µg/mL 100 µM

………………………………………… 0.08 ml

EMULSIÓN LECITINA-COLESTEROL (4:1) ALBÚMINA SÉRICA DE BOVINO MEDIO RPMI -1640

3%

…………………

0.15 ml

10 %

………………

0.50 ml

…………………………………………………………

4.22 ml 5.00 ml

Medio II. Libre de suero y de albúmina INSULINA

25 µg /mL

TRANSFERRINA *

25 µg/mL

Na2SeO3

0.025 µg/mL

FeCl3

…………………………………………… 0.05 ml

100 µM……………………………………………………

EMULSIÓN LECITINA-COLESTEROL (4:1) 3% MEDIO RPMI -1640

0.08 ml

……………………

0.15 ml

…………………………………………………………

4.72 ml 5.00 ml

* Solución Patrón.

20

Medio III. Libre de suero y de albúmina Complementado con 100 µg/mL de Insulina INSULINA

25 µg /mL

TRANSFERRINA *

25 µg/mL

Na2SeO3

0.025 µg/mL

FeCl3

100 µM…………………………………………………

INSULINA

75 µg /mL

…………………………………………… 0.05 ml

………………………………………………… 0.50 ml

EMULSIÓN LECITINA-COLESTEROL (4:1) MEDIO RPMI -1640

0.08 ml

3%…………………….

………………………………………………………….

0.15 ml 4.22 ml 5.00 ml

* Solución Patrón.

Para conocer el medio libre de suero más adecuado, se realizaron cinco cultivos

por

duplicado,

bajo

las

condiciones

mencionadas

anteriormente,

ocupándose como referencia de proliferación el medio con el suero seleccionado y contra el se compararon los resultados obtenidos con las distintas formulaciones de los medios libres de suero.

La siguiente fase consistió en obtener los sobrenadantes de los cultivos de bazo con suero y del medio libre de suero que apoyó mejor el cultivo celular. Para ello se realizó una nueva serie de experimentos, se recuperó el sobrenadante, mediante centrifugación a 2500 rpm, se filtró y se distribuyó en viales para su posterior utilización en los ensayos de actividad hematopoyética.

21

La fase final del experimento, se realizó para conocer el efecto de los sobrenadantes

sobre

la

proliferación

celular.

Se

realizaron

seis

cultivos,

sustituyendo el sobrenadante por el extracto y teniendo como testigos cultivos con solución salina al 0.85% y cultivos con Phytolacca americana diluida 1:15, la cual es un mitógeno utilizado para estimular la proliferación de linfocitos y la producción y liberación de factores del crecimiento hematopoyético.

22

RESULTADOS.

Selección del lote de suero. Todos los sueros apoyaron de forma similar la actividad hematopoyética del extracto de P. major, (p> 0.05, no significativo). Sin embargo, el lote C produjo los resultados más constantes, por lo que fue seleccionado para desarrollar el trabajo (Gráfica 1). En la siguientes etapas, la actividad hematopoyética del extracto de P. major en presencia del suero C fue considerada como el 100% y contra ella

se compararon los resultados obtenidos con los medios libres de

suero.

16 14

# de células (10 4)

12 10 8 6

*

4 2 0

Suero A

Suero B

Suero C

Suero D

Testigo

Gráfica 1. Efecto de la decocción de Plantago major sobre la proliferación de células de bazo de ratón con diferentes lotes de suero. Media ± Desviación estándar, * p< 0.05 de los medios con suero respecto al cultivo testigo.

23

Actividad hematopoyética de P. major en medios con suero vs medios libres de suero.

La capacidad del extracto para estimular la proliferación de las células de bazo en el medio libre de suero (fórmula 1), fue 40% más baja que la del medio con el suero C. Debido a que este produjo valores amplios de desviación estándar no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre la capacidad estimulante del extracto en ambos tipos de medios de cultivo (Gráfica 2). La actividad hematopoyética de P. major en los medios libres de suero fórmula 2 y 3, representó el 40% y 30%, respecto a la del medio con el suero C. En ambos casos se observó una diferencia estadísticamente significativa (p