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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

C12N 15/56 (2006.01) C12N 15/63 (2006.01) C12N 1/21 (2006.01) C12N 9/24 (2006.01) C12N 15/11 (2006.01) A61K 38/47 (2006.01)

ESPAÑA

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11 Número de publicación: 2 259 816

51 Int. Cl.:

TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 98943469 .1

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Fecha de presentación : 31.08.1998 87 Número de publicación de la solicitud: 0998569

87 Fecha de publicación de la solicitud: 10.05.2000

54 Título: Codificación polinucleótida de un polipéptido con actividad heparanasa y expresión del mismo en

células transducidas. 30 Prioridad: 02.09.1997 US 922170

02.07.1998 US 109386

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.10.2006

73 Titular/es: Insight Biopharmaceuticals Ltd.

Rabin Science Park, P.O. Box 2128 Rehovot 76121, IL HADASIT MEDICAL RESEARCH SERVICES AND DEVELOPMENT Ltd. 72 Inventor/es: Pecker, Iris;

Vlodavsky, Israel y Feinstein, Elena

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Isern Jara, Jorge

ES 2 259 816 T3

16.10.2006

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid

ES 2 259 816 T3 DESCRIPCIÓN Codificación polinucleótida de un polipéptido con actividad heparanasa y expresión del mismo en células transducidas. 5

La presente invención se refiere a un polinucleótido, referido de aquí en adelante como hpa, que codifica un polipéptido con actividad heparanasa, vectores que incluyen el mismo y células transducidas que expresan la heparanasa. Además la invención hace referencia a una proteína recombinante con actividad heparanasa. 10

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Heparan sulfato proteoglicanos: Heparan sulfatoproteoglicanos (HSPG) son macromoléculas ubicuas asociadas con la superficie de la célula y la matriz extracelular (MEC) de una amplia variedad de células de tejidos vertebrados e invertebrados (1-4). La estructura básica de HSPG incluye un núcleo de proteína en el que se le unen covalentemente varias cadenas lineales de heparan sulfato. Estas cadenas de polisacáridos están generalmente compuestas por unidades repetidas de disacáridos de ácido hialurónico y D-glucosamina que están sustituidas en diferente extensión por porciones de sulfato unidas a N- y O- y grupos acetilo unidos a N (1-4). Estudios acerca de la implicación de moléculas de la MEC en la adherencia celular, crecimiento y diferenciación revelaron un papel principal de los HSPG en la morfogénesis embrionaria, la angiogénesis, el desarrollo axonal y la reparación tisular (1-5). Los HSPG son componentes distinguidos de los vasos sanguíneos (3). En los vasos sanguíneos grandes se concentran mayoritariamente en las capas íntima y media interna, mientras que en los capilares se encuentran mayoritariamente en la membrana basal subendotelial dónde soportan las células endoteliales en proliferación y migración y estabilizan la estructura de la pared capilar. La habilidad de los HSPG para interaccionar con macromóleculas de la MEC tales cómo colágeno, laminina y fibronectina, y con diferentes sitios de adhesión en membranas plasmáticas sugiere un papel clave de este proteoglicano en el auto-ensamblaje y en la insolubilidad de los componentes de la MEC, así como en la adhesión celular y la locomoción. El fraccionamiento de las cadenas de heparan sulfato (HS) puede en consecuencia resultar en la degradación de las células de la MEC subendoteliales y, así pues, puede jugar un papel decisivo en la extravasación de células sanguíneas. El catabolismo de HS se observa en la inflamación, cicatrización, diabetes, y metástasis cancerosa, sugiriendo que enzimas que degradan HS juegan papeles importantes en procesos patológicos. La actividad heparanasa se ha descrito en células activadas del sistema inmune y en células cancerosas altamente metastásicas (68), pero la investigación ha sido obstaculizada por la falta de herramientas biológicas para explorar potenciales papeles causativos de la heparanasa en condiciones patológicas. Implicación de la Heparanasa en la invasión de células tumorales y metástasis: Células tumorales circulantes retenidas en los lechos capilares de diferentes órganos pueden invadir el recubrimiento endotelial de la célula y degradar su membrana basal subyacente (MB) con el propósito de invadir el(los) tejido(s) extravascular(es) dónde establece metástasis (9-10). Células tumorales metastásicas a menudo se adhieren a, o cerca de, las uniones intercelulares entre células endoteliales adyacentes. A esta adhesión de las células metastásicas le sigue la ruptura de las uniones, la retracción de los bordes de la célula endotelial y la migración a través de la fisura en el endotelio hacia la MB subyacente expuesta (9). Una vez localizadas entre las células endoteliales y la MB, las células invasoras deben degradar las glicoproteínas subendoteliales y proteoglicanos de la MB con el objetivo de migrar fuera del compartimiento vascular. Varias enzimas celulares (pej, colagenasa IV, activador del plasminógeno, catepsina B, elastasa, etc.) se creen involucradas en la degradación de la MB (10). Entre estas enzimas existe una endo-βD-glucuronidasa (heparanasa) la que fracciona el HS en sitios específicos intracatenarios (6, 8, 11). La expresión de una heparanasa de degradación de HS se correlacionó con el potencial metastático de linfoma de ratón (11), fibrosarcoma y células de melanoma (8). Además, se detectaron niveles incrementados de heparanasa en el suero de tumores metastásicos localizados en animales y pacientes con melanoma (8) y en biopsias tumorales de pacientes con cáncer (12). El control de la proliferación celular y la progresión tumoral por el microentorno local, centrándose en la interacción de las células con la matriz extracelular (MEC) producida por células endoteliales vasculares y células cultivadas de la córnea, fue investigado previamente por los presentes inventores. Esta MEC cultivada muy parecida al subendotelio in vivo en su apariencia morfológica y composición molecular. Contiene colágenos (mayoritariamente tipo III y IV, con pequeñas cantidades de los tipos I y V), proteoglicanos (mayoritariamente proteoglicanos heparan sulfato y dermatan sulfato, con pequeñas cantidades de proteoglicanos condroitin sulfato), laminina, fibronectina, entactina y elastina (13,14). La capacidad de las células para degradar HS en las MEC cultivadas se estudió permitiendo la interacción de las células con una MEC marcada metabólicamente con sulfato, seguido de un análisis por filtración en gel (Sepharose 6B) de los productos de degradación liberados al medio de cultivo (11). Mientras que los HSPG intactos son eluidos cerca del volumen de vacío de la columna (Kav