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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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11 N´ umero de publicaci´on: 7

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˜ ESPANA

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A61K 7/16

TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 97924017.3 kFecha de presentaci´on: 20.05.1997 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 910 333 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 28.04.1999

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54 T´ıtulo: Composiciones de enjuague bucal que comprenden cloruro de cetilpiridinio y un tensioactivo

anf´ otero.

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73 Titular/es: SMITHKLINE BEECHAM PLC

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72 Inventor/es: McConville, Peter Scott;

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74 Agente: Carpintero L´ opez, Francisco

30 Prioridad: 31.05.1996 GB 9611364

New Horizons Court Brentford, Middlesex TW8 9EP, GB

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.10.2002

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 173 447 T3

16.10.2002

Aviso:

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Walsh, Paula y Wicks, Mark Andrew

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

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DESCRIPCION Composici´ on de enjuague bucal que comprende cloruro de cetilpiridinio y un tensioactivo anf´ otero. La presente invenci´on se refiere a una composici´on de enjuague bucal que comprende cloruro de cetil piridinio (CPC) y un tensioactivo anf´ otero. El uso de agentes antibacterianos cati´onicos tales como CPC en composiciones para la higiene oral se ha defendido ampliamente como medio para reducir la placa bacteriana, y esto puede ser beneficioso en la profilaxis y/o tratamiento de la halitosis, enfermedad periodontal, placa, c´ alculos y/o caries. El documento WO-A-90/15592 describe geles dent´ıfricos no abrasivos que comprenden una cantidad antibacteriana eficaz de una combinaci´ on de una sal de cinc, tal como cloruro de cinc, y un compuesto de amonio cuaternario, tal como cloruro de cetilpiridinio, un agente gelificante y, opcionalmente, un tensioactivo de beta´ına. Aunque se dispone de enjuagues bucales que comprenden CPC, ´estos pueden sufrir el inconveniente de una menor eficacia debido a la desactivaci´on del CPC por la presencia de cualquier excipiente ani´onico dentro de tales enjuagues bucales. Aunque previamente se han sugerido tensioactivos no i´ onicos para uso con agentes antibacterianos cati´onicos, ahora se ha descubierto que muchos de tales tensioactivos pueden reducir la eficacia de los enjuagues bucales que comprenden CPC. Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que ciertos tensioactivos de amidobeta´ına anf´ oteros particulares son m´as compatibles con CPC que tensioactivos no i´onicos tales como ´esteres de sorbitol polietoxilados, policondensados de o´xido de etileno (polax´ ameros) y aceites de ricino hidrogenados polietoxilados. Por lo tanto, la presente invenci´ on proporciona una composici´ on de enjuague bucal que comprende una cantidad bacteriost´ aticamente eficaz de CPC; un veh´ıculo o excipiente aceptable para la v´ıa oral y una amidobeta´ına de f´ ormula:

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RC(O)NH(CH2 )a N+ (R1 )(R2 )(CH2 )b CO− 2 en la que R es alquilo C10−20 , preferiblemente alquilo C12−16; R1 y R2 son, independientemente, alquilo C1−4 , preferiblemente metilo; a es un n´ umero entero de 1 a 4, preferiblemente 3; y b es un n´ umero entero de 1 a 4, preferiblemente 1. Los ejemplos adecuados de amidobeta´ına incluyen cocoamidoetilbeta´ına, cocoamidopropilbeta´ına o lauramidobeta´ına, o mezclas de las mismas. Una amidobeta´ına preferida es la cocoamidopropilbeta´ına, que se ha descubierto que es especialmente compatible con CPC en formulaciones de enjuague bucal. Convenientemente, el CPC est´a presente en el intervalo del 0,005 al 10 %, preferiblemente del 0,01 al 5 % y, m´ as preferiblemente, del 0,02 al 2,5 % en peso del enjuague bucal. 2

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Convenientemente, la amidobeta´ına est´a presente junto con otros tensioactivos seleccionados entre un tensioactivo no i´ onico, otro tensioactivo anf´ otero o un tensioactivo cati´ onico, o mezclas de los mismos. Los tensioactivos no i´onicos adecuados incluyen, por ejemplo, ´esteres de sorbitol polietoxilados, en particular, mono´esteres de sorbitol polietoxilados, por ejemplo, PEG(40) di-isoestearato de sorbit´ an, y los productos comercializados con el nombre comercial “Tween” por ICI; policondensados de o´xido de etileno y o´xido de propileno (polox´ ameros), por ejemplo, los productos comercializados con el nombre comercial “Pluronic” por BASF-Wyandotte; condensados de propilenglicol; aceite de ricino hidrogenado polietoxilado, por ejemplo, Cremophor; y ´esteres grasos de sorbit´ an. Los tensioactivos anf´ oteros alternativos adecuados incluyen, por ejemplo, derivados de imidazolina de cadena larga tales como el producto comercializado con el nombre comercial “Miranol C2M” por Miranol, y alquilbeta´ınas de cadena larga, tales como el producto comercializado con el nombre comercial “Empigen BB” por Albright+Wilson y mezclas de los mismos. Los tensioactivos cati´ onicos adecuados incluyen la sal del ´acido D,L - 2 - pirrolidona - 5 carbox´ılico de etil - N - cocoil - L - arginato, comercializada con el nombre comercial CAE por Ajinomoto Co. Inc., y fosfato de cloruro de cocamidopropil PG dimonio y fosfato de cloruro de lauramidopropil PG dimonio, disponibles con los nombres comerciales Monaquat PCT y Monaquat PTL, respectivamente, en Mona Corporation. Convenientemente, entre un 50 y un 100 % del tensioactivo est´a presente como una amidobeta´ına. Preferiblemente, entre un 65 y un 90 % del tensioactivo est´a presente como una amidobeta´ına. M´ as preferiblemente, una amidobeta´ına est´a presente como u ´ nico tensioactivo. Convenientemente, el tensioactivo total est´ a presente en el intervalo del 0,01 al 20 %, preferiblemente del 0,05 al 10 % y, m´as preferiblemente, del 0,1 al 5 % en peso del enjuague bucal. Las formulaciones de enjuague bucal adecuadas tendr´ an una base acuosa que comprende agua o etanol acuoso, y opcionalmente otro l´ıquido tal como glicerina o propilenglicol. Las composiciones de enjuague bucal pueden proporcionarse en una forma “lista para el uso”; como una soluci´ on concentrada, para diluirse por el usuario inmediatamente antes del uso; o en una forma s´olida, tal como un comprimido o en una bolsita, para disolverse por el usuario inmediatamente antes del uso. Los comprimidos pueden prepararse convenientemente usando xilitol y/o sorbitol como ingrediente principal. Las bolsitas y comprimidos pueden formularse para proporcionar, tras la disoluci´on, un enjuague bucal, o para proporcionar, por medio de la incorporaci´ on de un par efervescente adecuado, por ejemplo, carbonato/bicarbonato s´ odico y a´cido c´ıtrico, un enjuague bucal efervescente. Tales composiciones contendr´an agentes de formulaci´ on apropiados tales como humectantes,

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agentes espesantes, agentes aromatizantes, agentes edulcorantes, agentes colorantes y conservantes seleccionados entre los usados convencionalmente en la t´ecnica de composiciones para la higiene oral para tales fines, y que son compatibles con el CPC y los tensioactivos descritos anteriormente. Los agentes espesantes adecuados incluyen, por ejemplo, agentes espesantes no i´ onicos tales como, por ejemplo, ´eteres de alquil(C1−6)celulosa, por ejemplo, metilcelulosa; ´eteres de hidroxialquil(C1−6)celulosa, por ejemplo, hidroxietilcelulosa e hidroxipropilcelulosa; ´eteres de alquil(C1−6)celulosa modificados con ´oxido de alquileno(C2−6), por ejemplo, hidroxipropil metilcelulosa; y mezclas de los mismos. Tambi´en pueden usarse otros agentes espesantes tales como gomas naturales y sint´eticas o materiales del tipo de gomas tales como Irish Moss, goma de tragacanto, carboximetilcelulosa s´odica, polivinil pirrolidona, almid´ on y s´ılices espesantes. Ventajosamente, el agente espesante est´a presente en el intervalo del 0,01 al 30 %, preferiblemente del 0,1 al 15 % y, m´ as preferiblemente, del 1 al 5 % en peso de la composici´on. Los humectantes adecuados para uso en composiciones de la invenci´on incluyen, por ejemplo, glicerina, sorbitol, propilenglicol o polietilenglicol, o mezclas de los mismos; pudiendo estar presente el humectante en el intervalo del 5 al 70 %, preferiblemente del 5 al 30 % y, m´ as preferiblemente, del 10 al 30 % en peso de la composici´on. Tales composiciones de la presente invenci´on pueden comprender adem´ as, de forma u ´ til, un agente anti-caries, por ejemplo, una fuente de iones fluoruro tales como un metal alcalino o una sal de fluoruro de amina, por ejemplo, fluoruro s´odico, o fluoruro de esta˜ no (II). Como alternativa, la fuente de i´ on fluoruro puede ser una sal monofluorofosfato de metal alcalino, por ejemplo, monofluorofosfato s´ odico, opcionalmente usada en combinaci´on con un agente tal como glicerofosfato c´ alcico que, como se sabe, aumenta la actividad del monofluorofosfato (documento GB 1 384 375, Beecham Group). Convenientemente, la composici´ on comprender´a entre 50 y 2500 ppm, preferiblemente entre 100 y 1500 ppm de iones fluoruro y, m´ as preferiblemente, 100-250 ppm. Tales composiciones de la presente invenci´on tambi´en pueden comprender otros agentes activos usados convencionalmente en composiciones para higiene oral, por ejemplo: un agente antiplaca alternativo tal como clorhexidina o triclosan adem´as de CPC; un agente contra los c´alculos tales como una sal pirofosfato de tetrao di-metal alcalino, o una mezcla de los mismos, una sal tripolifosfato de metal alcalino o una sal difosfonato de azacicloheptano; o un agente contra la sensibilidad tal como acetato de estroncio, cloruro de estroncio o una sal de potasio tal como nitrato pot´ asico, cloruro pot´ asico o citrato pot´asico. Tales agentes se incluir´an a niveles que proporcionen el efecto terap´eutico deseado y que sean compatibles con CPC.

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Las composiciones de enjuague bucal de acuerdo con la presente invenci´ on tendr´ an un pH que sea aceptable por v´ıa oral, t´ıpicamente, que var´ıe de aproximadamente pH 4 a 10, por ejemplo, de 5,5 a 8. Las composiciones de enjuague bucal de acuerdo con la presente invenci´ on puede prepararse mezclando los ingredientes en las cantidades relativas apropiadas en cualquier orden que sea conveniente, y posteriormente, si es necesario, ajustando el pH para dar el valor final deseado. La invenci´on tambi´en proporciona una procedimiento para combatir bacterias orales y para la profilaxis o tratamiento de la halitosis, enfermedad periodontal, placa, c´ alculos y/o caries, comprendiendo el procedimiento la aplicaci´ on de una composici´ on de acuerdo con la invenci´ on en la cavidad oral. Los siguientes ejemplos ilustran la invenci´on Ejemplo 1 (Uso de tensioactivo no i´ onico) Se fabric´ o un enjuague bucal como se indica a continuaci´on: % P/P

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Cremophor RH60 CPC Aromatizante Etanol NaF Sacarina Patent Blue-V-0,5 % Clorofilina Agua desionizada

0,2 0,05 0,12 15,00 0,05 0,052 0,075 0,01 84,443

∗ Cremophor RH60 es una aceite de ricino hidrogenado polietoxilado que contiene un promedio de 60 unidades etoxi en la cadena polietoxilada Ejemplo 2 (Uso de tensioactivo no i´ onico) Se fabric´ o un enjuague bucal como se indica a continuaci´on:

% P/P 50

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Cremophor RH60 CPC Aromatizante Etanol NaF Sacarina NHDC (Neohesperidine DC) Patent Blue-V-0,5 % Clorofilina Agua desionizada

0,2 0,05 0,12 8,00 0,023 0,04 3,00 0,075 0,01 88,482

Ejemplo 3 (Uso de cocoamidopropilbeta´ına) Se fabric´ o un enjuague bucal como se indica a continuaci´on:

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5 % P/P Cocoamidopropilbeta´ına CPC Aromatizante Etanol NaF Sacarina Patent Blue-V-0,5 % Clorofilina Agua desionizada

0,2 0,05 0,12 15,00 0,05 0,052 0,075 0,01 88,443

Ejemplo 4 (Uso de cocoamidopropilbeta´ına) Se fabric´ o un enjuague bucal como se indica a continuaci´on:

Ejemplo 7 (Uso de cocoamidopropilbeta´ına) Se fabric´ o un enjuague bucal como se indica a continuaci´on: 5

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% P/P Cocoamidopropilbeta´ına CPC Aromatizante Etanol NaF Sacarina NHDC (Neohesperidine DC) Patent Blue-V-0,5 % Clorofilina Agua desionizada

0,2 0,05 0,12 8,00 0,023 0,04 3,00 0,075 0,01 88,482

Ejemplo 5 (Uso de cocoamidopropilbeta´ına) Se fabric´ o un enjuague bucal como se indica a continuaci´on:

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% P/P Cremophor RH60 CPC Aromatizante Etanol NaF Sacarina Patent Blue-V-0,5 % Clorofilina Agua desionizada

0,65 0,05 0,13 15,00 0,05 0,06 0,075 0,01 83,975

Ejemplo 6 (Uso de cocoamidopropilbeta´ına y tensioactivo no i´ onico) Se fabric´ o un enjuague bucal como se indica a continuaci´on: % P/P Cocoamidopropilbeta´ına Cremophor RH60 CPC Aromatizante Etanol NaF Sacarina Patent Blue-V-0,5 % Clorofilina Agua desionizada 4

0,10 0,05 0,05 0,13 15,00 0,05 0,06 0,075 0,01 84,475

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% P/P Cocoamidopropilbeta´ına CPC Aromatizante Etanol NaF Sacarina Patent Blue-V-0,5 % Clorofilina Agua desionizada

0,30 0,05 0,13 15,00 0,05 0,06 0,075 0,01 84,475

Ejemplo 8 (Estudios in-vitro sobre esmalte/discos de hidroxiapatita) Se preparan discos de hidroxiapatita o esmalte bovino de superficie espec´ıfica conocida poniendo una pieza de 7,62 cm de algod´ on enroscada en el disco o en el canal radiculal vac´ıo del diente. Si se van a usar discos de HA, el hilo se pega al disco usando laca de u˜ nas. Si se va a usar esmalte bovino, se extiende una pel´ıcula fina de vinilpolisiloxano de cuerpo ligero (por ejemplo, Reprosil) sobre la dentina expuesta del diente, y esto sirve para mantener al algod´on en su sitio y tapar la dentina expuesta, impidiendo la uni´ on de CPC a este ´area. El diente o los discos de HA despu´es se ponen en 5 ml universales est´eriles (un diente por universal) de saliva humana entera recogida filtrada y despu´es se a˜ nade esterilina a cada uno con una pipeta. El diente despu´es se incuba durante una noche a 37◦ C. Al d´ıa siguiente, cada diente se aclara individualmente con agua desionizada (25 ml) durante 15 segundos. Esto despu´es se contin´ ua por un tratamiento de 1 minuto con el enjuague bucal de CPC o con una soluci´ on sencilla (10 ml). El diente despu´es se aclara tres veces en agua desionizada (25 ml), se retiran el Reprosil y el algod´on y el diente despu´es se sumerge en 5 ml de una soluci´ on de 50 % de acetonitrilo, 30 % de tetrahidrofurano, 19,9 % de agua desionizada y 0,1 % de ´acido pentanosulf´ onico durante 3 minutos para retirar el CPC unido a los dientes/discos. La soluci´on despu´es se pone un vial de HPLC apropiado y se analiza con respecto a su contenido de CPC. Esto proporciona los detalles de uni´ on. Para los detalles de retenci´ on se sigue el mismo protocolo, pero, antes de sumergir el diente en la mezcla de acetonitrilo/THF/´acido pentanosulf´ onico, se sumerge en 5 ml de saliva humana entera reunida filtrada durante 2 horas a ua el procedimiento de 37◦C y despu´es se contin´ la misma manera que el experimento de uni´on. Tras el examen de la uni´on de CPC a los discos de Hidroxiapatita desde los enjuagues bucales en comparici´ on con soluciones sencillas, se descubri´o que en el enjuague bucal se perd´ıa aproximadamente un 66 % de la capacidad de uni´ on de CPC: Enjuague bucal del Ejemplo 1, 1,68 µg/cm2 de CPC unido al disco ´ SENCILLA DE CPC AL 0,05 % SOLUCION EN AGUA, 5,36 µg/cm2 de CPC unido al disco

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(n=5). Esto sugiere que los excipientes presentes en el enjuague bucal podr´ıan reducir la uni´ on de CPC. Por lo tanto, se examin´ o el enjuague bucal del Ejemplo 1 menos cada excipiente cada vez para averiguar cu´ al podr´ıa tener el efecto m´as adverso sobre la uni´ on de CPC. Enjuague bucal del Ejemplo 1, 1,62 µg/cm2 de CPC unido al disco Enjuague bucal del Ejemplo 1 MENOS CREMOPHOR RH60 (solubilizante), 2,611 µg/cm2 de CPC unido al disco (n=5). Tambi´en se examinaron soluciones de CPC sencillas (al 0,05 %) que conten´ıan s´ olo uno de los excipientes cada vez, para averiguar de nuevo cu´ al ten´ıa efectos adversos. ´ SENCILLA DE CPC AL 0,05 % SOLUCION EN AGUA, 5,52 µg/cm2 de CPC unido al disco ´ SENCILLA DE CPC AL 0,05 % SOLUCION + CREMOPHOR RH60, 2,36 µg/cm2 de CPC unido al disco (n=5). Se descubri´ o que el solubilizante, Cremophor RH60, era el excipiente que ten´ıa el mayor efecto para reducir la uni´on de CPC. Se examinaron diversos solubilizantes con respecto a la uni´ on/retenci´ on de CPC en el esmalte bovino. Los solubilizantes examinados fueron Tween 80, Tween 20, Pluronic F127, Pluronic F108, Cremophor RH40 y Cremophor RH60 a diversos niveles en el enjuague bucal del Ejemplo 1, pero ninguno de ´estos pareci´o m´as prometedor que el Cremophor RH60 al 0,2 % (n=10). Despu´es, se examin´o otro solubilizante, Tegobetain (cocoamidopropilbeta´ına), a diversos niveles (0,2 %, 0,4 % y 1 %) en comparaci´ on con Cremophor RH60 (0,2 %) en la formulaci´ on de enjuague bucal del Ejemplo 1: Enjuague bucal del Ejemplo 3, 1,44 µg/cm2 de CPC retenido en el esmalte bovino. Enjuague bucal del Ejemplo 1, 0,60 µg/cm2 de CPC retenido en el esmalte bovino. De esta forma, se obtuvo un resultado alentador usando un 0,2 % del tensioactivo cocoamidopropilbeta´ına, que claramente mejor´o la retenci´on de CPC en el esmalte bovino. Otro estudio realizado con formulaciones modificadas produjo los siguientes resultados: Enjuague bucal del Ejemplo 2, 0,58 µg/cm2 de CPC retenido en el esmalte bovino. Enjuague bucal del Ejemplo 4, 0,93 µg/cm2 de CPC retenido en el esmalte bovino. Enjuague bucal del Ejemplo 2, 1,23 µg/cm2 de CPC unido al esmalte bovino. Enjuague bucal del Ejemplo 4, 2,54 µg/cm2 de CPC unido al esmalte bovino. Estos resultados demostraron que la cocoamidopropilbeta´ına es significativamente m´ as compatible con CPC que los tensioactivos no i´onicos y generalmente aumenta la uni´on y retenci´ on del CPC en el esmalte bovino. Otro estudio demostr´ o que un mayor nivel de cocoamidopropilbeta´ına era igualmente ventajoso: Enjuague bucal del Ejemplo 5, 0,95 µg/cm2 de CPC retenido en el esmalte bovino. Enjuague bucal del Ejemplo 1, 0,68 µg/cm2 de CPC retenido en el esmalte bovino.

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Se realizaron otros dos estudios sobre un sistema solubilizante mixto y se obtuvieron los siguientes resultados: Enjuague bucal del Ejemplo 6, 2,56 µg/cm2 de CPC unido al esmalte bovino. Enjuague bucal del Ejemplo 1, 1,62 µg/cm2 de CPC unido al esmalte bovino. Enjuague bucal del Ejemplo 6, 1,15 µg/cm2 de CPC retenido en el esmalte bovino. Enjuague bucal del Ejemplo 1, 0,68 µg/cm2 de CPC retenido en el esmalte bovino. Los resultados obtenidos indican que un tensioactivo de amidobeta´ına anf´ otero, bien solo o en mezcla con otro tensioactivo, mejora la uni´ on y retenci´on de CPC al esmalte bovino en comparaci´on con formulaciones de enjuague bucal que s´olo contienen un tensioactivo no i´ onico tal como Cremophor RH60. Ejemplo 9 (estudios in vitro en c´elulas de la mucosa) Se recogieron c´elulas epiteliales bucales humanas usando una esp´ atula de polipropileno y se dejaron caer en 20 ml de un tamp´ on Resting Saliva Salts (sales de saliva en reposo) (RSS) (cloruro s´odico 50 mM, cloruro c´ alcico 1,1 mM, ortofosfato pot´ asico di´acido 0,6 mM) que se almacenaron en hielo. Las c´elulas despu´es se lavaron tres veces por centrifugaci´on en 20 ml de tamp´ on RSS y se resuspendieron en tamp´on RSS a una concentraci´on final de 1 ml por voluntario. Todos los c´ umulos celulares que quedaban se rompieron por vibraci´ on ultras´ onica. Las c´elulas despu´es se contaron usando un hemocit´ ometro. Los enjuagues bucales de los ejemplos 1 y 6 y la suspensi´on celular se calentaron a 37◦ C en un incubador. Despu´es se a˜ nadi´ o la suspensi´on celular (en al´ıcuotas de 0,5 ml) a tubos de ensayo de ´ vidrio. Estos despu´es se centrifugaron y el sobrenadante se desech´ o. Despu´es se a˜ nadieron 0,5 ml de los enjuagues bucales a los sedimentos celulares y ´estos se sometieron brevemente a agitaci´on vorticial para suspender las c´elulas en el enjuague bucal. Despu´es se incubaron y se agitaron suavemente a 37◦C. Despu´es de 5 minutos, las c´elulas se recogieron por centrifugaci´on. Las c´elulas recogidas como sedimento despu´es se lavaron tres veces en 2 ml de tamp´ on RSS. A cada sedimento se le a˜ nadieron 1,5 ml de fase m´ovil de CPC (50 % de acetonitrilo, 30 % de tetrahidrofurano, 20 % de agua con un 0,1 % de a´cido pentanosulf´ onico) y se mezcl´o vigorosamente con agitaci´on vorticial y se dej´o en reposo durante 5 minutos. Estas mezclas despu´es se centrifugaron y en el sobrenadante se analiz´ o el CPC por HPLC. Se obtuvieron los siguientes resultados: Enjuague bucal del Ejemplo 1, 6,07 µg de CPC unido/100000 c´elulas. Enjuague bucal del Ejemplo 6, 9,57 µg de CPC unido/100000 c´elulas. Estos resultados demuestran que el tensioactivo de amidobeta´ına en combinaci´ on con otro tensioactivo permite un aumento significativo en el CPC unido a las c´elulas de la mucosa en comparaci´on con un producto similar sin amidobeta´ına. Ejemplo 10 (Resultados de retenci´on microbiol´ ogica) 5

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Se recubrieron discos de hidroxiapatita sumergi´endolos en saliva. Estos discos se sumergieron en soluciones de ensayo durante 2 minutos, seguido de dos lavados en agua desionizada. Las soluciones de ensayo se ensayaron en estado puro y a una diluci´ on de 1 en 5. Los discos despu´es se pusieron en superficies de una placa de agar sembrada con Propionobacter acnes. El agar era agar de infusi´ on cerebrocard´ıaca y la placa se incub´o a 37◦C durante 2 d´ıas en condiciones aerobias. Se midieron las zonas de inhibici´ on para averiguar la actividad microbiol´ ogica del CPC retenido en los discos. El enjuague bucal del Ejemplo 1 dio zonas de inhibici´ on de 18,65 para una diluci´ on 1:5 y de 21,08 para la soluci´ on pura. El enjuague bucal del Ejemplo 6 dio zonas de inhibici´ on de 20,11 para una diluci´ on 1:5 y de 23,58 para la soluci´ on pura. Un enjuague bucal con placebo, que no conten´ıa CPC pero con cocoamidopropilbeta´ına, no mostr´ o ninguna actividad ni en estado puro ni a la diluci´ on 1:5 y una soluci´ on de CPC al 0,05 % dio zonas de inhibici´ on de 20,98 para una diluci´ on 1:5 y de 24,83 para la soluci´ on en estado puro. Los resultados obtenidos indican que el tensioactivo de amidobet´ına en combinaciones con otro tensioactivo proporciona una mayor retenci´on de CPC en discos de hidroxiapatita y demuestra la actividad microbiol´ogica de este CPC retenido. Estos resultados complementan a los de los estudios de uni´ on y retenci´ on en esmalte y en discos de HA del Ejemplo 8. Ejemplo 11 (Actividad microbiol´ ogica) Los mecanismos que son sensibles a los cambios en el potencial de membrana proporcionan un medio para evaluar la viabilidad de las c´elulas. En bacterias, el aparato celular para el metabolismo energ´etico se localiza en la membrana citoplasm´atica interna. Cuando la membrana se altera por agentes f´ısicos o qu´ımicos, se reduce este potencial y se produce la muerte. Se han examinado sondas fluorescentes como indicadores de la viabilidad bacteriana usando Citometr´ıa de Flujo.

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De ´estas, el bis-(´acido 1,3-dibutilbarbit´ urico) trimetina oxonol (DiBAC4(3)) es el m´ as sensible y s´olido. Tambi´en es aplicable a ensayos de citometr´ıa de flujo de alto rendimiento. El colorante oxonol cargado negativamente experimenta distribuciones dependientes del potencial entre el citoplasma y la membrana extracelular y entra en las c´elulas despolarizadas (es decir, muertas), en las que se une a componentes ricos en l´ıpidos. La fluorescencia aumenta por acumulaci´on. El CPC es un compuesto de amonio cuaternario cati´ onico y act´ ua sobre la membrana celular produciendo una p´erdida generalizada de funci´ on. Tal p´erdida se reflejar´ıa como un aumento de la absorci´ on de oxonol (DiBAC4(3)) y el consiguiente aumento en fluorescencia que indica la muerte celular. Como CPC es el activo principal de los enjuagues bucales de la solicitud, se decidi´ o ensayar su eficacia relativa frente a Streptococcus mutans usando oxonol (DiBAC4(3)) y un Cit´ ometro de Flujo Biorad Bryte. Esto se realiz´o como se indica a continuaci´on: Se a˜ nadieron 100 µl de cada enjuague bucal del Ejemplo 7, el enjuague bucal del Ejemplo 1 y CPC + control de amidobeta´ına a vol´ umenes de 2 ml de PBS con aproximadamente 107 Streptococcus mutans NCTC 10904 por ml. A cada una de estas tres soluciones se le a˜ nadieron 10 µl de una soluci´ on de 1 mg/ml de oxonol. Se control´o el cambio de fluorescencia durante 20 minutos usando el Cit´ ometro de Flujo Biorad Bryte. Para cada una de las tres soluciones de ensayo, se represent´o el n´ umero medio de canales de fluorescencia (excitaci´on 470-495/emisi´ on 520-550 nm) respecto al tiempo. El gr´ afico mostrado en la Figura 1 muestra claramente una mayor fluorescencia por S. mutans en presencia del enjuague bucal del Ejemplo 7 en comparaci´on con el enjuague bucal del Ejemplo 1. Esto indica que en el organismo de S. mutans, la formulaci´ on que conten´ıa amidobeta´ına produjo da˜ nos celulares significativamente mayores (a p