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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 223 559

51 Int. Cl. : C07F 13/00

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A61K 51/04 // A61K 103:10

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 00952136 .0

86 Fecha de presentación: 28.06.2000

87 Número de publicación de la solicitud: 1192166

87 Fecha de publicación de la solicitud: 03.04.2002

54 Título: Complejos de metales de transición del grupo (VII) con ligandos aminopolicarboxilato multidentados

y un kit para producirlos. 30 Prioridad: 29.06.1999 US 140989 P

73 Titular/es: MALLINCKRODT Inc.

675 McDonnell Blvd, P.O. Box 5840 St. Louis, Missouri 63134, US

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

01.03.2005

72 Inventor/es: Dyszlewski, Mary, M.;

Alberto, Roger y Bugaj, Joseph, E.

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Díez de Rivera de Elzaburu, Alfonso

ES 2 223 559 T3

01.03.2005

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 223 559 T3 DESCRIPCIÓN Complejos de metales de transición del grupo (VII) con ligandos aminopolicarboxilato multidentados y un kit para producirlos. 5

Campo de la invención

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La presente invención se refiere a ligandos nuevos para formar complejos radionúclidos, nuevos complejos que incorporan tales ligandos, procedimientos para preparar tales complejos, radiotrazadores que incorporan tales complejos y los métodos de radiografía que utilizan estos radiotrazadores. Antecedentes de la invención

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La radiografía gammagráfica y las técnicas radiográficas similares para visualizar tejidos in vivo se están aplicando cada vez más en la investigación médica y biológica y en los procedimientos terapéuticos y de diagnóstico. Normalmente, los procedimientos gammagráficos implican la preparación de agentes radioactivos que, tras su introducción en un sujeto biológico, se circunscribe a la estructura específica del esqueleto, tejido u órgano elegido. Cuando se circunscribe de este modo, los perfiles, gráficas o gammagrafías que describen la distribución in vivo de la sustancia radiográfica se pueden realizar mediante diversos detectores de radiación, p.ej. escáneres de transmisión y gammacámaras. La distribución y la correspondiente intensidad relativa de la sustancia radioactiva detectada no sólo indica el espacio ocupado por el tejido diana sino que también indica una presencia de receptores, antígenos, aberraciones, procesos patológicos y similares. En general, según el tipo de radionúclido y del órgano de actuación o del tejido de interés, las composiciones comprenden un radionúclido, un excipiente diseñado para dirigirse al órgano específico o al centro de un tejido, varios agentes auxiliares que pegan el radionúclido al excipiente, agua u otros vehículos de entrega adecuados para la inyección, o mediante aspiración, en el individuo, como tampones fisiológicos, sales y similares. El excipiente fija o compleja el radionúclido al excipiente, lo que se traduce en la circunscripción del radionúclido que se deposita en la posición en la que el excipiente se concentra en el sujeto biológico. El tecnecio-99-metaestable (99m Tc) es un radionúclido conocido ampliamente por sus usos en radiotrazadores de tejidos. Debido a su seguridad y sus propiedades radiográficas idóneas, este radionúclido está disponible comercialmente de manera conveniente en la forma oxidada de pertecnetato (99m TcO4 − ), de ahora en adelante “pertecnetato-Tc99m”. Sin embargo, el pertecnetato no se complejará con la mayoría de los excipientes biológicos utilizados comúnmente para la gammagrafía de tejidos. Así pues, los radiotrazadores marcados con tecnecio generalmente se preparan mezclando una disolución salina isotónica de pertecnetato-Tc99m, un reductor del tecnecio (reductor) como el cloruro de estaño o el ditionito sódico y un quelato conjugado al excipiente peptídico deseado para dirigirlo al órgano de interés. Alternativamente, se puede preparar, antes de añadirlo a la molécula biológica quelante, un complejo intermedio de transferencia de tecnecio 99m líquido para mantener el estado de oxidación dentro de un nivel deseado. Ejemplos de este complejo incluyen el tartrato de 99m Tc o el gluconato de 99m Tc. Otro problema es que los radiotrazadores gammagráficos que contienen tecnecio se sabe que son inestables en presencia de oxígeno, principalmente porque la oxidación del reductor y/o del tecnecio-99m destruye el complejo tecnecio-99m reducido/excipiente. De acuerdo con ello, tales radiotrazadores normalmente se forman en ausencia de oxígeno mediante la saturación de las composiciones con nitrógeno gaseoso sin oxígeno o mediante la preparación de los radiotrazadores en una atmósfera sin oxígeno. La estabilización de los radiotrazadores también se puede lograr por medios químicos. La patente de los EE.UU. número 4232000 de Fawzi, hecha pública el 4 de noviembre de 1980, describe el uso del alcohol gentisílico como un estabilizador para los radiotrazadores de tecnecio. De igual forma, la patente de los EE.UU. número 4233284 de Fawzi, hecha pública el 11 de noviembre de 1980, describe el uso del ácido gentísico como un estabilizador. En la solicitud PCT publicada número PCT/US98/07979 (Publicación internacional número WO 98/48848), se describe un método para preparar un compuesto de la fórmula general (I): fac-[M(CO)3 (OH2 )3 )]+ en la que M es Mn, 99m Tc, 186 Re o 188 Re, haciendo reaccionar un metal en forma de permetalato con monóxido de carbono y un reductor, caracterizado en que una mezcla de una base, un reductor soluble en agua pero que no se descompone en agua de manera apreciable y, opcionalmente, un estabilizante, se disuelve en un sistema disolvente acuoso que contiene una disolución del metal en forma de permanganato, pertecnetato o perrenato en la presencia de monóxido de carbono y, opcionalmente, en presencia de un halogenuro. Los ligandos descritos para marcar moléculas biológicamente activas tienen una tendencia a estabilizar los metales en sus estados de oxidación bajos. Estos ligandos tienen en común la presencia de orbitales vacíos bajos de la simetría correcta para formar enlaces pi al aceptar electrones de los orbitales d metálicos ocupados, un fenómeno conocido como retroenlace. Los ligandos indicados en la solicitud de la patente incluyen isonitrilos, fosfinas, tioéteres, bases de Schiff y grupos del tipo piridina, imidazol y pirazol. En concreto, el aminoácido histidina se indica como un quelato ideal. Para algunos propósitos, un problema al usar como quelatos histidina y otras moléculas orgánicas insaturadas es que el compuesto marcado resultante es muy lipofílico por lo que la sangre y el hígado lo capturan en gran cantidad. La captación y la eliminación hepatobiliarias predominantes son, para algunos propósitos, características no deseables en los radiotrazadores buscados. Las publicaciones y otros materiales utilizados en la presente memoria para ilustrar los antecedentes de la inven2

ES 2 223 559 T3 ción o para proporcionar detalles adicionales respecto a la práctica se han agrupado, respectivamente, en la lista de referencias adjunta por comodidad. Compendio de la invención 5

De acuerdo con la presente invención, un método para preparar un compuesto de fórmula. fac − [M(CO)3 (OH2)3 ]+

(I)

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en la que M es Mn, 99m Tc, 186 Re o 188 Re,

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implica hacer reaccionar un metal en forma de permetalato con monóxido de carbono y un reductor, en el que un mezcla de un tampón borato básico y un reductor soluble en agua, pero que no se descompone en agua de manera apreciable, se disuelven en un sistema disolvente acuoso que contiene una disolución del metal en forma de permanganato, pertecnetato o perrenato en presencia de monóxido de carbono. El compuesto de fórmula (I) se puede hacer reaccionar con un ligando LX para formar un compuesto de la fórmula fac − [M(CO)3 (X)2 )LX ]n

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(II)

en la que M se define como arriba, Lx es un ligando multidentado y n es una carga del ligando Lx , aumentada con una carga positiva. La invención también se dirige a nuevos compuestos y kits para llevar a cabo los métodos descritos. 25

Breve descripción de las figuras Las figuras 1A-E representan las estructuras de His-Tyr-3-octreotato (figura 1A), n-DTPA-Tyr-3-octreotato (figura 1B), iso-DTPA-Tyr-3-octreotato (figura 1C), DTPA’-Tyr-3-octreotato (figura 1D) e IDA-glucosa (figura 1E).

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La figura 2 es una representación gráfica de la captación del [Tc(CO)3 (His-Y3 -octreotato)] y del [Tc(CO)3 (DTPA’Y3 -octreotato)] en ratas macho Lewis que portan implantes del tumor CA20948 a las 4 horas después de la inyección. La escala muestra el porcentaje de la dosis inyectada (ID) por gramo de tejido, tal como se muestra en la parte inferior del gráfico.

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La figura 3 es una gammagrafía de ratas a las que se inyectó bien el péptido frío (ratas 3 y 4) o bien un control salino (ratas 1 y 2) y a las que 30 minutos después se les inyectó 50 µCi de [99m Tc(CO)3 (DTPA’-Y3 -octreotato)]. La gammagrafía se realizó 3 horas después de la inyección.

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La figura 4 es una gráfica que compara la captación de 99m Tc-2148 3 horas después de la inyección en varios tejidos de ratas Lewis que portan el tumor CA20948, en ratas inyectadas con tampón salino o con una dosis competidora de péptido sin marcar 30 minutos antes de la inyección del péptido marcado. Descripción detallada de la invención

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La presente invención se refiere al uso de ligandos multidentados, que preferiblemente son quelatos aminopolicarboxilatos para marcar moléculas biológicas, lo que normalmente se traduce en compuestos más hidrofílicos que se excretan principalmente por los riñones. Aunque esta clase de ligandos no son ácidos pi y generalmente no estabilizan el tecnecio en un estado de oxidación bajo, forman complejos muy estables con el precursor Tc(I) tricarbonílico y presentan unas características de biodistribución favorables. En realizaciones particularmente preferidas, los ligandos a utilizar de acuerdo con la presente invención no son bidentados. La invención se refiere en concreto a compuestos de fórmula fac − [M(CO)3 Lx ]n

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(II)

en la que: M es Mn, 99m Tc, 186 Re o 188 Re; 60

Lx es un ligando aminopolicarboxilato multidentado; y n es la suma de la carga de los ligandos Lx . 65

Ejemplos de ligandos aminopolicarboxilatos incluyen el ácido dietilentriamino-pentaacético (DTPA), el ácido etililendiaminotetraacético (EDTA) y el ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetracético (DOTA). Los quelatos aminopolicarboxilatos preferidos son los que contienen una cara tridentada que se puede fijar al centro de tecnecio, como el ácido iminodiacético (IDA), el ácido nitrilotriacético (NTA) y el triazaciclononanotriacetato. 3

ES 2 223 559 T3 Se describen métodos para preparar compuestos tricarbonílicos metálicos faciales y ulteriores compuestos tricarbonílicos metálicos faciales coordinados. La invención se refiere además al uso de dichos compuestos tricarbonílicos metálicos faciales en la marcación de sustratos biológicamente activos y a otros ligandos y a un kit para preparar un compuesto tricarbonílico metálico facial o ulteriores compuestos tricarbonílicos metálicos faciales coordinados. 5

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La aplicación de complejos metálicos, con una amplia variedad de radionúclidos, se ha convertido en una herramienta importante en el campo de la medicina nuclear para el diagnóstico, y mucho más recientemente en la terapia. Los complejos metálicos a menudo se fijan a un sustrato biológicamente activo que actúa como un agente conductor. Uno de los procedimientos aplicados más ampliamente para la marcación con metales de sustratos biológicamente activos como proteínas, péptidos, glúcidos o compuestos pequeños biológicamente activos consiste en estabilizar el resto M(V)=O de metales (radioactivos) del grupo 7B de la tabla periódica con diferentes ligandos tetradentados. Después de la reducción, el resto M(V)=O se estabiliza inicialmente con una cantidad mayor de un ligando auxiliar como el glucoheptonato que posteriormente se sustituye por el quelante fijado al sistema a marcar. Se ha demostrado que este método funciona con éxito en muchos casos pero adolece de algunas desventajas importantes como la gran denticidad requerida y la voluminosidad del ligando y la dificultad al sintetizar y fijar tal ligando. Se sabe en la técnica (Alberto et al, 1994a) que los complejos tricarbonílicos metálicos faciales de metales radioactivos del grupo 7B de la tabla periódica son sustancias de partida muy adecuadas para las reacciones de sustitución en disolventes orgánicos así como en agua, ya que estos compuestos permanecen estables en agua durante semanas, incluso si se exponen al aire. Por lo tanto, dichos compuestos resultarían de gran utilidad para la marcación de sustratos biológicamente activos, como aminoácidos, péptidos, proteínas, glúcidos y cualesquiera moléculas que se unan a receptores. Sin embargo, hasta la fecha, una desventaja importante de estos compuestos es que sólo se han conseguido liberar en reacciones de carbonilación a elevada temperatura y con la ayuda del agente reductor pirofórico, tóxico y, por lo tanto, peligroso BH3 (Alberto et al, 1994b).

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La presente invención tiene por objetivo proporcionar un método para preparar compuestos tricarbonílicos metálicos faciales de metales (radioactivos) del grupo 7B con la ayuda de sustancias de partida fácilmente disponibles y de baja toxicidad a temperatura moderada y a una presión normal de monóxido de carbono, en un tiempo razonable y con un gran rendimiento. 30

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Un método así sería una herramienta poderosa que se puede utilizar para la síntesis de agentes de diagnóstico y terapéuticos, especialmente para la síntesis de dichos agentes de diagnóstico y terapéuticos derivados de metales radioactivos con una vida corta, con el objeto de tener acceso a estos compuestos marcados en laboratorios de hospitales mal equipados. Cuando el agente de diagnóstico mencionado arriba se marca con un radionúclido, se puede detectar con la llamada tomografía de emisión de fotones simples asistida por ordenador (SPECT y SPET); cuando se marca con un átomo metálico paramagnético se puede detectar mediante resonancia magnética nuclear. El objetivo definido arriba se puede lograr, de acuerdo con la presente invención, mediante un método para preparar un compuesto de la fórmula general

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fac − [M(CO)3 (OH2 )3 ]+

(I)

en la que M es Mn, 99m Tc, 186 Re o 188 Re, 45

haciendo reaccionar un metal en forma de permetalato (forma MO4 − ) con monóxido de carbono y un reductor, caracterizado en que una mezcla de una base, de un reductor soluble en agua pero que no se descompone en agua de manera apreciable y, opcionalmente, de un estabilizador, se disuelven en un sistema disolvente acuoso que contiene una disolución del metal en la forma de permanganato, pertecnetato o perrenato en presencia de monóxido de carbono. 50

El metal M es preferiblemente 99m Tc, 186 Re o 188 Re, ya que estos radionúclidos, cuando se utilizan en agentes de diagnóstico o terapéuticos, tienen la ventaja de que se pueden aplicar en concentraciones muy bajas, lo que minimiza el riesgo de toxicidad. 55

El término “que no se descompone en agua de manera apreciable” significa que tras la adición de la disolución de permanganato, pertecnetato o perrenato en agua, la velocidad de la reacción de descomposición del reductor con agua es cero o muy baja en comparación con la reacción de dicho reductor con el permanganato, pertecnetato o perrenato, por lo que la reacción con dicho permetalato se completa cuando todavía hay suficiente reductor presente.

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Sorprende mucho que se pueda lograr una reducción cuantitativa de permetalatos en sistemas disolventes que contienen agua a una temperatura moderada y en un tiempo razonable con reductores que son nucleofílicos y que normalmente se consideran menos reactivos que el reductor electrofílico BH3 conocido en la técnica.

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El método de la invención se puede realizar fácilmente simplemente mezclando la disolución de permetalato con los otros reactivos en presencia de monóxido de carbono. La disolución de permetalato puede, opcionalmente, contener iones halogenuros necesarios para la elución del permetalato desde un generador. El monóxido de carbono se puede suministrar utilizando un sistema cerrado con una atmósfera que contiene una cantidad suficiente de monóxido de 4

ES 2 223 559 T3 carbono o echando el monóxido de carbono gaseoso a través de la disolución. Preferiblemente, el gas es monóxido de carbono considerablemente puro. 5

10

La base utilizada es, preferiblemente, un tampón borato básico. Otras bases incluyen bases inorgánicas, seleccionadas del grupo de hidróxidos estables y de sales de carbonato como NaOH, KOH, NaHCO3 , Na2 CO3 , KHCO3 , K2 CO3 , Ca(OH)2 y Mg(OH)2 . La base se añade al reductor en una proporción molar de entre 0,1 y 2, y preferiblemente en una proporción molar de aproximadamente 0,35. La reacción se puede realizar con o sin un estabilizador. Como estabilizador se puede utilizar gentisato (2,5dihidroxibenzoato), glucoheptonato, citrato o tartrato, p.ej., como tartrato de sodio y potasio. El estabilizador se añade a la mezcla de reacción en una cantidad tal que su concentración sea mayor que la del metal a reducir. En realizaciones preferidas, la mezcla incluye ácido L-tartárico.

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En realizaciones particularmente preferidas, la mezcla incluye lactosa. Para la reducción se pueden utilizar varios reductores, como el anión borohidruro (BH4 − ) o el anión borohidruro sustituido en el que hasta tres de los átomos de hidrógeno que comprenden el anión borohidruro se han reemplazado independientemente por sustituyentes inertes. Ejemplos de dichos sustituyentes inertes son los grupos alcoxi o alquilcarboniloxi que contienen de 1 a 10 átomos de carbono y grupos cianuro. El ión complementario del grupo reductor puede constar de un metal del grupo 1A o 2A de la tabla periódica o de zinc o de amonio o de amonio tetrasustituido o de un ión de fosfonio tetrasustituido, en el que los cuatro sustituyentes son, cada uno independientemente, grupos alquilo que contienen de 1 a 10 átomos de carbono, grupos hidroxialquilo o grupos alcoxialquilo que contienen de 2 a 10 átomos de carbono o grupos arilos.

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El reductor preferido es el anión borohidruro, especialmente en la forma de compuestos como el borohidruro de sodio, el borohidruro de potasio, el borohidruro de litio y el borohidruro de zinc. El reductor más preferido es el KBH4 . 30

El reductor se hace reaccionar con el permetalato en una proporción molar mayor que 3. La reacción de reducción se puede realizar a una temperatura entre 20ºC y 100ºC. La temperatura de reacción preferida es aproximadamente de 75ºC. El calentamiento de la mezcla de reacción se puede realizar del modo normal pero también mediante calentamiento por microondas. La reacción también se puede realizar mediante la aplicación de ultrasonidos, p.ej., llevando a cabo las reacciones en un baño de ultrasonidos a temperatura ambiente, lo que normalmente conduce a la misma velocidad de reacción a una temperatura de reacción menor.

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El compuesto de la fórmula general (I) obtenido es muy adecuado para la marcación de sustratos biológicamente activos, como aminoácidos, péptidos, proteínas, glúcidos, pequeñas moléculas que se unen a receptores o células. 40

Ejemplos de péptidos que se pueden marcar son factores de crecimiento, somastostatina, bombesina, insulina, LHRH, gastrina, gastroliberina, tiroliberina, tirotropina, prolactina, péptido intestinal vasoactivo (VIP), péptido activador de la adenilato ciclasa hipofisaria (PACAP), angiotensina, neurotensina, interferones, IL-1, IL-4 e IL-6, anticuerpos monoclonales y sus análogos y derivados. Después de la marcación con una sustancia marcadora adecuada, estos péptidos se pueden, p. ej., utilizar para la detección y la localización del tratamiento de los tumores humanos malignos.

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Ejemplos de glúcidos que se pueden marcar son la glucosa, la desoxiglucosa y los derivados de dichos compuestos. Las pequeñas moléculas que se unen a receptores se definen como moléculas no peptídicas que se unen a un receptor y que generalmente tienen una masa molecular por debajo de 500 Da aproximadamente. 50

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Ejemplos de pequeñas moléculas que se unen a receptores que se pueden marcar son sustancias para el sistema serotonérgico como se describe en WO 96/30054 o sustancias para el sistema dopaminérgico (p.ej., racloprida, βCIT, lisurida), para el sistema colinérgico (p.ej., epibatidina), para el sistema glutaminérgico (p.ej., mematina) o para el sistema benzodiacepínico (p.ej., flumazenil, iomazenil). Ejemplos de moléculas metabólicas activas que se pueden marcar son la DOPA, la tirosina, la mIBG, la MAO-I y los análogos de las mismas. Ejemplos de células que se pueden marcar son los eritrocitos y los leucocitos.

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Como resultado de la marcación de sustratos (biológicamente activos) con un compuesto de la fórmula general I se obtiene un compuesto coordinado adicional de la fórmula general. fac − [M(CO)3 (X2 )L1 ]n

(II),

fac − [M(CO)3 (X)L2 ]n

(III) o

fac − [M(CO)3 L3 ]n

(IV),

5

ES 2 223 559 T3 en las que: M es Mn, 99m Tc, 186 Re o 188 Re; 5

L1 es un ligando monodentado; L2 se selecciona del grupo que consta de un ligando bidentado y dos ligandos monodentados; y

10

L3 se selecciona del grupo que consta de un ligando tridentado, un ligando monodentado y un ligando bidentado, y tres ligandos monodentados; X es H2 O o un ión halogenuro; n es la suma de la carga de los ligandos L1 o L2 o L3 y X incrementada con una carga positiva.

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Después de la reacción de marcación, el ligando X generalmente es H2 O. Sin embargo, uno de los ligandos H2 O se puede reemplazar por un ión halogenuro, cuando está disponible, para neutralizar la carga del complejo. Éste es el caso, a menudo, para los compuestos de la fórmula general III. 20

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Cuando el ligando L1 , L2 o L3 antes y/o después de la marcación con el compuesto tricarbonílico metálico facial es la molécula biológicamente activa, la presente invención ofrece un acceso fácil a los compuestos que se pueden utilizar directamente como un agente de diagnóstico o terapéutico. Ejemplos de ligandos monodentados dentro de la definición de L1 , L2 y L3 son sustratos (biológicamente activos) con grupos sustituyentes como fosfinas, isonitrilos, nitrilos, imidazoles, tioéteres y aminas aromáticas del tipo de la piridina. Ejemplos de ligandos bidentados dentro de la definición de L2 y L3 son sustratos (biológicamente activos) que llevan grupos de piridina, imidazol o pirazol, como histidina, histamina, sistemas de imidazol funcionalizados, tioéteres bidentados, isocianuros biodentados, ligandos del tipo base Schiff y ácido picolínico. Ejemplos de ligandos tridentados dentro de la definición de L3 son tris-pirazolil-borato, tris-pirazolil-metano, trisimidazolil-borato, tris-pirazolil-metano, 1,4,7,-tritiaciclononano (9-anoS3 ) y triazaciclononano (9-anoN3 ), histidina, metionina, derivados de la cisteína en el grupo tiol para obtener un tioéter y derivados del ciclopentadienilo. En algunos casos puede resultar ventajoso preparar el compuesto bioactivo radiomarcado en una etapa. Este objetivo se puede lograr de acuerdo con la presente invención, con un método para preparar un compuesto de la fórmula general.

40

fac − [M(CO)3 (X)2 L1 ]n

(II),

fac − [M(CO)3 (X)L2 ]n

(III) o

fac − [M(CO)3 L3 ]n

(IV),

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en las que: M es Mn, 99m Tc, 186 Re o 188 Re; L1 es un ligando monodentado,

55

L2 se selecciona del grupo que consta de un ligando bidentado y dos ligandos monodentados, y L3 se selecciona del grupo que consta de un ligando tridentado, un ligando monodentado y un ligando bidentado, y tres ligandos monodentados;

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X es H2 O o un ión halogenuro; n es la suma de la carga de los ligandos L1 o L2 o L3 y X aumentada con una carga positiva;

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caracterizado en que una mezcla de una base, ligandos L1 , o L2 o L3 , un reductor soluble en agua pero que no se descompone en agua de manera apreciable y, opcionalmente, se disuelve un estabilizador en un sistema disolvente acuoso que contiene una disolución del metal en forma de permanganato, pertecnetato o perrenato en presencia de monóxido de carbono y, opcionalmente, en presencia de un halogenuro. 6

ES 2 223 559 T3

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Sobretodo en el caso de compuestos radiomarcados, frecuentemente es imposible poner a disposición del usuario la composición lista para usar, debido a la a menudo escasa vida útil del compuesto radiomarcado y/o a la corta semivida del radionúclido utilizado. En tales casos, el usuario llevará a cabo la reacción de marcación con el metal en el hospital clínico o en el laboratorio. Por lo tanto, con este propósito, se ofrecen al usuario los diversos componentes para la reacción en la forma que se denomina “kit”. Resultará obvio que las manipulaciones necesarias para realizar la reacción deseada deberían ser lo más simples posibles para permitir al usuario preparar, a partir del kit, la composición radiomarcada utilizando los recursos que tiene a su disposición. Por lo tanto, la invención también se refiere a un kit para preparar una composición de marcación, la cual contiene un compuesto de fórmula I como el agente marcador. Tal kit para marcar un sustrato biológicamente activo, de acuerdo con la presente invención, comprende (i) un reductor soluble en agua pero que no se descompone en agua de manera apreciable, (ii) una base, (iii) si se desea, un estabilizador y/o un quelante, (iv) si se desea, uno o más excipientes inertes farmacéuticamente aceptables y/o formulaciones y/o aditivos, al menos uno de los componentes mencionados de (i) a (iv) se almacena en un recipiente con una atmósfera que contiene una cantidad suficiente de monóxido de carbono, los mencionados componentes de (i) a (iv) opcionalmente se combinan independientemente, y (v) instrucciones de uso con un protocolo para hacer reaccionar los componentes del kit con un metal (M) seleccionado del grupo que consta de Mn, 99m Tc, 186 Re o 188 Re en la forma de disolución de permetalato. Preferiblemente, el kit comprende una formulación liofilizada que incluye en un tampón borato básico y un reductor soluble en agua pero que no se descompone en agua de manera apreciable, la mezcla se sella en un recipiente que tiene una cámara de aire que comprende monóxido de carbono, mucho más preferiblemente monóxido de carbono sustancialmente puro. En otras realizaciones, el kit puede incluir un metal (M) como se ha definido arriba. Y aún en otras realizaciones, el kit puede incluir un ligando (Lx ), que preferiblemente es un ligando aminopolicarboxilato multidentado. Es mérito de la presente invención, describiendo una forma fácil de preparar compuestos metálicos tricarbonílicos faciales dentro de un marco de tiempo que es razonable comparado con el tiempo de semivida de los isótopos radioactivos implicados y con altos rendimientos, que se pueda preparar un kit para marcar sustratos biológicamente activos con dichos compuestos metálicos tricarbonílicos faciales. En algunos casos, puede resultar ventajoso adjuntar un sustrato bioactivo al kit para que se obtenga un kit para preparar una composición radiofarmacéutica. Alternativamente, el compuesto biológicamente activo se forma tras hacer reaccionar el ligando con el compuesto tricarbonílico metálico facial.

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Tal kit para preparar una composición farmacéutica terapéutica y de diagnóstico, de acuerdo con una realización diferente de la presente invención, comprende (i) un sustrato adecuado que se marcará con un metal seleccionado del grupo que consta de Mn, 99m Tc, 186 Re o 188 Re, (ii) un reductor soluble en agua pero que no se descompone en agua de manera apreciable, (iii) una base, (iv) si se desea, un estabilizador y/o un quelante, (v) si se desea, uno o más excipientes inertes farmacéuticamente aceptables y/o formulaciones y/o aditivos, al menos uno de los mencionados componentes de (i) a (v) que se almacenan en un recipiente que tiene una atmósfera que contiene una cantidad suficiente de monóxido de carbono, los mencionados componentes de (i) a (v) opcionalmente se combinan independientemente y (vi) instrucciones de uso con un protocolo para hacer reaccionar los ingredientes del kit con el mencionado metal en forma de una disolución de permetalato. La preparación de la composición farmacéutica de diagnóstico y terapéutica con la ayuda del kit arriba mencionado adjuntando un sustrato (biológicamente activo) puede tener lugar en dos realizaciones alternativas. En la primera realización, el compuesto metálico tricarbonílico facial se prepara primero y a continuación se hace reaccionar con el sustrato a marcar. En la segunda realización, la etapa de reducción se lleva a cabo en presencia del sustrato a marcar, lo que conduce directamente al compuesto marcado.

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A continuación, la invención se describirá con mayor detalle con referencia a los siguientes ejemplos específicos, que se ofrecen a modo de ilustración y que no pretenden limitar la invención de ninguna manera. Se utilizan técnicas estándares bien conocidas en la técnica anterior o las técnicas específicamente descritas más abajo. 55

Ejemplo 1 Síntesis del [99m Tc(OH2 )3 (CO)3 ]+

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En un vial cerrable de 10 mL se ponen juntos los siguientes productos químicos: 5,5 mg de NaBH4 ,4,0 mg de Na2 CO3 y 20,0 mg de tartrato de sodio y potasio. El vial se cierra con un tapón seroso y se hace pasar monóxido de carbono gaseoso durante 10 minutos con la ayuda de una jeringuilla. Se añaden, a través del tabique, 3 mL de una disolución de NaCl al 0,9% desde un generador de Mo-99/Tc-99m, con una actividad en torno a 100 mCi, el vial se calienta a 75ºC durante 30 minutos y a continuación se enfría a temperatura ambiente. El producto se analiza mediante TLC (cromatografía en capa fina) en placas de gel de sílice estándares de Merck con metanol/HCl concentrado (99/1) como fase móvil y a continuación se analiza la placa de gel de sílice por medio de un escáner de radioactividad. El rendimiento de la reducción del pertecnetato a [99m Tc(OH2 )3 (CO)3 ]+ facial es superior al 95% de acuerdo con la TLC. Después de neutralizar la disolución con una disolución de PBS (tampón fosfato, pH = 7,4, salino al 0,9%), se obtiene una disolución fisiológica neutra adecuada para marcar. 7

ES 2 223 559 T3 La tabla 1 muestra que se pueden obtener, bajo diferentes condiciones de reacción, disoluciones de [99m Tc(OH2 )3 (CO)3 ]+ con una actividad de hasta 700 mCi. TABLA 1 5

Preparación de [99m Tc(OH2 )3 (CO)3 ]+ bajo diferentes estados de reacción

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ES 2 223 559 T3 Ejemplo 2 Preparación de péptidos radiomarcados 5

10

Se prepararon, como se describe abajo en este ejemplo, complejos de [99m Tc(CO)3 (n-DTPA-Y3 -octreotato)], [99m Tc (CO)3 (iso-DTPA-Y3 -octreotato)] y [99m Tc(CO)3 (DTPA’-Y3 -octreotato)]. Aunque cada uno de los tres compuestos discutidos aquí comprenden un péptido de octreotato, se pueden fabricar de manera similar los complejos con otras biomoléculas como proteínas, glúcidos, etc. Éstas incluyen, pero no se limitan a, los péptidos discutidos en WO 98/48848, p.ej., anticuerpos, His-neurotensina y scFv. La síntesis de los octreotatos tricarbonílicos de 99m Tc se basó en el siguiente procedimiento de dos etapas. Etapa 1 Preparación del [99m Tc(CO)3 (OH)2 )3 ]+

15

20

En la primera etapa, se añadió 99m TcO4 − de un generador comercial (50-150 mCl, 1 mL) a un vial que contenía 2 mg de NaBH4 , 10 mg de tartrato de sodio y potasio y 2 mg de Na2 CO3 . El vial se tapa y se plisa y a continuación se hace pasar monóxido de carbono gaseoso por la cámara de aire durante 5 minutos. Posteriormente, la preparación se agitó y se calentó durante 10 minutos a 100ºC para producir el intermediario 99m Tc(I)-tricarbonilo. El control de calidad efectuado mediante HPLC en fase inversa [columna C-18 con un gradiente de TEAP (fosfato tetraetilamónico) a 0,05 M, pH = 2,25 y metanol] mostró una pureza radioquímica superior al 95% (tiempo de retención = 4,3 minutos). Etapa 2

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[99m Tc(CO)3 (DTPA’-Y3 -octreotato)] En la segunda etapa, se añadió 0,1 mL del intermediario [99m Tc(CO)3 (OH2 )3 ]+ a un vial que contenía 1,0 mL de tampón fosfato salino (PBS). A continuación se añadieron 50-125 µg del complejo peptídico DTPA’-Y3 -octreotato y la disolución resultante se calentó durante 30 minutos a 75ºC. La separación del complejo radiomarcado de las impurezas radioquímicas se efectuó utilizando un cartucho C-18 Sep-Pak de Waters. El cartucho se acondicionó primero con etanol y seguidamente se lavó con agua. A continuación, la mezcla de reacción se aplicó en la parte superior del cartucho, se lavó con agua para eliminar las impurezas radioquímicas y el producto se eluyó posteriormente con etanol. El control de calidad efectuado mediante HPLC en fase inversa (columna C-18 con un gradiente de TEAP 0,05 M y metanol) mostró una pureza radioquímica superior al 95% (tiempos de retención = 20-21 minutos). El [99m Tc (CO)3 (iso-DTPA-Y3 -octreotato)] y el [99m Tc(CO)3 (n-DTPA-Y3 -octreotato)] se prepararon exactamente como lo fue el [99m Tc(CO)3 (DTPA’-Y3 -octreotato)] excepto en que se utilizó un complejo peptídico iso-DTPA-Y3 -octreotato o nDTPA-Y3 -octreotato en lugar del complejo DTPA’-Y3 -octreotato. En la tabla 2 se proporcionan los datos resumidos para los tres Y3 -octreotatos radiomarcados.

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TABLA 2

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9

ES 2 223 559 T3 Ejemplo 3 Preparación de sustratos biológicos radiomarcados utilizando [99m Tc(CO)3 (OH2 )3 ]+ y ligandos aminopolicarboxilatos 5

10

En los estudios presentados en el ejemplo 5 de la presente invención, se encontró que el DTPA’-Y3 -octreotato presenta mejores características de biodistribución que el iso-DTPA-Y3 -octreotato y el n-DTPA-Y3 -octreotato. Por lo tanto, se han realizado estudios adicionales con el DTPA’-Y3 -octreotato. Este ejemplo describe variaciones menores de los métodos del ejemplo 2 para preparar este compuesto. Estos métodos se prefieren a los métodos del ejemplo 2 y hemos descubierto que son preferibles a los métodos descritos en WO 98/48848. Etapa 1 Preparación del [99m Tc(CO)3 (OH)2 )3 ]+

15

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A 10 mL de un vial tubular sellado que contiene la siguiente formulación liofilizada: 20 mg de lactosa monohidratada, 13 mg de ácido L-tartárico, 7,6 mg de KBH4 , tampón borato a pH = 11,6 y monóxido de carbono en la cámara de aire, se le añaden 2 mL de 99m TcO4 − de un generador comercial (50-200 mCi). Se agita vigorosamente el vial durante 30 segundos y se coloca en un baño de agua hirviendo durante 15 minutos. El control de calidad efectuado mediante HPLC en fase inversa (columna C-18 con un gradiente de TEAP 0,05 M a pH = 2,25 y metanol) mostró una pureza radioquímica superior al 90% (tiempo de retención = 4,3 minutos). Etapa 2

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30

[99m Tc(CO)3 (DTPA’-Y3 -octreotato)] En la segunda etapa, se añadieron 0,3 mL del intermediario [99m Tc(CO)3 (OH2 )3 ]+ a un vial de 2,0 mL seguidos de 35-40 µL de HCl 1 N. Se añadieron 100 µg del péptido y la disolución resultante se calentó durante 35 minutos a 75ºC. La separación del complejo radiomarcado de las impurezas radioquímicas se efectuó utilizando un cartucho C-18 Sep-Pak de Waters. Primero se acondicionó el cartucho con etanol y luego se lavó con agua. A continuación, la mezcla de reacción se aplicó en la parte superior del cartucho, se lavó con agua para eliminar las impurezas radioquímicas y, posteriormente, el producto se eluyó con etanol. El control de calidad efectuado mediante HPLC en fase inversa (columna C-18 con un gradiente de TEAP 0,05 M y metanol) mostró una pureza radioquímica superior al 95% (tiempos de retención = 19-21 minutos). Actividad específica: 250 Ci/mmol.

35

Ejemplo 4 Preparación del [99m Tc(CO)3 (IDA-glucosa) 40

45

Además de los complejos de octreotato discutidos anteriormente, se sintetizó para estudio [99m Tc(CO)3 (IDA-glucosa)]. La preparación de [99m Tc(CO)3 (OH2 )3 ]+ se sintetizó como en la primera etapa del ejemplo 3. A continuación, para la segunda etapa, se añadieron primero 0,3 mL del intermediario [99m Tc(CO)3 (OH2 )3 ]+ a un vial de 2,0 mL y seguidos de 35-40 µL de HCl 1 N. Se añadió 1 mg del análogo de glucosa y la disolución resultante se calentó durante 60 minutos a 75ºC. La separación del complejo radiomarcado de las impurezas radioquímicas se efectuó utilizando un cartucho C-18 Sep-Pak de Waters. El cartucho se acondicionó primero con etanol y luego se lavó con agua. A continuación, la mezcla de reacción se aplicó en la parte superior del cartucho, se lavó con agua para retirar las impurezas radioquímicas y, posteriormente, el producto se eluyó con etanol. El control de calidad efectuado mediante HPLC en fase inversa (columna C-18 con un gradiente de TEAP 0,05 M y metanol) mostró una pureza radioquímica superior al 95% (tiempos de retención = 16-17 minutos).

50

Ejemplo 5 Biodistribución de los [99m Tc(CO)3 (DTPA-octreotatos)] en ratas Lewis con el tumor CA20948 55

Estos estudios se efectuaron para evaluar la biodistribución y el potencial radiográfico de estos compuestos en ratas Lewis que portan implantes de tumores pancreáticos de rata CA20948. A) Métodos

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65

Para cada estudio, se anestesiaron seis (6) ratas Lewis macho que portaban implantes del tumor CA20948 con Metofane gaseoso y se les inyectaron por la vena yugular 200 µL (utilizando los compuestos del ejemplo 2) o 50 µL (utilizando los compuestos del ejemplo 3) del producto a prueba que contenía una actividad de ∼50 µCi. Se radiografiaron los animales durante 100 000 cuentas en una gammacámara a los 30 minutos (n = 3) y a las 4 horas (n=3) después de la inyección, después de lo cual se sacrificaron y se retiraron para el ensayo los siguientes tejidos: sangre, hígado, riñones, músculo, bazo, páncreas, intestino delgado, glándulas suprarrenales y tumor. Los datos se presentan como el porcentaje de la dosis inyectada por gramo y el porcentaje de la dosis inyectada por órgano entero. Los datos comparativos también se representan gráficamente. 10

ES 2 223 559 T3 B) Resultados

5

10

Las partes blandas de la sangre, del hígado y del músculo sugirieron una captación relativamente baja. Los tejidos que expresaban el receptor de somatostatina del páncreas, glándulas suprarrenales y tumor sugirieron una captación importante y sostenida. Las gammagrafías de los animales sugirieron una captación suficiente del agente en el tumor. La cantidad de actividad en el hígado y en el tubo digestivo con [99m Tc(CO)3 (DTPA’-Y3 -octreotato)] es significativamente menor en comparación con [99m Tc(CO)3 (His-Y3 -octreotato)]. Los resultados de este estudio (tabla 3 para los compuestos del ejemplo 2 y de la tabla 4, figura 2 para los compuestos del ejemplo 3) indican que estos compuestos se circunscribían en los tejidos que expresaban el receptor de somatostatina del páncreas, glándulas suprarrenales y tumor con menos captación y eliminación hepatobiliarias con [99m Tc (CO)3 (DTPA’-Y3 -octreotato)] en comparación con [99m Tc(CO)3 (His-Y3 -octreotato)]. Los péptidos utilizados son:

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Ejemplo 6 30

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Excreción por la orina y metabolismo del [99m T(CO)3 (DTPA’-Y3 -octreotato)] frente al [99m Tc(CO)3 (His-Y3 -ocreotato)] Durante los estudios de biodistribución general, se ligó un animal más por estudio para prevenir la micción antes de la inyección. Se mantuvo anestesiado al animal durante 3 horas después de la inyección y luego se sacrificó y se retiró la orina. Se midieron el volumen y la actividad de la orina, y se analizó una muestra mediante HPLC utilizando el método descrito arriba. Ambos compuestos permanecieron prácticamente intactos tal como determinó el análisis mediante HPLC. El porcentaje de la eliminación por el riñón del [99m Tc(CO)3 (DTPA’-Y3 -octreotato)] es casi el doble que la del [99m Tc(CO)3 (His-Y3 -octreotato)]. Los resultados se muestran en la tabla 5. TABLA 3 Tiempo: 30 minutos

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ES 2 223 559 T3 Tiempo: 4 horas

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TABLA 4 30

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ES 2 223 559 T3 Ejemplo 7 Estudio de competición de los receptores SST-2 en ratas Lewis CA20948 utilizando Y3 -octreotato frío para determinar la especificidad para el [99m Tc(CO)3 (DTPA’-Y3 -octreotato)] 5

Se utilizaron dos ratas para cada grupo. El grupo 1 recibió 500 µL de PBS administrados por vía subcutánea en la nuca 30 minutos antes de la inyección del [99m Tc(CO)3 (DTPA’-Y3 -octreotato)]. El grupo 2 recibió 350 µg del Y3 octreotato en 500 µL de tampón fosfato salino (PBS) administrados por vía subcutánea en la nuca 30 minutos antes de la inyección de [99m Tc(CO)3 (DTPA’-Y3 -octreotato)].

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Treinta minutos después de la inyección del péptido frío o del control salino, se anestesiaron los animales con gas Metofane y se les inyectaron 50 µL (50 µCi) de [99m Tc(CO)3 (DTPA’-Y3 -octreotato)]. A las tres horas después de la inyección se sacrificaron los animales, se tomaron muestras de sangre y, a continuación, se realizó una gammagrafía a las ratas durante 100 000 cuentas (figura 3). Al finalizar la gammagrafía, se realizó la autopsia a los animales y se les retiraron los siguientes tejidos para el radioanálisis: hígado, riñones, músculo, bazo, corazón, páncreas, glándulas suprarrenales y tumor. Los datos se calcularon como el porcentaje de la dosis inyectada por gramo y el porcentaje de la dosis inyectada por órgano entero. Los datos se muestran en la tabla 6 y en la figura 4. En los animales con el receptor de la somatostatina bloqueado, la captación en los tejidos que expresan el receptor de somastostatina se redujo considerablemente en torno al 90% en el tumor, al 95% en el páncreas y al 81% en las glándulas suprarrenales. La sangre, el hígado, el riñón, el músculo, el bazo y el corazón no cambiaron de manera significativa entre los dos grupos de animales. Los datos indican que el [99m Tc(CO)3 (DTPA’-Y3 -octreotato)] es específico del receptor.

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(Tabla pasa a página siguiente) 30

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Aunque la invención se ha descrito en esta solicitud de patente haciendo referencia a los detalles de las realizaciones preferidas de la invención, debe entenderse que la descripción pretende tener un sentido ilustrativo en lugar de limitador, ya que se contempla el que los expertos en la técnica realizarán modificaciones fácilmente, dentro del espíritu de la invención y del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

15

ES 2 223 559 T3 Lista de referencias Alberto R, et al. (1994a). J. Nucl. Biol. Med. 38: 388-90. 5

Alberto R, et al. (1994b). A Low CO pressure synthesis of (NEt)2 [MX3 (CO)3 ] (M = Tc, Re) and its Substitution Behaviour in Water and Organic Solvents. Technetium in Chemistry and Nuclear Medicine, No 4, Cortina International, Milano. Patente de los EE.UU. núm. 4.232.000, Fawzi, hecha pública el 4 de noviembre de 1980.

10

Patente de los EE.UU. núm. 4.233.284, Fawzi, hecha pública el 11 de noviembre de 1980. WO 98/48848 15

WO 96/30054

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16

ES 2 223 559 T3 REIVINDICACIONES 1. Un método para preparar un compuesto de fórmula. 5

fac − [M(CO)3 (OH2 )3 ]+

(I)

en la que M es Mn, 99m Tc, 186 Re o 188 Re, 10

15

que comprende hacer reaccionar un metal en forma de permetalato con monóxido de carbono y un reductor, en el que una mezcla de tampón borato básico y un reductor soluble en agua pero que no se descompone en agua de manera apreciable se disuelve en un sistema disolvente acuoso que contiene una dislolución del metal en forma de permanganato, pertecnetato o perrenato en presencia de monóxido de carbono. 2. El método de la reivindicación 1, en el que la mencionada mezcla además incluye un estabilizador. 3. El método de la reivindicación 1, en el que el mencionado reductor es KBH4 .

20

4. El método de la reivindicación 1, en el que la mencionada mezcla además incluye lactosa. 5. El método de la reivindicación 1, en el que la mencionada mezcla además incluye ácido L-tartárico. 6. Un método para preparar un compuesto de fórmula

25

fac − [M(CO)3 LX ]n

(II)

en la que: 30

M es Mn, 99m Tc, 186 Re o 188 Re; Lx es un aminopolicarboxilato; y

35

n es una carga del ligando Lx aumentada con una carga positiva; que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (I) preparado de acuerdo con la reivindicación 1 con el ligando Lx .

40

7. El método de la reivindicación 6, en el que la reacción con el ligando Lx tiene lugar en presencia de un halogenuro. 8. El método de la reivindicación 6, en el que LX comprende un sustrato biológicamente activo seleccionado del grupo que consta de aminoácidos, péptidos, proteínas, glúcidos, moléculas pequeñas que se unen a receptores y células del cuerpo.

45

9. El método de la reivindicación 6, en el que dicho método se realiza entre unos 20ºC y 100ºC. 10. El método de la reivindicación 6, en el que dicho método se realiza en torno a 75ºC. 50

55

11. El método de la reivindicación 6, en el que el mencionado ligando aminopolicarboxilato se selecciona del grupo que consta de ácido dietilen-triamino-pentaacético (DTPA), ácido etilen-diamino-tetraacético (EDTA), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA), ácido iminodiacético (IDA), ácido nitrilotriacético y triazaciclononanotriacetato. 12. El método de la reivindicación 6, en el que dicho ligando aminopolicarboxilato no es bidentado. 13. El método de la reivindicación 6, en el que dicho ligando aminopolicarboxilato es tridentado. 14. Un compuesto de fórmula

60

fac − [M(CO)3 Lx ]n en la que: 65

M es Mn, 99m Tc, 186 Re o 188 Re; Lx es un ligando aminopolicarboxilato multidentado; y 17

(II)

ES 2 223 559 T3 n es la suma de la carga de los ligandos Lx . 15. El compuesto de reivindicación 14, en el que Lx no es un ligando bidentado. 5

16. Un kit para llevar a cabo el método de la reivindicación 1, que comprende una formulación liofilizada que incluye un tampón borato básico y un reductor soluble en agua pero que no se descompone en agua de manera apreciable, siendo sellada dicha mezcla en un recipiente que tiene una cámara de aire que comprende monóxido de carbono.

10

17. El kit de la reivindicación 16, en el que la mencionada cámara de aire es monóxido de carbono sustancialmente puro. 18. El kit de la reivindicación 16, en el que el mencionado reductor es KBH4 .

15

19. El kit de la reivindicación 16, en el que la mencionada formulación además incluye lactosa. 20. El kit de la reivindicación 16, en el que la mencionada formulación además incluye ácido L-tartárico. 21. El kit de la reivindicación 16, que además incluye un metal M que es Mn, 99m Tc, 186 Re o 188 Re.

20

22. Un kit para llevar a cabo el método de la reivindicación 6, que comprende una formulación liofilizada que incluye un tampón borato básico, un reductor soluble en agua pero que no se descompone en agua de manera apreciable y un metal M que es Mn, 99m Tc, 186 Re o 188 Re. 25

23. El kit de la reivindicación 22, en el que el mencionado reductor es KBH4 . 24. El kit de la reivindicación 22, en el que la mencionada formulación además incluye lactosa. 25. El kit de la reivindicación 22, en el que la mencionada formulación además incluye ácido L-tartárico.

30

26. El kit de la reivindicación 22, que además comprende un ligando Lx que es un ligando aminopolicarboxilato multidentado. 27. El kit de la reivindicación 26, en el que Lx no es un ligando bidentado. 35

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ES 2 223 559 T3

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