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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 214 656

51 Int. Cl. : A01N 1/00

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A01N 1/02

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

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86 Número de solicitud europea: 98105964 .5

86 Fecha de presentación: 19.10.1995

87 Número de publicación de la solicitud: 0853881

87 Fecha de publicación de la solicitud: 22.07.1998

54 Título: Conservación prolongada de plaquetas sanguíneas.

30 Prioridad: 19.10.1994 US 326036

73 Titular/es: LIFECELL CORPORATION

3606-A Research Forest Drive The Woodlands, Texas 77381, US

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.09.2004

72 Inventor/es: Livesey, Stephen A.;

Connor, Jerome y Currie, Laura M.

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Díez de Rivera de Elzaburu, Alfonso

ES 2 214 656 T3

16.09.2004

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 214 656 T3 DESCRIPCIÓN Conservación prolongada de plaquetas sanguíneas. 5

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Esta invención se refiere a un método para prolongar el periodo de validez de las plaquetas sanguíneas humanas. La invención se refiere, concretamente, a un sistema inhibidor reversible y a un método que inhibe la activación biológica de las plaquetas durante el almacenamiento a temperaturas de refrigeración (4ºC) o temperaturas de congelación (-80ºC), si bien mantiene en las plaquetas la capacidad de recuperar las reacciones normales una vez retirado el sistema inhibidor. La composición y método de esta invención posibilitan el almacenamiento de plaquetas a crio-temperaturas y la recuperación de la función a un nivel anteriormente imposible de alcanzar. Las transfusiones de plaquetas se usan frecuentemente en el tratamiento de pacientes. Las transfusiones de plaquetas no se administran sólo a víctimas de accidentes que sufren pérdidas masivas de sangre, sino también a pacientes sometidos a quimioterapia. La quimioterapia reduce el número de plaquetas del paciente y además provoca que la función de las plaquetas presentes sea defectuosa. Por ejemplo, en los casos de trombocitopenia, el paciente presenta una disminución del número de plaquetas causada por supresión de la médula ósea, mientras que un paciente que sufre miocarditis hemorrágica puede tener plaquetas que se han convertido en funcionalmente defectuosas por acción de la quimioterapia. Las transfusiones de plaquetas se usan para aumentar el número de plaquetas en el tratamiento de enfermedades, tales como trombocitopenia, y para reemplazar plaquetas funcionalmente defectuosas en el tratamiento de la miocarditis hemorrágica. Las plaquetas sanguíneas se deben almacenar a la temperatura más baja posible, con objeto de reducir la función metabólica y el desarrollo de contaminantes. Actualmente, las plaquetas se almacenan hasta 5 días a 22ºC. Este tiempo de almacenamiento está limitado por una disminución en el pH, debida al aumento de lactato asociado con la actividad metabólica anaeróbica. El almacenamiento a 22ºC se ve también limitado por el crecimiento bacteriano potencial. La refrigeración ofrece ventajas sobre el almacenamiento a 22ºC con respecto a función metabólica, contaminación y estabilidad de pH. Sin embargo, el almacenamiento refrigerado tiene como consecuencia múltiples problemas inherentes. En primer lugar, después de unas 24 horas de almacenamiento refrigerado, las plaquetas experimentan un cambio de forma, pasando de forma discoidal a configuración esférica. En segundo lugar, después de 24-48 horas de almacenamiento refrigerado, la agregación espontánea aumenta. En tercer lugar, las plaquetas almacenadas a 4ºC no consiguen recuperar su actividad funcional después del periodo de almacenamiento. Finalmente, las plaquetas que han sufrido lesión durante el almacenamiento a 4ºC son retiradas de la circulación por el bazo después de la transfusión. Los objetivos del almacenamiento refrigerado de plaquetas son conservar un alto número de plaquetas, prolongar el tiempo durante el que las plaquetas se pueden conservar, mantener la integridad funcional de las plaquetas y tener la seguridad de que la duración de su vida circulatoria in vivo se aproxima a los límites normales. Esto se puede conseguir mediante el uso del sistema inhibidor de esta invención, debido a que bloquea las vías que son esenciales para la activación, convirtiendo así a la plaqueta en no susceptible a los daños inducidos a 4ºC. Dado que las plaquetas frescas tienen un periodo de validez de sólo 3 a 5 días a 22ºC (temperatura ambiente), los métodos para prolongar el periodo de validez deben ser beneficiosos. Desgraciadamente, a pesar del número de intentos para optimizar el almacenamiento de plaquetas, los cambios progresivos en la forma de las células (que tienen como resultado la disfunción biológica) y el deterioro permanente del potencial de agregación subsiguiente continúan limitando el almacenamiento de plaquetas. Además, las plaquetas desarrollan durante el almacenamiento lesiones que provocan que sean retiradas de la circulación, predominantemente por el bazo, durante el primer tránsito que sigue a la transfusión. Por ejemplo, el periodo típico de vida de una plaqueta normal en el cuerpo humano es aproximadamente ocho días. Los intentos recogidos en la técnica anterior de almacenar plaquetas durante periodos de tiempo prolongados tienen como resultado la creación de plaquetas modificadas por lesión. Mediante las técnicas previas, se pueden recuperar numéricamente, después del almacenamiento, aproximadamente el 80% - 90% de las plaquetas almacenadas, pero sólo el 20% - 35% permanecen activas después del primer flujo circulatorio a través del bazo. Esto es debido a que el bazo filtra las plaquetas modificadas por lesión. El uso de las composiciones y métodos de esta invención resulta, como en la técnica anterior, en el mismo 80% - 90% recuperado en términos numéricos, pero, dado que no se producen plaquetas modificadas por lesión, 65% a 80% de las plaquetas reactivadas deben funcionar biológicamente durante el tiempo típico en el cuerpo humano.

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Varios métodos, tales como reducción de la temperatura de almacenamiento, técnicas de crioconservación, aditivos y medios de almacenamiento artificiales, dan lugar a un aumento del número de plaquetas después del almacenamiento. Sin embargo, la capacidad funcional y persistencia en la circulación de las plaquetas recuperadas por estos métodos es limitada. Hospitales y bancos de sangre tienen gran necesidad de un sistema de almacenamiento de plaquetas que proporcione un número aumentado de plaquetas después del almacenamiento, pero que además impida la agregación de las plaquetas durante el almacenamiento y posibilite que continúen reteniendo su capacidad de reaccionar normalmente una vez que hayan sido transfundidas a un paciente, lo que incluye la capacidad de las plaquetas para permanecer en el torrente sanguíneo y no ser eliminadas. Todo esto se puede conseguir mediante un sistema de almacenamiento de plaquetas que: impida la formación de agregados de plaquetas durante el almacenamiento; posibilite que las plaquetas recuperen la capacidad de reaccionar normalmente una vez retiradas del almacenamiento; y permita que las plaquetas continúen en el torrente sanguíneo y evite que sean eliminadas por el bazo. 2

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Los intentos previos de uso de inhibidores de activación de plaquetas han obtenido un éxito muy limitado. Esto se debe principalmente a que lo presentado en el estado anterior de la técnica se limita, en el intento de conservar la función plaquetaria, al uso de un inhibidor simple. El sistema inhibidor simple da lugar, de cualquier modo, a resultados mejorados con respecto a la ausencia de inhibidor, aunque no se aproxima a los resultados inesperados conseguidos cuando se usan las composiciones y métodos objeto de la invención. Los métodos anteriores de uso de sistemas inhibidores simples se describen en Valeri, Feingold, y Marchionni, A Simple Method for Freezing Human Platelets Using Dimethylsulfoxide and Storage at -80ºC, Blood, Vol. 43, nº 1 (January), 1974 y en Bode, Holme, Heaton y Swanson, Extended Storage of Platelets in an Artificial Medium with the Platelet Activation Inhibitors Prostaglandin E, and Theophyline, Vox Sang 1991:60; 105-112.

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La patente de EE.UU. 4.994.367 de Bode et al. se refiere a una preparación de plaquetas sanguíneas que comprende plaquetas sanguíneas, un estimulador de adenilato ciclasa (teofilina), un inhibidor de fosfodiesterasa (PGE1), un inhibidor de trombina (Thromstop, hirudina o heparina) y un inhibidor de plasmina (aprotinina). La preparación plaquetaria se almacena preferiblemente a temperatura ambiente. En Blood Cells (1992) 18:361-380, Bode y Norris describen la prolongación del periodo de validez de concentrados de plaquetas almacenados a 22ºC mediante la adición de inhibidores de activación de plaquetas y actividad proteasa. Un anticoagulante citrato que contiene PGE1, teofilina, thromstop o hirudina, y aprotinina, fue considerado por los autores, en el momento de la publicación, como la mejor formulación de inhibidores para el almacenamiento a largo plazo de plaquetas en plasma. Contant et al. describen, en Thrombosis Research (1983) 31:365-374, el uso de una mezcla que contiene ácido cítrico, teofilina, adenosina y dipiridamol para impedir la inactivación de heparina en muestras de sangre antes de efectuar el ensayo de laboratorio de heparina. Las muestras de sangre se almacenan hasta cinco horas. En la patente de EE.UU. 4.764.463 de Mason et al., se describe un método de conservación de plaquetas sanguíneas mediante congelación de las plaquetas en contacto con una disolución crioprotectora que contiene prostaciclina para la inhibición de la función plaquetaria.

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La presente invención representa un avance espectacular en cuanto a resultados beneficiosos y sofisticación técnica con respecto a los métodos precedentes. El almacenamiento de plaquetas, reactivación y efectividad funcional a largo plazo de las plaquetas sanguíneas tratadas con las composiciones y métodos de esta invención habían sido considerados anteriormente como imposibles.

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Esta invención proporciona un método para prolongar la conservación de plaquetas sanguíneas humanas, como se define en las reivindicaciones. En el método se utiliza un sistema inhibidor que posibilita que las plaquetas sanguíneas mantengan su forma discoidal y retengan su integridad funcional durante almacenamientos prolongados. Esto se consigue mediante la inhibición de la función plaquetaria normal, lo que ayuda a preservar las plaquetas de la activación biológica durante el almacenamiento.

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El método de esta invención comprende en términos generales un sistema inhibidor que está compuesto por efectores de segundos mensajeros. Este sistema inhibidor de segundo mensajero actúa a través de las siguientes vías: adenosín monofosfato cíclico (AMP cíclico), canal de sodio, guanosín monofosfato cíclico (GMP cíclico), ciclooxigenasa, lipoxigenasa, fosfolipasa, cascada de calcio, proteasa y proteinasa, y modificación de membrana. Más específicamente, para cada una de las vías se pueden usar agentes especiales o combinaciones de agentes. Por ejemplo, adenosina, iloprost, prostaciclina y PGE2 actúan para inhibir la activación a través de la estimulación de la ruta del AMP cíclico. Amilorida y análogos de la amilorida actúan, para inhibir la activación, a través de la inhibición del canal de sodio. Nitroprusiato de sodio y L-arginina actúan, para inhibir la activación, a través de la estimulación de la ruta del GMP cíclico. Aspirina, dipiridamol, flurbiprofeno y ticlopidina actúan, para inhibir la activación, a través de la inhibición de la ruta de la ciclooxigenasa. Aspirina y ticlopidina actúan, para inhibir la activación plaquetaria, a través de la inhibición de la ruta de la lipoxigenasa. La quinacrina actúa, para inhibir la activación plaquetaria, a través de la inhibición de la ruta de la fosfolipasa. El calcio actúa, para promover la activación plaquetaria, a través de la cascada de calcio. Los inhibidores de proteasas y/o proteinasas actúan, para inhibir la agregación plaquetaria, a través de la inhibición de cambios en los receptores de superficie. Amantadina, ajoeno, heparina, ticlopidina y/o pentoxifilina actúan como modificadores de membrana. Los sistemas inhibidores previamente descritos actúan durante el almacenamiento a bajas temperaturas, es decir, de 2º a 8ºC. Cuando se usan temperaturas por debajo de cero (-20º a -135ºC), es beneficioso introducir un agente crioprotector en las plaquetas antes de la criopreparación. Dimetil sulfóxido, maltodextrinas, dextrano, hidroxietil almidón y glucosa son algunos ejemplos, aunque también se pueden usar otros crioprotectores. Los crioprotectores se pueden usar individualmente o en combinación. Un método de preferencia para la conservación de plaquetas humanas comienza por introducir sangre total humana vía venopunción en un tubo evacuado que contiene un anticoagulante. La sangre se centrifuga para aislar de la sangre el plasma rico en plaquetas. El plasma rico en plaquetas se centrifuga para separar el plasma pobre en plaquetas del sedimento de plaquetas, que es el concentrado de plaquetas que se obtiene después de centrifugar y decantar el plasma. A continuación, se añade un sistema inhibidor al plasma pobre en plaquetas. Este sistema inhibidor está constituido por disoluciones de las sustancias siguientes, que se añaden al plasma pobre en plaquetas y resultan en las siguientes concentraciones: de 0,1 mM a 10 mM, de preferencia aproximadamente 1 mM de amilorida en dimetil sulfóxido (DMSO); de 2,5 µM a 250 µM, de preferencia aproximadamente 25 µM de nitroprusiato de sodio (NaNP) en medio salino tamponado con fosfato; de 10 µM a 1 mM, de preferencia aproximadamente 0,1 mM, de adenosina en medio salino tamponado con fosfato; de 10 nM a 1 µM, de preferencia aproximadamente 0,1 µM, de quinacrina en medio salino tamponado con fosfato; de 2 µM a 200 µM, preferiblemente 20 µM, de dipiridamol en DMSO; de 0,5 mM a 5 3

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mM, preferiblemente 1,5 mM, de ticlopidina en DMSO; y de 5 unidades/mL a 200 unidades/mL, preferiblemente 20 unidades/mL, de heparina en medio salino tamponado con fosfato. El sedimento de plaquetas se vuelve a suspender cuidadosamente en la mezcla plasma pobre en plaquetas/sistema inhibidor. A continuación, la mezcla se coloca en un contenedor para almacenamiento de plaquetas y se guarda a 2º-8ºC sin agitación. Un método alternativo de adición de inhibidores consiste en preparar una suspensión de los inhibidores descritos, pero sin adicionar DMSO. Seguidamente, se liofiliza la suspensión. En el momento de la adición, el polvo liofilizado de inhibidores se rehidrata con plasma pobre en plaquetas y se añade a continuación al sedimento de plaquetas. Los demás aspectos del proceso y los intervalos de concentración de los inhibidores son iguales a los descritos anteriormente.

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Para el almacenamiento de plaquetas a temperaturas de -20º a -135ºC se usan las mismas etapas que para el almacenamiento a 4ºC, con dos excepciones. El agente crioprotector, dimetil sulfóxido, forma parte del sistema inhibidor usado para el almacenamiento a temperaturas de -20º a -135ºC, y el contenedor para el almacenamiento de plaquetas debe ser adecuado para el almacenamiento a temperaturas de -20º a -135ºC.

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La activación durante el almacenamiento no es deseable. Sin embargo, las plaquetas deben retener su capacidad para activarse cuando son retiradas del almacenamiento, con objeto de actuar normalmente con respecto a propósitos de transfusión. Cuando las plaquetas se retiran del almacenamiento, el sistema inhibidor de esta invención puede separarse de las plaquetas mediante lavado, lo que permite que vuelvan a un nivel de actividad muy próximo a su nivel normal. Esta etapa de lavado se puede efectuar in vitro mediante lavado mecánico o mediante efecto de dilución de transfusión directa.

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Para determinar si las plaquetas han retenido su capacidad funcional después del almacenamiento, se miden tres parámetros de actividad plaquetaria. Estos parámetros son útiles cuando se comparan con los mismos parámetros referentes a plaquetas frescas. Adicionalmente, se pueden comparar los parámetros de actividad plaquetaria de plaquetas almacenadas con diferentes mezclas inhibidoras, con objeto de determinar qué combinación inhibidora proporciona más plaquetas funcionales después del almacenamiento. Los ensayos usados para medir los parámetros de actividad plaquetaria conservada por esta invención son: número de plaquetas, respuesta al estrés hipotónico, agregación inducida por colágeno y agregación inducida por adenosín difosfato (ADP). Además, la medida de la liberación de sedimentos proporciona información importante sobre la integridad de las plaquetas durante el almacenamiento.

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La respuesta al estrés hipotónico es un ensayo que se usa para determinar si las plaquetas han retenido la viabilidad metabólica. Este ensayo consiste en una medida fotométrica de la capacidad de las plaquetas para superar la adición de una disolución hipotónica. Esta actividad refleja la función celular (es decir, bombeo de agua a través de la membrana funcional) y es indicativa de la recuperación plaquetaria después del almacenamiento. Se ha demostrado que la respuesta al estrés hipotónico es un indicador importante de la capacidad de las plaquetas para sobrevivir en el torrente sanguíneo después de una transfusión. En consecuencia, la respuesta al estrés hipotónico constituye un parámetro crucial de la evaluación de la bioquímica plaquetaria después del almacenamiento. El potencial de agregación es otra característica que demuestra si las plaquetas sanguíneas han mantenido su integridad funcional durante el almacenamiento. Este potencial se mide por medio del uso de ADP y colágeno para inducir la agregación. Un agonista es un agente que se une a un receptor e inicia una determinada respuesta. En la agregación inducida por un agonista, la respuesta es la agregación o acumulación. Los agonistas, ADP y colágeno, se usan para inducir la agregación, con el objetivo de determinar si las plaquetas han retenido su capacidad de agregarse. Además, cuando se efectúan las respuestas de agregación, se puede detectar la presencia de agregación espontánea, es decir, la adhesión de unas plaquetas a otras sin la adición de agonista. La presencia de agregación espontánea se ha correlacionado con la remoción de plaquetas de la circulación y por esa razón tienen tiempos de supervivencia cortos. A. Sistema inhibidor

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El sistema inhibidor de esta invención se basa en la aplicación de efectores de segundos mensajeros específicos, que interaccionan con las plaquetas y estabilizan las células para resistir las pérdidas de viabilidad y actividad funcional durante el almacenamiento a 4ºC y -80ºC. Mezcla de siete componentes

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Los modificadores específicos que constituyen el sistema inhibidor preferido de siete componentes son amilorida, adenosina, nitroprusiato de sodio, quinacrina, dipiridamol, ticlopidina y heparina. Estos modificadores se añaden al sedimento de plaquetas después de la dilución (de un concentrado 100 veces mayor) en plasma autólogo pobre en plaquetas. Cada uno de estos modificadores afecta a una vía diferente de segundo mensajero específico. La amilorida es un diurético conservador de potasio, empleado medicinalmente para el tratamiento de la hipertensión. En esta invención, la amilorida actúa como inhibidor del intercambiador Na+ -H+ de las plaquetas. La adenosina se usa medicinalmente para restablecer el ritmo sinusal normal de los pacientes. En esta invención, la adenosina estimula la producción de AMP cíclico. El nitroprusiato de sodio relaja la musculatura lisa, sirviendo así medicinalmente como vasodilatador. En esta invención, el nitroprusiato de sodio estimula la producción de GMP cíclico. El dipiridamol se emplea medicinalmente como inhibidor de la adhesión plaquetaria. En esta invención, el dipiridamol actúa como inhibidor de las enzimas ciclooxigenasa y lipoxigenasa de la cascada del ácido araquidónico. La quinacrina se usa en el tratamiento para erradicar cestodos intestinales. En esta invención, la quinacrina sirve como inhibidor de la fosfolipasa A2 . Medicinalmente, la ticlopidina se usa como inhibidor de la agregación de plaquetas para reducir el riesgo 4

ES 2 214 656 T3 de derrames cerebrales trombóticos. En esta invención, la ticlopidina se usa como inhibidor de la cascada del ácido araquidónico. La heparina se usa con fines medicinales como agente anticoagulante de la sangre. En esta invención, la heparina se usa para bloquear las uniones de fibrina. 5

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Se ha demostrado que todos los efectores de segundo mensajero inhiben la agregación inducida por agonistas, tanto por separado como en combinación con los otros. Y lo que es más importante, la inhibición es reversible una vez retirado el efector(es) mediante el lavado de las plaquetas. A partir de la adición de los efectores de segundos mensajeros, tanto individualmente como en combinación, las plaquetas se mostraron menos susceptibles a sufrir lesiones durante el almacenamiento a temperaturas de 2º a 8ºC o de -20º a -135ºC. Estas células mostraron también una fisiología de agregación normal después de la remoción del efector(es), no mostraron agregación espontánea y mantuvieron una respuesta alta al estrés hipotónico. En la descripción de los compuestos químicos que han demostrado utilidad como inhibidores de lesiones en plaquetas, debe entenderse que se pretende que estén dentro del ámbito de la invención los compuestos químicos reales mencionados junto con materiales funcionalmente equivalentes. Los compuestos químicos que los solicitantes saben que tienen utilidad conocida o demostrada como inhibidores se publican específicamente en la presente solicitud. Sin embargo, se pretende que el ámbito de la solicitud se extienda a otros compuestos químicos funcionalmente efectivos, tanto a compuestos químicos existentes como a compuestos químicos todavía no descubiertos. Determinados compuestos químicos, que se cree que son materiales funcionalmente equivalentes al inhibidor que actúa a través del canal de sodio, son los seleccionados del grupo consistente en amilorida, análogos de amilorida, bepridil, flecainida, saxitoxina, benzamil y prajnalium. Los materiales que se cree que son funcionalmente equivalentes al inhibidor que actúa a través de la ruta del GMP cíclico se seleccionan del grupo consistente en nitroprusiato de sodio, L-arginina, óxido nitroso, SIN-1, SIN-1A, factor natriurético atrial, vasopresina, oxitocina y trinitrato de glicerilo. Los materiales funcionalmente equivalentes al inhibidor que actúa a través de la ruta de la ciclooxigenasa se seleccionan del grupo consistente en aspirina, dipiridamol, flurbiprofeno, ticlopidina, ketoprofeno, ibuprofeno, indometacina, sulfinpirazona, guanabenz, ácido ursólico y benzohidroquinona. Los materiales funcionalmente equivalentes al componente inhibidor que actúa a través de la ruta de la lipoxigenasa se seleccionan del grupo consistente en aspirina, ticlopidina, ácido ursólico, umbeliferona, ácido araquidónico y esculetina. Finalmente, los materiales funcionalmente equivalentes al inhibidor que actúa a través de la cascada de calcio se seleccionan del grupo consistente en efectores de la proteína quinasa C, bloqueadores del canal del calcio, modificadores de la concentración de calcio, efectores de la calmodulina, ionóforos de calcio y estimuladores de la ATPasa. B. Almacenamiento de plaquetas a 4ºC

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El periodo de validez de las plaquetas sanguíneas se puede prolongar con éxito mediante el almacenamiento de las células a 4ºC con el sistema inhibidor de esta invención. Cuando se analizaron con respecto a su actividad post-almacenamiento las plaquetas almacenadas a 4ºC durante 10 días, el porcentaje de actividad de las células, en comparación con la actividad de las plaquetas frescas, fue el siguiente: 70% de agregación inducida por ADP, 85% de agregación inducida por colágeno, 65% de respuesta al estrés isotónico y > 95% de recuperación de número de células. Estos resultados son favorables en comparación con el almacenamiento convencional de plaquetas a 22ºC después de 5 días de almacenamiento, que dio resultados, en comparación con las plaquetas frescas, de 55% de agregación inducida por ADP, 80% de agregación inducida por colágeno y 50% de respuesta al estrés isotónico. Para llevar a cabo el experimento a 4ºC, se introduce sangre total, vía venopunción, en bolsas de sangre que contienen el anticoagulante citrato ácido de dextrosa, como se determina en los procedimientos y protocolos de la American Association of Blood Banks y se efectúa en las agencias de donación de sangre. Para realizar experimentos a pequeña escala, se puede también introducir sangre total en tubos evacuados de 6 mililitros y llevar a cabo el proceso mediante los mismos protocolos que en el caso de las bolsas de sangre. Las bolsas de sangre se centrifugan a 2000 x g durante 3 minutos para separar los glóbulos rojos de las plaquetas y el plasma. El plasma rico en plaquetas se aísla mediante introducción en una bolsa de almacenamiento de plaquetas conectada y seguidamente se efectúa una segunda centrifugación a 5000 x g durante 5 minutos para formar el sedimento de plaquetas. El plasma pobre en plaquetas se introduce en una bolsa de almacenamiento de plasma, mientras que el sedimento de plaquetas resultante, con aproximadamente 50-60 mililitros de plasma, se mantiene a 22ºC durante una hora, como se determina en los procedimientos de los bancos de sangre. Después de la incubación, la preparación de plaquetas se vuelve a suspender en el plasma residual con agitación suave. En los experimentos a pequeña escala en los tubos de 6 mililitros, se deja con el sedimento plaquetario un volumen equivalente de plasma y la muestra de plaquetas se vuelve a suspender. Se prepara una disolución de sistema inhibidor de la manera siguiente: Se prepara una disolución de reactivos en DMSO que contiene amilorida 100 mM, ticlopidina 150 mM y dipiridamol 2 mM. Se prepara una disolución de reactivos en medio salino tamponado con fosfato que contiene nitroprusiato de sodio 2,5 mM, adenosina 10 mM, quinacrina 10 µM y 2.000 unidades/mL de heparina. La concentración de los reactivos del sistema inhibidor en estas mezclas es 100 veces la concentración final necesaria en la preparación de plaquetas para conseguir un almacenamiento efectivo a 4ºC. Las disoluciones inhibidoras se añaden al concentrado de plaquetas en un volumen de 1/100 del volumen total de la preparación de plaquetas, vía inyección directa mediante un canal estéril. No se cree que el orden de adición de la disolución de DMSO y la disolución de medio salino tamponado con fosfato sea esencial para la práctica de la invención. La concentración final de los reactivos inhibidores en la preparación de plaquetas es la siguiente: amilorida - 1 mM, adenosina - 0,1 mM, nitroprusiato de sodio - 25 µM, dipiridamol - 20 µM, quinacrina 5

ES 2 214 656 T3 - 0,1 µM, ticlopidina - 1,5 mM y heparina - 20 unidades/mL. La preparación de plaquetas contenida en una bolsa de almacenamiento estándar se coloca a 4ºC sin agitación. La concentración de plaquetas con el sistema inhibidor se puede transfundir directamente después del almacenamiento. 5

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Alternativamente, se puede añadir la combinación de inhibidores al sedimento de plaquetas en ausencia de DMSO. Esto se puede conseguir de dos maneras. La combinación de inhibidores se puede procesar hasta una suspensión mediante sonicación. Esta suspensión sonicada puede entonces usarse directamente como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, la suspensión sonicada se puede liofilizar y almacenar como un polvo liofilizado. En el momento del uso, el polvo se rehidrata con un volumen adecuado de plasma pobre en plaquetas y se añade al sedimento de plaquetas, como se ha descrito anteriormente. La concentración final de aditivos, usando cualquiera de los dos métodos, es la misma que la descrita anteriormente (exceptuando la ausencia de DMSO). C. Almacenamiento de plaquetas de -20º a -135ºC

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Mediante criopreservación Un segundo uso de esta invención incluye el almacenamiento de plaquetas a temperaturas de -20º a -135ºC. La adición del sistema inhibidor en disolución de esta invención al sedimento de plaquetas estabiliza efectivamente las plaquetas, permitiendo así el éxito de la criopreservación y almacenamiento de las células a temperaturas de -20º a -135ºC. El almacenamiento de plaquetas a temperaturas de -20º a -135ºC requiere la adición de un agente crioprotector. Como parte del proceso de esta invención, el dimetil sulfóxido (DMSO) sirve como crioprotector. DMSO es una molécula polar que penetra la membrana celular y sirve para preservar la viabilidad de la célula durante el proceso de criopreparación. La función del DMSO en esta invención es estabilizar las plaquetas, permitiendo recuperar plaquetas funcionalmente activas después del almacenamiento a temperaturas de -20º a -135ºC. Después del almacenamiento a largo plazo (> 100 días) de las plaquetas que se criopreservaron con el sistema inhibidor de esta invención, el número de células recuperadas y la actividad funcional de las plaquetas se compararon con los de las plaquetas frescas. Se recuperaron más del 95% de las células criopreservadas y estas plaquetas mostraron una actividad funcional de 55% de agregación inducida por ADP, 65% de agregación por colágeno y 50% de respuesta al estrés hipotónico. La comparación de estos resultados con los de las plaquetas almacenadas convencionalmente después de 5 días de almacenamiento a 22ºC resulta favorable. Además, el DMSO puede sustituirse en este protocolo por otros crioprotectores; entre ellos se incluyen maltodextrina, dextrano, hidroxiletil almidón y glucosa, bien individualmente o bien en combinación. Para procesar plaquetas para la utilización del sistema de almacenamiento inhibidor de esta invención, se genera un concentrado de plaquetas de la forma determinada en los procedimientos de los bancos de sangre y detallada en la sección (B), almacenamiento a 4ºC. Se prepara una disolución de sistema inhibidor como se indica a continuación: Se prepara una disolución de reactivos en DMSO que contiene amilorida 100 mM, ticlopidina 150 nM y dipiridamol 2 mM. Se prepara una disolución de reactivos en medio salino tamponado con fosfato que contiene nitroprusiato de sodio 2,5 mM, adenosina 10 mM, quinacrina 10 µM y 2.000 unidades/mL de heparina. La concentración de los reactivos del sistema inhibidor en estas mezclas es 100 veces la concentración final necesaria en la preparación de las plaquetas. Las disoluciones inhibidoras se añaden al concentrado de plaquetas en un volumen de 1/100 del volumen total de la preparación de plaquetas, vía inyección directa mediante un canal estéril. El orden de adición de la disolución de DMSO y la disolución de medio salino tamponado con fosfato es irrelevante. La concentración final de los reactivos inhibidores en la preparación de plaquetas es la siguiente: amilorida - 1 mM, adenosina - 0,1 mM, nitroprusiato de sodio - 25 µM, dipiridamol - 20 µM, quinacrina - 0,1 µM, ticlopidina - 1,5 mM y heparina - 20 unidades/mL. Además, se añade DMSO directamente a la preparación de las plaquetas, vía inyección por medio de un canal estéril, hasta una concentración final entre 1% y 6%, preferiblemente 2%. La bolsa de almacenamiento de plaquetas, compatible con un almacenamiento a temperaturas de -20º a -135ºC, se coloca en un compartimiento de congelación estándar y a continuación en un congelador a temperatura de -20º a -135ºC. Después del almacenamiento de plaquetas a temperatura de -20º a -135ºC con el sistema inhibidor de esta invención, la preparación de plaquetas se retira del congelador a -20º a -135ºC y se coloca directamente en un baño de agua a 37ºC hasta la descongelación de toda la preparación. El concentrado de plaquetas con el sistema inhibidor se puede transfundir directamente después del procedimiento de descongelación. Alternativamente, la preparación de plaquetas se puede centrifugar para obtener un sedimento de plaquetas, eliminándose así el componente DMSO de la disolución de criopreservación. Estas plaquetas se pueden entonces volver a suspender en plasma autólogo y transfundirse directamente. Los ejemplos siguientes se proporcionan para hacer posible que los expertos en la técnica preparen las composiciones de esta invención. No se pretende que estos ejemplos limiten el ámbito de lo que los autores de la invención consideran como su invención. Se han llevado a cabo los esfuerzos necesarios para asegurar la precisión referente a los números usados para caracterizar las condiciones medidas; no obstante, pueden estar presentes algunas desviaciones y errores experimentales. Ejemplo 1

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El siguiente ejemplo describe los resultados de los experimentos en los que se ensaya un almacenamiento prolongado a 4ºC. Se tomaron muestras de sangre total en 6 tubos vía venopunción de la vena antecubital, usando tubos de toma de sangre evacuados de 6 mililitros que contienen el anticoagulante citrato ácido de dextrosa. Los tubos con la 6

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sangre total se centrifugaron a 250 x g durante 12 minutos. Se aisló el plasma rico en plaquetas. El plasma rico en plaquetas se centrifugó a 950 x g durante 20 minutos. Se separó del sedimento todo el plasma pobre en plaquetas. Se adicionaron las disoluciones al plasma pobre en plaquetas, lo que dio lugar a las siguientes concentraciones finales: amilorida 1 mM; nitroprusiato de sodio (NaNP) 25 µM; adenosina 0,1 mM en medio salino tamponado con fosfato; quinacrina 0,1 µM; dipiridamol 20 µM; ticlopidina 1,5 mM; 20 unidades/mL de heparina y 1% de DMSO. El plasma pobre en plaquetas con las disoluciones se devolvió al sedimento de plaquetas hasta un volumen de 1/10 del volumen rico en plaquetas original. El sedimento se volvió a suspender suavemente y la mezcla se transfirió a una bolsa de almacenamiento de plaquetas. La bolsa de plaquetas con la mezcla se almacenó a 4ºC sin agitación.

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Resultados del método anterior después de 10 días de almacenamiento a 4ºC

15

Después de diez (10) días de almacenamiento a 4ºC en bolsas estándar de almacenamiento de plaquetas, las plaquetas se llevaron a temperatura ambiente y se diluyeron con plasma autólogo al volumen original del plasma rico en plaquetas. Las plaquetas se analizaron con respecto a actividad post-almacenamiento en comparación con la actividad de las plaquetas frescas. Los resultados del perfil de actividad son los siguientes: Agregación Inducida por ADP - 70% Agregación Inducida por Colágeno - 85%

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Respuesta al Estrés Hipotónico - 65% Recuperación de Número de Células Plaquetarias - 95% 25

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Ejemplo 2 El siguiente ejemplo describe un experimento para medir la actividad de las plaquetas después del almacenamiento a -80ºC. Se tomaron muestras de sangre total en 6 tubos vía venopunción de la vena antecubital, usando tubos de toma de sangre evacuados de 6 mililitros que contienen el anticoagulante citrato ácido de dextrosa. Los tubos con la sangre total se centrifugaron a 250 x g durante 12 minutos. Se aisló el plasma rico en plaquetas. El plasma rico en plaquetas se centrifugó a 950 x g durante 20 minutos. Se separó del sedimento todo el plasma pobre en plaquetas. Se adicionaron las disoluciones al plasma pobre en plaquetas, lo que dio lugar a las siguientes concentraciones finales: amilorida 1 mM; nitroprusiato de sodio (NaNP) 25 µM; adenosina 0,1 mM; quinacrina 0,1 µM; dipiridamol 20 µM; ticlopidina 1,5 mM; 20 unidades/mL de heparina y 6% de DMSO. El plasma pobre en plaquetas con las disoluciones se devolvió al sedimento de plaquetas hasta un volumen de 1/10 del volumen rico en plaquetas original. El sedimento se volvió a suspender suavemente y la mezcla se transfirió a una bolsa de almacenamiento de plaquetas. La bolsa de plaquetas con la mezcla se almacenó a -80ºC en un compartimiento estándar de glóbulos rojos diseñado para congelación. Resultados del método anterior después de la criopreservación

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Después de la descongelación, efectuada introduciendo directamente la muestra congelada de plaquetas en un baño de agua a 37ºC, las plaquetas se diluyeron con plasma autólogo hasta el volumen original del plasma rico en plaquetas. Las plaquetas se analizaron con respecto a los perfiles de actividad post-almacenamiento en comparación con las plaquetas frescas, obteniéndose los siguientes resultados: 45

Agregación Inducida por ADP - 50% Agregación Inducida por Colágeno - 74% 50

Respuesta al Estrés Hipotónico - 78% Recuperación de Número de Células Plaquetarias - 85% Ejemplo 3

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A continuación se describe un ejemplo de la aplicación del sistema inhibidor de esta invención al almacenamiento de un concentrado de plaquetas de una unidad total a 4ºC durante un periodo extenso. Se tomó una unidad completa de sangre total vía venopunción en el Gulf Coast Regional Blood Bank, según técnicas estándar de bancos de sangre, en un sistema comercial y estéril de recogida de sangre. La bolsa de sangre que contenía la sangre total se centrifugó según los procedimientos estándar de bancos de sangre y la fracción de plasma rico en plaquetas resultante se vertió en una bolsa estándar de almacenamiento de plaquetas. El plasma rico en plaquetas se centrifugó a continuación según el protocolo de bancos de sangre y el plasma pobre en plaquetas resultante se vertió en una bolsa estándar de almacenamiento de plasma. El sedimento de plaquetas resultante retiene todavía, en la bolsa de almacenamiento de plaquetas, aproximadamente 60 mililitros de plasma. Este concentrado de plaquetas se almacena sin agitación durante una hora a 22ºC, con objeto de permitir la resuspensión de las plaquetas. Se prepara una disolución de inhibidores que contiene lo siguiente: se prepara una disolución de reactivos en DMSO que contiene amilorida 100 mM, ticlopidina 150 mM y dipiridamol 2 mM. Se prepara una disolución de reactivos en medio salino tamponado con fosfato que contiene nitroprusiato de sodio 2,5 mM, adenosina 10 mM, quinacrina 10 µM y 2.000 unidades/mL de heparina. La 7

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concentración de los reactivos del sistema inhibidor en estas mezclas es 100 veces la concentración final necesaria de la preparación de plaquetas. Las disoluciones inhibidoras se añaden al concentrado de plaquetas en un volumen de 1/100 del volumen total de la preparación de plaquetas (aproximadamente 0,6 mililitros), vía inyección directa por medio de un canal estéril. El orden de adición de la disolución de DMSO y de la disolución de medio salino tamponado con fosfato al concentrado de plaquetas es irrelevante. La concentración final de los reactivos inhibidores en la preparación de plaquetas es la siguiente: amilorida - 1 mM, adenosina - 0,1 mM, nitroprusiato de sodio - 25 µM, dipiridamol - 20 µM, quinacrina - 0,1 µM, ticlopidina - 1,5 mM y heparina - 20 unidades/mL. El concentrado de plaquetas con la disolución inhibidora se almacena a continuación a 4ºC, sin agitación. En paralelo, como medio de comparación, se almacenó una unidad de concentrado de plaquetas, siguiendo el método actual de los bancos de sangre, de la manera siguiente: después de una hora de incubación del concentrado de plaquetas para permitir la resuspensión, la preparación de plaquetas se almacenó a 22ºC con agitación suave, siguiendo los procedimientos estándar de los bancos de sangre. Además, se almacenó una preparación de concentrado de plaquetas a 4ºC sin la inclusión del sistema inhibidor. A diferentes intervalos de tiempo de almacenamiento, se retiró una parte alícuota de plaquetas de la preparación almacenada convencionalmente, de las plaquetas almacenadas a 4ºC y de las plaquetas almacenadas a 4ºC con la inclusión de la disolución inhibidora de esta invención. Seguidamente, se analizaron las plaquetas de estas preparaciones con respecto a viabilidad y actividad funcional de las células. Los resultados de este experimento se muestran en la tabla siguiente. Los datos se expresan como porcentaje de la viabilidad y actividad funcional de las plaquetas frescas en el momento de la obtención. % de Plaquetas Frescas

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Agregaclón inducida por ADP

Agregaclón inducida por Colágeno

Respuesta al Estrés Hipotónico

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Tiempo (días)

5

10

5

10

5

10

Almacenamiento a 22ºC

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35

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Almacenamiento a 4ºC

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15

44

31

34

22

Almacenamiento con Sistema Inhibidor

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58

89

83

86

65

35

En todos los ensayos de viabilidad y actividad funcional, el concentrado de plaquetas almacenado a 4ºC con la adición del sistema inhibidor de esta invención demostró una recuperación mayor al día 10 que las plaquetas almacenadas convencionalmente al día 5. Bajo las prácticas actuales de los bancos de sangre, el tiempo de almacenamiento máximo de plaquetas es de 5 días a 22ºC.

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Ejemplo 4

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A continuación se describe un ejemplo de la aplicación del sistema inhibidor de esta invención al almacenamiento de un concentrado de plaquetas de una unidad total a -80ºC durante un periodo extenso. Se tomó una unidad completa de sangre total vía venopunción en el Gulf Coast Regional Blood Bank, según técnicas estándar de bancos de sangre, en un sistema comercial y estéril de recogida de sangre. La bolsa de sangre que contenía la sangre total se centrifugó según los procedimientos estándar de bancos de sangre y la fracción de plasma rico en plaquetas resultante se vertió en una bolsa estándar de almacenamiento de plaquetas. El plasma rico en plaquetas se centrifugó a continuación, según el protocolo de bancos de sangre, y el plasma pobre en plaquetas resultante se vertió en una bolsa estándar de almacenamiento de plasma. El sedimento de plaquetas resultante retiene todavía, en la bolsa de almacenamiento de plaquetas, aproximadamente 60 mililitros de plasma. Este concentrado de plaquetas se almacena sin agitación durante una hora a 22ºC con objeto de permitir que las plaquetas se resuspendan. Se prepara una disolución de inhibidores que contiene lo siguiente: se prepara una disolución de reactivos en DMSO que contiene amilorida 100 mM, ticlopidina 150 mM y dipiridamol 2 mM. Se prepara una disolución de reactivos en medio salino tamponado con fosfato que contiene nitroprusiato de sodio 2,5 mM, adenosina 10 mM, quinacrina 10 µM y 2.000 unidades/mL de heparina. La concentración de los reactivos del sistema inhibidor en estas mezclas es 100 veces la concentración final necesaria de la preparación de plaquetas. Las disoluciones inhibidoras se añaden al concentrado de plaquetas en un volumen de 1/100 del volumen total de la preparación de plaquetas (aproximadamente 0,6 mililitros), vía inyección directa por medio de un canal estéril. El orden de adición de la disolución de DMSO y de la disolución de medio salino tamponado con fosfato al concentrado de plaquetas es irrelevante. La concentración final de los reactivos inhibidores en la preparación de plaquetas es la siguiente: amilorida - 1 mM, adenosina - 0,1 mM, nitroprusiato de sodio - 25 µM, dipiridamol - 20 µM, quinacrina - 0,1 µM, ticlopidina - 1,5 mM y heparina - 20 unidades/mL. Además, se añade DMSO al concentrado de plaquetas vía inyección, a través de un canal estéril, hasta una concentración final de 6%. La concentración de plaquetas dispuesta en una bolsa de congelación estándar se introdujo en un compartimiento congelador y se puso a -80ºC. En paralelo, se criopreservó un concentrado de plaquetas según los métodos convencionales de los bancos de sangre, es decir, adición al concentrado de plaquetas de 6% de DMSO y seguidamente introducción de la preparación de plaquetas en un compartimiento congelador a -80ºC. Después de un almacenamiento a -80ºC durante 20 días, se retiró la preparación de plaquetas del congelador a -80ºC y se colocó directamente en un baño de agua a 37ºC. Se 8

ES 2 214 656 T3 descongeló y centrifugó una porción alícuota de plaquetas para separar el DMSO. El sedimento de plaquetas se volvió a suspender en plasma autólogo y se determinó la viabilidad y actividad funcional de las células. Los resultados de este experimento se muestran en la siguiente tabla. Los datos se expresan como porcentaje de la viabilidad y actividad funcional de las plaquetas frescas en el momento de la adquisición. 5

% de Plaquetas Frescas Agregación Inducida por ADP

Agregación Inducida por Colágeno

Respuesta al Estrés Hipotónico

Sistema Convencional

0

13

7

Sistema Inhibidor

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76

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10

Condiciones de Criopreservación 15

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Las plaquetas almacenadas vía criopreservación a -80ºC, gracias al empleo del sistema inhibidor de esta invención, demuestran poseer una buena recuperación de la viabilidad y actividad funcional, mostrándose capaces de ser efectivas en la transfusión posterior.

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ES 2 214 656 T3 REIVINDICACIONES

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1. Una composición de almacenamiento de plaquetas que comprende un excipiente a base de plasma para el almacenamiento de plaquetas; incluyendo dicho excipiente a base de plasma cierta cantidad de tres o más inhibidores de activación de plaquetas, cada uno de los cuales inhibe una ruta diferente de activación de plaquetas, siendo dichos inhibidores funcionalmente efectivos para permitir la preservación in vitro de plaquetas bioactivas, y un agente crioprotector. 2. Una composición de almacenamiento de plaquetas, según la reivindicación 1, en la que dichos tres o más inhibidores de activación de plaquetas se seleccionan entre los diferentes miembros del grupo consistente en: efectores del sistema de segundo mensajero del AMP cíclico, inhibidores del canal de sodio, efectores del sistema de segundo mensajero del GMP cíclico, inhibidores de la ruta de la ciclooxigenasa, inhibidores de la ruta de la lipoxigenasa, inhibidores de la ruta de la fosfolipasa, inhibidores de la cascada de calcio, de proteasas o proteinasas, modificadores de membrana y combinaciones de los anteriores. 3. La composición de almacenamiento de plaquetas según la reivindicación 2, en la que dichos efectores del sistema de segundo mensajero del AMP cíclico se seleccionan del grupo consistente en adenosina, iloprost, prostaciclina, PGE2 , forskolina, toxina del cólera, isoproterenol, 8-bromo cAMP, dibutil cAMP, teofilina, isobutilmetil xantina, tirotropina y auranofina. 4. La composición de almacenamiento de plaquetas según la reivindicación 2, en la que dicho inhibidor que actúa a través del canal de sodio se selecciona del grupo consistente en amilorida, análogos de amilorida, bepridil, flecainida, saxitoxina, benzamil y prajnalium.

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5. La composición de almacenamiento de plaquetas según la reivindicación 2, en la que dicho inhibidor que actúa a través de la ruta del GMP cíclico se selecciona del grupo consistente en nitroprusiato de sodio, L-arginina, óxido nitroso, 3-morfolín sindonimina (SIN-1), N-morfolín-N-nitrosoaminoacetonitrilo (SIN-1A), factor natriurético atrial, vasopresina, oxitocina y trinitrato de glicerilo. 6. La composición de almacenamiento de plaquetas según la reivindicación 2, en la que dicho inhibidor que actúa a través de la ruta de la ciclooxigenasa se selecciona del grupo consistente en ácido acetilsalicílico, dipiridamol, flurbiprofeno, ticlopidina, ketoprofeno, ibuprofeno, indometacina, sulfinpirazona, guanabenz, ácido ursólico y benzohidroquinona. 7. La composición de almacenamiento de plaquetas según la reivindicación 2, en la que dicho inhibidor que actúa a través de la ruta de la lipoxigenasa se selecciona del grupo consistente en ácido acetilsalicílico, ticlopidina, ácido ursólico, umbeliferona, ácido araquidónico y esculetina. 8. La composición de almacenamiento de plaquetas según la reivindicación 2, en la que dicho inhibidor que actúa a través de la ruta de la fosfolipasa se selecciona del grupo consistente en quinacrina y mepacrina. 9. La composición de almacenamiento de plaquetas según la reivindicación 2, en la que dicho inhibidor que actúa a través de la cascada de calcio se selecciona del grupo que comprende efectores de la proteína quinasa C, bloqueadores del canal del calcio, modificadores de la concentración de calcio, efectores de calmodulina, ionóforos de calcio y estimuladores de la ATPasa. 10. La composición de almacenamiento de plaquetas según la reivindicación 2, en la que dicho inhibidor de una proteasa o proteinasa se selecciona del grupo que comprende heparina y aprotinina.

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11. La composición de almacenamiento de plaquetas según la reivindicación 2, en la que dicho modificador de membrana se selecciona del grupo que comprende amantadina, heparina, ticlopidina, pentoxifilina y ajoeno. 12. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 11 que comprende de 0,5% a 10% de dicho agente de criopreservación; en particular, en la que dicho agente de criopreservación es dimetil sulfóxido entre 0,5% y 6%; en particular, en la que dicho agente de criopreservación es dimetil sulfóxido presente en concentración de 2%. 13. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 12, en la que la concentración de dicha amilorida es amilorida 1 mM; en particular, en la que la concentración de dicho nitroprusiato de sodio es 25 µM; en particular, en la que la concentración de dicha adenosina es 0,1 mM; en particular, en la que la concentración de dicha quinacrina es 0,1 µM; en particular, en la que la concentración de dicho dipiridamol es 20 µM; en particular, en la que la concentración de dicha ticlopidina es 1,5 mM; en particular, en la que la concentración de dicha heparina es 20 unidades/mL. 14. Un método para el almacenamiento prolongado de plaquetas que comprende las etapas de:

65

adicionar los reactivos seleccionados a una fase de plasma, en la que dichos reactivos seleccionados se seleccionan del grupo consistente en tres o más de los siguientes: amilorida, nitroprusiato de sodio, adenosina, quinacrina, dipiridamol, ticlopidina y heparina; para formar una mezcla inhibidora en plasma; 10

ES 2 214 656 T3 mezclar dicha mezcla inhibidora en plasma con una preparación de plaquetas; y refrigerar.

5

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15. El método de la reivindicación 14, en el que dicha mezcla inhibidora en plasma comprende de 0,5% a 10% de un agente de criopreservación; en particular, en la que dicho agente de criopreservación es dimetil sulfóxido entre 0,5% y 6%; en particular, en la que dicho agente de criopreservación es dimetil sulfóxido presente en concentración de 2%. 16. El método de la reivindicación 14 ó 15, en el que dicha amilorida se añade en concentración 1 mM; en particular, en el que dicho nitroprusiato de sodio se añade en concentración 25 µM; en particular, en el que dicha adenosina se añade en concentración 0,1 mM; en particular, en el que dicha quinacrina se añade en concentración 0,1 µM; en particular, en el que dicho dipiridamol se añade en concentración 20 µM; en particular, en el que dicha ticlopidina se añade en concentración 1,5 mM; en particular, en el que dicha heparina se añade en concentración de 20 unidades/mL. 17. Un método para procesar sangre humana que comprende:

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(a) aislar de sangre humana fresca el plasma que contiene las plaquetas; (b) separar del plasma al menos una fracción de plaquetas; 20

(c) adicionar al plasma separado tres o más inhibidores reversibles como los definidos en cualquiera de las reivindicaciones 1 - 13, capaces de inhibir la agregación de tales plaquetas en el plasma separado; (d) suspender las plaquetas separadas en el plasma separado e inhibido; y

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(e) refrigerar el plasma resultante que contiene las plaquetas en suspensión a una temperatura eficaz para preservar el plasma refrigerado durante un periodo de tiempo seleccionado. 18. Un método para procesar sangre humana que comprende las etapas de:

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(a) extraer sangre total de una persona vía venopunción; (b) centrifugar la sangre extraída para aislar de la sangre el plasma rico en plaquetas; (c) centrifugar el plasma rico en plaquetas para formar un plasma pobre en plaquetas y un sedimento de plaquetas;

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(d) adicionar al plasma pobre en plaquetas tres o más inhibidores como los definidos en cualquiera de las reivindicaciones 1 - 13; 40

(e) volver a suspender suavemente el sedimento de plaquetas en el plasma pobre en plaquetas que contiene los inhibidores; y (f) almacenar el plasma resultante que contiene el sedimento suspendido a una temperatura de aproximadamente 4ºC.

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19. Un método para procesar sangre humana que comprende las etapas de: (a) extraer sangre total de una persona vía venopunción; (b) centrifugar la sangre extraída para aislar de la sangre el plasma rico en plaquetas;

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(c) centrifugar el plasma rico en plaquetas para formar un plasma pobre en plaquetas y un sedimento de plaquetas; (d) adicionar al plasma pobre en plaquetas tres o más inhibidores como los definidos en cualquiera de las reivindicaciones 1 - 13; 55

(e) volver a suspender suavemente el sedimento de plaquetas en el plasma pobre en plaquetas que contiene los inhibidores y un crioprotector; y 60

(f) almacenar el plasma resultante que contiene el sedimento suspendido a una temperatura de aproximadamente -80ºC. 20. Un método ara aislar plaquetas sanguíneas de sangre humana fresca que comprende: (a) separar el plasma sanguíneo que contiene las plaquetas de la sangre fresca;

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(b) separar las plaquetas del plasma sanguíneo separado para formar una fracción de plaquetas sustancialmente libre de plasma y una fracción de plasma pobre en plaquetas; 11

ES 2 214 656 T3 (c) adicionar tres o más inhibidores reversibles como los definidos en cualquiera de las reivindicaciones 1 - 13 al plasma pobre en plaquetas; (d) suspender la fracción de plaquetas en la fracción de plasma que contiene los inhibidores reversibles; y 5

(e) enfriar la fracción de plasma reversiblemente inhibida que contiene la fracción de plaquetas suspendida a una temperatura menor que aproximadamente 4ºC. 10

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluida en la mencionada reserva. 12