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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 243 005

51 Int. Cl. : A61K 35/78

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A61P 15/12 A61P 35/00 A61P 25/32

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 98942659 .8

86 Fecha de presentación : 30.07.1998

87 Número de publicación de la solicitud: 1001797

87 Fecha de publicación de la solicitud: 24.05.2000

54 Título: Extracto de soja, proceso para su preparación y composición farmacéutica.

30 Prioridad: 30.07.1997 DE 197 32 866

30.07.1997 DE 197 32 855 30.07.1997 DE 197 32 822

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.11.2005

73 Titular/es: INDENA S.p.A.

Viale Ortles, 12 20139 Milano, IT

72 Inventor/es: Bombardelli, Ezio y

Gabetta, Bruno

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Isern Jara, Jorge

ES 2 243 005 T3

16.11.2005

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 243 005 T3 DESCRIPCIÓN Extracto de soja, proceso para su preparación y composición farmacéutica. 5

La invención se refiere a nuevos extractos obtenidos por extracción de judías de soja completas maduras o a partir de harina de soja libre de aceite (Glycine max (L.) MERRIL, familia Leguminosae), su producción y formulaciones que contienen estos extractos. Los nuevos extractos se caracterizan por su contenido de isoflavonas y saponinas en proporciones definidas.

10

Se sabe que la soja contiene saponinas e isoflavonas además de sacáridos y aminoácidos, así como proteínas y sales minerales en cantidades las cuales dependen de su origen geográfico y de las condiciones bajo que se cultivó y se cosechó la planta.

15

Los contenidos en saponinas han sido divididas en tres clases dependiendo de la estructura química de sus componentes triterpénicos: saponinas de soja de los grupos A, B y E (Okubo K. et al., ACS Symp., Ser. 546, 330, 1994).

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Grupo A Grupo B Grupo E

R1

R2

R3

Cadena de sacárido Cadena de sacárido Cadena de sacárido

Cadena de sacárido OH -O

OH H H

Los componentes de isoflavona consisten en glicósidos de isoflavona (daidzina, genistina y glicitina) que pueden contener radicales acilo, por ejemplo radicales malonilo, unidos a la cadena de sacárido. 40

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Daidzina Glicitina Genistina Daizdeina Gliciteína Genisteína

R1

R2

R3

H OCH3 H H OCH3 H

H H OH H H OH

D-Glucosa D-Glucosa D-Glucosa H H H

De acuerdo con la literatura biomédica y la información epidemiológica publicadas en los últimos años, principalmente en relación a poblaciones del Este, las cuales consumen alimentos basados en la soja en mayor proporción, el uso de estos alimentos en una alta proporción reduce los síntomas pre-menopáusicos y post-menopáusicos en las mujeres (A. Cassidy, Proceedings of the Nutrition Society, 1996, 55, 339-417). Estos hechos, que aún carecen de bases claramente científicas, se atribuyen a menudo a las isoflavonas agliconas genisteína, daidzeína y gliciteína, las cuales están presentes en varios alimentos basados en la soja. 2

ES 2 243 005 T3 Las isoflavonas se consideran a menudo estrógenos de plantas, y numerosos estudios in-vitro han mostrado que estas sustancias actúan mediante un mecanismo de competición con estrógenos de mamíferos con una actividad de inferior evaluación con un factor de 500 a 1000 que la del estradiol (D.A. Shutt and R. I. Cox, Journal of Endocrinology, 1972, 52, 299-310). 5

10

De acuerdo con la literatura biomédica y la información epidemiológica publicadas en los últimos años, principalmente en relación a poblaciones del Este, que consumen alimentos basados en la soja en mayor proporción, el uso de estos alimentos hace disminuir en una alta proporción el cáncer de mama en mujeres y el cáncer de próstata en hombres (A. Nomura, B.E., Henderson J. Lee, American Journal of Clinical Nutrition, 1978, 31, 2020-2025; T. Hirayama in Diet, Nutrition and Cancer, 1986 pp. 41-53, Y. Hayashi, M. Nagao, T. Sugimura, S. Takayama, L. Tomatis, L.W. Wattenberg y G.N. Wogan eds. Tokyo: Japanese Scientific Society Press; R.K. Severson, A.M.Y. Nomura, J.S. Grove, G.N. Stemmerman, Cancer Research, 1989, 49, 1857-1860. También, estos hechos, que aún carecen de bases claramente científicas, se atribuyen a menudo a las isoflavonas agliconas genisteína, daidzeína y gliciteína, las cuales están presentes en varios alimentos basados en la soja.

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Estas isoflavonas se han estudiado en modelos in-vitro en consideración a su capacidad de interactuar con proteínas quinasas, particularmente con tirosina quinasa, enzimas que parecen jugar un papel en la proliferación de células tumorales. 20

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Recientemente se han hecho numerosos ensayos para preparar fármacos con extractos de soja para el tratamiento preventivo de síntomas pre-menopáusicos y post-menopáusicos y también para el tratamiento preventivo del cáncer. Algunas patentes o solicitudes de patentes describen composiciones de nuevos extractos de soja obtenidos por hidrólisis química o enzimática de los glucósidos presentes en las judías de soja o brotes de judía de soja (Kikkoman Corp. J-08291191; Kikkoman Corp. J-07173148; Kelly GE WO-9323069; Kikkoman Corp. J-0511707566). Todas estas publicaciones se refieren exclusivamente en la preparación de isoflavonas de alta concentración y actividades en consideración al control de trastornos pre-menopáusicos y post-menopáusicos y a la actividad antitumoral. Se ha encontrado ahora, que contrariamente a lo que se ha descrito previamente, los extractos que contienen glucósidos de isoflavonas y saponinas de soja del grupo B en proporciones definidas se consideran más activos que las isoflavonas aisladas en cuanto a ambas, la prevención o tratamiento de síntomas pre-menopáusicos y post-menopáusicos y la prevención o el tratamiento de cáncer. Otro aspecto relacionado con el extracto de la invención tiene que ver con el abuso de alcohol y dependencia del alcohol o adicción al alcohol. Éstos son fenómenos que pueden ser resumidos bajo el término “alcoholismo” y forman un serio problema de toda la sociedad moderna (Gessa G.L., “Bisogno compulsivo di bere e principio del piacere” [La compulsión de beber y el principio del placer] en Medicina delle tossicodipendenze [Medicina de la drogodependencia] II, 5 (1994)). En Italia, por ejemplo, más del 9% de la población (unos 5 millones) son bebedores asiduos y más de un millón son alcohol-dependientes (Calmo-Spechhia F.P., “Epidemiologia dell’alcolismo in Italia” [Epidemiología del alcoholismo en Italia] en Atti del VII Congresso Nazionale della S.I.A.[Informes del séptimo congreso nacional de la S.I.A.] Mediserve, Roma, 295-301 (1991)). Estos números se incrementan cuando países como USA se tienen en cuenta, dónde más de 13 millones son alcohol-dependientes. El abuso de alcohol y la dependencia de alcohol actuales inducen a un gasto público muy alto (desde 1991, en USA se han gastado alrededor de 200 mil millones de dólares al año)y son causas de un gran daño social y psicológico a estos afectados.

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Ensayos existentes para tratar el alcoholismo además de aquellos de naturaleza psicológica (terapia de grupo etc.) consisten en administrar fármacos tales como disulfiram y carbamida de calcio, los cuales actúan en el metabolismo del alcohol, la aldehído deshidrogenada hepática se inhibe y por consiguiente el nivel de acetaldehido emético incrementa, junto con todos los fenómenos indeseables que tienen lugar en el curso de la toma de alcohol.

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De acuerdo con el artículo anterior, las únicas plantas de las que sus derivados se usan para el tratamiento del alcoholismo son Pueraria lobata (Radix puerarie) y Salvia miltiorrhiza, las cuales se usan ampliamente en la medicina china tradicional y forman el contenido de las solicitudes de patentes WO 93/00896 y WO 96/35441. Además del uso de los extractos, estas solicitudes de patente reivindican el uso de sustancias puras tales como la daidzeína y sus derivados semisintéticos en WO 93/00896, o diterpenoides, como tanshinona y miltirona en WO 96/3544l. Un efecto en la alcohol deshidrogenasa con la ocurrencia del efecto descrito anteriormente se ha descrito para los derivados de isoflavona, mientras que el mismo mecanismo se ha excluido para los componentes diterpenoides. Además, la solicitud de Patente WO 96/36332 revela el efecto de la forskolina en la reducción del consumo de alcohol.

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Sorprendentemente, se ha descubierto que los extractos que contienen isoflavonas glucosídicas y saponinas del grupo B de la soja en proporciones definidas pueden ser utilizados con éxito para reducir el consumo deliberado de alcohol. Estos extractos son significativamente más efectivos que las isoflavonas solas y actúan mediante un mecanismo que es distinto del de la inhibición de la alcohol deshidrogenasa, pues el nivel plasmático de alcohol permanece invariable. Además de lo mencionado el artículo anterior Wo 96/10341 revela alimentos o productos para la salud que contienen hipocotilos de semillas de soja sustancialmente puros. No se hace ninguna referencia al procedimiento de extracción ni a la proporción entre isoflavonas y saponinas de acuerdo con la presente invención. 3

ES 2 243 005 T3 US 4.428.876 revela un proceso para aislar saponinas y flavonoides a partir de plantas leguminosas. La allí expuesta extracción de soja con hidróxido sódico acuoso 0,4% hace el extracto final diferente del de la presente invención. Una vez más, no se hace referencia a la proporción entre isoflavonas y saponinas de acuerdo con esta invención. 5

JP 59088064 se dirige al aislamiento y el uso de sólo saponinas. Lo mismo es aplicable a DE 34 00 258. De forma similar JP 61036225 se dirige al aislamiento y purificación de saponinas y JP 62005917 a la preparación de saponinas puras completamente libres de isoflavonas. JP 4036242 concierne la preparación de saponina pura o de un extracto con una elevada proporción saponina/isoflavona cómo un compuesto antiinflamatorio.

10

EP-A-426 998 expone la preparación de isoflavonas a partir de soja y en particular de genistina y malonato de daidzina. No se hace referencia a la extracción de saponinas y a la proporción entre isoflavonas y saponinas. JP 63245648 se dirige a la preparación de material alimenticio de soja libre de saponinas e isoflavonas las cuales son consideradas los componentes ásperos dejando el alimento incomible.

15

Mark Messina et al., Journal of the National Cancer Institute, Vol. 83, No. 8, April 17,1991, páginas 541-546 se dirige al papel de los productos de soja en la reducción del riesgo de cáncer ya descrito en la literatura científica. Ni este documento ni la literatura, sin embargo, se refieren a un extracto que contiene saponinas e isoflavonas en la proporción de esta invención, dejando sólo en efecto farmacológico obtenible por un extracto tan específico. 20

La presente invención consecuentemente se refiere a un extracto que contiene 0,6 a 1,5 partes en peso, preferiblemente 1 parte en peso de saponinas del grupo B de soja por 1 parte en peso de isoflavonas glucosidas, el contenido de isoflavonas glucósidas del extracto siendo como mínimo el 13% en peso. 25

Como se muestra por análisis HPLC-MS, las saponinas del grupo B de soja que tienen un efecto beneficioso en la actividad de los componentes isoflavona tienen las siguientes estructuras:

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Saponina de soja V Isómero de saponina de soja Isómero saponina de soja Saponina de soja II Saponina de soja III Saponina de soja IV

R1

R2

CH2 OH CH3 CH2 OH H CH2 OH H

Glucosa Arabinosa Ramnosa Ramnosa H H

La invención además se refiere a un proceso para producir el extracto antes descrito, que se caracteriza en que comprende las siguientes etapas:

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ES 2 243 005 T3 a) la extracción de judías de soja enteras y maduras o harina de soja libre de aceite que contiene saponinas de soja del grupo B e isoflavonas glucósidas en la proporción recíproca de 3:2 a 2:3, con alcoholes alifáticos o una mezcla de estos alcoholes con agua; 5

b) concentración del extracto de la etapa a); c) purificación del extracto concentrado de la etapa b) de sustancias oleosas y lipofílicas por tratamiento con hidrocarburos alifáticos;

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d) extracción del componente activo con alcoholes alifáticos inmiscibles en agua; e) concentración del extracto de la etapa d) y su secado.

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En particular, los extractos de acuerdo con la invención pueden ser producidos extrayendo judías de soja enteras y maduras o harina de soja libre de aceite que contiene saponinas de soja del grupo B y glucósidos de isoflavonas en la proporción recíproca de 3:2 a 2:3 con alcoholes alifáticos solos o en una mezcla con agua - preferiblemente con una mezcla etanol/agua, tal como etanol puro al 95%. Después de la concentración del extracto y purificación de sustancias oleosas y lipofílicas por tratamiento con hidrocarburos alifáticos (pej, n-hexano o n-heptano), los componentes activos son extraídos con alcoholes alifáticos inmiscibles en agua tales como n-butanol, isobutanol e isoamil alcohol. Después de concentrar a un volumen reducido, la fase orgánica se seca bajo presión reducida. La invención además se refiere a la modificación del proceso anterior, en el que, después de la etapa b) o c), el extracto alcohólico concentrado se somete a la siguiente etapa d’), que continúa con la etapa e): d’) adsorción de los componentes activos en una resina de adsorción basada en poliestireno; enjuagar la resina con agua; elución de los constituyentes activos con etanol. De acuerdo con esta modificación, un extracto típico de la invención se puede producir por adsorción de los componentes activos (isoflavonas y saponinas) que están presentes en el extracto concentrado alcohólico del material vegetal, en una resina de adsorción de poli-estireno tal como una duolite o cualquier XAD, en particular la XAD1180 dado su pH ligeramente ácido; y elución de la mezcla de isoflavonas y saponinas de soja del grupo B a su vez con etanol después de enjuagar con cuidado la columna de resina con agua para retirar sales y otros componentes inactivos. El extracto obtenido bajo estas condiciones contiene del 13 al 17% en peso de isoflavonas y de 0,6 a 1,5 partes en peso de saponinas de soja del grupo B, según la calidad del material de la planta utilizada, por 1 parte en peso de glucósidos de isoflavonas. Este extracto también contiene una gran cantidad de sustancias polifenólicas que demostraron ser esenciales para la actividad inherente del extracto. Una realización del proceso antes mencionado y su modificación comprenden las siguientes etapas:

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f) suspender el extracto de la etapa e) en una mezcla de alcohol miscible en agua y diluir éste con un disolvente aprótico inmiscible en agua. g) calentar la mezcla de la etapa f) para completar la disolución y dejarla a temperatura ambiente;

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h) recoger por filtración las saponinas de la soja del grupo B precipitadas; i) separar la fase orgánica de la fase acuosa; y concentrar la fase orgánica y secarla para producir los componentes isoflavona; y

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j) mezclar las saponinas de la etapa h) y las isoflavonas de la etapa i) para formar el extracto. En consecuencia, los extractos de acuerdo con la invención puede ser preferiblemente, incluso aquellos caracterizados por un muy elevado contenido de isoflavonas glucósidas y saponinas de soja del grupo B en la proporción antes descrita, también producido a partir del extracto obtenido de acuerdo con el proceso arriba descrito y su modificación. Para este propósito el procedimiento se puede seguir como sigue: dicho extracto se suspende en alcohol miscible en agua, tal como metanol o etanol, teniendo un componente en agua del 10 al 50% en volumen, y se diluye con un disolvente aprótico inmiscible en agua, tal como cloruro de metileno o acetato de etilo. La mezcla heterogénea obtenida se calienta para completar la disolución del extracto y se deja a temperatura ambiente, de forma que las saponinas de soja del grupo B pueden precipitar. Las saponinas que tienen una pureza superior al 90% son recogidas por filtración. Los componentes isoflavona que tienen una pureza superior al 80% se obtienen a partir de la tintura madre acuosa separando la fase orgánica y evaporando y secando la última. Las isoflavonas y saponinas pueden luego mezclarse para obtener un extracto que tenga el máximo contenido de glucósidos de isoflavonas y tenga un contenido de saponinas de soja del grupo B de 0,6 a 1,5 partes en peso por 1 parte en peso de glucósidos de isoflavonas. Las condiciones preferidas para llevar a cabo las etapas individuales del proceso del proceso de acuerdo con la invención son las que siguen. En este caso las unidades de medida de partes en volumen son l (litros) y aquellas para partes en peso son kg (kilogramos). 5

ES 2 243 005 T3 Etapa a

5

El material vegetal es preferiblemente extraído con 12 a 17 volúmenes de disolvente por 1 parte (peso) de biomasa. La temperatura de extracción es expedientemente por encima de 55ºC. Cada extracción es expedientemente llevada a cabo en el curso de menos de 4 horas. Disolventes adecuados además del etanol son, entre otros, metanol, propanol e isopropanol. Estos disolventes pueden contener agua hasta un 10%. Etapa b

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El extracto es expedientemente concentrado a temperatura inferior a 50ºC bajo presión reducida. El extracto es expedientemente concentrado a un contenido alcohólico de 55 a 75%. Etapa c

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La purificación es expedientemente realizada utilizando 0,3 a 0,6 volúmenes de hidrocarburos alifáticos por 1 parte (en peso) de material vegetal. Un procedimiento adecuado es el de extraer las sustancias oleosas y lipofílicas. Etapa d

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Los componentes activos son expedientemente extraídos con 0,2 a 0,4 volúmenes de disolvente alcohólico inmiscible en agua por extracción, calculado en 1 parte (en peso) de material vegetal; preferiblemente, se llevan a cabo tres extracciones. Etapa e

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El extracto de la etapa d es expedientemente concentrado a temperatura inferior a 50ºC y bajo presión reducida. Etapa f 30

El extracto de la etapa e) se suspende expedientemente en 5 a 10 volúmenes (por una parte de extracto) de alcohol soluble en agua, usando una proporción alcohol/agua en el rango desde 2:8 a 3:7 vol/vol. El solvente aprótico inmiscible en agua se usa en una cantidad de 2 a 5 volúmenes, basados en una parte (por peso) del extracto de la etapa e.

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Etapa g Para conseguir disolución completa, la mezcla se calienta expedientemente y se mantiene bajo reflujo. La mezcla luego se mantiene preferiblemente a temperatura ambiente durante 15 a 24h.

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Etapa i La fase orgánica se concentra expedientemente por evaporación a una temperatura por debajo de 30ºC bajo presión reducida.

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Etapa j Preferiblemente, las saponinas de la etapa h y los glucósidos de isoflavonas de la etapa g se usan para preparar una solución alcohólica que contiene las saponinas y los glucósidos de isoflavonas en una proporción 1:1, la cual luego se concentra para secarla a una temperatura por debajo de 50ºC bajo presión reducida.

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Las cantidades de isoflavonas y saponinas de soja del grupo B se determinan por análisis HPLC usando una columna Supelco-Sil LC-ABZ (250 mm x 4,6 mm), 5 µm, y un medio de elución ternario usando un gradiente, comprendiendo A) H2 O (CF3 COOH 0,01%), B) acetonitrilo (CF3 COOH 0,01%) y C)alcohol metílico (CF3 COOH 0,01%). Los componentes individuales pueden ser identificados y caracterizados por espectrometría de masa combinada con HPLC mediante una interfície termospray. Los extractos de acuerdo con la invención se distinguen de los extractos previamente conocidos con respecto a su acción especial.

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Respecto a los desórdenes de la menopausia, sofocos de calor, insomnio y depresión son los síntomas climatéricos más frecuentes que la mujer sufre durante la menopausia. Ellos se acompañan por una disminución o cesación de la actividad ovárica y también por un decrecimiento de la producción de estrógenos y un incremento de la producción de la hormona luteinizante (LH) y la hormona estimuladora del folículo.

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Un estudio reciente (Ducker E.M. et al.; Planta. Med 57, 420, 1991) describió una asociación entre un incremento ocasional en LH y cambios de temperatura en la piel de ratas hembras siguiendo una ovariectomía. Esta relación entre el nivel de LH y los sofocos de calor, la cual se ha observado no solamente en el caso de de ratas hembra sino que 6

ES 2 243 005 T3 también en mujeres, sugiere que la dosis de LH secretada se puede considerar como un parámetro adecuado para el estudio de efectos psiconeuróticos/endocrinos de componenetes activos endocrinos. 5

La Tabla 1 muestra los resultados que se obtuvieron cuando las ratas hembras ovariectomizadas se trataron con dos fracciones separadas (isoflavonas y saponinas de soja del grupo B) y los extractos de acuerdo con la invención. TABLA 1

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Concentración de hormona luteinizante (LH) en el plasma de ratas hembras ovariectomizadas después del tratamiento oral con extractos de soja Producto administrado

Dosis (mg/kg/día)

LH (ng/ml)

Vehículo Saponinas de soja del grupo B Isoflavonas de Soja Preparado de extracto de soja como en el Ejemplo 1 Preparado de extracto de soja como en el Ejemplo 3

10 ml/kg 1,000 1,000 1,000 1,000

6,2 ± 0,01 5,8 ± 0,02 3,4 ± 0,001 2,1 ± 0,001 1,3 ± 0,001

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Las ratas hembras se sometieron a ovariectomía por métodos conocidos. 15 días después de la operación los animales se trataron con las sustancias de prueba por administración oral simple al día durante 15 días. Se mataron a los animales tres horas después del último tratamiento. Después la sangre se centrifugó inmediatamente y el suero obtenido se mantuvo a -25ºC hasta la determinación de LH por radioimmunoensayo de acuerdo con el método descrito por Niswender et al. (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 128, 807, 1986). Como se puede ver, administrar los extractos de acuerdo con la invención condujo a una disminución, según las estadísticas, significante de LH, la cual fue mayor que la obtenida por la suma de los componentes individuales (efecto sinérgico). Los extractos empleados en tratamientos repetidos de animales sanos condujo a cambios no macroscópicos o microscópicos en los órganos o sistemas de animales machos, mientras que en animales hembras ellas emplean el peso del útero y del esqueleto, lo cual confirma su actividad estrogénica.

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Cuando los extractos de acuerdo con la invención se administraron a mujeres durante la menopausia independientemente de si esto ocurría naturalmente o se produjo quirúrgicamente - modificaron el nivel de LH en el plasma y redujeron los trastornos menopáusicos tales como los sofocos de calor o depresión etc. y al cabo de pocos días del tratamiento también redujeron la desmineralización de los huesos durante el tratamiento durante largos períodos.

40

Los extractos de acuerdo con la invención también han marcado actividad antiproliferativa. La Tabla 2 muestra la actividad antiproliferativa hacia una línea celular de tumor ovárico (OVCA 433). TABLA 2

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Actividad antiproliferativa de extractos de soja hacia una línea celular de tumor ovárico (OVCA 433) in Vitro IC50 µM

Componente 50

Saponinas del grupo B

6,2

Isoflavonas de soja

4,5

Preparado de extracto de soja como en el Ejemplo 1

1,6

Preparado de extracto de soja como en el Ejemplo 3

1,1

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Las células se cultivaron en un cultivo monocapa en un mínimo de medio esencial que contiene agregado de suero de ternera y 200 unidades/ml de penicilina para mantener el medio estéril. Para la reproducibilidad de las pruebas, las células se tripsinizaban cada semana y se aplicaron a las placas a una densidad de 8 x 104 células/ml y se incubaron a 37ºC bajo una atmósfera de aire con un contenido 5% de CO2 y humedad. Para ensayar la actividad de los componentes, las células se colocaron en pocillos (Falcon 3046, Becton Dickinson NY) a una concentración de 1 x 105 /ml en una cantidad mínima de sustrato. Después de 24h, el sustrato se reemplazó por sustrato fresco y los componentes disueltos se añadieron en etanol absoluto. Los controles se trataron de manera similar con el excipiente en ausencia del componente activo para ser probado. El tratamiento descrito anteriormente se repitió a intervalos de 24 horas para un periodo de prueba de 72h. La inhibición de la proliferación celular se calculó por enumeración 7

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directa de las células, con el crecimiento de los controles siendo comparados con éste de la prueba “tratada”. Como se ha mostrado, los extractos de acuerdo con la invención poseían una actividad antiproliferativa mayor que la de las suma de la actividad antiproliferativa de sus componentes (actividad sinérgica). Los componentes de acuerdo con la invención inhibían la proliferación celular in vivo, como se verificó midiendo la talla de los tumores transplantados en el interior de un ratón desnudo atímico de acuerdo con las condiciones habituales descritas en la literatura. Tratar los animales con dosis en el rango de 10 a 500 mg/kg llevó a una degeneración marcada de los tumores estudiados, hasta su desaparición en un alto porcentaje de los individuos. En cuanto al efecto en el consumo de alcohol, este efecto se determinó usando ratas consumidoras de alcohol de las especies “Sardos preferentes de alcohol” (Sp) (Fadda F., Mosca E., Colombo G., Gessa G.L, Alcohol preferring rats; Genetic sensitivity to alcohol-induced stimulation of dopamine metabolism, en Physiol. Behav. 47, 727 (1990) 9. Estos animales que, con una libre elección entre alcohol y agua, consumen de 6 a 7 g de alcohol diariamente por kg de peso corporal (en una proporción de agua-alcohol mayor que 2:1) se han usado exitosamente en los últimos años para determinar el efecto de varias sustancias el consumo voluntario de alcohol, ver por ejemplo, Balakleevsky A., Colombo G., Fadda F., Gessa G.L., Ro 19-4603, a benzodiazepine receptor inverse agonist, attenuates voluntary ethanol consumption in rats selectively bred for high ethanol preference, en Alcohol 25, 449-452 (1990); Fadda F., Garau B., Colombo G., Gessa G.L., Isardipine and other calcium channel antagonists attenuate ethanol sonsumption in ethanol-preferring rats, en Alcoholism: Clinical and Experimental Research 16 (3), 449-452 (1992). Los animales que se mantuvieron bajo condiciones normales de acomodación podían libremente escoger entre agua (que siempre estuvo presente) y alcohol (una solución al 10% vol/vol) el cual se ofreció durante un periodo de 4h al día (esto es las primeras cuatro horas de oscuridad durante el ciclo día/noche). Las cantidades de agua y alcohol consumidas se registraron cada día a la misma hora. Se ofreció comida cuando se deseaba. Después de un consumo estable de agua y alcohol se consiguió, el extracto, a una dosis de 1000 mg/kg suspendida en agua, se administró oralmente en una cantidad volumétrica de 2 ml/kg una vez al día durante 7 días sucesivos. Como control, se usó un volumen idéntico de excipiente. Al final del tratamiento, el consumo de alcohol se registró hasta que el valor de antes del tratamiento se cumplió.

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La Tabla 3 muestra el efecto de la administración oral repetida de 1000 mg/kg de extracto de soja en el consumo de alcohol.

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ES 2 243 005 T3 Tabla 3 lleva a la conclusión que el extracto de soja disminuye significativamente el consumo de alcohol. La reducción del consumo de alcohol permanece constante durante los siete días de tratamiento y luego disminuye después del final del tratamiento. Además, se puede observar que la reducción en el consumo de alcohol es mayor que la dada por la suma de los efectos de los componentes individuales (efecto sinérgico). 5

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La invención por lo tanto también se refiere a una composición farmacéutica que contiene el extracto antes descrito como componente activo. En particular, la invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene este extracto para la prevención o el tratamiento de síntomas pre- y post-menopáusicos, a una composición farmacéutica que contiene este extracto para la prevención y el tratamiento de cáncer de mama en mujeres y de próstata en hombres y a una composición farmacéutica que contiene este extracto para la prevención o el tratamiento del alcoholismo. Los productos o extractos de acuerdo con esta invención pueden ser formulados de forma adecuada en comprimidos, cápsulas de gelatina dura o blanda, polvos granulados para preparar soluciones listas para usar o fluidos o líquidos que son compatibles con su solubilidad. Las dosis del extracto de acuerdo con la invención están en el rango entre 30 mg y 500 mg en el caso de administración única o repetida al día, preferiblemente 200 mg con administración dos veces por día. La forma oral es la forma de administración adecuada. Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

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Ejemplo 1 Producción de extracto de soja con un contenido en isoflavonas del 15% en peso y una proporción de glucósidos de isoflavonas /saponinas de soja del grupo B de 1: 1,5 por purificación con disolventes 25

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10 Kg de harina de soja libre de aceite que contiene 0,2% de isoflavonas glucósidas y 0,3% de saponinas de soja del grupo B se someten a reflujo cinco veces con 30 l de alcohol etílico 95%. Los extractos alcohólicos se mezclan y se concentran bajo presión reducida hasta 5 l. El concentrado se diluye con 1,5 l de agua y se extrae cuatro veces con 5 l de n-hexano. La fase de hexano se descarta y la fase orgánica concentrada se extrae cuatro veces utilizando 2,5 l de n-butanol. La fase orgánica se concentra y se seca bajo presión reducida. Se obtienen 133 g de extracto que tiene un contenido en isoflavonas del 15% en peso y un contenido en saponinas de soja del grupo B del 22,5% en peso. Un diagrama HPLC del extracto obtenido con el proceso de este ejemplo se muestra en la Figura 1.

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Ejemplo 2 Producción de extracto de soja con un contenido en isoflavonas del 15% en peso y una proporción de isoflavonas glucósidas/saponinas de soja del grupo B de 1: 1,5 por purificación en resina de poliestireno 40

45

El concentrado acuoso producido en el ejemplo 1 no se extrae con n-butanol, sino que se trata con aceite de ricino polietoxilado (Cremophor®), para disolver los residuos de la resina de la concentración de la fase alcohólica. Luego se aplica, suspendido en agua purificada (5l), en una columna de resina xad1180. La columna se enjuaga después con agua para eliminar de forma completa las sales, azúcares y agentes de superficie activos y luego se eluye con unos 10 l de alcohol etílico 95%. Después de concentrar y secar el eluido alcohólico, se obtienen 130 g de extracto que tiene el mismo contenido que el extracto obtenido en el Ejemplo 1. Ejemplo 3

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Producción de extracto de soja con un contenido en isoflavonas del 43% en peso y una proporción de glucósidos de isoflavonas/saponinas de soja del grupo B de 1:1 200 g del extracto obtenido en el Ejemplo 1 o 2 se suspenden en 1 l de alcohol etílico 20% acuoso y se diluye con 0,5 l de acetato de etilo. La suspensión se somete a un calentamiento a contracorriente con agitación vigorosa hasta completa disolución y luego se deja durante el transcurso de una noche. Las saponinas precipitadas (38 g, pureza 93%) se aislan por filtración y se separa la tintura madre acuosa que contiene etilacetato y agua. La fase orgánica se concentra bajo presión reducida y secada. El residuo de isoflavonas - 37 g con una pureza de 81% - se disuelve en 1 l de alcohol etílico y se mezcla con 32 g de saponinas cristalizadas, para obtener un producto que contiene isoflavonas y saponinas en una proporción en peso de 1:1. La solución alcohólica se concentra hasta sequedad bajo presión reducida y proporciona 69 g de extracto con un contenido de 43% en peso de glucósidos de isoflavonas y 43% en peso de saponinas de soja del grupo B.

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ES 2 243 005 T3 Ejemplo 4 Producción de cápsulas de gelatina dura que contienen extracto de soja 5

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Extracto de soja, producido de acuerdo con Ejemplo 1 Lactosa Celulosa microcristalina Dióxido de silicio coloidal Croscarmelosa sódica (polímero reticulado de carboximetilcelulosa sódica) Talco Estearato de magnesio

200,0 mg 67,5 mg 22,5 mg 3,0 mg 21,0 mg 8,0 mg 3,0 mg

Ejemplo 5 Producción de comprimidos que contienen extracto de soja

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Extracto de soja, producido de acuerdo con Ejemplo 3 Polisacáridos de soja Celulosa microcristalina Hidroxipropilmetilcelulosa Aceite vegetal hidrogenado Dióxido de silicio coloidal Estearato de magnesio

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400,0 mg 155,5 mg 57,0 mg 12,0 mg 19,5 mg 3,0 mg 3,0 mg

ES 2 243 005 T3 REIVINDICACIONES

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1. Extracto de soja, caracterizado por contener de 0,6 a 1,5 partes en peso de saponinas de soja del grupo B por 1 parte en peso de glucósidos de isoflavonas, siendo el contenido de glucósidos de isoflavonas del extracto como mínimo del 13% en peso. 2. Extracto de soja de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por un contenido de 1 parte en peso de saponinas de soja del grupo B por 1 parte en peso de isoflavonas glucósidas.

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3. Un proceso para la producción de extracto de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, que se caracteriza en que comprende las siguientes etapas: a) la extracción de judías de soja maduras enteras o harina de soja libre de aceite que contiene saponinas de soja del grupo B y glucósidos de isoflavonas en la proporción recíproca de 3:2 a 2:3, con alcoholes alifáticos o una mezcla de éstos alcoholes con agua; b) concentración del extracto de la etapa a);

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c) purificación del extracto concentrado de la etapa b) de sustancias oleosas o lipófilas por tratamiento con hidrocarburos alifáticos; d) extracción de componentes activos con alcoholes alifáticos inmiscibles en agua; e) concentración del extracto de la etapa d) y su secado.

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4. Un proceso para producir un extracto de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, que comprende la etapa a), y en el que, después de la etapa b) o etapa c), el extracto alcohólico concentrado es sometido a la siguiente etapa d’), que es seguida de la etapa e): 30

d’) adsorción de los componentes activos en una resina de adsorción basada en poliestireno; enjuagando la resina con agua; elución de los constituyentes activos con etanol, en dónde las etapas a),b),c) y e) son como en la reivindicación 3. 5. El proceso de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4, comprende las siguientes etapas adicionales:

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f) suspender el extracto de la etapa e) en una mezcla de alcohol miscible en agua y agua y diluir ésta con un disolvente aprótico inmiscible en agua; g) calentar la mezcla de la etapa f) para completar la disolución y dejarla a temperatura ambiente; 40

h) recoger las saponinas de soja del grupo B por filtración; i) separar la fase la fase orgánica de la fase acuosa; y concentrar la fase orgánica y secarla para producir los componentes isoflavona; y 45

j) mezclar las saponinas de la etapa h) y las isoflavonas de la etapa i) para formar el extracto. 6. Una composición farmacéutica que contiene, como componente activo, un extracto de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2. 50

7. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 para la prevención o el tratamiento de síntomas pre- y post-menopáusicos. 8. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 para la prevención o el tratamiento de cáncer. 55

9. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 o 8 para la prevención o el tratamiento del cáncer de mama en mujeres. 60

10. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 o 8 para la prevención o el tratamiento del cáncer de próstata en hombres. 11. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 para la prevención o el tratamiento del alcoholismo.

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ES 2 243 005 T3

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