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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 229 252

51 Int. Cl. : A23K 1/165

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ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 96201318 .1

86 Fecha de presentación: 15.05.1996

87 Número de publicación de la solicitud: 0743017

87 Fecha de publicación de la solicitud: 20.11.1996

54 Título: Aplicación de fosfolipasas en la alimentación del ganado.

30 Prioridad: 15.05.1995 EP 95201266

08.09.1995 EP 95202442

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.04.2005

73 Titular/es: DSM IP Assets B.V.

Het Overloon 1 6411 TE Heerlen, NL

72 Inventor/es: Beudeker, Robert Franciscus y

Kies, Arie Karst

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Tavira Montes-Jovellar, Antonio

ES 2 229 252 T3

16.04.2005

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 229 252 T3 DESCRIPCIÓN Aplicación de fosfolipasas en la alimentación del ganado. 5

Campo de la invención La presente invención se refiere a la aplicación de enzimas en la alimentación del ganado. Antecedentes de la invención

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Un número de enzimas son secretadas en el tracto gastrointestinal de los animales para digerir la comida. Cada una de estas enzimas actúa sobre componentes específicos, en un ambiente específico de una parte del tracto gastrointestinal. Las pepsinas, por ejemplo, son activas en el ambiente ácido del estómago, mientras que otras proteasas, tales como la quimotripsina y las carboxipeptidasas muestran actividad en la parte superior del intestino delgado, a pH 6-7. Muchas de dichas enzimas necesitan estar en forma de precursor antes de activarse. La pepsina, por ejemplo, se forma solamente a partir de pepsinógeno en un ambiente ácido. La quimotripsina y las carboxipeptidasas se secretan en una forma inactiva, y se activan por la proteasa tripsina. La digestión de la grasa es un proceso complejo. La mayoría de la grasa en las dietas para animales está disponible en forma de triglicéridos. Estos triglicéridos son difícilmente o en absoluto absorbibles por el intestino, y necesitan degradarse a mono o diglicéridos, glicerol y ácidos grasos libres. Está conversión está catalizada por la enzima lipasa, que se secreta por el páncreas. Esta enzima es activa sobre la interfase entre agua y aceite. Para una buena digestión, es esencial tener gotitas muy pequeñas de grasa en una emulsión de aceite en agua. Los emulsionantes son sustancias activas en superficie, que permiten la dispersión de la grasa en una fase acuosa. El emulsionante más importante en el tracto gastrointestinal es la bilis. La bilis se secreta por el hígado, y puede almacenarse en la vesícula biliar. La bilis contiene, entre otros, ácidos biliares y sales, colesterol y fosfolípidos. Pequeñas partículas, micelas, se forman por la mezcla de los componentes de la bilis con los (restantes) productos de triglicéridos. Estas micelas difunden a las células epiteliales yeyunales, donde sus contenidos se liberan y se absorben. En estas células epiteliales, los triglicéridos se reconstituyen. Junto con el colesterol, los ésteres de colesterol, los fosfolípidos y las proteínas, forman nuevas partículas, solubles en agua, denominadas quilomicrones. Los fosfolípidos, tales como la lecitina, son degradados enzimáticamente mediante la acción de las fosfolipasas A y B, que también se secretan por el páncreas.

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La lecitina es una mezcla de lípidos polares y neutros, en la que el contenido de lípidos polares es al menos de 60%. Dado su carácter hidrófobo/hidrófilo los lípidos polares (y por lo tanto las lecitinas), se utilizan como emulsionantes. Los lípidos polares incluyen (glicero)fosfolípidos y glicolípidos. La estructura básica de un glicerofosfolípido es como sigue: 40

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X= 65

Colina Etanolamina Inositol Serina Hidrógeno 2

ES 2 229 252 T3 Los glicerofosfolípidos básicamente consisten en un resto glicerol con ácidos grasos en las posiciones C1 y C2. La posición C3 está esterificada con ácido fosfórico. El ácido fosfórico está frecuentemente ligado a un grupo alcohol, generando así los siguientes compuestos: 5

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- fosfatidil-etanolamina - fosfatidil-colina - fosfatidil-serina - fosfatidil-inositol - ácido fosfatídico

(PE; X = etanolamina) (PC; X = colina) (PS; X = serina) (PI; X = inositol) (PA; X = hidrógeno)

Los glicerofosfolípidos que tienen solo un residuo de ácido graso (en lugar de los dos habituales), se denominan liso-fosfolípidos. 15

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La lecitina se utiliza como un emulsionante en numerosas aplicaciones, incluyendo la comida y el alimento para animales. Los emulsionantes son sustancias activas en superficie que permiten la dispersión de una fase grasa líquida en una fase acuosa. Los emulsionantes poseen tanto grupos hidrófilos como lipófilos dentro de la misma molécula. La razón entre los grupos hidrófilos y lipófilos, conocida como valor HLB es un indicador característico de los emulsionantes. Los emulsionantes hidrófobos solubles en grasa tienen valores HLB en el intervalo de 0 a menos de 10, mientras que los compuestos solubles en agua tienen valores HLB por encima de 10 y 20.

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Emulsionantes tales como la lecitina, se añaden al alimento de animales, para conseguir un valor nutritivo del alimento mejorado, o para conseguir una mejor dispersión en el caso de alimentos líquidos. También se añade lisolecitina al alimento de animales (bajo el nombre comercial de Lysoforte®, vendida por la compañía Kevin), que tiene propiedades emulsionantes mejoradas, lo que permite conseguir un valor nutritivo mejor (Pluimveehouderij 24: 20-21 (18 de marzo de 1994)). Las propiedades emulsionantes de la lecitina no se explotan únicamente en la producción de ganado, mediante la inclusión de lecitina en las raciones secas, sino también en áreas en las que a los animales se les da alimento líquido que contiene una gran proporción de grasa. Estos son primariamente sustitutos de leche para terneras, y sustitutos de leche de cerda para cerdos. La función de las lecitinas es producir la dispersión más fina posible de la grasa en un alimento líquido ya preparado. La dispersión fina da como resultado una digestibilidad mejorada de la grasa por los animales. Además, la lecitina exhibe un efecto favorable en el establecimiento de los constituyentes insolubles en un alimento líquido. En los años recientes, la industria alimenticia ha comenzado a utilizar industrialmente enzimas producidas, para complementar las enzimas producidas naturalmente en el tracto gastrointestinal de los animales. Algunos ejemplos incluyen fitasas, α-amilasas, proteasas y diversas enzimas de degradación de las paredes de las células de las plantas. Sin embargo, en ningún lugar de la técnica anterior se ha descrito la adición de fosfolipasas al alimento de animales, con el propósito de promover el crecimiento de los animales, ya que los animales por si mismos secretan grandes cantidades de estas enzimas en la parte superior del intestino delgado. El Documento EP-A-0 619 079 describe la utilización de fosfolípidos inter alia, como revestimiento para granulados que contienen sustancias biológicamente activas, para incluir en el alimento para rumiantes. El revestimiento sirve para proteger las sustancias biológicamente activas en la panza, para permitir su digestión subsiguiente y su absorción a través de los órganos digestivos post-abomaso. El Documento EP-A 0 619 079 además describe que opcionalmente puede también incorporarse una fosfolipasa en el revestimiento protector, para ayudar a su hidrólisis, sin embargo, el Documento EP-A 0 619 079 no describe ni sugiere que la fosfolipasa pueda añadirse al alimento para promover el crecimiento o mejorar la eficiencia de la utilización del alimento. El Documento GB-A-2 267 033 se refiere a la promoción del crecimiento, sin embargo, el Documento GB-A-2 267 033 enseña a añadir un kit que comprende el fosfolípido lecitina junto con la cepa Streptomyces al ensilaje. Se había sugerido que la cepa Streptomyces era capaz de producir una fosfolipasa A2 durante la fermentación del ensilaje. Se sigue que la utilización de dicho kit se limita al alimento de animales, cuyo proceso de producción comprende una etapa de fermentación, que es compatible con la producción de fosfolipasa por dicha cepa Streptomyces. Así, existe todavía una necesidad para un aditivo de fosfolipasa para alimento, ampliamente aplicable, versátil y listo para usar, para mejorar la eficiencia de la utilización del alimento y/o la promoción del crecimiento de los animales. Sumario de la invención

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La presente invención proporciona un procedimiento para mejorar la eficiencia de la utilización de alimento, en el que un animal es alimentado con una dieta que comprende una composición que contiene las sustancias del alimento y un aditivo de fosfolipasa listo para usar. La presente invención también proporciona un procedimiento para la promoción del crecimiento de los animales, 3

ES 2 229 252 T3 en el cual un animal es alimentado con una dieta que comprende una composición que contiene las sustancias del alimento y un aditivo de fosfolipasa listo para usar. 5

Además, la invención proporciona un procedimiento para la producción de un alimento para animales, que comprende mezclar una fosfolipasa lista para usar con las sustancias del alimento. Descripción detallada de la invención

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La presente invención describe la utilización de una fosfolipasa añadida exógenamente y lista para usar, a un alimento para animales, para mejorar las propiedades emulsionantes de los fosfolípidos en el tracto gastrointestinal, y de esta manera mejorar la eficiencia de la utilización del alimento y/o la promoción del crecimiento del animal. La promoción del crecimiento de los animales es aquí definido como la promoción del crecimiento en términos de ganancia de peso en tiempo (tasa de crecimiento) y/o promoción del crecimiento en términos de eficiencia del alimento (razón de conversión del alimento).

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Las fosfolipasas que pueden utilizarse en la invención incluyen: fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32), fosfolipasa A2, fosfolipasa B (lisofosfolipasa), fosfolipasa C y fosfolipasa D. 20

Específicamente, la presente invención describe la aplicación de un alimento al que se añade fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4). La fosfolipasa A2 puede producirse mediante aislamiento de, por ejemplo, páncreas porcino, como un producto secundario de, por ejemplo, la producción de insulina. Alternativamente, la fosfolipasa A2 puede producirse de forma recombinante mediante expresión de un gen heterólogo en un microorganismo tal como, por ejemplo, Kluyveromyces lectis. La enzima se obtiene de dichos microorganismos por medio de la fermentación y procedimientos posteriores, para recuperar la enzima.

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Otra posibilidad para la adición exógena de fosfolipasas al alimento para animales que contiene lecitina, es añadir materiales de planta que contienen fosfolipasa, preferiblemente semillas transgénicas, en las que la fosfolipasa se ha sintetizado a través de la expresión de un gen heterólogo. Para obtener esto, el gen que codifica la fosfolipasa se clona en un vector de expresión de planta, bajo el control de las señales de expresión de plantas apropiadas, por ejemplo, un promotor específico de tejido, tal como un promotor específico de semillas. El vector de expresión que contiene el gen de la fosfolipasa, se trasforma posteriormente en células de plantas, y las células de plantas trasformadas se seleccionan para regeneración en plantas completas. Las plantas transgénicas así obtenidas pueden cultivarse y recolectarse, y aquellas partes de la planta que contienen la fosfolipasa heteróloga, pueden incluirse en el alimento para animales, bien como tales, o tras un procesamiento posterior. La fosfolipasa heteróloga puede estar contenida en las semillas de las plantas transgénicas, o pueden estar contenidas en otros materiales de plantas, tales como raíces, tallos, hojas, tronco, flores, corteza, y/o frutos. Así, el aditivo de fosfolipasa se entiende como una fosfolipasa que no es un constituyente natural de las principales sustancias del alimento, o que no está presente en ellas en su concentración natural, es decir, la fosfolipasa se añade al alimento separadamente de las sustancias del alimento, sola o en combinación con otros aditivos del alimento, o la fosfolipasa es una parte integral de una de las sustancias del alimento, pero se ha producido en ella mediante tecnología de DNA recombinante. Aditivos de fosfolipasa lista para usar incluyen fosfolipasas que están en una proforma inactiva, pero que pueden activarse en el tracto gastrointestinal, por ejemplo, mediante un proceso proteolítico. Un alimento preferido contiene fosfolípidos, preferiblemente lecitina, tal como está presente en los materiales crudos, como por ejemplo las semillas de soja con toda su grasa, las semillas de colza con toda su grasa, el aceite de semilla de soja, el aceite de colza o el aceite rico en lecitina, además de la fosfolipasa añadida exógenamente, que es preferiblemente fosfolipasa A2 porcina (producida en microbios). Sin embargo, el alimento no necesita contener fosfolípidos, ya que el páncreas ya secreta fosfolípidos.

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Es otro aspecto de esta invención que la fosfolipasa, preferiblemente fosfolipasa A2 porcina (producida en microbios), se incluya en los sustitutos de leche que contienen lecitina para animales jóvenes. Esto mejora la digestibilidad de la grasa por los animales jóvenes. 55

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Es todavía otro aspecto de esta invención que se incluya una fosfolipasa en las dietas de peces y crustáceos, para mejorar el crecimiento y la razón de conversión del alimento. Después del tratamiento con, por ejemplo, fosfolipasa A2 (PLA2), el valor HLB de la lecitina se eleva desde 7 hasta aproximadamente 8 ó 9, lo que puede contribuir al efecto beneficioso del tratamiento con fosfolipasa A2 sobre las propiedades emulsionantes de la lecitina. La fosfolipasa A2 porcina no exhibe actividad in vitro por debajo de pH 6,0. El pH prevalente en el tracto gastrointestinal de los animales monogástricos está por debajo de 6,0 en el buche y el estómago.

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Uno no esperaría ningún efecto beneficioso de la adición de fosfolipasa A2, ya que: a) no se espera actividad de una fosfolipasa añadida en el buche y el estómago, como consecuencia de una desproporción entre el pH prevalente y la dependencia de pH de la enzima; y 4

ES 2 229 252 T3 b) los animales por si mismos secretan grandes cantidades de esta enzima en la parte superior del intestino delgado, donde el pH prevalente está en línea con la dependencia de pH de la enzima. 5

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Sorprendentemente, se ha observado que la adición de fosfolipasa A2 exógena porcina da como resultado una mejoría marcada en la razón de conversión del alimento en pollos (Ejemplo 3). Aparte de en los animales monogástricos, la fosfolipasa A2 también puede utilizarse de forma ventajosa en los poligástricos. Durante la lactación temprana en vacas de alta producción de leche, por ejemplo, es de interés incluir niveles elevados de grasa en sus dietas para compensar en parte los balances energéticos muy negativos. Se sabe de la literatura que la digestibilidad de ácidos grasos en el tracto gastrointestinal de vacas de leche varía en función de la relación de la composición inter alia y de la fuente de la grasa. Se ha observado que la digestibilidad de los ácidos grasos varía entre 87% para una dieta que contiene 500 g de grasa saturada, alta en ácido palmítico (C16:0), y 64% para una dieta que contiene 1000 g de grasa saturada, alta en ácido esteárico (C18:0) (Weisbjerg et al., Acta Agric. Scand. Section A, Animal Sciences 42 p. 115-120, 1992).

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Una gran parte de la variación en la digestibilidad de los ácidos grasos en vacas de leche, se explica por las variaciones en la digestibilidad en el intestino delgado (Ibid, p. 114-120). La acción de la fosfolipasa A2 en el intestino delgado de las vacas de leche parece aumentar la digestibilidad de los ácidos grasos. 20

Las proteínas tales como la enzima fosfolipasa A2 son generalmente degradadas rápidamente en la panza. Como consecuencia, estas proteínas deberían liberarse en el intestino delgado, como forma de prevenir su degradación en la panza. Un número de métodos de formulación están disponibles para las personas expertas en la técnica de protección de enzimas de la inactivación en la panza.

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Se ha observado una mejoría significativa en la digestibilidad de la grasa en terneras no rumiantes, con la adición de fosfolipasa, específicamente fosfolipasa A2 porcina (Ejemplo 4).

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Las dietas para peces y crustáceos se suplementan frecuentemente con concentraciones relativamente muy elevadas de fosfolípidos, para conseguir un crecimiento, salud y conversión del alimento aceptables. De acuerdo con la invención, la fosfolipasa puede también añadirse a estas dietas para mejorar el crecimiento y la razón de conversión del alimento. Es todavía un aspecto más de la invención que la adición de fosfolipasa, y opcionalmente fosfolípidos, al alimento para animales, permite reducir las cantidades de ingredientes caros del alimento, tales como vitaminas y/o colorantes, que se incorporan al alimento para animales. La fosfolipasa puede añadirse al alimento en una concentración que varía en función del tipo y la concentración de fosfolípido y del animal diana, generalmente entre alrededor de 1.000 - 5.000.000 unidades internacionales (IU, para definición, véase el Ejemplo 1), por kg de fosfolípido. En general, el alimento para animales contiene alrededor de 12 g de fosfolípido por kg. Consecuentemente, un intervalo de 1 - 10.000 IU/kg, o preferiblemente de 10 - 1.000 IU/kg de alimento será apropiado, sin embargo, el intervalo más preferido está alrededor de 100 - 1.000 IU/kg de alimento. Se sigue que la dosificación de fosfolípasa añadida al alimento puede ajustarse, en caso de un contenido inusual de fosfolípidos en el alimento.

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En una realización preferida de la invención, la fosfolipasa se obtiene utilizando tecnología de DNA recombinante. La fosfolipasa se obtiene de forma recombinante, mediante expresión heteróloga de un gen de fosfolipasa o cDNA, en un organismo hospedante adecuado, o, alternativamente, mediante sobreexpresión homóloga de un gen endógeno adecuado.

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Las realizaciones específicas de la presente invención descritas aquí utilizan fosfolipasa A2 porcina, producida mediante expresión heteróloga del gen en la levadura Kluyveromyces lactis. Sin embargo, los expertos entenderán que las fosfolipasas obtenidas de otras fuentes funcionarán también en la presente invención. Dichas fosfolipasas pueden derivarse de otros mamíferos, tales como por ejemplo ratas, ratones o seres humanos, para todos los cuales están disponibles en la técnica los genes de la fosfolipasa A2. Alternativamente, las fosfolipasas pueden derivarse de organismos diferentes de mamíferos, tales como, por ejemplo, fosfolipasas microbianas o incluso de plantas.

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De forma similar, los microorganismos utilizados para la producción de la fosfolipasa utilizada en la invención no se limitan necesariamente solo a la levadura Kluyveromyces lactis. Aparte del K. lactis, se ha referido expresión heteróloga de la fosfolipasa A2 con éxito en Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae y Aspergillus niger (revisado por Swinkels et al., 1993, Antonie van Leeuwenhoek 64, 187-201). Es por lo tanto esperable que pueda obtenerse la expresión exitosa (heteróloga) de las fosfolipasas de la invención en un amplio rango de microorganismos. Los microorganismos preferidos para este propósito son las bacterias del género Bacillus y Escherichia, las levaduras de los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia, Candida, o los hongos filamentosos de los géneros Aspergillus, Fusarium, y Trichoderma. Con respecto a los métodos para la expresión de las fosfolipasas en materiales de plantas transgénicas, preferiblemente en semillas, nos referimos a la Solicitud Internacional WO 91/14772, que describe métodos generales para 5

ES 2 229 252 T3 la expresión (heteróloga) de las enzimas en plantas, incluyendo métodos para la expresión de enzimas específicas de semillas. 5

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Los expertos entenderán que la adición de la fosfolipasa en la forma de material de planta transgénica, por ejemplo semillas transgénicas que contienen fosfolipasa, puede requerir el procesamiento del material de planta para hacer disponible a la enzima, o al menos para mejorar su disponibilidad. Dichas técnicas de procesamiento pueden incluir diversas técnicas de molienda y trituración, o tratamientos termomecánicos, tales como la extrusión o la expansión. La presente invención no se limita a la utilización de las cepas de Streptomyces capaces de producir una fosfolipasa A2 durante la fermentación del ensilado, que proporciona inter alia las siguientes ventajas: - Cualquier fosfolípido puede incluirse. Esto permite la utilización de fosfolipasas que son endógenas al animal en el que la enzima va a aplicarse, lo que facilitará la obtención de la aprobación del producto por las autoridades reguladoras.

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- Esto permite además seleccionar la fosfolipasa más adecuada para aplicación como aditivo del alimento.

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- La necesidad de fermentar el alimento, con objeto de producir la enzima in situ, se obvia. Esto permite controlar con precisión la cantidad de aditivo de fosfolipasa añadida en el alimento, que es importante, a la vista del intervalo de concentraciones de fosfolipasas óptimas en ciertas aplicaciones (véase Ejemplo 3). - Esto permite una gran flexibilidad en la formulación tanto del aditivo de la enzima como del alimento que la contiene.

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- La adición de fosfolipasa A2 de mamíferos proporciona una promoción del crecimiento inesperadamente alta. Ejemplo 1

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Expresión de fosfolipasa A2 porcina (PLA2 ) en la levadura Kluyveromyces lactis La identificación y la clonación molecular del gen que codifica la proteína fosfolipasa A2 porcina, está descrita en detalle previamente por Geus et al. (Nucl. Acid Res. 15, 3743-3759, 1987), y van den Bergh et al. (Eur. J. Biochem. 170, 241-246, 1987).

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Con uno de estos clones bien caracterizado, el pCB08T, que contiene la secuencia de cDNA completa de PLA2 , y elementos reguladores genéticos específicos del Kluyveromyces, construimos el casete de expresión pKLAPLA-11, con objeto de obtener la expresión de PLA2 porcina en la levadura Kluyveromyces lactis. Como la secuencia de cDNA de PLA2 y las secuencias para los elementos reguladores de K. lactis están todos disponibles en bases de datos públicas, los expertos pueden obtener todos los materiales requeridos para construir casetes de expresión para la expresión de PLA2 en K. lactis. Todas las técnicas estándar de clonación, tales como el aislamiento y la purificación de ácidos nucleicos, la electroforesis de ácidos nucleicos, la modificación enzimática, la escisión y/o amplificación de ácidos nucleicos, la trasformación de E. coli, etc., se realizaron como están descritos en la literatura (Sambrook et al. (1989) “Molecular Cloning: a laboratory manual”, Cold Spring Harbour Laboratories, Cold Spring Harbour, New Cork; Innis et al. (eds.) (1990) y “PCR protocols, a guide to methods and applications” Academic Press, San Diego). La síntesis de oligo-desoxinucleótidos y el análisis de la secuencia de DNA se realizaron en un sintetizador de DNA 380B y en un secuenciador de DNA 373A de Applied Biosystems, respectivamente, según los manuales de uso proporcionadas por el fabricante.

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Para facilitar la construcción de pKLAPLA-11, primero se introdujeron lugares de restricción flanqueantes apropiados, en los extremos de la secuencia madura de cDNA de PLA, mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). En el extremo 5’, justo en el lugar de escisión de la proteína PLA2 pro- y madura, un lugar SmaI, y en el extremo 3’, justo aguas abajo del codón de terminación, se introdujeron simultáneamente lugares de restricción XhoI y KpnI. Para hacer eso, se sintetizaron dos oligonucleótidos:

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La amplificación por PCR se realizó con los oligonucleótidos 1 y 2 como cebadores, y el pCBO8T como plantilla. El fragmento amplificado obtenido de 400 pares de bases de cDNA de PLA, se digirió con SmaI y KpnI, y posteriormente se insertó en los lugares apropiados de pTZ18R mediante clonación molecular. El vector resultante se denominó pPLA-1. Este fragmento modificado de cDNA de PLA se secuenció completamente, para verificar la reacción de amplificación por PCR, y los lugares de restricción flanqueantes introducidos. Para introducir un lugar de restricción SalI, y las secuencias óptimas de iniciación de la traslación de la levadura, en el extremo 5’ de la secuencia de prepro-señal de PLA2 , se sintetizaron dos oligonucleótidos sintéticos complementarios.

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Después de la reasociación de estos dos oligonucleótidos, el fragmento de DNA de doble cadena obtenido se clonó molecularmente en los lugares apropiados (SalI y SmaI) de pPLA-1. El plásmido obtenido se denominó pKLAPLA-5 y comprendía el cDNA de preproPLA2 completo, flanqueado en el extremo 5’ por un único lugar de restricción SalI, y en el extremo 3’ por un lugar de restricción XhoI.

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Para la expresión de PLA2 porcina en K. lactis, se utilizó el potente promotor de lactasa (PLAC ) de K. lactis. Además de la producción de lactasa en K. lactis, esta secuencia promotora PLAC había sido utilizado previamente para expresar quimosina bovina (Berg van den J. et al., 1990, Bio/Technol. 8, 135-139), y albúmina sérica humana (HSA) en K. lactis. Para la expresión de HSA, se construyó el plásmido pGBHSA-20, que se ha descrito previamente por Swinkels et al., 1993 (Antonie van Leeuwenhoek 64, 187-201).

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Para la expresión de HSA en K. lactis, la secuencia de cDNA de HSA, en pGBHSA-20, se dirigió por el promotor LAC4 de K. lactis. El extremo 3’ del cDNA de HSA está flanqueado por las secuencias de terminación de LAC4. Además, para la selección de células trasformadas, el pGBHSA-20 contiene el gen fosfotransferasa Tn5, que confiere resistencia al antibiótico G418 (Geneticin, BRL; Reiss et al. (1984) EMBO J. 3, 3317-3322), dirigido por el promotor ADH1 de S. cerevisiae (Bennetzen y Hall (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025). En el único lugar SstII del promotor LAC4, el pGBHSA-20 contiene el vector de E. coli pTZ19R, que se utiliza para la amplificación en E. coli. Antes de la trasformación del K. lactis, se eliminaron las secuencias pTZ19R de E. coli del pGBHSA-20, mediante digestión con SstII y purificación en gel de agarosa. La trasformación del pGBHSA-20 hecho lineal en el lugar SstII del promotor LAC4 en el K. lactis, da como resultado la integración en el promotor LAC4 genómico, mediante recombinación homóloga. Para la expresión de PLA2 porcina en K. lactis, la secuencia preproPLA2 se fusionó apropiadamente a la secuencia del promotor de lactasa de K. lactis en pGBHSA-20. Entonces el pGBHSA-20 se digirió con SalI y XhoI, y la secuencia de cDNA de HSA se sustituyó por el fragmento de DNA SalI-XhoI de pKLAPLA-5 mediante clonación molecular. Como se describió anteriormente, este fragmento de DNA SalI-XhoI de pKLAPLA-5, contiene la secuencia de codificación de preproPLA2 . El vector de expresión final para PLA2 se denominó pKLAPLA-11. Las levaduras trasformadas se generaron mediante procedimientos como los descritos en nuestra solicitud de patente publicada EP-A 0 635 574, que están basados en los métodos de Ito H. et al. (J. Bacteriol. 153, 163-168, 1983). El pKLAPLA-11 se hizo lineal en el promotor de LAC4, mediante digestión con SstII. Las secuencias de pTZ19r se eliminaron mediante fraccionamiento y purificación en geles de agarosa. Se transfirieron 15 µg de este fragmento de DNA a las cepas CBS 2360 y CBS 683 de K. lactis, y se obtuvieron colonias resistentes a G418 de ambas cepas, después de incubación a 30ºC durante 3 días. Un número limitado de células trasformadas de cada cepa hospedante se seleccionó inicialmente, para analizar la expresión de PLA2 porcina activa en el medio de cultivo. Las células trasformadas se inocularon en medio de cultivo de K. lactis YEPD, que contenía: 1% (p/v) de extracto de levadura; 2% (p/v) de peptona; 2% (p/v) de glucosa, y 50 µg/ml de G418. Después de 3 días de crecimiento a 30ºC, los sobrenadantes se recolectaron y se analizaron para la presencia de PLA2 , mediante el ensayo de actividad de yema de huevo, como se describe más adelante, después del tratamiento de las muestras con tripsina. La escisión del pro-péptido es necesaria para activar la pro-enzima inactiva (producida por las K. lactis trasformadas), a PLA2 activa, madura. Todos las células trasformadas parecían producir PLA2 porcina activa, en el intervalo desde 5 hasta 40 U/ml.

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ES 2 229 252 T3 Una unidad (IU) se define como la cantidad de enzima que produce 1 micromol de ácidos grasos libres por minuto, bajo condiciones estándar: sustrato de yema de huevo (0,4% de fosfolípidos), pH 8, 40ºC, Ca2+ 6 mM. Ejemplo 2 5

Producción de preparaciones de enzima estables

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El cultivo de Kluyveromyces lactis se sometió a filtración de placa, seguida de ultrafiltración. El ultrafiltrado se trató con tripsina al 0,3% a pH 8,0, en presencia de CaCl2 10 mM, durante 2,5 horas, lo que dio como resultado la eliminación del heptapéptido de la pro-enzima para la activación de la enzima. Se añadieron ácido benzoico y ácido sórbico como conservantes a pH 4,0, y la actividad tripsina restante se inactivó durante 30 minutos a 70ºC. El producto final es pardo y contiene una actividad de 10.000 IU/ml.

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La estabilidad de esta preparación puede mejorarse mediante posterior purificación y almacenamiento a baja temperatura. Después de un mes de almacenamiento a 4ºC, no se observa pérdida de actividad enzimática. Ejemplo 3

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Aplicación de la fosfolipasa A2 en el alimento para animales Se llevaron a cabo ensayos con pollos, para analizar la eficacia de la fosfolipasa A2. Se mantuvieron pollos machos (Ross) desde el día 1 hasta el día 5 en una dieta estándar. En el día 5, se seleccionaron animales de este grupo y se dividieron en jaulas. Se tomó en cuenta el peso de los animales y su variación. El peso medio y su desviación eran iguales en cada jaula. Quince animales se mantuvieron en una jaula. Las jaulas se situaron en una casa para pollos calentada, ventilada e iluminada artificialmente. El espacio de suelo de cada jaula era de 0,98 m2 , con suelos de alambre. La casa para pollos estaba iluminada durante 24 horas al día. Durante el periodo experimental, la intensidad de la luz se redujo gradualmente. La temperatura se redujo gradualmente desde 28ºC durante la primera semana, a 23ºC durante la última semana del experimento. La humedad en la unidad de pollos era aproximadamente del 60% durante el periodo experimental. Los animales habían sido vacunados contra la enfermedad de New Castle, utilizando un método de aerosol, a una edad de uno y catorce días respectivamente. El experimento duró 33 días, comprendiendo un periodo de pre-tratamiento de 5 días y un periodo de ensayo de 28 días. Las dietas experimentales se ofrecieron ad lib a los animales. El agua estaba disponible libremente.

35

El alimento era en bolas frías (se mantuvieron las temperaturas por debajo de 65ºC), de un diámetro de 3 mm. El experimento comprendía los siguientes tratamientos: 40

a) dieta de maíz/trigo/soja (testigos negativos) b) dieta de maíz/trigo/soja + 100 IU/kg c) dieta de maíz/trigo/soja + 500 IU/kg

45

Cada tratamiento se repitió seis veces (90 pájaros por tratamiento en total). Se midieron la ganancia de peso y la conversión del alimento. La composición del alimento utilizado se muestra en la Tabla 1. 50

(Tabla pasa a página siguiente) 55

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65

8

ES 2 229 252 T3 TABLA 1 Composición de la dieta de maíz/trigo/soja en experimentos con pollos 5

10

15

20

Ingredientes

Contenido (%)

Maíz Trigo Aceite de soja Grasa animal Manioco Harina de soja (50% de proteína cruda) Semillas de soja tostadas con toda su grasa Comida de pescado Comida de carne, elevado aceite Guisantes Premezcla de vitaminas/minerales Piedra caliza Fosfato monocálcico Sal (NaCl) DL-metionina

25,00 15,00 3,50 2,00 11,68 19,45 10,00 1,00 4,00 5,0 1,00 0,82 1,00 0,30 0,25 100, 00

25

30

35

ME de pollos (MJ/kg) Proteína cruda (%) Grasa cruda (%) Lisina (disponible) (%) Metionina + Cisteína (disponibles) (%)

12,55 22,1 9,6 1,23 (1,04) 0,91 (0,79)

La enzima se añadió a esta dieta, mezclándola primero con un excipiente. Los resultados se muestran en la Tabla 2. TABLA 2

40

Efecto de la fosfolipasa A2 en la dieta de maíz/trigo/soja, sobre el crecimiento y la razón de conversión del alimento en pollos, entre los 5 y los 33 días de edad

45

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60

Se llevó a cabo un segundo experimento, idéntico en esencia al descrito previamente, en el que se utilizó una dieta de trigo/centeno/soja, como la especificada en la Tabla 3, como dieta básica. 65

El experimento comprendía los siguientes tratamientos: a) dieta de trigo/centeno/soja (testigos negativos)

9

ES 2 229 252 T3 b) dieta de trigo/centeno/soja + 100 IU/kg c) dieta de trigo/centeno/soja + 500 IU/kg 5

d) dieta de trigo/centeno/soja + 1000 IU/kg Todos los demás parámetros fueron los mismos que los utilizados en el experimento anterior con la dieta de maíz/trigo/soja. TABLA 3

10

Composición de la dieta de trigo/centeno/soja en los experimentos con pollos Ingredientes

Contenido (%)

15

20

25

30

35

40

Trigo Centeno Aceite de soja Grasa animal Manioco Comida de semilla de soja (45,4% de proteína cruda) Semillas de soja tostadas con toda su grasa Comida de carne (58% de proteína cruda) Premezcla de vitaminas/minerales Piedra caliza Fosfato monocálcico Sal (NaCl) L-lisina HCl DL-metionina

40,00 10,00 1,00 6,00 4,28 22,00 10,00 3,00 1,00 0,94 1,20 0,26 0,11 0,21 100, 00

ME de pollos (MJ/kg) Proteína cruda (%) Grasa cruda (%) Lisina (disponible) (%) Metionina + Cisteína (disponibles) (%)

11,9 21,4 10,5 1,23 (1,05) 0,90 (0,77)

La enzima se añadió a esta dieta, mezclándola primero con un excipiente. 45

Los resultados se muestran en la Tabla 4. TABLA 4 Efecto de la fosfolipasa A2 en la dieta de trigo/centeno/soja, sobre el crecimiento y la razón de conversión del alimento, en pollos entre los 5 y los 33 días de edad

50

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10

ES 2 229 252 T3 Como se muestra en la Tabla 4, hay un óptimo en el intervalo de las concentraciones de fosfolipasa que deben utilizarse en esta dieta particular para pollos, es decir, más de alrededor de 100 IU/kg de alimento y menos de alrededor de 1000 IU/kg de alimento. Para otros sistemas, pueden existir diferentes óptimos, que pueden determinarse mediante experimentos de rutina. 5

Ejemplo 4 Aplicación de la fosfolipasa A2 en los sustitutos de leche 10

15

20

Se llevó a cabo un experimento, utilizando 3 grupos de 5 terneras machos Friesian Dutch Holstein-Friesian cada uno. Durante el periodo pre-experimental, se administró un sustituto de leche comercial. Después de 14 días, los animales se dividieron para recibir tres tratamientos, teniendo en cuenta el peso y las variaciones en el peso. Los animales se mantuvieron en cuadras individuales. El establo estaba iluminado naturalmente; se ventilaba, y se mantenía a una temperatura de alrededor de 18ºC. Los animales se adaptaron a su dieta durante 14 días. Posteriormente, las heces se recolectaron cuantitativamente durante 5 días consecutivos, durante 24 horas al día. Las terneras se guarnicionaron antes del periodo experimental. Las heces se recolectaron en bolsas de plástico enganchadas a los arneses. Una vez al día, las heces se pesaron, se juntaron y se almacenaron a -20ºC. Antes del análisis, las heces se mezclaron concienzudamente y se subdividieron. Los animales se alimentaron individualmente, según su peso, siguiendo un esquema de alimentación. El sustituto de leche utilizado tenía la siguiente composición:

25

30

35

Leche en polvo desnatada Grasa Lactosa Almidón. Vitaminas, minerales

% 58,5 19,8 17,6 4,1

ME Proteína cruda (N*6,25) Grasa cruda

4450 kcal/kg 21,5% 19,5%

El polvo de sustituto de leche se mezcló con agua antes de administrarlo como alimento, a una temperatura de alrededor de 40ºC. 40

Según este tratamiento, la grasa consistía en 18% de grasa bovina, grasa de coco o manteca. Se añadió lecitina a una concentración del 10% del contenido graso. 45

Se añadió fosfolipasa A2 porcina a estas dietas, a una concentración final de 500 IU/kg de sustituto de leche. Se midió la digestibilidad de la grasa. Los resultados se muestran en la Tabla 5. Tabla 5

50

Los efectos del tratamiento con fosfolipasa A2 sobre la digestibilidad de varias grasas, en terneras no rumiantes que reciben el 18% de grasa en sus dietas y 1,8% de lecitina (10% del contenido graso). La fosfolipasa A2 se preparó como se mostró en el ejemplo 2, y se añadió a la dieta a una concentración final de 500 IU/kg de sustituto de leche. Sin fosfolipasa A2

Con fosfolipasa A2

Grasa bovina

70,0%

73,1%

Grasa de coco

95,6%

96,2%

Manteca

79,4%

84,3%

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11

ES 2 229 252 T3 REIVINDICACIONES

5

1. Un procedimiento para mejorar la eficacia de la utilización del alimento, en el que un animal es alimentado con una dieta, que comprende una composición obtenible mediante un procedimiento, que comprende mezclar un aditivo de fosfolipasa listo para usar, con la sustancia del alimento. 2. Un procedimiento para promover el crecimiento de animales. en el que un animal es alimentado con una dieta, que comprende una composición obtenible mediante un procedimiento, que comprende mezclar un aditivo de fosfolipasa listo para usar, con la sustancia del alimento.

10

3. Una composición de alimento para animales, que mejora la eficiencia de utilización del alimento, obtenible mediante un procedimiento, que comprende mezclar un aditivo de fosfolipasa listo para usar, con la sustancia del alimento. 15

4. Una composición de alimento para animales, que promueve el crecimiento, obtenible mediante un procedimiento, que comprende mezclar un aditivo de fosfolipasa listo para usar, con la sustancia del alimento. 5. Una composición según las reivindicaciones 3 ó 4, que comprende fosfolípido.

20

6. Una composición según la reivindicación 5, en la que el fosfolípido comprende lecitina. 7. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en la que la fosfolipasa es obtenible de un mamífero, una planta o un microorganismo.

25

8. Una composición según la reivindicación 7, en la que la fosfolipasa es una fosfolipasa A2 de mamífero, seleccionada del grupo que comprende fosfolipasa A2 bovina, porcina, murina, de rata o humana. 9. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en la que la fosfolipasa es obtenible mediante expresión de DNA recombinante en un organismo hospedante.

30

10. Una composición según la reivindicación 9, en la que el organismo hospedante es un microorganismo, seleccionado del grupo que comprende bacterias, levaduras y hongos filamentosos. 35

11. Una composición según la reivindicación 10, en la que el microorganismo es de un género seleccionado de Bacillus, Escherichia, Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia, Candida, Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Mucor, Fusarium y Humicola. 12. Una composición según la reivindicación 11, en la que el microorganismo es Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis o Aspergillum niger.

40

13. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, que comprende material de planta, que contiene la fosfolipasa obtenible de una planta transgénica. 45

14. Una composición según la reivindicación 13, que comprende las semillas de una planta transgénica, que contiene fosfolipasa obtenible mediante expresión de DNA recombinante. 15. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 14, que comprende desde 1.000 hasta 5.000.000 de Unidades Internacionales de fosfolipasa por kg de fosfolípido.

50

16. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 18, en la que el aditivo de fosfolipasa está presente a una concentración en el intervalo de 100 a 1000 Unidades Internacionales por kg de alimento. 17. Un procedimiento para la producción de un alimento para animales, según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 16, que comprende mezclar una fosfolipasa lista para usar, con la sustancia del alimento.

55

18. Un procedimiento según la reivindicación 17, que comprende mezclar una fosfolipasa lista para usar con la sustancia del alimento y al menos con un fosfolípido. 60

19. Un procedimiento según las reivindicaciones 17 ó 18, en el que la fosfolipasa se produce de forma recombinante. 20. Un procedimiento según la reivindicación 19, en el que la fosfolipasa se añade en forma de material de planta transgénica.

65

21. Un procedimiento según la reivindicación 20, en el que el material de planta transgénica es procesado para hacer disponible la fosfolipasa. 22. La utilización de una composición obtenible mediante un procedimiento, que comprende mezclar un aditivo 12

ES 2 229 252 T3 de fosfolipasa lista para usar, con la sustancia del alimento, para alimentar a animales no rumiantes. 23. La utilización de una composición obtenible mediante un procedimiento, que comprende mezclar un aditivo de fosfolipasa listo para usar, con la sustancia del alimento, para alimentar a terneras no rumiantes. 5

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ES 2 229 252 T3 LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACION GENERAL 5

(i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Gist-brocades B. V. (B) CALLE: Wateringseweg 1

10

(C) CIUDAD: Delft (D) PAÍS: Holanda (E) CODIGO POSTAL (ZIP): 2611 XT (F) TELÉFONO: +31-15-2799111

15

(G) TELEFAX: +31-15-2793957 (ii) TITULO DE LA INVENCION: Aplicación de las fosfolipasas en los alimentos para animales

20

(iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 4 (iv) FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR (A) TIPO DE MEDIO: disquete

25

(B) ORDENADOR: PC compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: PatentIn Release #1,0, Versión #1,30 (EPO)

30

(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases

35

(B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE HEBRAS: única (D) TOPOLOGÍA: lineal

40

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO

45

(v) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1: TGTCATGCCC GGGCATTATG GCAGTTTCGT

50

(3) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (E) LONGITUD: 39 pares de bases

55

(F) TIPO: ácido nucleico (G) NÚMERO DE HEBRAS: única (H) TOPOLOGÍA: lineal

60

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: SI

65

(v) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: AGTCCTCGGT ACCTCGAGTC AGCAGTACTT CTTGGTGTC 1

ES 2 229 252 T3 (4) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5

(I) LONGITUD: 73 pares de bases (J) TIPO: ácido nucleico (K) NÚMERO DE HEBRAS: única (L) TOPOLOGÍA: lineal

10

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO 15

(iv) ANTI-SENTIDO: NO (v) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

20

(5) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO: 4: 25

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (M) LONGITUD: 69 pares de bases (N) TIPO: ácido nucleico

30

(O) NÚMERO DE HEBRAS: única (P) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

35

(iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: SI (v) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

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