19

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 199 358

51 Int. Cl. : A61K 31/415, A61K 31/05

7

A61K 31/065 // A61K 35/20, A61K 39/395 A61K 31/00, A61K 33/00

ESPAÑA

12

TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 97916035 .5

86 Fecha de presentación: 20.03.1997

87 Número de presentación de la solicitud: 0910376

87 Fecha de publicación de la solicitud: 28.04.1999

54 Título: Uso de clotrimazol y compuestos relacionados en el tratamiento de la diarrea.

30 Prioridad: 20.03.1996 US 621169

73 Titular/es: Children’S Medical Center Corporation

55 Shattuck Street Boston Massachusetts 02115, US

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.02.2004

72 Inventor/es: Lencer, Wayne, I.;

Brugnara, Carlo y Alper, Seth

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Tavira Montes-Jovellar, Antonio

ES 2 199 358 T3

16.02.2004

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 199 358 T3 DESCRIPCIÓN Uso de clotrimazol y compuestos relacionados en el tratamiento de la diarrea. 5

10

Antecedentes del invento Las diarreas agudas y crónicas representan un problema médico importante en muchas áreas del mundo. La diarrea es un factor importante en la malnutrición y la principal causa de muerte (51 000.000 muertes/año) en niños menores de cinco años. Las diarreas secretoras son también un estado peligroso en pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y con enfermedad inflamatoria crónica intestinal (IBD) (del inglés, “Inflammatory Bowel Disease”). Dieciséis millones de personas que viajan a países en vías de desarrollo desde naciones industrializadas todos los años, manifiestan diarrea, variando la gravedad y el número de casos de diarrea dependiendo del país y área del viaje. Las principales consecuencias médicas de las enfermedades diarreicas incluyen deshidratación, acidosis, muerte y trastornos del crecimiento.

15

20

25

30

35

La diarrea en animales de establo y mascotas tales como vacas, cerdos y caballos, ovejas, cabras, gatos y perros, conocida también como disentería, es una causa importante de muerte en estos animales. La diarrea puede ser el resultado de cualquier cambio importante, tal como el destete o movimiento físico. Una de las formas de la diarrea se caracteriza por una diarrea en respuesta a una infección bacteriana o vírica y generalmente se presenta en las primeras horas de la vida del animal. Aunque las principales consecuencias de las enfermedades diarreicas son muy similares, existen numerosas causas de diarrea. La diarrea secretora y la diarrea exudativa están causadas principalmente por infecciones bacterianas o víricas. La bacteria más común causante de diarrea es la E. coli enterotoxinógena (ETEC) que lleva el antígeno K99 pilus. Los virus comúnmente causantes de diarreas incluyen los rotavirus y los coronavirus. Otros agentes infecciosos incluyen cryptosporodium, giardia lamblia y salmonella, entre otros. El tratamiento de la diarrea depende del paciente y de la fuente de infección. La diarrea encontrada en personas que viajan a naciones industrializadas (diarrea del viajero) suele estar causada por patógenos bacterianos que se han adquirido a través de la ingestión de alimentos y/o agua con contaminación fecal. Aproximadamente 50%-75% de estos casos son atribuidos a ETEC. Aunque la diarrea del viajero es dolorosa, por lo general no es potencialmente mortal y a menudo los síntomas duran sólo 3-5 días. Los síntomas incluyen diarrea urgente, espasmos abdominales, nauseas y fiebre. El método de tratamiento más efectivo para la diarrea del viajero es la administración de antibióticos junto con la rehidratación oral. Se ha demostrado que la administración profiláctica de antibióticos disminuye drásticamente el número de viajeros que experimentan síntomas de diarrea. Sin embargo, la administración periódica de antibióticos no es aconsejada porque puede hacer que se desarrollen cepas resistentes. Otros métodos de tratamiento incluyen la administración de subsalicilato de bismuto, con frecuencia tomado en forma de Pepto-Bismal, difenoxilato y loperamida.

50

La diarrea en pacientes con SIDA es un estado muy grave que produce agotamiento y puede ser un factor importante en el empeoramiento de estos pacientes. Los pacientes con SIDA con frecuencia manifiestan diarrea debido a infecciones entéricas contra las que su sistema inmunitario es incapaz de luchar, pero los pacientes con SIDA pueden también presentar diarrea producida por la enteropatía asociada al SIDA. La enteropatía asociada al SIDA es un trastorno caracterizado por diarrea sin implicación de infecciones secundarias. Está causada por la infección de las células de la mucosa del intestino delgado y de células de la mucosa del colon, con el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). El agente infeccioso más común causante de la diarrea debida a una infección entérica en pacientes con SIDA es cryotosporidium. Los métodos para el tratamiento de la diarrea en pacientes con SIDA incluyen la administración de antibióticos y la administración de inmunoglobulinas o de una fracción de calostro bovino, enriquecida con inmunoglobulinas. El calostro, que es la primera leche producida por mamíferos después del alumbramiento, está enriquecida con anticuerpos.

55

La diarrea aguda o disentería, es una de las principales causas de muerte en muchos animales de establo recién nacidos, tales como terneros y cerdos. La disentería suele estar causada por la ETEC que lleva un antígeno K99 pilus. La infección con la ETEC produce una hipersecreción de fluidos y electrolitos. La hipersecreción a su vez causa deshidratación y desequilibrio del pH, lo que puede producir la muerte del ternero o cerdo recién nacido.

40

45

60

Los animales de establo recién nacidos son también susceptibles a agentes infecciosos víricos causantes de disentería. Las infecciones con rotavirus y coronavirus son comunes en terneros y cerdos recién nacidos. La infección con rotavirus suele tener lugar dentro de las 12 horas después del nacimiento. Los síntomas de la infección con rotavirus incluyen la excreción de heces líquidas, deshidratación y debilidad. El coronavirus, que origina una enfermedad más grave en los animales recién nacidos, tiene una tasa de mortalidad más alta que la de la infección con rotavirus. Con frecuencia, sin embargo, un animal joven puede ser infectado con más de un único virus o con una combinación microorganismos víricos y bacterianos al mismo tiempo. Esto aumenta de manera espectacular la gravedad de la enfermedad.

65

Generalmente, la mejor protección para un animal de establo recién nacido frente infecciones víricas o bacterianas es el consumo de calostro. Si el animal madre ha estado expuesto a estos agentes infecciosos, el calostro contendrá anticuerpos, los cuales suelen ser suficientes para proteger al recién nacido de contraer las enfermedades. Sin embargo, 2

ES 2 199 358 T3

5

10

15

a veces esto no es suficiente y los animales necesitan una protección adicional. Un método común de tratamiento incluye la administración de una disolución concentrada de calostro o de una fracción de inmunoglobulina aislada de una disolución de calostro. Este tratamiento oral puede combinarse con sales de rehidratación. Aunque estos métodos han mejorado la tasa de morbilidad y mortalidad de animales recién nacidos que presentan disentería, sigue existiendo la necesidad de tratamientos más efectivos. Algunos imidazoles, tales como el clotrimazol, son agentes que se han utilizado como antifúngicos tanto por vía tópica como por vía sistémica. Más recientemente, unos estudios han identificado otros usos de esos imidazoles. La Patente de EE.UU. n.º 5.273.992 reveló que estos imidazoles regulan los canales de K+ activados por Ca++ en eritrocitos, y de este modo son útiles en el tratamiento de la anemia de células falciformes, que implica la inhibición del transporte de potasio. También se ha encontrado que estos imidazoles son efectivos en la inhibición de la proliferación de células de músculo liso endoteliales y/o vasculares. Los resultados de este descubrimiento se encuentran descritos en la Patente de EE.UU. n.º 5.358.959 y en el documento US, n.º de serie 08/018.840, que describen el uso de clotrimazol para tratar estados ateroscleróticos y angiogénicos, respectivamente. Metabolitos y análogos no imidazólicos de los siguientes compuestos se han descrito también como útiles en el tratamiento de los estados anteriormente mencionados (véanse los documentos US, n.º de serie 08/307.874 y 08/307.887). Sumario del invento

20

25

30

35

40

45

50

El presente invento proporciona métodos y productos para tratar la diarrea y la disentería. Se ha descubierto que compuestos aromáticos son efectivos en el tratamiento de pacientes con diarrea. Estos compuestos son potentes inhibidores de la secreción transepitelial y electrógena de cloruro, estimulada por secretagogos en células intestinales. Según uno de los aspectos del invento, se proporciona un método para tratar diarreas de etiología diversa. El método comprende administrar a un sujeto que necesita ese tratamiento, un compuesto aromático del invento en una cantidad efectiva para inhibir la diarrea. Preferiblemente el compuesto se administra por vía oral junto con fluidos de rehidratación oral. Los compuestos aromáticos útiles en el invento tienen la siguiente fórmula: Ar1 | X | Ar2 —C—Op —(CH2 )n R’ | Ar3 en la que n = 0-3; en la que p = 0 ó 1; en la que X se selecciona entre el grupo constituido por (CH2 )m (m=1,2 ó 3), CH=CH, C≡C, SCH2 , OCH2 y NOCH2 ; en la que R’ se selecciona entre el grupo constituido por H, OH, SH, NO2 , CN, CHO, ONH2 , COR”, CO2 H, CO2 R”, OR”, SR”, NR”R”, CONR”R”, furanilo, piridinilo, tiofenilo, indolilo, quinolilo y CONR”(OCH3 ); en la que Ar1 se selecciona entre el grupo constituido por fenilo, fenilo sustituido y heteroarilo; en la que Ar2 se selecciona entre el grupo constituido por fenilo y fenilo sustituido; en la que Ar3 se selecciona entre el grupo constituido por fenilo, fenilo sustituido, bifenilo, bibencilo y naftilo; en la que el sustituyente del fenilo se selecciona entre el grupo constituido por Cl, F, Br, I, R, OR”, SR”, NO2 , CN, CF3 , NR”R”, y CO2 R; en la que R se selecciona entre el grupo constituido por un alquilo lineal de CZ (Z=1-5), alquilo lineal sustituido de CZ (Z=1-5), alquilo ramificado de CZ (Z=1-5), y alquilo ramificado sustituido de CZ (Z=1-5); en la que el sustituyente del alquilo se selecciona entre el grupo constituido por Cl, Br, F, I, OH, OCH3 , SH, SH3 , NH2 , NHCH3 y N(CH3 )2 ; y en la que R” se selecciona entre el grupo constituido por hidrógeno y R. Un grupo heteroarilo incluye, pero no se limita a ellos, furanilo, imidazol, piridinilo, tiofenilo, indolilo, imidazolilo y quinolilo. En una realización preferida del invento, el compuesto aromático es un metabolito del clotrimazol.

55

60

65

En una de las realizaciones del invento, los compuestos aromáticos anteriormente mencionados pueden administrarse en combinación con otros agentes antidiarreicos. En otras realizaciones, los compuestos aromáticos pueden administrarse en combinación con otros agentes antidisentéricos. Según una de las realizaciones del invento, el sujeto que necesita ese tratamiento es un sujeto que presenta síntomas de diarrea o disentería. En otra realización del invento, el sujeto que necesita ese tratamiento es un sujeto con riesgo de desarrollar diarrea o disentería. Según otro aspecto del invento, se proporcionan preparaciones farmacéuticas. Estas preparaciones farmacéuticas incluyen los compuestos aromáticos del invento junto con un agente antidiarreico. En una de las realizaciones, los compuestos aromáticos útiles según el invento, tienen la fórmula general anteriormente proporcionada. En otra realización más, los compuestos aromáticos útiles según el invento tienen la fórmula general anteriormente descrita, pero en la 3

ES 2 199 358 T3 que R’ y Ar1 no incluyen imidazoles. Preferiblemente, la composición farmacéutica del invento puede administrarse por vía oral. 5

10

Según otro aspecto del invento, se proporcionan preparaciones veterinarias. Estas preparaciones veterinarias incluyen los compuestos aromáticos útiles según el invento junto con una preparación antidisentérica. En una de las realizaciones, los compuestos aromáticos del invento tienen la fórmula general anteriormente proporcionada. En otra realización más, los compuestos aromáticos útiles según el invento tienen la fórmula general anteriormente descrita, pero en la que R’ y Ar1 no incluyen imidazoles. El invento también proporciona los compuestos aromáticos del invento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diarrea. En una de las realizaciones, los compuestos aromáticos del invento tienen la fórmula general anteriormente descrita, pero no incluyen clotrimazol. En otra realización, los compuestos aromáticos útiles en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diarrea tienen la fórmula general anteriormente descrita, pero en la que R’ y Ar1 no incluyen imidazoles.

15

El invento también proporciona los compuestos aromáticos del invento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de disentería. En una de las realizaciones, los compuestos aromáticos del invento tienen la fórmula general anteriormente descrita, pero no incluyen clotrimazol. 20

En otra realización, los compuestos aromáticos útiles en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de disentería tienen la fórmula general anteriormente descrita, pero en la que R’ y Ar1 no incluyen imidazoles. Breve descripción de los dibujos

25

La Figura 1 es un diagrama de barras que representa el efecto del clotrimazol en la inhibición de la secreción de Cl− dependiente de cAMP y Ca++ en células T84. La Figura 2 es una gráfica que muestra el efecto de clotrimazol sobre la inhibición del valor de base y la efusión de 86 Rb estimulada por Ca++ en monocapas de células T84.

30

Descripción detallada del invento

35

El invento implica el uso de un producto para disminuir los síntomas de la diarrea o para prevenir la diarrea en un sujeto con riesgo de manifestarla. Los compuestos del invento son compuestos aromáticos. Los compuestos aromáticos útiles según el invento se proporcionan en una preparación farmacéutica y en una preparación veterinaria. Los compuestos aromáticos del invento son también útiles en un método para tratar diarrea y disentería así como en un método para prevenir diarrea y disentería. Los compuestos aromáticos que se sabe que son útiles en el invento tienen la siguiente fórmula:

40

45

50

55

60

Ar1 | X | 2 Ar —C—Op —(CH2 )n R’ | Ar3 en la que n = 0-3; en la que p = 0 ó 1; en la que X se selecciona entre el grupo constituido por (CH2 )m (m=1,2 ó 3), CH=CH, C≡C, SCH2 , OCH2 y NOCH2 ; en la que R’ se selecciona entre el grupo constituido por H, OH, SH, NO2 , CN, CHO, ONH2 , COR”, CO2 H, CO2 R”, OR”, SR”, NR”R”, CONR”R”, furanilo, piridinilo, tiofenilo, indolilo, quinolilo y CONR”(OCH3 ); en la que Ar1 se selecciona entre el grupo constituido por fenilo, fenilo sustituido y heteroarilo; en la que Ar2 se selecciona entre el grupo constituido por fenilo y fenilo sustituido; en la que Ar3 se selecciona entre el grupo constituido por fenilo, fenilo sustituido, bifenilo, bibencilo y naftilo; en la que el sustituyente del fenilo se selecciona entre el grupo constituido por Cl, F, Br, I, R, OR”, SR”, NO2 , CN, CF3 , NR”R”, y CO2 R; en la que R se selecciona entre el grupo constituido por un alquilo lineal de CZ (Z=1-5), alquilo lineal sustituido de CZ (Z=1-5), alquilo ramificado de CZ (Z=1-5), y alquilo ramificado sustituido de CZ (Z=1-5); en la que el sustituyente del alquilo se selecciona entre el grupo constituido por Cl, Br, F, I, OH, OCH3 , SH, SH3 , NH2 , NHCH3 y N(CH3 )2 ; y en la que R” se selecciona entre el grupo constituido por hidrógeno y R. Un grupo heteroarilo incluye, pero no se limita a ellos, furanilo, imidazol, piridinilo, tiofenilo, indolilo, imidazolilo y quinolilo.

65

Los compuestos que se cree son útiles según el invento son metabolitos del clotrimazol, que tienen la siguiente estructura química: 4

ES 2 199 358 T3

5

10

Los compuestos aromáticos del invento se encuentran comercialmente disponibles, derivan de compuestos comercialmente disponibles, o se sintetizan de novo utilizando procedimientos rutinarios de síntesis química conocidos por los que tienen una experiencia normal en la técnica. 15

20

25

30

Diarrea, según aquí se utiliza, indica un síndrome médico que está caracterizado por los síntomas de diarrea o disentería. La diarrea puede dividirse en tres categorías basándose en el mecanismo subyacente: exudativa, por malabsorción y secretora. Las diarreas exudativas son el resultado de procesos inflamatorios que conducen a una absorción colónica alterada y al vertido de células y coloides producido por esos trastornos tales como colitis ulcerosa, shigelosis y amebiasis. Los trastornos de malabsorción incluyen alteraciones osmóticas, anatómicas y trastornos de motilidad. La diarrea osmótica puede producirse como resultado de anormalidades digestivas tales como la intolerancia a la lactosa. La alteración anatómica da como resultado una superficie de absorción disminuida causada por procedimientos tales como la colectomía subtotal y la fístula gastrocólica. Los trastornos de motilidad son el resultado de un tiempo de contacto disminuido resultante de enfermedades tales como el hipertiroidismo y el síndrome del intestino irritable. La diarrea secretora se caracteriza por la hipersecreción de líquidos y electrolitos por las células de la pared intestinal. En la forma clásica, la hipersecreción es debida a cambios que son independientes de la permeabilidad, capacidad de absorción y gradientes osmóticos, generados de manera exógena dentro del intestino. No obstante, todas las formas de diarrea pueden manifestar un componente secretor. Los métodos y productos del invento son particularmente útiles en el tratamiento de la diarrea que es secretora. Sin embargo, los métodos y productos del invento pueden también ser útiles en combinación con otros métodos de tratamiento que son conocidos en la técnica para tratar la diarrea causada por malabsorción o inflamación. Los compuestos del invento están implicados en la regulación de la secreción de Cl− y son capaces de actuar solos o cuando se usan en combinación con otros métodos de tratamiento para disminuir la secreción neta de líquidos incluso cuando ésta es debida principalmente a anormalidades en la absorción o a inflamación.

35

40

45

50

55

60

65

Los métodos y productos del invento son útiles para prevenir la diarrea y disentería en sujetos con riesgo de desarrollar estos trastornos. Los sujetos con riesgo de desarrollar diarrea y disentería son aquellos sujetos que tienen una alta probabilidad de exposición a los microorganismos bacterianos y víricos que causan estos síntomas. Por ejemplo, aproximadamente 1/3 de las personas que viajan a países en vías de desarrollo, padecerán diarreas; la infección con rotavirus es una de las causas productoras de muerte en niños de países en vías de desarrollo; los pacientes con HIV tienen una probabilidad mayor que el 50% de manifestar diarrea, y muchos terneros y cerdos recién nacidos desarrollan disentería. Los pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal manifiestan diarreas recurrentes. Los métodos y productos del invento son también útiles en el tratamiento de sujetos que ya exhiben los síntomas de diarrea y disentería. Una vez que un sujeto se ha expuesto a un microorganismo causante de los síntomas, el sujeto puede ser tratado con los métodos y productos del presente invento con el fin de disminuir los síntomas. Los síntomas de la diarrea incluyen irregularidad intestinal, fluido fecal rico en sodio y potasio, heces líquidas, deshidratación fiebre, pérdida de peso corporal, dolor de cabeza, anorexia, vómitos, malestar y mialgia. Los síntomas de la disentería incluyen pérdida de peso corporal o retraso del crecimiento, deshidratación, heces malolientes, heces líquidas, heces que contienen trozos de leche o de material semisólido parcialmente digeridos y heces de color blanco amarillento o pardo. Uno de los productos del invento es una preparación veterinaria de un compuesto aromático del invento, utilizado solo o mezclado con un agente antidisentérico. Un agente antidisentérico es una composición que se sabe que es útil para prevenir o inhibir los síntomas de la disentería. Las composiciones conocidas incluyen, por ejemplo, extractos de calostro, tales como los descritos en la Patente de EE.UU. n.º 4.377.569 y Patente de Canadá n.º 1.175.352, y composiciones de amplia disponibilidad comercial (p. ej., Soluble Colostrum Powder, fabricado por VedCo, Inc., St. Joseph MO; Colostrum Bolus II, fabricado por RX Veterinary Products, Kansas City MO, etc.); una preparación inmunológica de calostro aislada de mamíferos productores de leche que pueden haberse inmunizado contra determinados microorganismos causantes de diarreas, como las descritas en la Patente de EE.UU. n.º 4.834.974, Patente de Australia n.º 39340/89, Patente de Australia n.º 52547/90, y Patente de Alemania n.º 1.560.344; preparaciones inmunológicas específicas de microorganismos, que incluyen anticuerpos monoclonales derivados de hibridomas y específicos de microorganismos, tales como los descritos en Sherman y col., Infection and Immunity, Vol. 42(2), Págs. 653-658 (1983) y una fracción de inmunoglobulina bovina preparada a partir de plasma bovino o de suero bovino purificado, tal como la fracción descrita en la Patente de EE.UU. n.º 3.984.539; fluidos de rehidratación oral y/o composiciones de reposición de electrolitos que tienen una amplia disponibilidad comercial en forma de composiciones secas o de disoluciones liquidas, preparadas para administración oral o intravenosa (p. ej., Electrolyte H, fabricada por Agri-Pet 5

ES 2 199 358 T3

5

10

Inc., Aubrey TX; Electrolyte Powder 8x, fabricada por Phoenix Pharmaceutical Inc. St. Joseph MO; Electrolyte Solution Rx, fabricada por Lextron Inc., Greeley CO, ProLabs LTD, St. Joseph MO, y VetTeK Inc., Blue Springs MO; Calf Rehydrate, fabricada por Durvet Inc., Blue Springs MO, etc., y composiciones antibióticas que se encuentran comercialmente disponibles (p. ej., BIOSOL® Liquid, fabricado por The UpJohn Company Animal Health Division, Kalamazoo MI; AMOXIBOL®, fabricada por SmithKline-Beecham Animal Health, Exton PA; 5-WAY CALF SCOUR BOLUS™, fabricada por Agro Laboratories LTD, St. Joseph MO; 1-A-DAY CALF SCOUR BOLUS, fabricada por A.H.A.; GARACIN® PIG PUMP, fabricada por Schering-Plough Animal Health Corporation, Kenilworth NJ, etc.). En una de las realizaciones, los compuestos aromáticos útiles en la preparación veterinaria incluyen los compuestos aromáticos de la fórmula general anteriormente proporcionada. En otra realización, los compuestos aromáticos útiles en la preparación veterinaria incluyen los compuestos aromáticos de la fórmula general anteriormente proporcionada, pero en la que Ar1 no incluye imidazol.

15

En una de las realizaciones, la preparación veterinaria es una preparación seca del compuesto aromático del invento y de un agente antidisentérico. La preparación seca puede administrarse directamente o puede hidratarse y/o diluirse en una disolución líquida antes de la administración. En otra realización, la preparación veterinaria es una disolución líquida del compuesto del invento y un agente antidisentérico.

20

Otro producto del invento es una preparación farmacéutica de un compuesto aromático del invento y un agente antidiarreico. Un agente antidiarreico incluye, por ejemplo, una preparación de inmunoglobulinas procedentes de calostro bovino; lomotil; un fluido de rehidratación intravenosa u oral; una composición salina seca de rehidratación; una composición de reposición de electrolitos (en forma seca o líquida); una disolución o composición seca de azúcares y electrolitos, para administración oral o intravenosa; un antibiótico tal como tetraciclina, trimetropima o sulfametoxazol; un fármaco derivado de quinolonas tal como norfloxacino o ciprofloxacino, subsalicilato de bismuto, difenoxilato; y loperamida.

25

En una de las realizaciones, los compuestos aromáticos útiles en la preparación farmacéutica incluyen los compuestos aromáticos de la fórmula general anteriormente proporcionada. 30

En otra realización, los compuestos aromáticos útiles en la preparación farmacéutica incluyen los compuestos aromáticos de la fórmula general anteriormente proporcionada, pero en la que Ar1 no incluye imidazol. 35

40

45

50

55

60

65

En una de las realizaciones, la preparación farmacéutica es una preparación seca del compuesto aromático del invento y de un agente antidiarreico. La preparación seca puede administrarse directamente o puede hidratarse y/o diluirse en una disolución líquida antes de la administración. En otra realización, la preparación farmacéutica es una disolución líquida del compuesto del invento y un agente antidiarreico. Un sujeto, según aquí se utiliza, significa seres humanos, primates, caballos, vacas, ovejas, cerdos, cabras, gatos y perros. El momento de la administración de los compuestos aromáticos útiles según el invento varía dependiendo del propósito de la administración. Cuando los compuestos del invento se administran con el fin de prevenir la aparición de diarrea en sujetos que viajan a áreas con alto riesgo de exposición a agentes infecciosos, o en sujetos expuestos por otros motivos a agentes causantes de diarrea, los compuestos deben administrarse durante el tiempo que el sujeto está expuesto al riesgo o se encuentra en el área de alto riesgo. Cuando los compuestos se administran a los sujetos con el fin de prevenir la aparición de disentería, la preparación veterinaria debe administrarse en las primeras 12 horas después del nacimiento, y preferiblemente en las primeras 4 horas después del nacimiento. Cuando los compuestos del invento se utilizan para tratar a sujetos que presentan síntomas de diarrea o disentería, los compuestos pueden administrarse en cualquier momento en el que el sujeto esté experimentando los síntomas, y preferiblemente tan pronto como los síntomas se manifiestan. Cuando se administran, las formulaciones del invento se aplican en cantidades farmacéuticamente aceptables y en composiciones farmacéuticamente aceptables. Esas preparaciones normalmente pueden contener sales, tampones, conservantes, excipientes compatibles, y opcionalmente otros componentes terapéuticos. Cuando se usan en medicina, las sales deben ser farmacéuticamente aceptables, pero sales no farmacéuticamente aceptables pueden utilizarse de manera conveniente para preparar sus sales farmacéuticamente aceptables, y no están excluidas del alcance del invento. Esas sales farmacológica y farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitarse a ellas, las sales preparadas a partir de los siguientes ácidos: clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, p-toluenosulfónico, tartárico, cítrico, metanosulfónico, fórmico, malónico, succínico, naftalén-2-sulfónico y bencenosulfónico. Asimismo, las sales farmacéuticamente aceptables pueden prepararse en forma de sales de metales alcalinos o alcalinotérreos, tales como sales de sodio, potasio o calcio, del grupo de los ácidos carboxílicos. Los tampones adecuados incluyen: tampones de ácido acético y una sal (al 1%-2% p/v), ácido cítrico y una sal (al 1%-3% p/v); ácido bórico y una sal (al 0,5%-2,5% p/v); y ácido fosfórico y una sal (al 0,8%-2% p/v). Los conservantes adecuados incluyen cloruro de benzalconio (al 0,003%-0,03% p/v); clorobutanol (al 0,3%-0,9% p/v), parabenos (al 0,01%-0,25% p/v) y timerosal (al 0,004%-0,02% p/v). 6

ES 2 199 358 T3

5

10

15

Los principios activos del presente invento pueden ser composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto aromático de la fórmula general anteriormente proporcionada, en combinación con un agente antidiarreico, opcionalmente incluido en un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los principios activos del presente invento también pueden ser composiciones veterinarias que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto aromático de la fórmula general anteriormente proporcionada, en combinación con un agente antidisentérico, opcionalmente incluido en un excipiente farmacéuticamente aceptable. La expresión “excipiente farmacéuticamente aceptable” según aquí se utiliza, significa, una o más sustancias de relleno, diluyentes o sustancias de encapsulado, sólidas o líquidas, y compatibles, que son adecuadas para la administración a un ser humano u otro animal. El término “excipiente” indica un componente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que el principio activo se mezcla para facilitar su aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas también son capaces de mezclarse con el compuesto del presente invento, con los agentes antidiarreicos o antidisentéricos, y entre ellos mismos, de manera tal que no existe interacción alguna que altere sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada. Un vehículo común de administración (p. ej., pastillas, comprimidos, bolo, polvo o disolución para dilución, bomba Pig, implante, disolución inyectable, etc.) contendría los dos componentes útiles en este invento y el agente antidiarreico o el agente antidisentérico. Por lo tanto, el presente invento proporciona composiciones farmacéuticas o veterinarias, para uso médico o veterinario, que comprenden los principios activos del invento junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables para ellos y otros componentes terapéuticos.

20

25

Las formulaciones del invento se administran en cantidades efectivas. Una cantidad efectiva es una cantidad suficiente para inhibir la secreción de Cl− de las células del epitelio intestinal, disminuyendo con ello de manera efectiva la respuesta secretora, y produciendo por lo tanto una disminución de la diarrea o disentería y/o de sus síntomas. Las cantidades efectivas dependerán, evidentemente, del estado particular que está siendo tratado; de la gravedad de ese estado; de los parámetros individuales del paciente que incluyen edad, estado físico, tamaño y peso; tratamiento concurrente, frecuencia del tratamiento; y el modo de administración. Estos factores son muy conocidos por los expertos en la técnica y pueden manejarse con una experimentación no mayor que la habitual. En general se prefiere utilizar una dosis máxima, es decir, la dosis inocua más alta conforme a un criterio médico razonable, en particular si la diarrea o disentería agudas son la manifestación clínica dominante.

30

35

40

45

50

La dosificación puede ajustarse de manera apropiada para alcanzar los niveles plasmáticos deseados del fármaco. En general, dosis orales diarias de los principios activos serán desde aproximadamente 0,01 miligramos/kg por día hasta 1.000 miligramos/kg por día. Se espera que dosis orales en el intervalo de 50 a 500 miligramos/kg, en una o varias administraciones por día, produzcan los resultados deseados. En caso de que la respuesta de un sujeto sea insuficiente a esas dosis, pueden emplearse dosis incluso más altas (o dosis efectivas más altas administradas por una vía de suministro diferente, más localizada) en la medida en que la tolerancia del paciente lo permita. Se contempla que dosis múltiples por día alcanzan los niveles sistémicos apropiados de los compuestos. Pueden utilizarse diversas vías de administración. El modo particular seleccionado dependerá evidentemente, del fármaco concreto seleccionado, de la gravedad de la diarrea o disentería que está siendo tratada y de la dosificación requerida para la eficacia terapéutica. Los métodos de este invento, hablando en sentido amplio, pueden llevarse a la práctica utilizando cualquier modo de administración que sea médicamente aceptable, lo que significa cualquier modo que produzca niveles efectivos de los principios activos sin producir efectos adversos clínicamente inaceptables. Esos modos de administración incluyen las vías oral, rectal, tópica, nasal, transdérmica o parenteral. El término “parenteral” incluye la vía subcutánea, intramuscular o por infusión. Las vías intravenosa e intramuscular no son particularmente adecuadas para una terapia y profilaxis a largo plazo. Sin embargo estas vías pueden ser las preferidas en situaciones de urgencia. La administración oral será la preferida para el tratamiento profiláctico debido a la comodidad para el sujeto así como para la pauta posológica. Las composiciones pueden ir presentadas convenientemente en forma de dosis unitarias y pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos perfectamente conocidos en la técnica de farmacia. Todos los métodos incluyen la etapa de asociar los principios activos con un excipiente que constituye uno o más componentes accesorios. En general, las composiciones se preparan asociando los principios activos de manera uniforme e íntima con un excipiente líquido, un excipiente sólido finamente dividido, o ambos, y luego, en caso necesario, dando forma al producto.

55

60

65

Las composiciones adecuadas para la administración oral pueden presentarse en forma de unidades discretas tales como cápsulas, sellos, comprimidos o tabletas, conteniendo cada una de ellas una cantidad predeterminada del principio activo. Otras composiciones incluyen suspensiones y licores acuosos o líquidos no acuosos tales como un jarabe, un elixir o una emulsión. Los principios activos administrados por vía oral pueden estar en cualquiera de las formas adecuadas para la administración oral, p. ej., pastilla, comprimido, bolo, disolución bebible, composición líquida o en polvo para ser diluida o mezclada con alimento, bomba Pig, etc. Las composiciones adecuadas para administración parenteral comprenden convenientemente una preparación>>> acuosa estéril del principio activo, que preferiblemente es isotónica con la sangre del receptor. Esta preparación acuosa puede formularse conforme a métodos conocidos utilizando los agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril puede ser también una disolución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico y parenteralmente aceptable, por ejemplo, una disolución de 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran el agua, la disolución de Ringer y la 7

ES 2 199 358 T3

5

10

15

20

25

disolución isotónica de cloruro sódico. Además, como disolvente o medio de suspensión convencionalmente se emplean aceites no volátiles estériles. Para este propósito puede emplearse cualquier aceite no volátil suave, incluyendo monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como el ácido oleico, son útiles en la preparación de inyectables. Formulaciones de excipientes adecuadas para administración oral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, etc., pueden encontrarse en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company,>>> Easton, PA. Otros sistemas de suministro pueden incluir sistemas de suministro de liberación por tiempos, retardada o prolongada. Esos sistemas son capaces de evitar las administraciones repetidas de los principios activos del invento, aumentando la comodidad para el sujeto y para el médico. Los expertos con una capacitación normal en la técnica conocen y pueden disponer de muchos tipos de sistemas de suministro y liberación. Estos sistemas incluyen sistemas basados en polímeros tales como poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), polianhídridos y policaprolactona; sistemas no poliméricos que son lípidos que incluyen esteroles tales como colesterol, ésteres de colesterol y ácidos grasos o grasas neutras tales como monoglicéridos, diglicéridos y triglicéridos; sistemas de liberación que utilizan hidrogeles; sistemas que utilizan Silastic; sistemas basados en péptidos; revestimientos con cera, comprimidos que usan agentes aglutinantes y excipientes convencionales, implantes parcialmente fusionados y sistemas similares. Algunos ejemplos específicos incluyen, sin limitarse a ellos: (a) sistemas de erosión en los que el polisacárido está contenido en una forma incluida en una matriz, encontrados en las Patentes de EE.UU. números 4.452.775 (Kent); 4.667.014 (Nestor y col.,); y 4.748.034 y 5.239.660 (Leonard) y (b) sistemas de difusión en los que un principio activo se infiltra a través de un polímero a una velocidad controlada, encontrados en las Patentes de EE.UU. números 3.832.253 (Higuchi y col.,) y 3.854.480 (Zaffaroni). Además, puede utilizarse sistemas de suministro con un soporte físico basado en una bomba, algunos de los cuales se han adaptado para ser implantados. El uso de un implante de liberación prolongada a largo plazo puede ser particularmente adecuado para el tratamiento de la diarrea en pacientes inmunodeficientes, que necesitan una administración continua de las composiciones del invento. Liberación “a largo plazo”, según aquí se utiliza, significa que el implante se construye y se dispone para que suministre los niveles terapéuticos del principio activo durante al menos 30 días, y preferiblemente durante al menos 60 días. Los implantes de liberación prolongada a largo plazo son muy conocidos por los expertos en la técnica e incluyen algunos de los sistemas de liberación anteriormente descritos.

30

Ejemplos Ejemplo 1 35

40

45

El clotrimazol inhibe la secreción de agua y electrolitos en células epiteliales del intestino La base bioquímica de la diarrea secretora implica la secreción intestinal de Cl− en las células intestinales de las criptas. En condiciones normales, los iones Cl− están guardados en el interior de las células intestinales de las criptas en unos niveles por encima de su potencial electroquímico por la acción de mecanismos de transporte activo primarios y secundarios, tales como las bombas de Na/K ATPasa y los cotransportadores de Na/K/2Cl. El Cl− es transportado hacia el lumen desde las células intestinales de las criptas a través de canales apicales de Cl− . Los niveles intracelulares de K+ , cAMP, cGMP y Ca++ están todos ellos implicados en la regulación de la respuesta secretora. Se utilizaron células T84 para determinar si el clotrimazol regula la secreción de Cl− en células intestinales de las criptas. Las células T84 forman monocapas confluentes de epitelio cilíndrico que exhiben resistencias transepiteliales elevadas, membranas apicales y basolaterales polarizadas, y rutas secretoras de Cl− reguladas por cAMP y Ca++ , análogas a las encontradas en el intestino normal. Métodos

50

Crecimiento de células T84

55

60

Células T84, obtenidas procedentes de la ATCC, se cultivaron y se hicieron pases en parte iguales de medio de Eagle modificado por Dulbeco (DMEM), (D-glucosa, 1 g/litro) y mezcla nutritiva F-12 de Ham, complementados con suero de ternera recién nacida al 5%, HEPES 15 mM, NaHCO3 14 mM, penicilina 40 mg/l, ampicilina 8 mg/l, estreptomicina 0,90 mg/l. Las células se sembraron en densidad confluente sobre inserciones Transwell de 0,33 cm2 o 5 cm2 (Costar, Cambridge, MA) revestidas con una disolución diluida de colágeno de rata, de la manera previamente descrita (Lencer y col., J. Clin. Invest., 92:2941-2951 (1993); Lencer y col., J. Cell. Biol. 117:1197-1209 (1992). Las resistencias transepiteliales alcanzan niveles estables (>1.000 Ohmios·cm2 ) pasados 7 días. El desarrollo de altas resistencias transepiteliales se correlacionó con la formación de las monocapas confluentes que tenían uniones apretadas y bien formadas, según se estableció mediante análisis morfológico, y con la capacidad de las monocapas para secretar Cl− (Madara y col., Gastro, 92:1133-1145 (1987)). Electrofisiología (medida de la secreción electrógena de Cl− )

65

Las monocapas confluentes se transfirieron a Disolución Salina Tamponada de Hank (HBSS) (del inglés, “Hanks Buffered Salt Solution”) que contenía CaCl2 0,185 g/l, MgSO4 0,098 g/l, KCl 0,4 g/l, KH2 PO4 0,06 g/l, NaCl 8 g/l, Na2 HPO4 0,048 g/l, glucosa 1 g/l y HEPES 10 nM, pH 7,4. Los reservorios de la serosa y de la mucosa se pusieron 8

ES 2 199 358 T3

5

en contacto con electrodos de calomelanos y de Ag-Ag Cl a través de puentes de agar al 5% preparados con tampón de Ringer. Las resistencias transepiteliales se midieron utilizando una pinza de doble voltaje, para aplicar pulsos de corriente de 25 ó 50 µA. La corriente de cortocircuito (Isc) (del inglés, “short circuit current”) se calculó utilizando la ley de Ohm de la manera previamente descrita (Lencer y col., J. Clin. Invest. 92:2941-2951) (1993); Lencer y col., J. Cell Biol. 117:1197-1209 (1992). Resultados

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

El clotrimazol inhibe de manera reversible la secreción de Cl− provocada por agonistas dependientes de Ca++ o cAMP en células T84 Estudios previos han demostrado que la secreción de Cl− en células T84 está controlada con rutas de efusión de K+ que son biofísica y farmacológicamente distintas entre sí. Una de las rutas participa en la respuesta secretora frente a agonistas dependientes de cAMP y muestra sensibilidad a sales de Ba++ (McRoberts y col., J. Biol. Chem. 260:1416314172 (1985); Reenstra, Am. J. Physiol. 264:C161-168 (1993)). La otra ruta media en la respuesta a agonistas dependientes de Ca++ , y es insensible a Ba++ . Varios agonistas de canales de K+ , específicos de una ruta, son útiles para determinar si un compuesto particular está actuando a través de una ruta específica de cAMP o de Ca++ . Por ejemplo, el péptido intestinal vasoactivo (VIP) y la toxina del cólera son agonistas del canal de K+ mediados por cAMP, mientras que el carbacol es un agonista dependiente de Ca++ , que es agonista de los canales de K+ regulados por Ca++ . La ruta a través de la que actúa un inhibidor particular de la secreción de Cl− en células T84 puede identificarse midiendo la capacidad del inhibidor para modificar las resistencias transepiteliales en células T84 que han sido tratadas con VIP o con carbacol para estimular la secreción de Cl− . Las células T84 se cultivaron como se ha descrito anteriormente y la secreción de Cl− se estimuló mediante la adición al medio de carbacol (100 µM) o VIP (5 nM). Las células se trataron luego con BaCl (3 mM), caribdotoxina (100 nM), o clotrimazol (33 µM). La corriente de cortocircuito (Isc) se determinó para los diferentes tratamientos con inhibidor, en forma de un porcentaje del control en ausencia de inhibidor (Fig. 1). El BaCl inhibió fuertemente la respuesta secretora frente al agonista VIP mediado por cAMP, pero no tuvo un efecto claro sobre la respuesta secretora provocada por el agonista carbacol dependiente de Ca++ . Por el contrario, la caribdotoxina de veneno de escorpión inhibió fuertemente la respuesta secretora provocada por el carbacol, pero tuvo unos efectos mínimos sobre la secreción de Cl− provocada por VIP. Sin embargo, el clotrimazol inhibió las respuestas secretoras de Cl− frente a ambos agonistas. La inhibición de la secreción de Cl− producida por el clotrimazol fue totalmente reversible>>> (96% ± 2%, n=4) después de una recuperación de 60 minutos en presencia de albúmina de suero bovino, 0,01 mg/ml. Para estudiar los posibles efectos del clotrimazol sobre la sinergia entre los agonistas mediados por cAMP y los agonistas mediados por Ca++ , se dejó que las monocapas, inicialmente estimuladas con VIP, alcanzaran los niveles de secreción del estado de equilibrio estacionario y después se expusieron además a carbacol (100 µM). El clotrimazol fue algo más efectivo en la inhibición de la respuesta secretora frente al carbacol que frente a cAMP, con valores de IC50 3 µM y 8 µM, respectivamente. Cuando los efectos del clotrimazol sobre las rutas secretoras dependientes de cAMP y Ca++ se estudiaron en esas mismas monocapas, se encontró que la inhibición de la respuesta sinergística a VIP más carbacol era paralela a la inhibición de la secreción promovida por agonistas dependientes de Ca++ en solitario. A dosis bajas (= 10−7 o inferiores), el clotrimazol potenció ligeramente (en un 5%-10%) las respuestas secretoras de Cl− frente a cada uno de los agonistas. El clotrimazol inhibió de manera efectiva la respuesta secretora frente a la toxina del cólera (20 nM, un agonista dependiente de cAMP) y frente a la toxina termoestable de E. coli (100 nM, un agonista dependiente de cGMP) (valores de IC50 10 µM y 15 µM, respectivamente). El efecto del clotrimazol sobre las conductancias de K+ se examinó también mediante estudios de flujo isotópico utilizando 86 Rb. Las células T84 se cultivaron en presencia de un agonista mediado por cAMP, el VIP, o de un agonista mediado por Ca++ (la Tapsigargina). Se añadió clotrimazol y se midió la efusión de 86 Rb. El clotrimazol inhibió de manera significativa el valor de base y la efusión de 86 Rb estimulada por Ca++ en presencia de los dos agonistas, el mediado por cAMP y el mediado por Ca++ , en comparación con las células que no habían sido tratadas con clotrimazol. Se encontró que otros compuestos aromáticos del invento inhibían la secreción de cloruro. Aunque el clotrimazol fue el más potente de los inhibidores ensayados de la secreción de Cl− provocada por cAMP y Ca++ , el ketoconazol, econazol, miconazol y 2-clorofenil-bis-fenil-metanol también fueron efectivos en la inhibición de la secreción de cloruro. Considerados en su conjunto, estos estudios indican que el clotrimazol inhibe la secreción de Cl− provocada por los canales de K+ mediados por cAMP o Ca++ en células T84.

60

Ejemplo 2 El clotrimazol actúa en etapas distales en las rutas de transducción de señales dependientes de cAMP y Ca++ 65

Para determinar el sitio en el que el clotrimazol actúa, los efectos del pretratamiento con clotrimazol se estudiaron en monocapas estimuladas con agonistas que inician la secreción de Cl− en etapas secuenciales de la cascada de señalización dependiente de cAMP. Las monocapas de células T84 se preincubaron con HBSS, en presencia o ausencia de clotrimazol (33 µM), y luego se estimularon o con VIP 5 nM (que activa la adenilato-ciclasa a través de receptores 9

ES 2 199 358 T3 de superficie celular ligados a la GTPasa heterotrimérica), o con forskolina 10 µM (que activa la adenilato-ciclasa directamente), o con 8Br-cAMP 3 mM (un estimulador directo de la proteína-quinasa A). El clotrimazol inhibió la respuesta secretora de cada uno de estos agonistas. Estos datos proporcionan la evidencia de que el clotrimazol actúa en una etapa distal para la activación de la proteína-quinasa A. 5

10

15

La señalización intracelular dependiente de Ca++ en células T84 y en otras células no excitables implica el abastecimiento de los almacenes intracelulares de Ca++ dependientes de trifosfato de inositol (IP3) (del inglés, “Inositol TrisPhosphate”) (Halm y Frizzell, Textbook of Secretory Diarrhea, Raven Press, 47-58 (1990); Mandel y col., J. Biol. Chem. 267:704-712 (1986); Halm y col., Am. J. Physiol. (Cell Physiol. 23) 254:C505-C511 (1988)), y la posterior activación de rutas de entrada de Ca++ por la membrana plasmática (Barrett, Am. J. Physiol. (Cell Physiol. 34): C859C868 (1993)). Los eventos que tienen lugar aguas abajo pueden estar mediados por [Ca++ ]i, IP3, diacilglicerol, o por factores difusibles hasta la fecha no identificados (Putney y Bird, Cell 75:199-201 (1993)). Para estudiar el sitio en el que actúa clotrimazol en solitario en esta cascada de procesos de señalización, las monocapas de células T84 pretratadas en presencia o ausencia de clotrimazol (33 µM), se estimularon con los agonistas dependientes de Ca++ , carbacol (100 µM, que provoca señales dependientes de Ca++ e IP3), tapsigargina (5 µM, que eleva el nivel de Ca++ citoplásmico, a través de la inhibición de la ERCa++ -ATPasa) (Vandorpe y col., Biophys. J. 66:46-58 (1994)), o el ionóforo de Ca++ ionomicina (10 µM). El clotrimazol inhibió fuertemente la respuesta secretora de Cl− frente a cada uno de estos reactivos. Estos datos sugieren que el clotrimazol actúa en la respuesta secretora en etapas distales con respecto a la liberación de los almacenes intracelulares de Ca++ .

20

Ejemplo 3 El clotrimazol no afecta a la conductancia de aniones por la membrana apical ni a cotransportadores de NaK2Cl de la membrana basolateral 25

Métodos Estudios de efusión con 125 I 30

35

40

Las monocapas confluentes dispuestas sobre inserciones Transwell de 5 cm2 se utilizaron 10-14 días después de la siembra. El 125 I se midió como indicador de la actividad de los canales apicales de Cl− y de los canales basolaterales de K+ de la manera descrita con anterioridad (Venglarik, y col., Am. J. Physiol. (Cell Physiol. 28):C358-C364 (1990)). Las monocapas se preincubaron a 37ºC con 125 I, 4 µCi/ml, en HBSS durante 90 minutos, en presencia o ausencia de clotrimazol 33 µM durante los últimos 30 minutos de este período de preincubación de 90 minutos. El pretratamiento con clotrimazol no alteró la carga de 125 I de estas células. Después de lavar dos veces con HBSS de nueva aportación, cada dos minutos se obtuvieron muestras de 0,5 ml procedentes del reservorio apical y se repusieron con HBSS de nueva aportación. Después de obtener 4 muestras del valor de base, las células se trataron (a t=8 minutos) con péptido intestinal vasoactivo (VIP, 5 nM) o con tapsigargina (5 µM) para estimular la secreción de Cl− y se obtuvieron 15 muestras adicionales a distintos tiempos. Por último, la monocapa de células se lavó, se cortó con su soporte separándola del anillo de poliestireno, y se determinó la radioactividad residual asociada a las células. Las monocapas se mantuvieron a 37ºC al aire a lo largo de todo el estudio. La medida de las cuentas de 125 I se realizó en un contador gamma y se normalizó con respecto al porcentaje de incorporación total, según se ha descrito con anterioridad (Venglarik, y col., Am. J. Physiol. (Cell Physiol. 28): C358-C364 (1990)).

45

Estudios de incorporación de 86 Rb

50

Las monocapas confluentes sobre inserciones Transwell de 5 cm2 , se incubaron durante 30 minutos en HBSS a 37ºC. Un grupo de monocapas de control y un grupo de monocapas tratadas con CLT (33 µM, durante 30 min) se trataron con bumetanida (10 µM, durante 12 min). Todas las monocapas se trataron luego con VIP (5 nM) y se trasladaron a HBSS que contenía 86 Rb, 1 µCi/ml, durante 3 minutos a 37ºC. Se puso fin a la incorporación de 86 Rb lavando las inserciones en una disolución enfriada en hielo que contenía MgCl2 100 mM, y Tris-Cl 10 mM, pH 7,4. Las monocapas se cortaron de sus inserciones, se dispusieron en el interior de viales de centelleo, y la medida de las cuentas se realizó utilizando métodos estándar.

55

Resultados

60

65

Se llevaron a cabo estudios para determinar si la inhibición de la secreción electrógena de Cl− podría tener lugar mediante el bloqueo de los canales de Cl− de la membrana apical, o mediante el bloqueo de cotransportadores de NaK2Cl situados en la membrana basolateral. Para determinar si el clotrimazol afectaba la conductancia de iones a través de los canales de Cl− de la membrana apical, se estudió el transcurso de la efusión de 125 I en monocapas de células T84 pretratadas, en presencia o en ausencia de clotrimazol (Venglarik, y col., Am. J. Physiol. (Cell Physiol. 28):C358-C364 (1990)). El clotrimazol tuvo un efecto escaso o nulo sobre el transcurso de la efusión de 125 I desde las monocapas tratadas con VIP. Las constantes de velocidad correspondientes a la efusión de 125 I desde las monocapas tratadas o no tratadas con clotrimazol fueron indistinguibles (0,0637% frente a 0,0645% de incorporación/minuto, n=2 en duplicado). El clotrimazol presentó una falta de efecto similar sobre la efusión de 125 I estimulado por tapsigargina. Seguidamente se ensayó el efecto del clotrimazol sobre los cotransportadores de NaK2Cl de la membrana basolateral, determinado por medio de la incorporación de 86 Rb sensible a bumetanida (Matthews y col., J. Biol. Chem. 10

ES 2 199 358 T3

5

269:15703-15709 (1994)). El tratamiento con clotrimazol disminuyó de cantidad total de incorporación de 86 Rb en un 53,6% ± 5,8% (media ± SEM, n=6), pero no ejerció efecto alguno sobre el componente fraccional que era sensible a bumetanida (88% ± 3,2% frente a 75,2% ± 12,7% de la incorporación total, media ± SEM). Considerados en su conjunto, estos datos sugieren con fuerza que el clotrimazol no tiene efecto sobre la secreción de Cl− en células T48 a través de la inhibición de ni de los canales de Cl− de la membrana apical, no de los cotransportadores de NaK2Cl de la membrana basolateral. Ejemplo 4

10

El clotrimazol inhibe la secreción de cloruro inhibiendo la efusión de K+ a través de los canales de K+ basolaterales en células T84 1. El clotrimazol inhibe la secreción de cloruro mediante bloqueo del transporte de K+ a través de canales sensibles tanto a Ba++ como a caribdotoxina

15

Métodos Estudios sobre la efusión de 86 Rb 20

25

30

Las monocapas confluentes dispuestas sobre inserciones Transwell de 5 cm2 se utilizaron 10-14 días después de la siembra. El flujo de 86 Rb se midió como indicador de la actividad de los canales apicales de Cl− y de los canales basolaterales de K+ de la manera previamente descrita (Venglarik, y col., Am. J. Physiol. (Cell Physiol. 28):C358C364 (1990)). Las monocapas se preincubaron a 37ºC con 86 Re, 4 µCi/ml, en HBSS durante 90 minutos, en presencia o ausencia de clotrimazol 33 µM durante los últimos 30 minutos de este período de preincubación de 90 minutos. El pretratamiento con clotrimazol no alteró la carga de 86 Rb de las células. Se obtuvieron muestras de 1 ml del reservorio basolateral y se repuso el volumen. Después de obtener 4 muestras del valor de base, las células se trataron (a t=8 minutos) con péptido intestinal vasoactivo (VIP, 5 nM) o con tapsigargina (5 µM) para estimular la secreción de Cl− , y se obtuvieron 15 muestras adicionales a distintos tiempos. Por último, la monocapa de células se lavó, se cortó con su soporte separándola del anillo de poliestireno, y se determinó la radioactividad residual asociada a las células. Las monocapas se mantuvieron a 37ºC al aire a lo largo de todo el estudio. Se determinó el número de cuentas de 86 Rb por centelleo líquido y se normalizó con respecto al porcentaje de incorporación total, según se ha descrito previamente (Venglarik, y col., Am. J. Physiol. (Cell Physiol. 28): C358-C364 (1990)). Resultados

35

40

45

50

55

60

65

La actividad de los canales de K+ se estimó midiendo la efusión de 86 Rb. Se encontró que el clotrimazol inhibía de manera significativa la velocidad de efusión de 86 Rb después del tratamiento con el agonista VIP (5 nM) dependiente de cAMP. La constante de velocidad correspondiente a la efusión de 86 Rb estimulada por VIP se redujo en el 87% en las monocapas tratadas con clotrimazol (0,0062% frente a 0,0465% de la incorporación/minuto, n=2 en triplicado). El clotrimazol inhibió en un grado similar la efusión de 86 Rb desde las monocapas estimuladas con tapsigargina (recuadro B, constantes de velocidad 0,011% frente a 0,048% de la incorporación/minuto, n=2), lo que sugiere que el clotrimazol es capaz de inhibir la secreción de Cl− por medio del bloqueo del transporte de K+ a través de canales sensibles tanto a Ba++ como a caribdotoxina. 2. El clotrimazol inhibe la secreción de cloruro a través de canales de K+ basolaterales distintos, sensibles a cAMP y sensibles a Ca++ Permeabilización selectiva de membrana y medida de la conductancia de potasio de la membrana basolateral. La conductancia de potasio de la membrana basolateral se midió utilizando la técnica desarrollada por Dawson y colaboradores. En primer lugar se estableció un gradiente de potasio (desde la mucosa hasta la serosa) a través de la monocapa utilizando tampones con concentraciones asimétricas en la mucosa y en la serosa, que contenían K+ como único ion permeable. La adición de anfotericina B (20 µM) al reservorio de la mucosa forma poros conductivos en la membrana apical, y de este modo elimina toda resistencia al movimiento transepitelial de potasio a través de esta membrana. Así, en las condiciones del experimento, en las que la corriente en la monocapa está interrumpida SHORT CIRCUITED (es decir, VOLTAGE-CLAMPED el voltaje se ha fijado a potencial cero) y el gradiente transepitelial de potasio es constante, la Isc dependiente de anfotericina se convierte en una medida de la velocidad de flujo transepitelial de potasio a través de las membranas basolaterales. Los cambios en la corriente de cortocircuito (Isc), representan por lo tanto cambios en las conductancias de K+ (gK) en la membrana basolateral. La Isc y las conductancias de K+ se midieron utilizando electrodos de calomelanos, puentes de agar-KCl 3M, y una pinza de voltaje (Universidad de Iowa, Iowa City). Para generar una interrelación voltaje-corriente en los canales, se generaron corrientes aplicando potenciales de prueba desde -80 hasta +80 mV en incrementos de 10 mV en la disolución asimétrica de alta concentración en gluconato de K+ . Cálculo de la permeabilidad de K+ por la membrana basolateral: Las permeabilidades de la membrana se calcularon según la fórmula: P

K = (cm/s) = J K(mM/cm2 · s)/∆[K+ ](mM/cm3 ) 11

ES 2 199 358 T3 en la que ∆[K+ ] es igual a la diferencia en la concentración de K+ (135 mM) entre las disoluciones de lavado asimétricas de la membrana apical y de la membrana basolateral. Los valores máximos de la Isc se convirtieron en flujos de K+ dividiendo por la constante de Faraday F (96.500 culombios/mol), según se ha descrito previamente (Huflejt y col., J. Clin. Invest. 93:1900-1910 (1994)). 5

Resultados

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El transporte basolateral de K+ se estudió en monocapas de células T48 permeabilizadas en la membrana apical mediante pretratamiento con anfotericina B. Los tampones de las membranas apical y basolateral contenían K+ como único ion permeable. Todos los estudios se realizaron con un gradiente de K+ que tenía una diferencia entre las de 135 mM, dirigido hacia la membrana basolateral. Este método se ha utilizado con anterioridad para estudiar el transporte tanto de Cl− como de K+ en células T84 y en células HT29-Cl.16E. Brevemente expuesto, las conductancias iónicas en las membranas luminal o basolateral de las monocapas de células T84 confluentes pueden determinarse por separado permeabilizando de manera selectiva la membrana apical o la membrana basolateral utilizando el ionóforo anfotericina B. Este ionóforo elimina de manera artificial toda resistencia eléctrica al transporte de iones a través de la membrana plasmática que contiene poros formados por la anfotericina B. Como resultado de ello, la membrana plasmática contralateral intacta se vuelve limitadora de la velocidad de transporte iónico transepitelial. Los cambios en las conductancias iónicas, dependientes de la acción de agonistas, pueden ser determinados de manera directa ya sea en forma de la corriente transepitelial de cortocircuito (Isc) en presencia de gradientes iónicos establecidos, o en forma de la conductancia transepitelial (G) en presencia de potenciales transepiteliales establecidos. El transporte de K+ se midió en el valor de base y después de las adiciones ordenadas de agonistas dependientes de cAMP y Ca++ . La permeabilización inicial con anfotericina B se asoció con un incremento del 49% ± 19% en la conductancia. Los poros formados por la anfotericina B mostraron una selectividad para cationes monovalentes. El Ca++ permaneció relativamente no permeable como se evidenció por el pequeño aumento en Isc y GK en la situación de equilibrio estacionario, causado por la permeabilización apical con anfotericina B. Dado este bajo valor de base de Isc y GK , las permeabilidades del K+ (PK), tanto la sensible a cAMP como la sensible a Ca++ , se pusieron pronto de manifiesto después de la estimulación con los agonistas. El tratamiento con el agonista forskolina (10 µM), dependiente de cAMP, produjo un incremento rápido en el transporte de K+ a través de una ruta(s) aparentemente de baja conductancia, como se evidencia por incrementos simétricos en Isc y G. El carbacol también incrementó las corrientes de K+ . La magnitud de la IscK inducida por carbacol, sin embargo, fue similar tanto si el carbacol se añadía solo como si se añadía después de la forskolina (111,7% ± 7,4 µA/cm2 frente a 180,7 ± 15,7 µA/cm2 , respectivamente). Por lo tanto, no hubo una clara evidencia de sinergia entre las rutas de K+ mediadas por cAMP y mediadas por Ca++ , como cabría esperar en un sistema celular permeabilizado en la membrana apical. Igual que en los descubrimientos previos de los autores del invento en monocapas intactas de células T84, los cambios en la Isc inducidos por forskolina fueron prolongados mientras que el efecto del carbacol fue de poca duración. Tanto la IscK como GK retornaron a los valores del valor de base en los 5 min posteriores a la adición de carbacol. Se definieron cocientes formales corriente/voltaje (I/V) antes y después de la estimulación con los agonistas para confirmar que ambas corrientes, la dependiente de cAMP y la dependiente de Ca++ , se provocaban a potenciales de membrana fisiológicos. En estos estudios se utilizó tapsigargina en lugar de carbacol como agonista dependiente de Ca++ , debido a que las transiciones de K+ provocadas por tapsigargina alcanzan conductancias en el estado de equilibrio estacionario de duración mucho más larga, lo mismo que sucede en monocapas intactas. Se encontró que en condiciones en las que se utilizan gradientes de K+ dirigidos hacia la membrana basolateral, tanto la forskolina como la tapsigargina activan las corrientes macroscópicas rectificadas hacia el exterior (desde la mucosa hacia la serosa) a voltajes transepiteliales positivos. Los cocientes experimentales (I/V) obtenidos después de la estimulación con forskolina y tapsigargina mostraron potenciales inversos (-40 mV) que se aproximaban al potencial de Nernst calculado (-85 mV, calculado como RT/zQolog[Na]fuera /[Na]dentro ). Estos resultados concuerdan con la activación de las diferentes conductancias de K+ en la membrana basolateral, la sensible a cAMP y la sensible a Ca++ , junto con una o más derivaciones iónicas transepiteliales e inespecíficos, que posiblemente tienen lugar a través de las apretadas uniones intercelulares o de “pérdidas” por la membrana basolateral. Para confirmar que los cambios observados en la Isc y G representaban el transporte de K+ a través de rutas selectivas de K+ , el efecto de la forskolina y el carbacol sobre las conductancias de la monocapa de células T84 se estudió utilizando tampones que contenían Na+ como único catión permeable. Estos estudios se realizaron utilizando un gradiente de cationes (Na+ ) con una diferencia entre las concentraciones de 135 mM, dirigido hacia la membrana basolateral. No se pudieron detectar incrementos en la Isc ni en G en ausencia de K+ . Por lo tanto, los incrementos en las conductancias catiónicas inducidas por estimulación con agonistas son específicos del transporte de K+ . Dos rutas de efusión de K+ , farmacológicamente diferentes, se han identificado previamente en células T84 intactas. Una de las rutas participa en la respuesta secretora frente a agonistas dependientes de cAMP y muestra sensibilidad a sales de Ba++ . La otra ruta de efusión de K+ media en la respuesta a agonistas dependientes de Ca++ , y es insensible a Ba++ . Estos descubrimientos se confirmaron en el modelo que utiliza células permeabilizadas. La IK sensible a cAMP (provocada mediante tratamiento con forskolina 10 µM) se inhibió en una proporción mayor que 70% mediante la adición de BaCl2 (3 mM) a los reservorios basolaterales. El Ba++ , sin embargo, no tuvo efecto detectable alguno sobre el transporte de K+ inducido por la posterior adición de carbacol (100 µM) a las mismas monocapas. Por el contrario, cuando las monocapas permeabilizadas se trataron primero con carbacol, la IK inducida sensible a Ca++ , se inhibió en el 50% mediante pretratamiento con caribdotoxina de veneno de escorpión (100 nM). La caribdotoxina, sin embargo 12

ES 2 199 358 T3 no tuvo efecto detectable alguno sobre el transporte de K+ inducido por la posterior adición de forskolina. Por lo tanto en células permeabilizadas, la sensibilidad diferencial del transporte de K+ frente a la inhibición ejercida por bloqueadores de los canales de K+ , BaCl2 y caribdotoxina, igualó exactamente el efecto de estos inhibidores selectivos de canal, sobre el transporte de K+ en células intactas (medido indirectamente en forma de corriente de Cl− ). 5

Considerados en su conjunto, estos estudios definen el modelo en células T84 permeabilizadas, y proporcionan una importante evidencia de que en las condiciones definidas, tanto Isc como G representan el transporte de K+ a través de canales de K+ diferentes en la membrana basolateral, el sensible a cAMP y el sensible a Ca++ . 10

15

20

3. El clotrimazol y 2-clorofenil-bis-fenil-metanol, un metabolito estable y estructuralmente relacionado, inhiben el transporte de K+ a través de ambos canales de K+ , el dependiente de cAMP y el dependiente de Ca++ . A continuación se probó la hipótesis de que el clotrimazol puede inhibir directamente los canales de K+ de la membrana basolateral en células T84 de intestino humano, al igual que hace en los glóbulos rojos. El clotrimazol inhibió de manera significativa el transcurso la duración del transporte de K+ después del tratamiento con el agonista forskolina (10 µM) dependiente de cAMP, y con el agonista carbacol (100 µM) dependiente de Ca++ . Los cocientes I/V formales, obtenidos en la situación de equilibrio estacionario después de la estimulación con cAMP o con Ca++ , confirman que el clotrimazol afectó a ambos canales, el sensible a cAMP y el sensible a Ca++ . Se obtuvieron resultados casi idénticos con 2-clorofenil-bis-fenil-metanol. El clotrimazol y su metabolito 2-clorofenil-bis-fenil-metanol inhiben directamente ambos canales intestinales de K+ , el sensible a cAMP y el sensible a Ca++ , lo que indica que la estructura en anillo en ausencia del anillo de imidazol es suficiente (y quizá necesaria) para esta actividad biológica. 4. El clotrimazol dirige su acción a la superficie basolateral más que a la superficie apical de células T84

25

Métodos Medida de la conductancia de Cl− de la membrana plasmática apical

30

Para examinar las conductancias de Cl− en la membrana apical, el Cl− se utilizó como único ion permeable utilizando disoluciones tampón idénticas en la membrana apical y en la membrana basolateral. La monocapas se permeabilizaron en la membrana basolateral mediante la adición de Anfotericina B 100 µM al reservorio de la serosa. La generación de curvas de voltaje-corriente de las corrientes de los canales se provocó aplicando potenciales de prueba de 1 s desde -80 mV hasta +80 mV, en incrementos de 10 mV, en tampones simétricos con alto contenido en>>> Colina Cl− .

35

Resultados

40

Se llevaron a cabo estudios para determinar si el objetivo principal del clotrimazol se localizaba en las superficies celulares basolaterales o apicales. La inhibición más rápida se consiguió mediante incubación con clotrimazol a ambos lados de la monocapa. Sin embargo, la aplicación basolateral sola fue casi igual de efectiva que la incubación a ambos lados. De manera adicional, se encontró que la potencia real de la inhibición del clotrimazol en un punto de tiempo determinado, era mayor cuando se aplicaba en la membrana basolateral que cuando se aplicaba en la membrana apical. Esta acción preferencial del clotrimazol en la superficie basolateral de la célula, concuerda con la hipótesis de que sus objetivos principales son los canales basolaterales de K+ .

45

50

55

60

Para confirmar estos descubrimientos, se estudió el transporte de Cl− en monocapas de células T84 permeabilizadas en la membrana basolateral formando poros con anfotericina B. Estos estudios se llevaron a cabo con Cl− como único anión permeable, y con concentraciones de Cl− (142 mM) simétricas en la membrana apical y en la membrana basolateral. En las monocapas no tratadas con clotrimazol, la adición de forskolina (10 µM) a los reservorios basolaterales incrementó de manera significativa las conductancias de Cl− de los reservorios basolaterales, en relación con el valor de base, presumiblemente a través de la activación del canal de Cl− del regulador de transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) (del inglés, “Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator”). En contraste con los claros efectos inhibitorios del clotrimazol sobre las conductancias basolaterales de K+ , sin embargo, el clotrimazol no tuvo efecto detectable alguno ni sobre las conductancias de Cl− estimuladas por forskolina ni sobre las estimuladas por tapsigargina. Los cocientes I/V correspondientes al transporte de Cl− fueron casi idénticos en las monocapas tratadas o no tratadas con clotrimazol. Estos datos proporcionan una evidencia adicional de que el clotrimazol inhibe la secreción de Cl− en monocapas de células T48 intactas, afectando de manera específica los canales basolaterales de K+ . Los canales de Cl− de la membrana apical no se inhiben. Ejemplo 5 El clotrimazol inhibe la secreción de Cl− in vivo 1. Estudios en cámara de Ussing utilizando mucosa de colon de conejo

65

Métodos Cuatro conejos macho, de raza New Zealand (2,5 kg) se anestesiaron con una inyección intravenosa de pento13

ES 2 199 358 T3

5

10

15

barbital (0,5 ml/kg). Se extirpó una longitud de 15 cm del colon distal y se abrió en sentido longitudinal. Las capas musculares externas se separaron por disección roma y se montaron preparaciones de mucosa de colon en una cámara de Ussing (DCTSYS; Precision Instrument Design, CA; 10,3 cm2 de superficie) y se incubaron con una disolución tampón que contenía: NaCl 122,0 mM, CaCl2 2,0 mM; MgSO4 1,3 mM; KCl 5,0 mM; glucosa 20 mM; NaHCO3 25,0 mM (pH cuando se gaseó con O2 al 95%/CO2 al 5%; la temperatura se mantuvo a 37ºC), con y sin clotrimazol>>> (30 µM). El volumen de fluido a cada uno de los lados de la mucosa fue de 7 ml. La diferencia de potencial y la Isc se detectaron de manera continua y se registraron cada 10 minutos. Las disoluciones tampón del lumen y de la serosa se pusieron en contacto a través de electrodos de Ag-AgCl (Voltage/Current Clamp, Modelo VCC600, Physiologic Instruments, Inc. San Diego, CA, USA) y un puente de disolución de Ringer/agar hasta la pinza de voltaje (modelo DVC-1000; Voltage/Current Clamp, World Precision Instruments, Inc.). La resistencia (R) se calculó utilizando la ley de Ohm y la Isc se expresa en Ωxcm2 . Una vez obtenidos los valores estables de resistencia e Isc del valor de base, las preparaciones de la mucosa se incubaron en presencia o ausencia de clotrimazol en la serosa (30 µM) durante 30 min, y a continuación se estimularon mediante adición de forskolina>>> (10 µM) o carbacol (10 µM) en el reservorio de la serosa. Resultados

20

Para determinar la capacidad del clotrimazol para bloquear los canales de K+ y con ello la secreción de Cl− en tejido intestinal normal, se montaron preparaciones aisladas de mucosa de colon de conejo en cámaras de Ussing que contenían disolución de Ringer modificada con o sin clotrimazol (30 µM). Una vez que la Isc se hubo estabilizado, a los reservorios de la serosa se aplicaron adiciones sucesivas de forskolina (10 µM) y luego de carbacol (10 µM), y la Isc y G se detectaron de manera continua. El clotrimazol inhibió fuertemente el transcurso de la Isc inducida por forskolina. El carbacol no tuvo ningún efecto adicional sobre la Isc en este sistema.

25

2. Modelo murino de la diarrea secretora Métodos 30

35

A ratones tratados y ratones de control no tratados, se les administró por sonda nasogástrica o clotrimazol (150 mg/kg/día, dividido en dos dosis iguales, disuelto en aceite de cacahuete en una concentración de 20 mg/ml), o un vehículo de control, durante un período de administración de 7 días. Los ratones a continuación fueron sometidos a una estimulación inmunológica administrándoles por sonda nasogástrica 25 µg de toxina del cólera purificada (Calbiochem, San Diego, CA) en PBS, o un vehículo de control solo (PBS sin toxina del cólera), o toxina del cólera en PBS que contenía clotrimazol 30 µM. Los animales fueron sacrificados pasadas 5 horas en una campana de CO2 sin estar amontonados. El animal muerto se pesó, el abdomen se abrió, y se ataron ligaduras en el duodeno proximal y en el recto distal. El bloque intestinal se diseccionó liberándolo de las estructuras de soporte, y se separó en forma de una única unidad y se pesó. Los segmentos de intestino delgado y de intestino grueso se normalizaron con respecto al peso corporal (peso del intestino/peso del animal muerto) en cada uno de los animales.

40

Resultados

45

50

55

Para estudiar si el clotrimazol puede inhibir la secreción intestinal in vivo, se utilizó un modelo murino de diarrea secretora. A ratones Balb/C se les administró clotrimazol por sonda nasogástrica, 150 mg/kg/día, dividido en dos dosis iguales, o un vehículo de control, cada 12 h durante 7 días, y después fueron sometidos a una estimulación inmunológica por vía oral con toxina del cólera purificada (25 µg). Cinco horas después del tratamiento con la toxina del cólera, los ratones fueron sacrificados y la secreción de fluidos intestinales se determinó por gravimetría. El pretratamiento con clotrimazol redujo en el 86% la secreción de fluidos intestinales inducida por la toxina del cólera. El clotrimazol no tuvo efecto sobre la secreción intestinal de fluidos, inducida por la toxina del cólera. El clotrimazol no tuvo efecto sobre la secreción intestinal en ausencia de la toxina del cólera. Por lo tanto, el clotrimazol trató de manera efectiva la diarrea secretora in vivo, presumiblemente inhibiendo los canales de K+ de la membrana basolateral de las células epiteliales de las criptas. Habiendo descrito las realizaciones hasta la fecha preferidas, de acuerdo con el presente invento, debe entenderse que el presente invento está únicamente limitado por las reivindicaciones adjuntas.

60

65

14

ES 2 199 358 T3 REIVINDICACIONES

5

10

15

20

25

30

1. El uso de un compuesto aromático para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de diarrea o disentería, en el que el compuesto aromático tiene la fórmula general: Ar1 | X | 2 Ar —C—Op —(CH2 )n R’ | Ar3 en la que n = 0-3; en la que p = 0 ó 1; en la que X se selecciona entre el grupo constituido por (CH2 )m (m=1,2 ó 3), CH=CH, C≡C, SCH2 , OCH2 y NOCH2 ; en la que R’ se selecciona entre el grupo constituido por H, OH, SH, NO2 , CN, CHO, ONH2 , COR”, CO2 H, CO2 R”, OR”, SR”, NR”R”, CONR”R”, furanilo, piridinilo, tiofenilo, indolilo, quinolilo y CONR”(OCH3 ); en la que Ar1 se selecciona entre el grupo constituido por fenilo, fenilo sustituido y heteroarilo; en la que Ar2 se selecciona entre el grupo constituido por fenilo y fenilo sustituido; y en la que Ar3 se selecciona entre el grupo constituido por fenilo, fenilo sustituido, bifenilo, bibencilo y naftilo; en la que el sustituyente del fenilo se selecciona entre el grupo constituido por Cl, F, Br, I, R, OR”, SR”, NO2 , CN, CF3 , NR”R” y CO2 R; en la que R se selecciona entre el grupo constituido por un alquilo lineal de CZ (Z=1-5), alquilo lineal sustituido de CZ (Z=1-5), alquilo ramificado de CZ (Z=1-5), y alquilo sustituido de CZ (Z=1-5); en la que el sustituyente del alquilo se selecciona entre el grupo constituido por Cl, F, Br, I, OH, OCH3 , SH, SCH3 , NH2 , NHCH3 y N(CH3 ); y en la que R” se selecciona entre el grupo constituido por hidrógeno y R. 2. Un uso según la reivindicación 1, en la que el compuesto aromático se selecciona entre el grupo constituido por:

35

40

45

3. Un uso según la reivindicación 1, en el que el compuesto aromático se administra por vía oral.

50

4. Un uso según la reivindicación 1, en el que el medicamento es para el tratamiento de la diarrea en seres humanos, o en el que el medicamento es para el tratamiento de la disentería en caballos, vacas, cerdos o cabras. 5. Un uso según la reivindicación 1, en el que el medicamento es para el tratamiento de la diarrea y comprende además un agente antidiarreico, preferiblemente un fluido de rehidratación oral.

55

6. Un uso según la reivindicación 1, en el que el medicamento es para el tratamiento de la disentería y comprende además un agente antidisentérico. 7. Un uso según la reivindicación 1, en el que el compuesto aromático es 2-clorofenil-bis-fenil-metanol y tiene la siguiente fórmula:

60

65

15

ES 2 199 358 T3

5

10

8. El uso de un compuesto aromático para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diarrea o disentería, en el que el compuesto aromático se selecciona entre el grupo constituido por miconazol y econazol. 15

9. Una preparación veterinaria que comprende: un compuesto aromático en una cantidad efectiva para inhibir disentería en un sujeto, teniendo el compuesto aromático la fórmula general: 20

Ar1 | X | 2 Ar —C—Op —(CH2 )n R’ | Ar3

25

30

35

40

en la que n = 0-3; en la que p = 0 ó 1; en la que X se selecciona entre el grupo constituido por (CH2 )m (m=1,2 ó 3), CH=CH, C≡C, SCH2 , OCH2 y NOCH2 ; en la que R’ se selecciona entre el grupo constituido por H, OH, SH, NO2 , CN, CHO, ONH2 , COR”, CO2 H, CO2 R”, OR”, SR”, NR”R”, CONR”R”, furanilo, piridinilo, tiofenilo, indolilo, quinolilo y CONR”(OCH3 ); en la que Ar1 se selecciona entre el grupo constituido por fenilo, fenilo sustituido y heteroarilo; en la que Ar2 se selecciona entre el grupo constituido por fenilo y fenilo sustituido; y en la que Ar3 se selecciona entre el grupo constituido por fenilo, fenilo sustituido, bifenilo, bibencilo y naftilo; en la que el sustituyente del fenilo se selecciona entre el grupo constituido por Cl, F, Br, I, R, OR”, SR”, NO2 , CN, CF3 , NR”R” y CO2 R; en la que R se selecciona entre el grupo constituido por un alquilo lineal de CZ (Z=1-5), alquilo lineal sustituido de CZ (Z=1-5), alquilo ramificado de CZ (Z=1-5), y alquilo ramificado sustituido de CZ (Z=1-5); en la que el sustituyente del alquilo se selecciona entre el grupo constituido por Cl, F, Br, I, OH, OCH3 , SH, SCH3 , NH2 , NHCH3 y N(CH3 ); y en la que R” se selecciona entre el grupo constituido por hidrógeno y R; y un agente antidisentérico.

45

10. Una preparación veterinaria según la reivindicación 9, en la que agente antidisentérico es un extracto de calostro, una preparación inmunológica de calostro, una preparación inmunológica específica de un microorganismo, un fluido de rehidratación oral, una composición de reposición de electrolitos o una composición antibiótica. 50

11. Una preparación veterinaria según la reivindicación 9, en la que la preparación veterinaria es una preparación seca. 12. Una preparación farmacéutica que comprende:

55

60

65

un compuesto aromático en una cantidad efectiva para inhibir diarrea, teniendo el compuesto aromático la fórmula general: Ar1 | X | Ar2 —C—Op —(CH2 )n R’ | Ar3 16

ES 2 199 358 T3

5

10

en la que n = 0-3; en la que p = 0 ó 1; en la que X se selecciona entre el grupo constituido por (CH2 )m (m=1,2 ó 3), CH=CH, C≡C, SCH2 , OCH2 y NOCH2 ; en la que R’ se selecciona entre el grupo constituido por H, OH, SH, NO2 , CN, CHO, ONH2 , COR”, CO2 H, CO2 R”, OR”, SR”, NR”R”, CONR”R”, furanilo, piridinilo, tiofenilo, indolilo, quinolilo y CONR”(OCH3 ); en la que Ar1 se selecciona entre el grupo constituido por fenilo, fenilo sustituido y heteroarilo; en la que Ar2 se selecciona entre el grupo constituido por fenilo y fenilo sustituido; y en la que Ar3 se selecciona entre el grupo constituido por fenilo, fenilo sustituido, bifenilo, bibencilo y naftilo; en la que el sustituyente del fenilo se selecciona entre el grupo constituido por Cl, F, Br, I, R, OR”, SR”, NO2 , CN, CF3 , NR”R” y CO2 R; en la que R se selecciona entre el grupo constituido por un alquilo lineal de CZ (Z=1-5), alquilo lineal sustituido de CZ (Z=1-5), alquilo ramificado de CZ (Z=1-5), y alquilo ramificado sustituido de CZ (Z=1-5); en la que el sustituyente del alquilo se selecciona entre el grupo constituido por Cl, F, Br, I, OH, OCH3 , SH, SCH3 , NH2 , NHCH3 y N(CH3 ); y en la que R” se selecciona entre el grupo constituido por hidrógeno y R; y un agente antidiarreico.

15

20

13. Una preparación farmacéutica según la reivindicación 12, en la que el agente antidiarreico es un fluido de rehidratación oral, un antibiótico, una composición electrolítica, una preparación de inmunoglobulinas procedente de calostro bovino o una disolución oral de azúcares y electrolitos. 14. Una preparación según una cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 12, en la que el compuesto aromático es 2clorofenil-bis-fenil-metanol y tiene la siguiente fórmula:

25

30

35

40

45

50

55

60

65

NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluida en la mencionada reserva. 17

ES 2 199 358 T3

18

ES 2 199 358 T3

19