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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

C12N 15/12 (2006.01) C12N 15/85 (2006.01) C12N 15/62 (2006.01) C12N 15/90 (2006.01) C12N 5/10 (2006.01) C07K 14/505 (2006.01) A61K 38/18 (2006.01)

ESPAÑA

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11 Número de publicación: 2 273 434

51 Int. Cl.:

TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 98941401 .6

86

Fecha de presentación : 22.07.1998 87 Número de publicación de la solicitud: 0986644

87 Fecha de publicación de la solicitud: 22.03.2000

54 Título: Obtención de la eritropoyetina mediante activación génica endógena.

30 Prioridad: 23.07.1997 EP 97112640

03.12.1997 DE 197 53 681 10.07.1998 US 113692

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

73 Titular/es: Roche Diagnostics GmbH

Sandhofer Strasse 116 68305 Mannheim, DE

72 Inventor/es: Stern, Anne;

Brandt, Michael; Honold, Konrad; Auer, Johannes y Koll, Hans

01.05.2007

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Isern Jara, Jorge

ES 2 273 434 T3

01.05.2007

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid

ES 2 273 434 T3 DESCRIPCIÓN Obtención de la eritropoyetina mediante activación génica endógena. 5

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La invención se refiere a células humanas, las cuales debido a una activación del gen endógeno de la EPO humana, están en disposición de producir EPO en una cantidad y pureza suficientes, para hacer posible una obtención con un coste rentable de EPO humana como preparado farmacéutico. Además, la invención se refiere a un procedimiento para la obtención de dichas células productoras de EPO humana, la construcción de un ADN para la activación del gen endógeno de EPO en las células humanas, así como un procedimiento para la producción técnica en gran escala de EPO en células humanas. La eritropoyetina (EPO) es una glicoproteína humana, la cual estimula la producción de las células rojas de la sangre. La EPO está presente en el plasma sanguíneo de las personas sanas solamente en muy pequeñas concentraciones, de manera que una preparación en grandes cantidades por esta vía no es posible. Las patentes EP-B-0148 605 y EP-B0205 564 describen la obtención de EPO humana recombinante en las células CHO. La EPO descrita en la patente EPB-0148 605 tiene un peso molecular más grande que la EPO de la orina y ninguna O-glicosilación. La EPO descrita en la patente EP-B-0 205 564 a partir de células CHO, está disponible entretanto en grandes cantidades y en forma pura, aunque sin embargo procede de células no humanas. Además, el rendimiento de producción de las células CHO es a menudo relativamente limitada.

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Además, es conocida la obtención de la EPO humana a partir de la orina de pacientes con anemia aplásica (Miyake et al., J. Biol.. Chem. 252 (1977), 5558 - 5564). Se da a conocer en este trabajo un procedimiento de siete pasos, el cual comprende cromatografía de intercambio iónico, precipitación con etanol, gelfiltración y cromatografía de adsorción. Con un rendimiento del 21% se obtiene un preparado de EPO con una actividad específica de aproximadamente 70.000 U/mg de proteína. Desventajas de este procedimiento y otros procedimientos para la obtención de EPO de la orina consisten en el suministro del material de partida en cantidades suficientes y con calidad reproducible. Además, la purificación de la orina es difícil e incluso un producto purificado no está libre de impurezas orinarias.

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La patente GB-A-2085 887 describe un procedimiento para la obtención de células linfoblastoides humanas, las cuales son capaces de producir EPO en pequeñas cantidades. La producción rentable de un medicamento con estas células no es posible.

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La patente WO 91/06667 describe un procedimiento para la obtención recombinante de EPO. Para ello, en un primer paso de procedimiento, se lleva en células renales embrionales humanas primarias el gen-EPO endógeno mediante la recombinación homóloga en un empalme operativo con un promotor vírico, y se aisla el ADN de estas células. En un segundo paso, el ADN aislado de esta forma, se transforma en células CHO no humanas y se analiza la expresión de EPO en estas células. No se encuentra ningún indicio de que sea posible la producción de EPO en células humanas.

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La patente WO 93/09222 describe la producción de EPO en células humanas. En los fibroblastos humanos, que se transfectan con un vector que contiene el gen EPO completo, se encuentra una producción de EPO relativamente alta de hasta 960.620 mU/106 células/24 horas. Estas células contienen un gen EPO exógeno, que no se encuentra en el lugar correcto del gen EPO, de manera que hay que esperar problemas respecto a la estabilidad de la línea celular. Datos sobre una producción constitutiva de EPO no se encuentran en la patente WO 93/092222. Además, no se encuentran tampoco datos de si la EPO producida puede ser obtenida en una calidad suficiente para fines farmacéuticos.

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Además, en la patente WO 93/09222 se describe una activación del gen EPO endógeno en las células humanas HT1080. A este respecto, se encuentra un producción de EPO de solamente 2.500 mU/106 células/24 horas (correspondientes aproximadamente a 16 ng/106 células/24 horas). Una producción de este tipo es completamente insuficiente para la producción rentable de un preparado farmacéutico.

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Las patentes WO94/12650 y WO 95/31560 describen que una célula humana con un gen EPO endógeno activado por un promotor vírico es capaz, después de la amplificación del gen EPO, de producir EPO en una cantidad de hasta aproximadamente 100.000 mU/106 células/24 horas (correspondientes aproximadamente a 0,6 µg/106 células/24 horas). Tampoco esta cantidad es suficiente para la producción rentable de un medicamento.

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La finalidad en la que se basa la presente invención consiste en solventar los citadas inconvenientes del estado actual de la técnica por lo menos parcialmente, y proporcionar un procedimiento tecnológico mejor para la obtención de EPO en células humanas. En particular, debería poderse obtener con el mismo, un producto en una cantidad y pureza suficientes, para permitir la obtención económicamente rentable con fines farmacéuticos.

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Este problema se resuelve mediante la activación del gen EPO endógeno en células humanas y eventualmente mediante la subsiguiente amplificación del gen EPO humano activado. De esta forma se logra sorprendentemente, mediante la apropiada selección de células de partida, la construcción de un ADN y estrategias de selección, preparar células humanas capaces de producir EPO en una cantidad, calidad y pureza suficientes, que permitan la obtención económicamente rentable, de preparados farmacéuticos. En particular, después de la amplificación del gen EPO endógeno activado, pueden obtenerse células, que presentan claramente un más alto rendimiento de producción que las células de producción CHO empleadas hasta ahora para la obtención de EPO recombinante. 2

ES 2 273 434 T3

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Un objeto de la invención, es una célula humana con el requisito de que dicha célula humana no sea ninguna célula pregerminativa, en donde la célula contiene una copia de un gen EPO endógeno en unión operativa con una secuencia heteróloga del control de secuencia, activa en la célula humana y sea capaz, sin una anterior amplificación génica de la producción, de producir por lo menos 200 ng EPO/106 células/24 horas, en donde la distancia entre la secuencia heteróloga del control de la expresión y el principio de la traducción del gen EPO no sea mayor de 1100 bp. De preferencia, la célula humana según la invención es capaz de la producción de 200 a 3000 ng de EPO/106 células/24 horas y con la máxima preferencia, de la producción de 1000 a 3000 ng de EPO/106 células/24 horas.

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Otro objeto de la presente invención es una célula humana, con la condición de que no sea ninguna célula pregerminativa, la cual puede obtenerse mediante la amplificación génica de la célula antes citada, contiene varias copias de un gen EPO endógeno, cada una de ellas en unión operativa con una secuencia heteróloga del control de la expresión, activa en la célula humana, y es capaz de la producción de por lo menos 1.000 ng de EPO/106 células/24 horas. Particularmente preferida es la línea celular humana que puede obtenerse por amplificación génica capaz de la producción de 1.000 a 25.000 ng de EPO/106 células/24 horas, y con la máxima preferencia para la producción de 5.000 a 25.000 ng de EPO/106 células/24 horas.

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La célula humana es una célula cualquiera, con el requisito de que no sea ninguna célula pregerminativa, con la condición de que pueda ser cultivada in vitro. Particularmente preferidas son las células humanas que pueden cultivarse en un medio libre de suero y en particular cultivables en suspensión. De esta manera la producción de EPO puede efectuarse en un fermentador grande con por ejemplo 1.000 litros de volumen de cultivo.

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Con particular preferencia la célula humana es una célula inmortalizada, por ejemplo una célula HT 1080 (Rasheed et al., Cancer 33 (1974), 1027-1033), un célula HeLa S3 (Puck et al., J. Exp. Med. 103 (1956), 273-284), una célula Namalwa (Nadkarni et al., Cancer 23 (1969), 64-79) ó una célula derivada de las mismas. Un ejemplo de una célula según la invención es el clon “Aladin”, el cual fue depositado el 15.07.1997 según las prescripciones del Tratado de Budapest en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, con el número de referencia DSM ACC 2320. En la célula según la invención, el gen EPO endógeno está unido a una secuencia heteróloga del control de expresión, la cual es activa en la célula humana. La secuencia del control de la expresión comprende un promotor vírico potente y de preferencia otras secuencias para mejorar la expresión, p. ej., un potenciador. El promotor puede ser un promotor regulable o constitutivo. De preferencia, el promotor es un SV40 ó un promotor CMV. Particularmente preferido es el promotor/potenciador CMV. Además, para la optimización de la expresión de EPO, se prefiere que el gen EPO endógeno de la célula humana, el cual está en unión operativa con el promotor heterólogo, presente una secuencia que codifica un péptido señal, la cual es distinta de la secuencia natural que codifica el péptido señal, y de preferencia codifica un péptido señal con la secuencia de aminoácidos modificada. Es particularmente preferida una secuencia que codifica el péptido señal, la cual codifica la secuencia del péptido señal modificada en los cuatro primeros aminoácidos, la cual se escoge de Met-X1 -X2 -X3

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en donde X1 es Gly ó Ser, X2 es Ala, Val, Leu, Ile, Ser ó Pro, X3 es Pro, Arg, Cys ó His, con el requisito de que X1 -X2 -X3 no es la secuencia Gly-Val-His, y en particular de (a) Met-Gly-Ala-His, (b) Met-Ser-Ala-His,

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(c) Met-Gly-Val-Pro ó (d) Met-Ser-Val-His. 55

Es particularmente preferido que la secuencia de los cuatro primeros aminoácidos del péptido señal sea Met-SerAla-His. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de una célula humana productora de EPO, como se ha mencionado anteriormente, el cual comprende los pasos de:

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(a) Preparación de las células de partida humanas, las cuales contienen por lo menos una copia de un gen EPO endógeno, con el requisito de que las células de partida humanas no sean ninguna célula pregerminativa, (b) Transfección de las células con una construcción de ADN, la cual comprende: 65

(i) dos secuencias de ADN flanqueantes, que son homólogas a las regiones del lugar del gen EPO humano, para permitir una recombinación homóloga 3

ES 2 273 434 T3 (ii) un gen marcador de selección positiva, y

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(iii) una secuencia heteróloga del control de expresión, la cual es activa en la célula humana, en donde la secuencia heteróloga del control de expresión comprende un potente promotor vírico y la distancia entre el promotor heterólogo y el comienzo de la traducción del gen EPO no es mayor de 1100 bp, (c) Cultivo de las células transfectadas en condiciones en las que tiene lugar una selección para detectar la existencia del gen marcador de selección positiva,

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(d) análisis de las células seleccionadas según el paso (c), y (e) identificación de las células productoras de EPO.

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La construcción de ADN, empleada para la obtención de la célula productora de EPO humana, contiene dos secuencias de ADN flanqueantes, las cuales son homólogas a las regiones del lugar del gen EPO humano, para permitir una recombinación homóloga. La elección de secuencias flanqueantes adecuadas tiene lugar por ejemplo según los métodos descritos en las patentes WO 90/11 354 y WO 91/09 955. De preferencia, las secuencias flanqueantes tienen cada una de ellas una longitud de por lo menos 150 bp. Particularmente preferidas son las secuencias homólogas de ADN seleccionadas de la región de las secuencias 5’ sin traducir, exón 1 e intrón 1 del gen EPO. A este respecto, es particularmente preferido utilizar una secuencia de ADN modificada en la región del exón 1, la cual codifica el péptido señal modificado en los primeros aminoácidos. Las modificaciones en la región del exón 1 son de preferencia como se ha mencionado más arriba. El gen marcador de selección puede ser un gen marcador de selección cualquiera, apropiado para células eucariotas, el cual conduce en la expresión a un fenotipo seleccionable, p. ej., la resistencia a un antibiótico, auxotropía, etc. Un gen marcador de selección positiva particularmente preferido es el gen de la neomicinfosfotransferasa. Eventualmente puede existir también un gen marcador de selección negativa como por ejemplo la HSV-timidinquinasa, mediante cuya expresión se destruyen las células en presencia de un medio de selección.

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Cuando se desea una amplificación del gen EPO endógeno activado en las células humanas, la construcción de ADN contiene un gen de amplificación. Ejemplos de genes de amplificación adecuados son la dihidrofolatoreductasa, adenosindesaminasa, ornitindescarboxilasa, etc. Un gen de amplificación particularmente preferido es el gen de la dihidrofolatoreductasa, en particular un dihidrofolatoreductasa-arginino-mutante, el cual posee una pequeña sensibilidad para el agente selectivo (metotrexato) como el gen del tipo salvaje (Simonsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983); 2495). En presencia de un gen de amplificación en el cual se emplea una construcción de ADN para la activación del gen EPO, el procedimiento según la invención puede comprender todavía otros pasos:

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(f) amplificación de la secuencia de ADN que codifica la EPO, y

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(g) obtención de las células productoras de EPO, las cuales contienen un elevado número de copias frente a la célula de partida, de una secuencia endógena de ADN que codifica la EPO madura en unión operativa con una secuencia heteróloga de control de la expresión, Una construcción de ADN apropiada para la activación del gen de EPO endógeno existente en la célula de partida humana, son los plásmidos relacionados en los ejemplos, p187, p189, p190 y p122. Es particularmente preferido el plásmido p189, el cual fue depositado en el DSMZ según las determinaciones del tratado de Budapest del 16.07.1997 bajo el número de referencia DSM 11661, ó un plásmido derivado del mismo. Las construcciones de ADN son de preferencia moléculas de plásmido circulares, las cuales para la transfección a la célula humana se emplean en una forma linealizada. Otro objeto de la presente invención es una construcción de ADN para la activación de un gen EPO endógeno en una célula humana, que comprende: (i) dos secuencias de ADN flanqueantes, las cuales se seleccionan homólogamente a la región del lugar del gen EPO humano, a partir de secuencias no traducidas en 5’, exón 1 e intrón 1, para permitir una recombinación homóloga, en donde en la región del exón 1, existe una secuencia modificada que codifica los aminoácidos:

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Met-Ser-Ala-His, (ii) un gen marcador de selección positiva, 65

(iii) una secuencia heteróloga del control de expresión, que es activa en una célula humana, en donde la secuencia heteróloga de control de la expresión comprende un potente promotor vírico y la distancia entre el promotor heterólogo y el comienzo de la traducción del gen EPO no es mayor de 1100 bp, y 4

ES 2 273 434 T3 (iv) eventualmente un gen de amplificación.

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Todavía otro ejemplo de la presente invención es una construcción de ADN de un gen EPO endógeno en una célula humana con la condición de que la célula humana no sea ninguna célula pregerminativa, en donde la construcción comprende: (i) dos secuencias de ADN flanqueantes, las cuales, se seleccionan homólogamente a la región del lugar del gen EPO humano, a partir de secuencias 5’ no traducidas, exón 1 e intrón 1, para permitir una recombinación homóloga,

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(ii) un gen marcador de selección positiva, (iii) una secuencia heteróloga de control de la expresión, que es activa en una célula humana, en donde dicha secuencia heteróloga de control de la expresión comprende un potente promotor vírico y la distancia entre la secuencia heteróloga del control de expresión y el comienzo de la traducción del gen EPO no es mayor de 1100 bp, y

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(iv) eventualmente un gen de amplificación.

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Sorprendentemente se comprobó que, en una modificación de la secuencia señal EPO ó/y en un acortamiento de la distancia entre la secuencia heteróloga del control de expresión y el comienzo de la traducción del gen EPO, se obtiene una expresión óptima. La distancia entre el promotor de la secuencia heteróloga del control de expresión y el comienzo de la traducción del gen EPO no es mayor de 1100 bp, de preferencia no más de 150 bp y con mayor preferencia no mayor de 100 bp. Un ejemplo particularmente preferido para una construcción de ADN a emplear según la invención, es el plásmido p189 (DSM 11661) ó un plásmido derivado del mismo. Todavía otro aspecto de la presente invención es un procedimiento para la obtención de EPO humana, en donde se cultiva una célula humana según la invención en condiciones en un medio adecuado en el cual tiene lugar una producción de EPO, y la EPO se obtiene a partir del medio de cultivo. Como medio se emplea de preferencia un medio libre de suero. Las células se cultivan de preferencia en suspensión. El cultivo tiene lugar de preferencia en un fermentador, en particular en un fermentador grande, con un volumen de por ejemplo 10 litros - 50.000 litros.

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La obtención de EPO humana a partir del medio de cultivo de líneas celulares humanas comprende de preferencia los siguientes pasos: 35

(a) conducción del sobrenadante de las células a un medio de cromatografía de afinidad, y obtención de las fracciones que contienen la EPO, (b) eventualmente, conducción de las fracciones que contienen la EPO, sobre un medio de cromatografía de interacción hidrófobo, y obtención de las fracciones que contienen la EPO,

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(c) conducción de las fracciones que contienen la EPO, sobre hidroxiapatita y obtención de las fracciones que contienen la EPO, y (d) concentración o/y conducción sobre un medio de HPLC (RP) de fase invertida.

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El paso (a) del procedimiento de purificación comprende la conducción del sobrenadante de las células, el cual puede ser tratado previamente, sobre un medio de cromatografía de afinidad. Medios de cromatografía de afinidad son aquellos que están copulados con un colorante azul. Un ejemplo particularmente preferido es el azul-sefarosa. Después de la elución del medio de la cromatografía de afinidad se conduce el eluato que contiene la EPO eventualmente sobre un medio de cromatografía de interacción hidrófobo. Este paso es conveniente cuando se utiliza un medio de cultivo con un contenido en suero ≥ 2% (v/v). Cuando se utiliza un medio de cultivo con un contenido en suero pequeño, p. ej., 1% (v/v) ó un medio libre de suero, este paso puede omitirse. Un medio preferido de cromatografía de interacción hidrófobo, es la butil-sefarosa. El eluato del paso (a) ó del paso (b), siempre que se utilice, se conduce al paso (c) del procedimiento según la invención, sobre hidroxiapatita y el eluato que contiene la EPO se somete a un paso de concentración o/y un paso de purificación mediante HPLC de fase invertida. La concentración tiene lugar de preferencia mediante cromatografía de exclusión, p. ej., filtración por membrana, en donde el empleo de un medio p. ej., una membrana con un tamaño de exclusión de 10 kD se ha evidenciado como favorable.

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Mediante el procedimiento según la invención puede obtenerse una EPO humana aislada con una actividad específica de por lo menos 100.000 U/mg de proteína in vivo (ratón normocitémico), la cual está libre de las impurezas de la orina y puede diferenciarse en su glicosilación de la EPO recombinante de células CHO. De preferencia, la EPO según la invención tiene una actividad específica de por lo menos 175.000, con particular preferencia por lo menos de 200.000 a 400.000 ó 450.000 IU/mg de proteína. La EPO humana que puede obtenerse mediante el procedimiento según la invención puede contener radicales de ácido siálico unidos a α-2,3- ó/y α-2,6-. En investigaciones a partir de EPO de células que contienen un gen de EPO activado endógeno, se encontró sobre la base de los resultados provisionales existentes, la existencia de radicales de ácido siálico unidos a α-2,3- y α-2,6-. Además, se comprobó sobre la 5

ES 2 273 434 T3 base de los resultados provisionales existentes que la EPO humana según la invención tiene un contenido inferior al 0,2% de ácido N-glicolneuramínico referido al contenido de N-acetilneuramínico. 5

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La pureza de la EPO humana según la invención es de preferencia por lo menos del 90%, con particular preferencia por lo menos del 95% y con la máxima preferencia por lo menos del 98% con respecto al contenido total de proteína, La determinación del contenido total de proteína puede efectuarse mediante HPLC de fase invertida, p. ej., con una columna Poros R/2H. Además, pueden obtenerse mediante el procedimiento según la invención especies de EPO humana, las cuales se diferencian por su secuencia de aminoácidos. Así por ejemplo, se encuentra mediante análisis espectrométrico de masas (MALDI-MS), que a partir de células HeLa S3 puede aislarse una EPO humana la cual contiene preponderantemente un polipéptido con una longitud de 165 aminoácidos, el cual se origina mediante el procesado C-terminal de un radical arginina, y eventualmente comprende hasta el 15% de una EPO con 166 aminoácidos. Además, puede también obtenerse una EPO humana, la cual contiene un polipéptido con una longitud de 166 aminoácidos, es decir, una EPO sin procesar. A partir de células Namalwa pudo aislarse por ejemplo una EPO humana, la cual contiene una mezcla de polipéptidos con una longitud de 165 y 166 aminoácidos. Esta EPO humana puede emplearse como substancia activa para un preparado farmacéutico, el cual eventualmente puede contener otras substancias activas así como otras substancias auxiliares, cargas y aditivos farmacéuticamente habituales. Todavía en otro aspecto, la presente invención se refiere a un ADN aislado, el cual codifica una EPO humana con la secuencia modificada en la región de los 4 primeros aminoácidos del péptido señal,

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Met-Ser-Ala-His El ADN puede ser por ejemplo, un ADN genómico o un ADNc. Además, la invención se aclara mediante los siguientes ejemplo y figuras y protocolos de secuencia.

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Se muestran: Figura 1: Una representación esquemática de la amplificación de regiones de homología del gen EPO a partir de la región de las secuencias 5’ sin traducir, exón 1 e intrón 1; 35

Figura 2: Una representación esquemática de un plásmido, el cual contiene regiones de homología de EPO a partir de la región de las secuencias 5’ sin traducir, exón 1 e intrón 1; 40

Figura 3: Una representación esquemática de una secuencia de activación génica, la cual contiene el promotor del Rous-Sarcomavirus (RSV), el gen de la neomicinfosfotransferasa (NEO), la región temprana de poliadenilación de SV40 (SVI pA), el promotor del temprano SV40 (SVI), el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR), otra región temprana de SV40-poliadenilación y el promotor inmediato temprano y potenciador (MCMV) del Cytomegalovirus; Figura 4a: Obtención del vector diana del gen de EPO, p176;

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Figura 4b: Obtención de los vectores diana del gen de EPO, p179 y p187; Figura 4c: Obtención del vector diana del gen de EPO, p189 (DSM 11661); 50

Figura 4d: Obtención del vector diana del gen de EPO, p190; Figura 4e: Obtención del vector diana del gen de EPO, p192; Figura 5: Una representación esquemática de la obtención del ADNc de EPO con mutaciones de la secuencia señal;

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Figura 6a: Hibridación de ADN celular con una sonda a partir de la región CMV del casette génico representado en la figura 3; las huellas 1 a 4 son cada una de ellas, ADN escindido de células humanas con las enzimas de restricción AgeI y AscI; huella 1: célula HeLa S3 productora de EPO con 1.000 nM de MTX amplificada; huella 2: célula HeLa S3 productora de EPO con 500 nM de MTX amplificada; huella 3: célula HeLa S3 productora de EPO sin amplificación; huella 4: célula HeLa S3 sin el gen EPO activado; huella 5: marcador de longitud marcado con digoxigenina; el tamaño del fragmento que se hibrida en las huellas 1 a 3 es de aproximadamente 5.200 bp, y Figura 6b: La hibridación de una sonda a partir de la región codificadora de EPO con ADN de células humanas; huella 1: marcador de longitud marcado con digoxigenina; huellas 2 a 4: ADN de células humanas escindido con las enzimas de restricción BamHI, HindIII y SalI; huella 2: célula HeLa S3 productora de ECO amplificada con 500 nM de MTX (longitud de las bandas producidas por el gen endógeno no activado: 3.200 bp; longitud de la copia del gen EPO activada por la diana génica: 2600 bp); huella 3: ADN a partir de una célula HeLa S3 productora de EPO sin amplificar; huella 4: ADN de una célula HeLa S3 de control; 6

ES 2 273 434 T3 SEQ ID NO. 1 y NO. 2

Secuencias de nucleótidos de los cebadores empleados para la obtención del producto 1 de la PCR (figura 1);

SEQ ID NO. 3 y NO. 4

Secuencias de los cebadores empleados para la obtención del producto 2 de la PCR (figura 1);

SEQ ID NO. 5

Secuencia del cebador EPO EX1;

SEQ ID NO. 6

Secuencia del cebador EX2;

SEQ ID NO. 7

Secuencia del cebador EX3 (Met-Gly-Ala-His);

SEQ ID NO. 8

Secuencia del comienzo del péptido señal modificado codificado por el cebador EX3;

SEQ ID NO. 9

Secuencia del cebador EX4 (Met-Ser-Ala-His);

SEQ ID NO. 10

Secuencia del comienzo del péptido señal modificado codificado por el cebador EX4;

SEQ ID NO. 11

Secuencia del cebador EX5 (Met-Gly-Val-Pro);

SEQ ID NO. 12

Secuencia del comienzo del péptido señal modificado codificado por el cebador EX5;

SEQ ID NO. 13

Secuencia del cebador EX6 (Met-Ser-Val-His);

SEQ ID NO. 14

Secuencia del comienzo del péptido señal modificado codificado por el cebador EX6;

SEQ ID NO. 15

Secuencia del cebador EX genoma 1;

SEQ ID NO. 16

Secuencia del cebador EX13, y

SEQ ID NO. 17

Secuencia del cebador EPO EX 17.

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Ejemplos 35

La activación del lugar génico de EPO para la producción de proteína a escala industrial se alcanzó mediante la integración homóloga de una secuencia de activación génica, la cual contenía neomicinfosfotransferasa (NEO)Gen para selección (resistencia G-418), dihidrofolatoreductasa de ratón (DHFR)-Gen (para la amplificación génica mediante MTX) y el promotor-temprano-inmediato del Cytomegalovirus (CMV), y po-tenciador para la activación génica.

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Ejemplo 1 Clonación de regiones de homología de EPO 45

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Las regiones de homología del gen EPO fueron amplificadas mediante PCR con utilización de un ADN de placenta genómico (Boehringer Mannheim). A este respecto se prepararon, a partir de una región de homología de 6,3 kB de longitud de la región de secuencias 5’ sin traducir, de los genes EPO, exón 1 e intrón 1, dos productos PCR (ver figura 1). Los cebadores empleados para la obtención del producto 1 de la PCR, tenían las siguientes secuencias: 5’-CGC GGC GGA TCC CAG GGA GCT GGG TTG ACC GG-3’ (SEQ ID NO. 1) y 5’-GGC CGC GAA TTC TCC GCG CCT GGC CGG GGT CCC TCA GC-3’ (SEQ ID NO. 2). Los cebadores empleados para la obtención del producto 2 de la PCR tenían las siguientes secuencias: 5’-CGC GGC GGA TCC TCT CCT CCC TCC CAA GCT GCA ATC-3’ (SEQ ID NO. 3) y 5’-GGC CGC GAA TTC TAG AAC AGA TAG CCA GGC TGA GAG-3’ (SEQ ID NO. 4). A partir de los productos 1 y 2 de la PCR, se separaron los segmentos deseados mediante escisión por restricción (Producto 1 de la PCR: HindIII, producto 2 de la PCR: HindIII y Eco RV), y se clonaron en el vector pCRII (de la Firma Invitrogen) el cual fue escindido con Hind III y Eco RV. El vector recombinante obtenido de esta forma se designó como 5epopcr1000 (ver figura 2). Ejemplo 2

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Construcción de los vectores diana del gen EPO

65

2.1 Una secuencia de activación génica, la cual contiene el gen NEO, el gen DHFR y un promotor/ potenciador CMV (ver figura 3) fueron insertados en el lugar AgeI del plásmido 5epocr1000 que contiene la región de homología de EPO, con lo que se obtuvo el plásmido p176 (ver figura 4a). Para llevar el promotor CMV lo más cerca posible al lugar de comienzo de la traducción del gen EPO, se suprimió un segmento de 963 bp de longitud entre el lugar de restricción AscI y AgeI (escisión parcial), con lo cual se obtuvo el plásmido p179 (figura 4b). 7

ES 2 273 434 T3

5

10

15

20

25

2.2 Para lograr una optimización de la expresión, se substituyeron los nucleótidos del exón 1, los cuales codifican el comienzo de la secuencia líder de EPO, Met-Gly-Val-His, por la secuencia sintética Met-Ser-Ala-His (ver también ejemplo 6). Esta secuencia se obtuvo por amplificación de una secuencia genómica EPO-ADN, por ejemplo del plásmido pEPO148, el cual contiene un fragmento BstEII/EcoRI de 3,5 kB (inclusive el exón 1-5) de la secuencia del gen EPO humano bajo el control del promotor SV40 (Jacobs et al., Nature 313 (1985), 806 y Lee-Huang et al., Gene 128 (1993), 227) como matriz con los cebadores Ex4 (SEQ ID NO. 9) y Ex17 (SEQ ID NO. 17) (tabla 1). Con ello, se obtuvo el plásmido p187 (figura 4b). 2.3 El plásmido p189 se obtuvo a partir del plásmido p187 mediante la inserción del virus del Herpes Simplex, gen de la timidinaquinasa (HSV-TK), el cual procedía de Psvtk-1 (fragmento PvuII/NarI) (figura 4c). El gen de HSV-TK se encuentra bajo control del promotor SV40 en el extremo 3’ del intrón 1 (Eco RV/CLAI) en orientación opuesta con respecto al promotor CMV y debía servir para la selección negativa en una recombinación homóloga. 2.4 Para la construcción del plásmido p190 se subclonó un fragmento SfiI/BglII de pHEAVY, un plásmido que contiene el ADNc de un mutante de arginina de DHFR descrito por Simonsen et al. (Proc. Natl. Sci. USA 80 (1983), 2495), en el plásmido pGenak-1 cortado con SfiI y BglII, el cual contiene el gen NEO bajo el control del promotor RSV y el lugar de poliadenilación de SV40 tardío como terminador, el gen DHFR de ratón bajo control del SV40 temprano y el lugar de poliadenilación temprana de SV40 como terminador (Kaufmann et al., Mol. Cell. Biol. 2 (1982), 1304; Okayama et al., Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 280 y Schimke, J. Biol.. Chem. 263 (1988).5989) y el promotor de CMV (Boshart et al., Cell 41 (1995), 521). A continuación, se ligó un fragmento HpaI, el cual contenía el ADNc que codifica el mutante de DHFR-arginina, en el plásmido p189 cortado con HpaI, con lo que se obtuvo el plásmido p190 (figura 4d). 2.5 Para obtener un vector de transfección sin el gen HSV-TK, se ligó un fragmento AscI/NheI del plásmido p190, el cual contenía la secuencia de activación del gen, en un fragmento AscI/NheI del plásmido p187 que contenía el exón 1. El plásmido resultante recibió el nombre de p192 (figura 4e). Ejemplo 3

30

Transfección de células Se seleccionaron diferentes líneas celulares en base a la producción de EPO y se transfectaron con vectores diana. 3.1 Células Namalwa

35

40

45

Las células se hicieron crecer en frascos de cultivo de tejidos T150, y se transfectaron mediante electroporación (1 x 107 células/800 µl de tampón de electroporación 20 mM de Hepes, 138 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 0,7 mM de Na2 HPO4 , 6 mM de D-glucosa-monohidrato pH 7,0, 10 µg de ADN linealizado, 960 µF, 260 V BioRad Gene Pulser). Después de la electroporación, se hicieron crecer las células en RPMI 1640, 10% (v/v) de suero fetal bovino (FCS), 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio en cuarenta placas de 96 pocillos. Después de dos días, las células se cultivaron durante 10 a 20 días en un medio conteniendo 1 mg/ml de G-418. El sobrenadante se ensayó mediante un análisis ELISA de fase sólida, para determinar la producción de EPO (ver ejemplo 4). Los clones productores de EPO se repartieron en placas de 24 pocillos y frascos T-25 de cultivo de tejidos. Se congelaron alícuotas y las células se subclonaron mediante FACS (Ventage, Beckton Dickinson). Los subclones fueron analizados repetidamente para detectar la producción de EPO. 3.2 Células HT 1080

50

55

60

Las condiciones fueron como las descritas para las células Namalwa, a excepción de que las células HT1080 fueron cultivadas en DMEM, 10% (v/v) de FCS, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio. Para la transfección mediante electroporación se disolvieron las células por tripsinación de las paredes de los recipientes de cultivo. Después de la electroporación se cultivaron 1 x 107 células en DMEM, 10% (v/v) de FCS, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio en 5 placas de 96 pocillos. 3.3 Células HeLa S3 Las condiciones fueron como las descritas para las células Namalwa, a excepción de que las células HeLa fueron cultivadas en RPM 1640, 10% (v/v) de FCS, 2 mM de L-glutamina, 1% (v/v) de MEM aminoácidos no esenciales (Sigma), 1 mM de piruvato de sodio. Para la transfección mediante electroporación se disolvieron las células mediante tripsinación de las paredes de los recipientes de cultivo. Las condiciones para la electroporación fueron 960 µF/250 V. Después de la electroporación las células fueron cultivadas en RPMI 1640, 10% (v/v) de FCS, 2 mM de L-glutamina, 1% (v/v) de MEM, 1 mM de piruvato de sodio en frascos T75 de cultivo de tejidos. 24 horas después de la electroporación se tripsinizaron las células y durante 10 a 15 días se cultivaron en un medio conteniendo 600 µg/ml de G-418, en 10 placas de 96 pocillos.

65

8

ES 2 273 434 T3 Ejemplo 4 Selección de los clones productores de EPO 5

10

15

El sobrenadante del cultivo de células transfectadas se ensayó mediante un análisis ELISA de EPO. Todos los pasos se realizaron a temperatura ambiente. Placas de 96 pocillos revestidas previamente con estreptavidina se recubrieron con anticuerpos anti-EPO biotinados (Boehringer Mannheim). Para el recubrimiento se lavaron primeramente las placas con 50 mM de fosfato de sodio pH 7,2, 0,05% (v/v) de Tween 20. A continuación se añadieron por pocillo 0,01 ml de tampón de recubrimiento (4 µg/ml de anticuerpo biotinado, 10 mM de fosfato de sodio pH 7,2, 3 g/litro de albúmina de suero bovino, 20 g/litro de sacarosa, 9 g/litro de NaCl), y se incubó 3 horas a temperatura ambiente. A continuación se lavaron las placas con 50 mM de fosfato de sodio pH 7,2, se secaron y se soldaron. Antes del ensayo se lavaron las placas tres veces con 0,3 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), 0,05% de Tween 20 (Sigma), se incubaron durante la noche con 0,2 ml de PBS, 1% (w/v) de croteína (Boehringer Mannheim) por pocillo, para bloquear las uniones no específicas.

20

Después de eliminar la solución de bloqueo se añadieron 0,1 ml del sobrenadante del cultivo, y las placas se incubaron durante la noche. Los pocillos individuales se lavaron tres veces con 0,3 ml de PBS, 0,05% de Tween 20 cada vez. A continuación se añadieron 100 µl de anticuerpo monoclonal conjugado con peroxidasa (POD) (Boehringer Mannheim, 150 mU/ml) durante dos horas. Los pocillos se lavaron a continuación de nuevo tres veces con 0,3 ml de PBS, 0,05% de Tween 20 cada vez. A continuación se efectuó la reacción de la peroxidasa empleando el ABTS® como substrato en un fotómetro Perkin Elmer a 405 nm. Se empleó una curva estándar, empleando EPO recombinante de células CHO (Boehringer Mannheim, 100-1000 pg/pocillo) para el cálculo de las concentraciones de EPO.

25

Ejemplo 5 Amplificación del gen EPO

30

Para aumentar la expresión de EPO se cultivaron los clones productores de EPO en presencia de concentraciones crecientes (100 pm - 1000 nM) de metotrexato (MTX). En cada concentración de MTX se ensayaron los clones mediante un análisis ELI-SA (ver ejemplo 4) para detectar la producción de EPO. Los fuertemente productores se subclonaron mediante dilución limitada. Ejemplo 6

35

Mutaciones de las secuencias señal

40

45

50

Para optimizar la secuencia líder de la molécula de EPO, se intercambiaron los primeros aminoácidos codificados por el exón 1. Se utilizaron cebadores con diferentes secuencias (SEQ ID NO. 4-17: el cebador 3’- contenía un lugar CelII para la selección de secuencias modificadas), para obtener un fragmento AscI/XbaI como matriz, mediante PCR con el empleo del plásmido pEPO227, el cual contiene un fragmento HindIII/ EcoRI (inclusive el exón 1-5) de la secuencia del gen ECO humana bajo el control del promotor SV40 (Jacobs et al., Nature 313 (1985), 806; Lee-Huang et al., Gene 128 (1993), 227). Los fragmentos resultantes se clonaron a continuación en el plásmido pEPO148 (ejemplo 2.2), con lo cual se obtuvieron los plásmidos pEPO 182, 183, 184 y 185 (figura 5). La expresión del gen EPO fue impulsada por un promotor SV40. Las células COS-7 fueron transitoriamente transfectadas con la construcción (DEAE método del dextrano), y se analizaron las células 48 horas después de la transfección para detectar la producción de EPO. La secuencia líder mutada obtenida de esta manera Met-Ser-Ala-His con la mejor expresión de EPO, se empleó para la construcción del vector diana del gen (ver ejemplo 2.2) Ejemplo 7 Caracterización de las líneas celulares productoras de EPO

55

Se seleccionaron tres líneas celulares diferentes (Namalwa, HeLa S3 y HT 1080) para la activación del gen EPO. Se obtuvieron clones productores de EPO mediante transfección con los plásmidos p179, p187, p189, p190 ó p192 (ver ejemplos 2 y 3). 60

65

Se analizaron aproximadamente 160.000 clones resistentes a NEO para detectar la producción de EPO, de los cuales 12-15 secretaron EPO con una significativa producción reproduciblemente en el sobrenadante de la célula. De los mismos pudieron identificarse sorprendentemente sin amplificación génica mediante MXT un total de 7 clones de EPO, los cuales generaron EPO en cantidad suficiente para una producción a escala técnica. La producción de EPO de estos clones fue del orden de 200 ng/ml hasta más de 1000 ng/ml/106 células/24 horas. Un ejemplo de una de estas células es el clon “Aladino” (DSM ACC 2320) depositado en el DSMZ, el cual fue obtenido a partir de una célula Namalwa. 9

ES 2 273 434 T3 Después de la amplificación génica con 500 nM de MTX pudo aumentarse la producción de EPO de los clones EPO identificados por encima de 3000 ng/ml/106 células/24 horas. Otro aumento de la concentración de MTX a 1000 nM condujo a una producción de más de 7000 ng/ml/106 células/24 horas. 5

Los clones obtenidos mostraron una producción de EPO también por debajo de las condiciones de cultivo libre de suero. Ejemplo 8

10

Caracterización del genoma de clones productores de EPO 8.1 Metódica

15

20

Se aisló el ADN genómico humano de aproximadamente 108 células y se cuantificó (Sambrook et al., 1989). Después de la escisión del ADN genómico mediante enzimas de restricción, p. ej., AgeI y AscI ó respectivamente BamHI, Hind III y SalI, se separaron los fragmentos de ADN mediante electroforesis con gel de agarosa de acuerdo con sus tamaños, y finalmente se transfirieron e inmovilizaron sobre una membrana de nylon. El ADN inmovilizado se hibridó con una sonda de EPO marcado con digoxigenina ó una sonda de ADN específica para la secuencia de activación génica (DIG ADN Labeling Kit, Boehringer Mannheim) y se lavó en condiciones restrictivas. Las señales específicas de hibridación fueron detectadas con ayuda de un procedimiento de quimioluminiscencia con el empleo de películas sensibles a las radiaciones. 8.2 Resultados

25

El tratamiento de las células con 500 nM de MTX condujo a un reforzamiento de la señal de hibridación en el lugar EPO, por un factor 5 a 10. Con otro aumento de 1000 nM de MTX se obtuvo un reforzamiento por un factor > 10 (figura 6a). 30

En el caso de la hibridación con la sonda específica de EPO, se detectaron también mediante recombinación homóloga copias no encontradas del cromosoma 7. Como se puede ver en la figura 6b, estos fragmentos de ADN igualmente hibridantes tienen otro tamaño claramente diferenciable, y no cambian la intensidad de su señal mediante el empleo de MTX.

35

Ejemplo 9 Purificación de la EPO a partir de sobrenadantes de cultivos de líneas celulares humanas (Hela S3; Namalwa y HT1080)

40

Esencialmente, se utilizaron para la purificación de EPO a partir de sobrenadantes de cultivos celulares de líneas celulares humanas, dos métodos, los cuales difieren en número y principio de los pasos de cromatografía y se emplearon en función de la composición del medio y de la concentración de EPO. Método 1:

1er paso:

Columna de azul-sefarosa

2º paso:

Columna de butil-sefarosa

3er paso:

Columna de hidroxiapatita

4º paso:

Concentración

1er paso:

Columna de azul-sefarosa

2º paso:

Columna de hidroxiapatita

3er paso:

concentración

45

50

Método 2:

55

(alternativa al 3er paso: RP-HPLC) 60

Ejemplo para la purificación del sobrenadante de un cultivo celular de HeLa S3 con 2% (v/v) de suero bovino fetal (FKS) según el método 1: 1. Columna de azul-sefarosa

65

Una columna Hi-Trap-Blue de 5 ml (columna preparada azul-sefarosa, de la Firma Pharmacia) se equilibró con por lo menos 5 volúmenes de columna (SV) de tampón A (20 mM de Tris-HCl, pH 7,0; 5 mM de CaCl2 ; 100 mM de NaCl). A continuación se fijaron 70 ml de sobrenadante de células Hela (conteniendo aproximadamente 245 µg de EPO y 70-100 mg de proteína total) durante la noche en un fluido de 0,5 ml/minuto en un proceso de circuito cerrado. 10

ES 2 273 434 T3 La columna se lavó con por lo menos 5 SV de tampón B (20 mM de Tris-HCl, pH 7,0; 5 mM de CaCl2 , 250 mM de NaCl) y por lo menos 5 SV de tampón C (20 mM de Tris-HCl, pH 7,0; 0,2 mM de CaCl2 , 250 mM de NaCl) a 0,5 ml/minuto. Al resultado del lavado le siguió la medición del contenido de proteína a OD280. 5

10

La elución de la EPO se efectuó con tampón D (100 mM de Tris-HCl, pH 7,0; 0,2 mM de CaCl2 ; 2 M de NaCl) con un flujo de 0,5 ml/minuto. La solución de elución se obtuvo en 1-2 fracciones. El contenido en EPO de las fracciones, de las soluciones de lavado y del caudal, se determinó mediante HPLC de fase invertida (RP) mediante la aplicación de un alícuota sobre una columna POROS R2/H (Boehringer Mannheim). Alternativamente la identificación cualitativa de las fracciones conteniendo EPO se efectuó mediante un “dotblot” inmunológico. Las fracciones conteniendo EPO (8-12 ml) se reunieron en una sola y se aplicaron a una columna de butil-sefarosa.

15

El rendimiento de la columna azul-sefarosa fue de aproximadamente 175 µg de EPO (corresponde aproximadamente al 70%). En general el rendimiento de la columna azul-sefarosa fue entre el 50 y 75%. 2. Columna de butil-sefarosa (cromatografía de interacción hidrófoba

20

Una columna de butil-sefarosa de 2-3 ml autoobtenida (material: Toyopearl Butyl S650) se equilibró con por lo menos 5 SV de tampón D (100 mM de Tris HCl, pH 7,0); 0,2 mM de CaCl2 ; 2 M de NaCl) y a continuación se fijó el conjunto de fracciones reunidas de azul-sefarosa conteniendo la EPO, a partir de 1. (aproximadamente 150 µg de EPO) con un flujo de 0,5 ml/minuto.

25

La columna se lavó con por lo menos 5 SV de tampón E (20 mM de Tris-HCl de pH 7,0; 2 M de NaCl y 10% de isopropanol) a 0,5 ml/minuto. El resultado del lavado fue seguido por la medición del contenido en proteína a OD280. La elución de la EPO se efectuó con tampón F (20 mM de Tris-HCl, pH 7,0; 2 M de NaCl y 20% de isopropanol) con un flujo de corriente de 0,5 ml/minuto. La solución de elución se obtuvo en 1-2 fracciones.

30

El contenido en EPO de las fracciones, de las soluciones de lavado y del caudal, se determinó mediante HPLC de fase invertida (RP) mediante la aplicación de un alícuota sobre una columna POROS R2/H. Alternativamente la identificación cualitativa de las fracciones conteniendo EPO se efectuó mediante un “dotblot” inmunológico. 35

40

Las fracciones conteniendo EPO (10-15 ml) se reunieron en una sola y se aplicaron a una columna de hidroxiapatita. El rendimiento de la columna de butil-sefarosa fue de aproximadamente 130 µg de EPO (corresponde aproximadamente al 85%). En general el rendimiento de la columna de butil-sefarosa fue entre el 60 y 85% de la cantidad aplicada del conjunto de azul-sefarosa. 3. Columna de hidroxiapatita

45

50

Una columna de hidroxiapatita de 5 ml (columna preparada Econo-Pac CHT II, de la Firma BioRAD) se equilibró con por lo menos 5 SV de tampón F (20 mM de Tris HCl, pH 7,0); 2 M de NaCl; 20% de isopropanol) y a continuación se fijó el conjunto de las fracciones reunidas de butil-sefarosa conteniendo la EPO, a partir de 2. (aproximadamente 125 µg de EPO) con un flujo de 0,5 ml/minuto. La columna se lavó con por lo menos 5 SV de tampón G (20 mM de Tris-HCl de pH 7,0; 2 M de NaCl) a 0,5 ml/minuto. El resultado del lavado fue seguido por la medición del contenido en proteína a OD280. La elución de la EPO se efectuó con tampón H (10 mM de fosfato de Na, pH 7,0; 80 nM de NaCl) con un flujo de 0,5 ml/minuto. La solución de elución se obtuvo en 1-2 fracciones.

55

60

El contenido en EPO de las fracciones, de las soluciones de lavado y del caudal, se determinó mediante RP-HPLC mediante la aplicación de un alícuota sobre una columna POROS R2/H. Las fracciones conteniendo la EPO (3-6 ml) se reunieron en una sola. El rendimiento de la columna de hidroxiapatita fue de aproximadamente 80 µg de EPO (corresponde aproximadamente al 60%). En general el rendimiento de la columna de hidroxiapatita fue entre el 50 y 65% de la cantidad aplicada del conjunto de butil-sefarosa. 4. Concentración

65

Las fracciones de EPO reunidas a partir del paso de hidroxiapatita, se concentraron en unidades de centrifugación con un tamaño exclusivo de 10 kD (p. ej., Microsep de la Firma Filtron) a una concentración de 0,1-0,5 mg/ml, se mezclaron con 0,01% de Tween 20 y se almacenaron en alícuotas a -20ºC.

11

ES 2 273 434 T3 Esquema de rendimientos

5

10

EPO (µg)

Rendimiento (%)

Comienzo

245

100

Azul-sefarosa

175

70

Columna de butil-sefarosa

130

53

Columna de hidroxiapatita

80

33

Concentración

60

25

15

La pureza de la EPO aislada fue aproximadamente > 90%, por regla general, incluso > 95%. 20

25

Para aumentar el rendimiento en EPO se empleó también el método 2 en el cual falta el paso de butil-sefarosa. Ante todo en el sobrenadante del cultivo de células sin o con adición de 1% (v/v) de FKS, este método es utilizable y proporciona EPO aislada con aproximadamente la misma pureza (90-95%). La presencia de 5 mM de CaCl2 , en el tampón de equilibramiento (tampón F) para la columna de hidroxiapatita, condujo con este método a una mejor unión y con ello también a un mejor comportamiento de elución de la EPO en el paso de hidroxiapatita. Por esta razón el método 2 se efectuó en principio con el mismo transcurso que el método 1 con los siguientes tampones: 1. Columna con azul-sefarosa

30

Tampón de equilibrio (tampón A):

20 mM Tris-HCl, pH 7,0; 5 mM CaCl2 ; 100 mM NaCl

35

Tampón de lavado 1 (tampón B):

20 mM Tris-HCl, pH 7,0; 5 mM CaCl2 ; 250 mM NaCl

40

Tampón de lavado 2 (tampón C):

20 mM Tris-HCl, pH 7,0; 5 mM CaCl2 ; 250 mM NaCl

45

Tampón de elución (tampón D):

100 mM Tris-HCl, pH 7,0; 5 mM CaCl2 ; 2 M NaCl

50

2. Columna de hidroxiapatita

55

Tampón de equilibrio (tampón F):

50 mM Tris-HCl, pH 7,0; 5 mM CaCl2 ; 1 M NaCl

Tampón de lavado (tampón G):

10 mM Tris-HCl, pH 7,0;

60

5 mM CaCl2 ; 80 mM NaCl Tampón de elución (tampón H):

10 mM fosfato Na, pH 7,0;

65

0,5 mM CaCl2 ; 80 mM NaCl

12

ES 2 273 434 T3 Esquema de rendimiento

5

10

15

EPO (µg)

Rendimiento (%)

Comienzo

600

100

Azul-sefarosa

450

75

Columna de hidroxiapatita

335

55

Concentración

310

52

La adición de 5 mM de CaCl2 al tampón del B al G, en el método 1 condujo igualmente a una mejor unión y una elución más definida de la columna de hidroxiapatita. Ejemplo 10

20

25

30

35

Determinación de la actividad específica in vivo de la EPO de líneas celulares humanas (bioensayo en el ratón normocitímico) Se determinó la actividad de EPO en función de la dosismediante la propagación y diferenciación de células precursoras de eritrocitos in vivo en ratones, mediante el aumento de reticulocitos en la sangre después de una dosis de EPO. Para ello se administró parenteralmente a cada ocho ratones, diferentes dosis de la muestra de EPO a analizar, y un estándar de EPO (ajustado frente al estándar WHO de EPO). Los ratones se mantuvieron a continuación en condiciones definidas constantes. 4 días después de la administración de ECO se extrajo sangre de los ratones y se tiñeron los reticulocitos con naranja de acridina. La determinación del número de reticulocitos por 30000 eritrocitos se efectuó microfluorimétricamente en el citrómetro de flujo mediante análisis del histograma de fluorescencia roja. El cálculo de la actividad biológica se efectuó a partir de los valores del número de reticulocitos de la muestra y del estándar, a las diferentes dosis según el procedimiento descrito por Linder de determinación del contenido por pares con rectas paralelas (A. Linder, “Planen und Auswerten von Versuchen” (“Planes y evaluación de ensayos”), 3ª edición, 1969, editorial Birkenhäuser, Basilea. Resultado

40

45

EPO de la línea celular

Actividad específica U/mg

HeLa S3 (muestra 1)

100.000

HeLa S3 (muestra 2)

110.000

50

55

60

65

13

ES 2 273 434 T3 REIVINDICACIONES 1. Célula humana, 5

10

caracterizada porque, contiene una copia de un gen EPO endógeno en unión operativa con un promotor heterólogo activo en la célula humana, y la cual es capaz de producir por lo menos 200 ng de EPO/106 células/24 horas, en donde la distancia entre el promotor heterólogo y el comienzo de la traducción del gen EPO no es mayor de 1100 bp, la cual puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende los pasos: (a) Preparación de células humanas de partida, las cuales por lo menos contienen una copia de un gen EPO endógeno con la condición de que las células humanas de partida no sean células pregerminativas,

15

(b) Transfección de las células con una construcción de ADN, la cual comprende: (i) dos secuencias flanqueantes de ADN, las cuales son homólogas a la región del lugar del gen EPO humano, para permitir una recombinación homóloga,

20

(ii) un gen marcador de selección positiva, y (iii) una secuencia heteróloga de control de la expresión, la cual es activa en la célula humana, en donde la secuencia heteróloga de control de la expresión comprende un promotor vírico potente y la distancia entre el promotor heterólogo y el comienzo de la traducción del gen EPO no es mayor de 1100 bp,

25

(c) Cultivo de las células transfectadas en condiciones en las que tiene lugar una selección para detectar la existencia del gen marcador de selección positiva, (d) análisis de las células seleccionadas según el paso (c), y 30

(e) identificación de las células productoras de EPO. 2. Célula humana según la reivindicación 1, caracterizada porque, 35

es capaz de la producción de 200 - 3000 ng de EPO/106 células/24 horas. 3. Célula humana según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque,

40

es la célula DSM ACC 2320. 4. Célula humana, que se obtiene mediante la amplificación génica de una célula según una de las reivindicaciones 1 a 3, 45

caracterizada porque,

50

contiene varias copias de gen EPO endógeno cada una de ellas en unión operativa con un promotor heterólogo activo en la célula humana, y es capaz de la producción de por lo menos 1000 ng de EPO/106 células/24 horas obtenibles mediante un procedimiento que comprende los pasos de: (f) amplificación del gen EPO, y

55

(g) obtención de las células productoras de EPO, las cuales contienen varias copias de un gen de EPO endógeno cada una de ellas en unión operativa con una secuencia heteróloga de control de la expresión. 5. Célula humana según la reivindicación 4, caracterizada porque,

60

es capaz de la producción de 1000 - 25000 ng de EPO/106 células/24 horas. 6. Célula humana según una de las reivindicaciones 1 a 5, 65

caracterizada porque, es una célula inmortalizada. 14

ES 2 273 434 T3 7. Célula humana según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque, 5

puede cultivarse en un medio libre de suero. 8. Célula humana según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque,

10

se selecciona entre una célula HT 1080, una célula HeLa S3, una célula Namalwa o un célula derivada de las mismas. 9. Célula humana según una de las reivindicaciones 1 a 8, 15

caracterizada porque, el gen EPO endógeno activado está bajo el control de un promotor CMV. 20

10. Célula humana según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque,

25

el gen EPO presenta una secuencia que codifica un péptido señal, la cual es distinta de la secuencia que codifica el péptido señal natural. 11. Célula humana según la reivindicación 10, caracterizada porque,

30

el gen EPO el cual está en unión operativa con la secuencia heteróloga de control de la expresión, presenta una secuencia codificadora del péptido señal, la cual codifica una secuencia del péptido señal modificada en la región de los 4 primeros aminoácidos, los cuales se seleccionan a partir de: 35

Met-X1 -X2 -X3 en donde X1 es Gly o Ser, X2 es Ala, Val, Leu, Ile, Ser ó Pro, X3 es Pro, Arg, Cys ó His, con la condición de que X1 X2 -X3 no sea la secuencia Gly-Val-His.

40

12. Célula humana según la reivindicación 11, caracterizada porque, los primeros 4 aminoácidos se seleccionan a partir de:

45

(a) Met-Gly-Ala-His, (b) Met-Ser-Ala-His, 50

(c) Met-Gly-Val-Pro ó (d) Met-Ser-Val-His. 13. Célula humana según la reivindicación 12,

55

caracterizada porque la secuencia de los primeros 4 aminoácidos del péptido señal es Met-Ser-Ala-His. 60

14. Procedimiento para la obtención de una célula humana productora de EPO según una de las reivindicaciones 1 a 13, el cual comprende los pasos: (a) Preparación de células de partida humanas, las cuales por lo menos contienen una copia de un gen EPO endógeno con la condición de que las células de partida humanas no sean células pregerminativas,

65

(b) Transfección de las células con una construcción de ADN, la cual comprende:

15

ES 2 273 434 T3 (i) dos secuencias flanqueantes de ADN, las cuales son homólogas a la región del lugar del gen EPO, para permitir una recombinación homóloga, (ii) un gen marcador de selección positiva, y 5

(iii) una secuencia heteróloga de control de la expresión, la cual es activa en la célula humana, en donde la secuencia heteróloga de control de la expresión comprende un promotor vírico potente y la distancia entre el promotor heterólogo y el comienzo de la traducción del gen EPO no es mayor de 1100 bp, 10

(c) Cultivo de las células transfectadas en condiciones en las que tiene lugar una selección para detectar la existencia del gen marcador de selección positiva, (d) análisis de las células seleccionadas según el paso (c), y

15

(e) identificación de las células productoras de EPO. 15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque,

20

las secuencias de ADN homólogas se seleccionan a partir de la región de las secuencias 5’ sin traducir, exón 1 e intrón 1 del gen EPO. 16. Procedimiento según la reivindicación 15, 25

caracterizado porque, se emplea una secuencia modificada en la región del exón 1. 30

17. Procedimiento según la reivindicación 15 ó 16, caracterizado porque, se emplea el gen de la neomicinfosfotransferasa como gen marcador de selección.

35

18. Procedimiento según una de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque, 40

comprende además de la construcción de ADN, un gen de amplificación. 19. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque,

45

se emplea un gen de dihidrofolatoreductasa como gen de amplificación. 20. Procedimiento según la reivindicación 19, 50

caracterizado porque, se emplea el gen de un mutante de dihidrofolatoreductasa arginina como gen de amplificación. 21. Procedimiento según una de las reivindicaciones 16 a 18, el cual comprende además los pasos:

55

(f) amplificación del gen EPO, y (g) obtención de las células productoras de EPO, las cuales contienen varias copias de un gen EPO endógeno cada una de ellas en unión operativa con una secuencia heteróloga de control de la expresión. 60

22. Procedimiento según una de las reivindicaciones 14 a 21, caracterizado porque, 65

se emplea un promotor/potenciador de CMV como secuencia control de la expresión. 23. Procedimiento según una de las reivindicaciones 14 a 22, 16

ES 2 273 434 T3 caracterizado porque, como construcción de ADN se emplea el plásmido p189 (DSM 11661) ó un plásmido derivado del mismo en forma linealizada. 5

24. Construcción de ADN para la activación de un gen EPO endógeno en una célula humana, la cual comprende:

10

(i) dos secuencias de ADN flanqueantes, las cuales se seleccionan homólogamente a la región del lugar del gen EPO humano, a partir de secuencias 5’ no traducidas, exón 1 e intrón 1, para permitir una recombinación homóloga, en donde en la región del exón 1, existe una secuencia modificada que codifica los aminoácidos: Met-X1 -X2 -X3

15

en donde X1 es Gly ó Ser, X2 es Ala, Val, Leu, Ile, Ser ó Pro, X3 es Pro, Arg, Cys ó His, con la condición de que X1 X2 -X3 no sea la secuencia Gly-Val-His, (ii) un gen marcador de selección positiva,

20

(iii) una secuencia heteróloga de control de la expresión, que es activa en una célula humana, en donde la secuencia heteróloga de control de la expresión comprende un potente promotor vírico y la distancia entre el promotor heterólogo y el comienzo de la traducción del gen EPO no es mayor de 1100 bp, y (iv) eventualmente un gen de amplificación.

25

25. Construcción de ADN según la reivindicación 24, caracterizada porque, los aminoácidos se seleccionan a partir de

30

(a) Met-Gly-Ala-His, (b) Met-Ser-Ala-His, 35

(c) Met-Gly-Val-Pro ó (d) Met-Ser-Val-His.

40

26. Empleo de una construcción de ADN para la activación de un gen EPO endógeno en una célula humana para la obtención de una célula según la reivindicación 1, con la condición de que la célula humana no sea ninguna célula pregerminativa, en donde la construcción comprende: (i) dos secuencias de ADN flanqueantes, las cuales se seleccionan homólogamente a la región del lugar del gen EPO humano, a partir de secuencias 5’ no traducidas, exón 1 e intrón 1, para permitir una recombinación homóloga,

45

(ii) un gen marcador de selección positiva,

50

(iii) una secuencia heteróloga de control de la expresión, que es activa en una célula humana, en donde la secuencia heteróloga de control de la expresión comprende un potente promotor vírico y la distancia entre la secuencia heteróloga de control de la expresión y el comienzo de la traducción del gen EPO no es mayor de 1100 bp, y (iv) eventualmente un gen de amplificación. 27. Plásmido p189 (DSM 11661) ó un plásmido derivado del mismo.

55

28. Procedimiento para la obtención de EPO humana, caracterizado porque, 60

una célula humana según una de las reivindicaciones 1 a 13, se cultiva en un medio apropiado, en unas condiciones en las cuales tiene lugar la producción de EPO y el EPO se obtiene a partir del medio de cultivo. 29. Procedimiento según la reivindicación 28,

65

caracterizado porque, se emplea un medio libre de suero. 17

ES 2 273 434 T3 30. Procedimiento según una de las reivindicaciones 28 ó 29, caracterizado porque, 5

las células se cultivan en suspensión. 31. Procedimiento según una de las reivindicaciones 28 a 30, caracterizado porque,

10

el cultivo tiene lugar en un fermentador. 32. Procedimiento según la reivindicación 31, 15

caracterizado porque, el volumen del fermentador es de 10 litros - 50000 litros. 33. Procedimiento según una de las reivindicaciones 28 a 32,

20

caracterizado porque, la obtención de EPO a partir del medio de cultivo comprende los pasos: 25

(a) conducción del sobrenadante de las células a un medio de cromatografía de afinidad, y obtención de las fracciones que contienen EPO, (b) eventualmente, conducción de las fracciones que contienen EPO sobre un medio de cromatografía de interacción hidrófobo, y obtención de las fracciones que contienen EPO,

30

(b) conducción de las fracciones que contienen EPO sobre hidroxiapatita, y obtención de las fracciones que contienen EPO, y (d) concentración o/y conducción sobre un medio de HPLC de fase invertida. 35

34. Procedimiento según la reivindicación 33, caracterizado porque, 40

en el paso (a) se emplea un medio de azul-sefarosa. 35. Procedimiento según una de las reivindicaciones 33 ó 34, caracterizado porque,

45

en el paso (b) se emplea un medio de butil-sefarosa. 36. Procedimiento según una de las reivindicaciones 33 a 35, 50

caracterizado porque, la concentración tiene lugar mediante cromatografía de exclusión. 37. Procedimiento según la reivindicación 36,

55

caracterizado porque, se emplea un medio con un tamaño de exclusión de 10 kD. 60

38. Procedimiento según una de las reivindicaciones 28 a 37, caracterizado porque, se obtiene una EPO humana con una pureza de por lo menos el 90%.

65

39. Procedimiento según una de las reivindicaciones 28 a 38, caracterizado porque, 18

ES 2 273 434 T3 se obtiene una EPO humana con una actividad específica in vivo (ratón normocitémico) de por lo menos 100000 IU/mg. 40. Procedimiento según la reivindicación 39, 5

caracterizado porque, se obtiene una EPO humana con una actividad específica in vivo (ratón normocitémico) de por lo menos 175.000 IU/mg a 450.000 IU/mg. 10

41. Procedimiento según una de las reivindicaciones 28 a 40, caracterizado porque, 15

se obtiene una EPO humana con un contenido menor del 0,2% de ácido N-glicolneuramínico referido al contenido de ácido N-acetilneuramínico. 42. Procedimiento según una de las reivindicaciones 28 a 41,

20

caracterizado porque, se obtiene una EPO humana con ésteres del ácido sialínico con uniones α-2,3-. 43. Procedimiento según una de las reivindicaciones 28 a 42,

25

caracterizado porque, se obtiene una EPO humana con ésteres del ácido sialínico con uniones α-2,3- y α-2,6-. 30

44. Procedimiento según una de las reivindicaciones 28 a 43, caracterizado porque, se obtiene una EPO humana que contiene un polipéptido con una longitud de 165 aminoácidos.

35

45. Procedimiento según una de las reivindicaciones 28 a 43, caracterizado porque, 40

se obtiene una EPO humana que contiene un polipéptido con una longitud de 166 aminoácidos. 46. Procedimiento según una de las reivindicaciones 28 a 43, caracterizado porque,

45

se obtiene una EPO humana que contiene una mezcla de polipéptidos con una longitud de 165 y 166 aminoácidos. 47. ADN aislado, que codifica una EPO humana la cual tiene una secuencia Met-Ser-Ala-His modificada en la región de los primeros 4 aminoácidos del péptido señal. 50

48. ADN según la reivindicación 47, caracterizado porque, 55

es un ADN genómico. 49. ADN según la reivindicación 47, caracterizado porque,

60

es un ADNc.

65

19

ES 2 273 434 T3

20

ES 2 273 434 T3

21

ES 2 273 434 T3

22

ES 2 273 434 T3

23

ES 2 273 434 T3

24

ES 2 273 434 T3

25

ES 2 273 434 T3

26

ES 2 273 434 T3

27

ES 2 273 434 T3

28

ES 2 273 434 T3

29

ES 2 273 434 T3

30

ES 2 273 434 T3 LISTA DE SECUENCIAS (1) DATOS GENERALES: 5

(i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Boehringer Mannheim GmbH (B) CALLE: Sandhofer Str. 112-132

10

(C) LOCALIDAD: Mannheim (E) PAÍS: Alemania (F) CÓDIGO POSTAL: 68305 (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Obtención de la eritropoyetina mediante activación de genes endógenos

15

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 17 (iv) MODALIDAD DE LECTURA DEL ORDENADOR: (A) SOPORTE DE DATOS: disco flexible 20

(B) ORDENADOR: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, versión #1.30 (EPA)

25

(2) DATOS DE LA SECUENCIA ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

30

(A) LONGITUD: 32 pares de bases (B) CLASE: Nucleótido (C) CADENA: monocatenaria (D) TOPOLOGÍA: lineal

35

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1: CGCGGCGGAT CCCAGGGAGC TGGGTTGACC GG

40

32

(2) DATOS DE LA SECUENCIA ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 38 pares de bases

45

(B) CLASE: Nucleótido (C) CADENA: monocatenaria (D) TOPOLOGÍA: lineal

50

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: GGCCGCGAAT TCTCCGCGCC TGGCCGGGGT CCCTCAGC

55

38

(2) DATOS DE LA SECUENCIA ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 36 pares de bases

60

(B) CLASE: Nucleótido (C) CADENA: monocatenaria (D) TOPOLOGÍA: lineal

65

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: CGCGGCGGAT CCTCTCCTCC CTCCCAAGCT GCAATC 1

36

ES 2 273 434 T3 (2) DATOS DE LA SECUENCIA ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5

(A) LONGITUD: 36 pares de bases (B) CLASE: Nucleótido (C) CADENA: monocatenaria (D) TOPOLOGÍA: lineal

10

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: CGCCGCGAAT TCTAGAACAG ATAGCCAGGC TGAGAG 15

36

(2) DATOS DE LA SECUENCIA ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases

20

(B) CLASE: Nucleótido (C) CADENA: monocatenaria (D) TOPOLOGÍA: lineal

25

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: TCACCCGGCG CGCCCCAGGT CGCT

30

24

(2) DATOS DE LA SECUENCIA ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 61 pares de bases

35

(B) CLASE: Nucleótido (C) CADENA: monocatenaria (D) TOPOLOGÍA: lineal

40

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: ATGCTCGAGC GGCCGCCAGT GTGATGGATA TCTGCAGAGC TCAGCTTGGC CGCGAATTCT A 61 (2) DATOS DE LA SECUENCIA ID NO: 7:

45

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 78 pares de bases (B) CLASE: Nucleótido 50

(C) CADENA: monocatenaria (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS:

55

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) POSICIÓN: 49...60 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

60

65

2

ES 2 273 434 T3 (2) DATOS DE LA SECUENCIA ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5

(A) LONGITUD: 4 aminoácidos (B) CLASE: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal

10

(ii) CLASE DE MOLÉCULA: Proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8: Met Gly Ala His 1

15

(2) DATOS DE LA SECUENCIA ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 20

(A) LONGITUD: 78 pares de bases (B) CLASE: Nucleótido (C) CADENA: monocatenaria

25

(E) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS

30

(B) POSICIÓN: 49...60 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

35

40

(2) DATOS DE LA SECUENCIA ID NO: 10: 45

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4 aminoácidos (B) CLASE: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal

50

(ii) CLASE DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: 55

Met Ser Ala His 1 (2) DATOS DE LA SECUENCIA ID NO: 11:

60

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 78 pares de bases (B) CLASE: Nucleótido

65

(C) CADENA: monocatenaria (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS: 3

ES 2 273 434 T3 (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) POSICIÓN: 49...60 5

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

10

15

(2) DATOS DE LA SECUENCIA ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 20

(A) LONGITUD: 4 aminoácidos (B) CLASE: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal

25

(ii) CLASE DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12: Met Gly Val Pro 1

30

(2) DATOS DE LA SECUENCIA ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 35

(A) LONGITUD: 78 pares de bases (B) CLASE: Nucleótido (C) CADENA: monocatenaria

40

(D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS

45

(B) POSICIÓN: 49...60 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

50

55

(2) DATOS DE LA SECUENCIA ID NO: 14: 60

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4 aminoácidos (B) CLASE: aminoácido

65

(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) CLASE DE MOLÉCULA: proteína 4

ES 2 273 434 T3 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14: Met Ser Val His 1 5

(2) DATOS DE LA SECUENCIA ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 10

(A) LONGITUD: 59 pares de bases (B) CLASE: Nucleótido (C) CADENA: monocatenaria

15

(D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15: GGACATTCTA GAACAGATAT CCAGGCTGAG CGTCAGGCGG GGAGGGAGAA GGGTGGCTG

20

59

(2) DATOS DE LA SECUENCIA ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 48 pares de bases

25

(B) CLASE: Nucleótido (C) CADENA: monocatenaria (D) TOPOLOGÍA: lineal

30

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16: CTGATGGATA TCTCTAGAAC AGATAGCCAG GCTGAGAGTC AGGCGGGG

35

48

(2) DATOS DE LA SECUENCIA ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 39 pares de bases

40

(B) CLASE: Nucleótido (C) CADENA: monocatenaria (D) TOPOLOGÍA: lineal

45

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17: ATGGATATCA TCGATTCTAG AACAGATAGC CAGGCTGAG

50

55

60

65

5

39