19

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 246 588

51 Int. Cl. : A61K 31/55, A61K 31/47

7

A61K 39/395, A61P 13/12 A61K 31/435, A61K 31/40 // (A61K 31/55, A61K 38:19 A61K 31:335, A61K 31:40) A61K 38:12

ESPAÑA

12

TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 99966268 .7

86 Fecha de presentación : 15.12.1999

87 Número de publicación de la solicitud: 1140106

87 Fecha de publicación de la solicitud: 10.10.2001

54 Título: Tratamiento de enfermedades que implican formación de quistes.

30 Prioridad: 18.12.1998 US 113008 P

26.05.1999 US 136208 P

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.02.2006

73 Titular/es: SCIOS Inc.

820 West Maude Avenue Sunnyvale, California 94086, US

72 Inventor/es: Schreiner, George, F.;

Joly, Alison y White, R., Tyler

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Arias Sanz, Juan

ES 2 246 588 T3

16.02.2006

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 246 588 T3 DESCRIPCIÓN Tratamiento de enfermedades que implican formación de quistes. 5

10

Campo de la invención La presente invención se refiere al tratamiento de enfermedades que implican la formación de quistes, tal como la enfermedad poliquística del riñón. La presente invención también se refiere a diversos ligandos endógenos y exógenos de receptores de benzodiazepina de tipo periférico, y en particular, su uso en la prevención o tratamiento de la formación de quistes. Antecedentes de la invención A. Enfermedades que implican la formación de quistes

15

20

25

30

35

40

45

50

Hay varias enfermedades humanas que dan lugar a la formación de quistes de material semisólido o líquido. Los quistes benignos pueden producirse, por ejemplo, en el ovario, bazo, pulmones, riñón e hígado, donde a menudo son hereditarios. Los quistes pueden adquirirse, como en la diverticulosis de los intestinos, o adquirirse como causa secundaria de una enfermedad hereditaria, como en la fibrosis quística, o heredarse directamente como en la enfermedad poliquística del riñón, que también puede afectar al hígado y al cerebro. Los quistes renales se originan en el parénquima renal y comienzan como dilataciones o evaginaciones de las nefronas o de los túbulos colectores existentes o de los equivalentes de estas estructuras en desarrollo. Los quistes renales contienen un líquido que presumiblemente deriva de su nefrona parental y/o es una secreción local. Pueden ser hereditarios, aparecer durante el desarrollo o adquirirse, y pueden producirse en la corteza, médula o ambas y pueden estar asociados o no con otras anomalías renales o sistémicas. Para más detalles véase, por ejemplo, Brenner y Rector, The Kidney, Cuarta Edición, 1991, vol. II, Pág. 1657-1659. La enfermedad poliquística del riñón (PKD) es un subgrupo de trastornos quísticos renales en la que los quistes se distribuyen por toda la corteza y médula de ambos riñones. La PKD es generalmente el distintivo de un único trastorno autosómico dominante (enfermedad poliquística autosómica dominante del riñón, ADPKD) o autosómico recesivo (enfermedad poliquística autosómica recesiva del riñón, ARPKD), pero también pueden encontrarse en asociación con una diversidad de estados clínicos o adquirirse en algún momento de la vida por un paciente con una enfermedad renal no quística subyacente. La PKD es el trastorno renal hereditario de mayor prevalencia, siendo responsable de más del 5 por ciento de pacientes en hemodiálisis crónica. La ADPKD, la enfermedad renal hereditaria dominante más común, generalmente aparece a mediana edad y se caracteriza morfológicamente por un agrandamiento quístico masivo, infiltración intersticial moderada con células mononucleares y fibrosis extensiva. Los síntomas característicos incluyen proteinuria, dolor abdominal y riñones palpables, seguido por hematuria, hipertensión, piuria, uremia y cálculos. En aproximadamente el 15% de los pacientes, la muerte se debe a un aneurisma cerebral. La ADPKD está causada por mutaciones en uno de tres genes: PKD1 en el cromosoma 16 es responsable de aproximadamente el 85% de los casos, mientras que PKD2 en el cromosoma 4 es responsable de aproximadamente el 15%. Las mutaciones en el gen PKD3, hasta ahora sin mapear, son raras. (Reeders y col., Nature 317:542-544 [1985]; Kimberiing y col., Genomics 18:467-472 [1993]; Daoust y col., Genomics 25:733736 [1995]; Koptides y col., Hum. Mol. Genet. 8:509-513 [1999]). La ARPKD es un trastorno hereditario raro que generalmente se manifiesta clínicamente en la infancia temprana, aunque también se ha observado en muchos casos la aparición de ARPKD a edades más tardías y supervivencia en la madurez. La ARPKD se estudió primero en ratones C57BL/6J en los que aparece espontáneamente (Preminger y col., J. Urol. 127:556-560 [1982]). La mutación cpk característica de esta enfermedad se ha mapeado en el cromosoma 12 del ratón (Davisson y col., Genomics 9:778-781 [1991]). El gen responsable de la ARPKD en humanos se ha mapeado en el cromosoma 6p. Más recientemente se ha publicado un mapeo más exhaustivo del locus de la enfermedad poliquística autosómica recesiva del riñón (PKDH1) (Mucher y col., Genomics 48:40-45 [1998]).

55

Se ha publicado que el taxol y los derivados del taxol inhiben la progresión de la PKD y prolonga la supervivencia de ratones cpk poliquísticos (Woo y col., Nature 368:750-753 [1994]; Publicación PCT WO 94/08041; Patente de EE. UU. Nº 5.882.881). Puesto que el taxol induce específicamente la expresión de TNF-α en macrófagos y linfocitos, se ha sugerido también que el TNF-α es útil en el tratamiento de PKD (Patente de EE. UU. Nº 5.750.495).

60

En la APKD, los quistes renales se mantienen pequeños durante 30-40 años. Entonces, comienzan a expandirse, reemplazando progresivamente el parénquima renal que funciona con normalidad. Los factores implicados en la expansión de los quistes incluyen pérdida de diferenciación epitelial, proliferación y apoptosis aumentadas, secreción de cloro y otros iones en el líquido quístico y el desarrollo de inflamación alrededor de la circunferencia externa de la pared del quiste (Grantham, J, Am. J. Kid. Dis. 28:788-803 [1996]).

65

Existe la necesidad de la identificación de factores endógenos y exógenos que sean útiles para la prevención y tratamiento de enfermedades que implican formación de quistes y expansión de quistes. En vista de la gravedad 2

ES 2 246 588 T3 y frecuencia de la presencia de PKD, hay una particular necesidad de encontrar agentes terapéuticos útiles en la prevención y tratamiento de esta enfermedad. B. Ligandos de receptores de benzodiazepina de tipo periférico (PTBR) 5

10

15

20

25

30

35

Los ligandos de los PTBR se conocen desde hace muchos años y los efectos antiansiedad en el SNC de los agonistas de PTBR (por ejemplo, el valium) son ampliamente conocidos. Con respecto a los receptores de benzodiazepina fuera del SNC (PTBR) la mayoría de lo que se conoce se refiere a la función de estos receptores como mediadores de la relajación muscular, en particular, la relajación del músculo esquelético. Se ha encontrado que el tono vagal disminuye tras la administración intravenosa de diazepam. (Adinoff y col., Psychiatry Research 41:89-97 [1992]). Hay evidencias del control del tono vagal cardiaco por receptores de benzodiazepina (DiMicco, Neuropharmacology 26:533-559 [1987]). Se ha descrito que los ligandos de PTBR Ro5-4864 y PK11195, pero no el diazepam, reducen la función cardiaca en un modelo de corazón de rata que funciona aislado (Edoute y col., Pharmacology 46:224-230 [1993]). También se ha informado de que Ro5-4864 aumenta el flujo coronario en un corazón de rata de Langendorf aislado y perfundido sin afectar a la frecuencia cardiaca ni a la contractibilidad ventricular izquierda. PK11195 no contrarresta este efecto vasodilatador (Grupp y col., Eur. J. Pharm. 143:143-147 [1987]). En una preparación de corazón de rata aislado, el diazepam inducía un efecto ionotrópico negativo transitorio seguido de una respuesta ionotrópica positiva. La ionotropía positiva era contrarrestada por PK11195 (Leeuwin y col., Eur. J. Pharm. 299:149-152 [1996]). El diazepam aumentaba la fuerza contráctil en el corazón de rata de Langendorf. (Leeuwin y col., Arch. Int. Pharmacodyn, 326:5-12 [1993]). Se ha demostrado que Ro5-4864 tiene un pequeño (20%) efecto depresivo en la amplitud de contracción (efecto ionotrópico positivo) de las bandas atriales humanas que no se contrarresta con PK11195 (Shany y col., Eur. J. Pharm. 253:231-236 [1994]). En una preparación de corazón de cobaya, Ro5-4864 disminuía la duración del potencial de acción intracelular y de la contractibilidad. El diazepam era menos eficaz y el clonazepam ineficaz. Los efectos de Ro5-4864 se invertían por PK11195, pero no por un antagonista específico de BZR del SNC (Mestre y col., Life Sciences 35:953-962 [1984]). Se demostró in vivo la presencia de sitios de unión de PTBR en corazones de perro y humanos mediante tomografía por emisión de positrones usando [11 C]-PK11195. (Charmonneau y col., Circulation 73:476-483 [1986]). Se ha informado también de que Ro5-4862 y dipiridamol pueden competir con la unión de [3 H]diazepam al tejido cardiaco. El diazepam potencia las acciones de adenosina sobre músculo cardiaco y esquelético aislado y la acción vasodilatadora coronaria de la adenosina en perros. Hay evidencias de que el diazepam puede actuar de una manera similar al dipiridamol inhibiendo la captación de adenosina. (Davies y Huston, Eur. J. Pharm. 73:209-211 [1981]). Más recientemente, se ha demostrado que los PTBR juegan un papel en las rutas celulares subyacentes a la apoptosis. Los PTBR expresados en mitocondrias sirven como receptores de anclaje para Bcl2 , una proteína que inhibe la apoptosis. Las rutas biológicas en la apoptosis moduladas por las interacciones de ligandos de PTBR no se conocen específicamente. Resumen de la invención

40

45

50

La presente invención se basa en el reconocimiento de que ligandos que interaccionan con los PTBR son útiles en el tratamiento de enfermedades asociadas con la formación de quistes, y en particular, retrasan o previenen la progresión de la enfermedad poliquística del riñón (PKD) a una insuficiencia renal, y/o retrasan o previenen la tendencia acompañante a la hipertensión. El objeto de la invención se define en las reivindicaciones. La invención es útil para el tratamiento de una enfermedad, que implica la formación de quistes, que comprende administrar a un paciente que tiene o está en riesgo de desarrollar esta enfermedad una cantidad eficaz de un ligando de un receptor de benzodiazepina de tipo periférico (PTBR). El paciente preferiblemente es un mamífero, más preferiblemente humano. En una realización particular, la enfermedad a tratar es la enfermedad poliquística del riñón (PKD). En una realización preferida, la administración de un ligando de PTBR previene o retrasa la progresión de la PKD. En otra realización preferida, la administración de un ligando de PTBR previene o retrasa el desarrollo de un síntoma de la PKD, tal como la hipertensión asociada con PKD, la hemorragia en el quiste o el dolor asociado con la expansión del quiste.

55

En un aspecto adicional, la invención puede usarse para el tratamiento de la insuficiencia renal progresiva asociada con la progresión de la enfermedad quística. 60

65

En otro aspecto, la invención es útil para el tratamiento de la hipertensión que acompaña a la enfermedad poliquística renal (PKD) que comprende administrar a un paciente una cantidad eficaz de un ligando de un receptor de benzodiazepina de tipo periférico (PTBR). Aún en otro aspecto, la invención se refiere a un a composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad que implica la formación de quistes o la expansión de quistes, que comprende una cantidad eficaz de un ligando de un receptor de benzodiazepina de tipo periférico (PTBR) en una mezcla con taxol o un derivado de taxol y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En todos los aspectos, la enfermedad a tratar es preferiblemente la enfermedad poliquística del riñón (PKD), que 3

ES 2 246 588 T3

5

10

15

20

25

incluye tanto la enfermedad poliquística autosómica dominante del riñón (ADPKD) como la enfermedad poliquística autosómica recesiva del riñón (ARPKD). El tratamiento específicamente incluye la prevención y retardo de la progresión de la enfermedad. Si el objetivo es prevenir o retrasar la progresión de la PKD, puede diagnosticarse a los pacientes susceptibles a la enfermedad identificando mutaciones en los genes PKD1, PKD2 o PKD3 que están asociados con la PKD. En todos los aspectos, el agonista de PTBR puede ser, por ejemplo, un ligando de PTBR de secuencia nativa o un fragmento o una subunidad funcional del mismo, una molécula o péptido orgánico pequeño, una variante polipeptídica de un ligando de secuencia nativa, un anticuerpo, un glicopéptido, un glicolípido, un polisacárido, un oligosacárido, un ácido nucleico, un peptidomimético, un agente farmacológico o un metabolito del mismo, una secuencia control de la transcripción o de la traducción y similares. De forma similar, el antagonista de PTBR puede ser un polipéptido, un péptido o una molécula orgánica pequeña, una variante polipeptídica de un ligando de secuencia nativa, un anticuerpo, un glicopéptido, un glicolípido, un polisacárido, un oligosacárido, un ácido nucleico, un peptidomimético, un agente farmacológico o un metabolito del mismo, una secuencia control de la transcripción o traducción y similares. Por ejemplo, los antagonistas de PTBR incluyen variantes polipeptídicas de un ligando de PTBR de secuencia nativa, variantes de un PTBR de secuencia nativa que retienen la capacidad para unir un ligando endógeno, pero que son deficientes en cuanto a su capacidad para mediar actividad biológica, anticuerpos anti-PTBR o anti-ligando de PTBR e inhibidores selectivos de la producción in vivo de un ligando de PTBR endógeno. Las moléculas orgánicas pequeñas se seleccionan entre las clases químicas de benzodiazepinas, isoquinolina carboxamidas, imidazopiridinas, 2-aril-3-indolacetamidas y pirolobenzoxazepinas. Un agonista particularmente preferido es Ro5-4864, mientras que un antagonista particularmente preferido es PK 11195. Los ligandos de PTBR pueden administrarse en combinación con un agente terapéutico adicional, preferiblemente con un agente conocido por ser útil para tratar la enfermedad blanco o una dolencia relacionada. Por ejemplo, los ligandos de PTBR de la presente invención pueden administrarse en combinación con uno o más agentes terapéuticos que inhiben el suministro de proteínas de membrana a la membrana de una célula del paciente tratado. Estos agentes incluyen, por ejemplo, taxol, citocalasina-B, citocalasina-D, faloidina y derivados de cualquiera de los anteriores, y TNF-α. Los ligandos de PTBR pueden también administrarse en combinación con inhibidores genéricos de la progresión de la insuficiencia renal, tales como terapéuticos antihipertensión, que incluyen inhibidores ECA.

30

La administración puede realizarse por diversas rutas conocidas en la técnica, que incluyen, sin limitación, la administración por vía intravenosa, intraperitoneal, intraarterial, subcutánea, oral o intramuscular. Breve descripción de las figuras 35

La figura 1 muestra los datos de alineamiento comparando el ADNc que codifica el gen del receptor de benzodiazepina de tipo periférico de rata expresado diferencialmente (P0268) con el correspondiente ADNc humano para PTBR (SEC ID Nº: 1 y 2). 40

La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos del PTBR humano (SEC ID Nº: 3). La figura 3 muestra los datos de alineamiento comparando el ADNc que codifica el gen del inhibidor de la unión de diazepam (DBI) de rata expresado diferencialmente con el correspondiente ADNc humano para DBI (SEC ID Nº: 4 y 5).

45

La figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos del DBI humano (SEC ID Nº: 6). La figura 5 muestra la estructura química de los ligandos de PTBR seleccionados, incluyendo el agonista de PTBR Ro5-4864 y el antagonista PK 11195. 50

La figura 6 es una ilustración gráfica del efecto del agonista de PTBR Ro5-4864 sobre la proliferación de células de ADPKD humanas. En la Figura, “A” representa Ro5-4864, y los números siguientes representan las concentraciones molares del agonista. De este modo, “-12” después de “A” significa que el agonista Ro5-4864 se usó a una concentración de 10−12 M. 55

Descripción detallada de la invención I. Definiciones 60

65

Siempre que no se defina otra cosa, los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado normalmente entendido por cualquier experto en la materia a la que pertenece esta invención. Singleton y col., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2ª Edición, J. Wiley e Hijos (Nueva York, NY 1994), y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4ª Edición, John Wiley e Hijos (Nueva York, NY 1992) proporcionan a cualquier experto en la materia una guía general de muchos de los términos usados en la presente solicitud. Un experto en la materia reconocerá muchos procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento, que podrían usarse en la práctica de la presente invención. De hecho, la presente invención no 4

ES 2 246 588 T3 está de ningún modo limitada por los procedimientos y materiales descritos. Para los fines de la presente invención, a continuación se definen los siguientes términos. 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Las expresiones “receptor de benzodiazepina de tipo periférico”, “PTBR” y “polipéptido de PTBR”, usados en singular o en plural, se usan indistintamente y abarcan cualquier polipéptido de PTBR de secuencia nativa. Estos polipéptidos de PTBR pueden aislarse de diversas fuentes, tales como diversos tipos de tejidos humanos o no humanos, o prepararse mediante procedimientos de recombinación y/o de síntesis. Todos estos polipéptidos están específicamente dentro del alcance de la definición, independientemente de su modo de preparación, e incluye variantes de los mismos. De este modo, las expresiones “receptor de benzodiazepina de tipo periférico”, “PTBR” y “polipéptido de PTBR”, usadas en singular o plural, se refieren a polipéptidos del receptor que se unen a moléculas de benzodiazepina, pero son distintos de los asociados con receptores de benzodiazepina de tipo central y que tienen la misma secuencia de aminoácidos que el respectivo polipéptido de origen natural. Estos polipéptidos PTBR pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse por medios de recombinación o sintéticos. El término “PTBR” abarca específicamente formas truncadas o secretadas naturales (por ejemplo, una secuencia del dominio extracelular), así como formas variantes naturales (por ejemplo, formas de ayuste alternativo) y variantes alélicas naturales. Los PTBR representan un subgrupo de la familia del receptor de benzodiazepina que se localiza fuera del sistema nervioso central. Kruger y col., en GABA and Benzodiazepine Receptor Subtypes, Biggio y Costa editores, pág. 1-14 (1990) publicaron la purificación, clonación y expresión de un receptor de benzodiazepina de tipo periférico. El ADNc de un polipéptido de PTBR de 18 kDa, identificado originalmente en tejido cardiaco, se ha clonado posteriormente a partir de diversas fuentes, tales como adrenal de rata (Sprengel y col., J. Biol. Chem. 264:20.415-20.421 [1989]); adrenal bovina (Parola y col., J. Biol. Chem. 266:14.082-14.087 [1991]); una línea celular de linfoma humano (Riond y col., Eur. J. Biochem. 195:305-311 [1991]); y una línea celular de tumor de Leydig de ratón (Garnier y col., Mol. Pharmac. 45:201-211 [1993]). Esta proteína de 169 aminoácidos tiene aproximadamente el 80% de homología entre especies. Diversas células transfectadas con estos ADNc exhiben características de unión para los ligandos de PTBR Ro5-4864 y PK 11195. Se ha sugerido que PTBR es un complejo multimérico en el que el sitio de unión de PK 11195 está en la subunidad de 18 kDa y la expresión del sitio de unión de benzodiazepina requiere otra subunidad, denominada VDAC. Se ha intentado también identificar otra proteína de 10 kDa, asociada con PTBR, como un componente más del complejo PTBR (Véase, por ejemplo, Zisterer y Williams, supra). Todos estos polipéptidos, solos o en cualquier combinación funcional, están específicamente dentro de la definición de “PTBR”. En una realización particular, el receptor de benzodiazepina de tipo periférico tiene la secuencia de aminoácidos del PTBR humano (SEC ID Nº: 3). Las expresiones “ligando”, “ligando de PTBR” y “ligando de un PTBR (de secuencia nativa)” se usan indistintamente y se usan en el sentido más amplio para incluir factores endógenos y exógenos que interaccionan con un PTBR, incluyendo ligandos de PTBR de secuencia nativa y sus variantes, así como ligandos de polipéptidos sintéticos o moléculas pequeñas. La “interacción” se define como la capacidad para afectar a la función de un PTBR puede, pero no necesariamente, implicar la unión específica del PTBR de secuencia nativa. El término “ligando de PTBR” incluye antagonistas y agonistas, como se define a continuación. Las expresiones “ligando de secuencia nativa”, “ligando de PTBR de secuencia nativa”, “ligando de secuencia nativa de un PTBR” y equivalentes gramaticales de ellos, se usan indistintamente, y se refieren a ligandos endógenos de un PTBR, conocidos o descubiertos en lo sucesivo. Estos polipéptidos de secuencia nativa se pueden aislar de la naturaleza o se pueden producir por medios recombinantes y/o sintéticos. La expresión “secuencia nativa” conjuntamente con la designación de un polipéptido particular abarca específicamente las formas truncadas o secretadas naturales (por ejemplo, una secuencia del dominio extracelular), así como formas variantes naturales (por ejemplo, formas de ayuste alternativo) y variantes alélicas naturales del polipéptido mencionado. El término “antagonista” se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que bloquea parcial o totalmente, inhibe o neutraliza una actividad biológica mediada por un PTBR de secuencia nativa mediante la prevención de la unión de un agonista al PTBR de secuencia nativa, bloqueando, de ese modo, la actividad biológica del agonista mediada por el PTBR. De manera similar, el término “agonista” se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que mimetiza una actividad biológica mediada por un PTBR, y cambia específicamente la función o expresión de un PTBR, o la eficacia de señalización a través de un PTBR, alterando, de ese modo, (aumentando o inhibiendo) una actividad biológica ya existente o desencadenando una nueva actividad biológica. Las expresiones “variante” y “variante de la secuencia de aminoácidos” se usan indistintamente y designan polipéptidos a los que se añaden y/o sustituyen y/o seleccionan y/o insertan uno o más aminoácidos en el extremo Nterminal o C-terminal o en cualquier lugar dentro de la secuencia nativa correspondiente y que retiene al menos una actividad (como se define a continuación) del correspondiente polipéptido nativo. En diversas realizaciones, un polipéptido “variante” normalmente tiene al menos aproximadamente el 75% de identidad de secuencia de aminoácidos, o al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, preferiblemente al menos el 85% de identidad de secuencia de aminoácidos, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia de aminoácidos, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos del correspondiente polipéptido de secuencia nativa. La “identidad de secuencia”, se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en una secuencia polipeptídica nativa, después de alinear las secuencias e introducir los huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. 5

ES 2 246 588 T3

5

10

15

20

La homología local en el algoritmo de Smith y Waterman (Smith y col., Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)) puede conducir al alineamiento óptimo de secuencias para su comparación, por ejemplo, por la homología de alineamiento por medio del algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman y col., J. Mol. Biol. 48:443 (1970)), por la búsqueda de similitudes por el procedimiento de Pearson y Lipman (Pearson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)), por la puesta en práctica informatizada de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante inspección. En una realización preferida, se puede usar la homología de alineamiento mediante algoritmos empleados en el programa BLAST (Altschul y col., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). La familia de programas BLAST permite todas las combinaciones de secuencias de consulta de ADN o de proteínas con búsquedas en bases de datos de ADN o de proteínas. En el contexto de la presente invención, los programas BLAST específicos que se pueden utilizar incluyen: blastp, que compara una secuencia de aminoácidos de consulta con una base de datos de secuencias de proteínas; blasn, que compara una secuencia de nucleótidos de consulta con una base de datos de secuencias de nucleótidos; blastx, que compara los seis posibles productos de traducción en fase de una secuencia de nucleótidos de consulta (ambas cadenas) con una base de datos de secuencias de proteínas; tblastn, que compara una secuencia proteica de consulta con una base de datos de secuencias nucleotídicas traducidas dinámicamente en las seis fases de lectura abierta (ambas cadenas); y tblastx, que compara las seis traducciones en fase de una secuencia de nucleótidos de consulta con las seis traducciones en fase de una base de datos de secuencias de nucleótidos. Para el programa blastn se utilizan los siguientes parámetros y valores por defecto: -G: valor de penalización por abrir un hueco, por defecto = 5; -E: valor de penalización por extender un hueco, por defecto = 2; -q: penalización por falta de coincidencia en la porción blast de desarrollo, por defecto = -3; r: recompensa por una coincidencia en la porción de blast de desarrollo, por defecto = 1; -e: valor esperado (E), por defecto= 10,0; -W: tamaño de palabra, por defecto es 11 para blastn y 3 para otros programas, -v: número de descripciones de una línea (V), por defecto = 100 y -b: número de alineamientos a mostrar (B), por defecto = 100.

25

Más preferiblemente, los valores de % de identidad de secuencia se generan con el programa NCBI BLAST2.0 como se define en Altschul y col., (1997), “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs”, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402. Los parámetros se ajustan a valores por defecto, con la excepción de la penalización por falta de coincidencia 7, que se ajusta a -1. 30

35

40

“Activa” o “actividad” significa una propiedad biológica y/o inmunológica cualitativa. En el contexto de la presente invención, una actividad biológica preferida de un antagonista de PTBR es la capacidad para prevenir, retrasar la progresión o eliminar la formación del quiste o la expansión del quiste, o tratar una enfermedad que depende o está mediada por la formación de quistes. Incluso más preferiblemente, un antagonista PTBR es biológicamente activo, si éste es eficaz en el tratamiento de la enfermedad poliquística del riñón (PKD). La expresión “propiedad inmunológica” significa la reactividad cruzada inmunológica con al menos un epítope de la molécula polipeptídica de referencia (secuencia nativa), en la que “reactividad cruzada inmunológica” significa que el polipéptido candidato es capaz de inhibir de forma competitiva la actividad biológica cualitativa del polipéptido de referencia (secuencia nativa). La reactividad cruzada inmunológica es preferiblemente “específica”, lo que significa que la afinidad de unión de la molécula con reactividad cruzada inmunológica identificada con el polipéptido correspondiente es significativamente mayor (preferiblemente al menos aproximadamente 2 veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 4 veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 6 veces mayor) que la afinidad de unión de esta molécula a cualquier otro polipéptido nativo conocido.

45

50

55

60

65

Las expresiones “enfermedad poliquística del riñón”, “PKD” y “enfermedad renal poliquística” se usan indistintamente y se refieren a un grupo de trastornos caracterizados por un gran número de quistes distribuidos a lo largo de riñones espectacularmente atrofiados. El desarrollo de los quistes resultantes lleva a una función renal deficiente y puede causar finalmente una insuficiencia renal. “PKD” específicamente incluye la enfermedad poliquística autosómica dominante del riñón (ADPKD) y la enfermedad poliquística autosómica recesiva del riñón (ARPKD), en todos las etapas del desarrollo, sin tener en cuenta la causa subyacente. Los términos “tratar” y “tratamiento” se refieren tanto a tratamientos terapéuticos como a medidas profilácticas o preventivas, en las que el objeto es prevenir o retrasar (aliviar) un cambio o trastorno fisiológico no deseado, o la expansión de este trastorno, tal como el desarrollo de la enfermedad poliquística del riñón. Para los fines de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no de forma limitante, la mejora de los síntomas, disminución del alcance de la enfermedad, estado estabilizado de la enfermedad (es decir, sin empeoramiento), retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación de la patología y remisión (bien parcial o total), detectable o indetectable. “Tratamiento” también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Entre los que necesitan tratamiento se incluyen los que ya sufren la dolencia o el trastorno, así como los propensos a sufrir la dolencia o el trastorno o en los que se tiene que prevenir la dolencia o el trastorno. La administración “crónica” se refiere a la administración del agente(s) de un modo continuo a diferencia del modo agudo, para mantener de este modo el efecto deseado durante un periodo prolongado de tiempo. La administración “intermitente” es el tratamiento que no se da de forma consecutiva sin interrupción, sino más bien de naturaleza cíclica. 6

ES 2 246 588 T3 La administración “en combinación con” uno o más agentes terapéuticos adicionales incluyen la administración simultánea (concomitante) y consecutiva en cualquier orden. Un “individuo” es un vertebrado, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un humano. 5

“Mamífero” para los fines del tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportivos o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferiblemente el mamífero en este documento es humano. 10

Una “cantidad efectiva” es una cantidad suficiente para proporcionar resultados clínicos beneficiosos o deseados. Puede administrarse una cantidad eficaz en una o más administraciones. Para los fines de esta invención, una cantidad eficaz de un ligando de PTBR es una cantidad que es suficiente para llevar a cabo el tratamiento, como se ha definido anteriormente.

15

El término “recombinante” cuando se usa con referencia a una célula, animal o virus indica que la célula, animal o virus codifica un ADN o ARN extraño. Por ejemplo, células recombinantes que opcionalmente expresan ácidos nucleicos (por ejemplo, ARN) no encontrados en la forma nativa (no recombinante) de la célula.

20

25

30

35

40

45

50

El término “anticuerpo” se usa en el sentido más amplio y especialmente abarca anticuerpos monoclonales antiPTBR (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizantes), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) así como fragmentos de anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales específicamente incluyen anticuerpos “quiméricos” en los que una porción de la cadena ligera y/o pesada es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes a anticuerpos derivados de una especie en particular o pertenece a una clase o subclase de anticuerpo en particular, mientras que el resto de la cadena(s) es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de otra especie o pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de estos anticuerpos siempre que muestren la actividad biológica deseada (Patente de EE. UU. Nº 4.816.567; Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Adicionalmente, los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos o fragmentos de los mismos “humanizados” (tales como Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 u otras subsecuencias del anticuerpo de unión al antígeno) que contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulinas no humanas. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpos receptores) en los que se han sustituido restos de un CDR del receptor por restos del CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los restos FR del Fv de la inmunoglobulina humana han sido sustituidos por los correspondientes restos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de CDR o de regiones estructurales importadas. Estas modificaciones se hacen para refinar y maximizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos los dominios variables de al menos uno, y típicamente dos, en los que todas o sustancialmente todas la regiones CDR corresponden con las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son de una secuencia de inmunoglobulina humana. Óptimamente, el anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase Jones y col., Nature 321:522-525 (1986) y Reichmann y col., Nature 332:323-329 (1988). El anticuerpo humanizado incluye un anticuerpo PRIMATIZED® en el que la región de unión al antígeno del anticuerpo deriva de un anticuerpo producido inmunizando monos macacos con el antígeno de interés. “Fragmentos de anticuerpo” comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región de unión al antígeno o región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2 y Fv; dianticuerpos, anticuerpos lineales (Zapata y col., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)); moléculas de anticuerpo de cadena única y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. II. Modos de realización de la invención A. Ligandos de PTBR

55

60

Hay varios polipéptidos nativos que supuestamente se han identificado como ligandos endógenos de PTBR o como componentes de estos ligandos. Un posible ligando endógeno es el inhibidor de la unión de diazepam (DBI) (Berkovich y col., Mol. Pharmac. 37:164-172 [1990]; Guidotti y col., Nature 257:533-535 [1978]), un polipéptido endógeno de 11 kDa de 86 aminoácidos (Besman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:4897-4901 [1989]). El mismo ligando también se denomina en la bibliografía como proteína de unión al acil coenzima A (Knudsen y col., Biochem. J. 26: 513-519 [1989]). Este no es un ligando selectivo ya que tiene la misma afinidad (intervalo µM) tanto para el receptor GABAA /benzodiazepina como para PTBR. Un fragmento corto de DBI (fragmento 17-50 también denominado como tricontetraneuropéptido) es más selectivo para PTBR. Otro conjunto de ligandos endógenos son porfirinas naturales de las que se ha informado que tienen alta afinidad por el PTBR (Taketani y col., J. Biochem. 117:875-880 [1995] y Zisterer y Williams, supra).

65

También se conocen y se han caracterizado bien ligandos sintéticos. Estos ligandos sintéticos incluyen benzodiazepinas, tales como, por ejemplo, Ro5-4864 y clonazepam; isoquinolina carboxamidas, por ejemplo, PK 11195 [1-(2clorofenil)-N-metil-N-(1-metilpropil)-3-isoquinolina carboxamida]; y PK 14105 [(2-fluoro-5-nitro-fenil)-N-metil-N7

ES 2 246 588 T3

5

10

(1-metilpropil)-3-isoquinolina carboxamida]; imidazopurinas, por ejemplo Alpidem y Zolpidem y Z-amil-3 indoleacetamidas, por ejemplo, FGIN-1-27 y pirolobenoxapinas, por ejemplo, NF 182. Las estructuras químicas de algunos ligandos de PTBR sintéticos seleccionados se muestran en la figura 5. Otros ligandos de PTBR sintéticos también son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Zister y Williams, supra; Anzini y col., J. Med. Chem 4275 (1996), Cappelli y col., J. Med Chem. 2910 (1997) (análogos conformacionalmente restringidos de Ro5-4864); documento WO 96132383 [derivados de (2-fenil-pirimidil-4-il)(oxi o amino) acetamida]; documento FR 2.678.269 [derivados de 1-(4-clorofenil)-2-(1-piperidinil)-etanol]; documento EP 524.846 [derivados de 2-(1-piperidinil)-2-(6(3,4-quinolin-2-(1H)-ona))-etanol), documento FR 2.669.926 (derivados de fenilurea); documentos US 5.128.338 y EP 446.141 [derivados de imidazol(1,2-c)quinazolina], documento US 5.026.711 (derivados de amino-quinolina 4sustituido o del ácido naftiridin-3-carboxílico); documentos US 4.808.599 y EP 248.734 (derivados de benzotifeno o benzofuran carboxamida) y documento EP 210-084 (derivados de amida o carbamato de (iso)quinolina y quinazolina).

15

El uso de éstos y de ligandos nativos o sintéticos similares conocidos o descubiertos en lo sucesivo, está específicamente dentro del alcance de la presente invención. Los ligandos preferidos muestran alta selectividad por el PTBR, en relación con los receptores de benzodiazepina presentes en el cerebro (CBR) o GABA. En experimentos de unión competitiva, la diferente en la afinidad de unión preferiblemente es de al menos 10 veces, más preferiblemente al menos de 100 veces, lo más preferiblemente al menos de 1000 veces.

20

Los ligandos PTBR incluyen agonistas y antagonistas de PTBR. Los agonistas representativos de PTBR incluyen benzodiazepinas, por ejemplo, Ro5-4864 y sus derivados, mientras que los antagonistas de PTBR representativos incluyen isoquinolina carboxamidas, por ejemplo, PK 11195 y PK 14105 y derivados. B. Selección de nuevos antagonistas y agonistas de PTBR

25

30

35

40

45

50

La primera etapa en la identificación de nuevos ligandos de PTBR (agonistas o antagonistas) es el análisis in vitro para identificar compuestos que se unen selectivamente a los receptores de tipo periférico. La unión al receptor puede ensayarse usando receptores de tipo periférico o derivados del cerebro aislados a partir de sus respectivas fuentes naturales, o producidos por tecnología de ADN recombinante y/o por síntesis química. La afinidad de unión de los compuestos candidatos puede ensayarse por unión directa (véase por ejemplo Schoemaker y col., J. Pharmacol. Exp. Ther., 285:61-69 [1983]) o indirecta, por ejemplo, unión competitiva. En experimentos de unión competitiva, la concentración de un compuesto necesaria para desplazar el 50% de cualquier otro compuesto unido al receptor (CI50 ) normalmente se usa como medida de afinidad de unión. El otro ligando puede ser cualquier compuesto del que se conoce que se une a PTBR con alta afinidad y selectividad, por ejemplo, PK 11195 o Ro5-4864. En una realización específica, para identificar ligandos nuevos, el ADN que codifica la secuencia de longitud completa del receptor de benzodiazepina de tipo periférico humano (GenBank M36035) se clona en un vector de expresión que contiene un marcador seleccionable. El vector se usa para transfectar células hospedadoras recombinantes, por ejemplo, células de mamífero, por ejemplo, la línea celular de riñón embrionario humano HEK-293. Tras varios ciclos de selección, se identifican por transferencia de tipo Western líneas estables que expresan PTBR usando inmunoreactividad hacia un epítope marcado que se introduce por ingeniería genética en el gen PTBR. Se preparan fracciones de membrana a partir de las líneas celulares que expresan en masa de forma estable y se conservaron congeladas para la selección por HTP. La autentificación de las fracciones de membranas que contiene PTBR se consigue reproduciendo los coeficientes de unión de ligandos conocidos marcados radiactivamente (tales como [3 H]Ro5-4864). La selección de nuevos ligandos se realiza en virtud de su capacidad para competir de forma eficaz con [3 H]Ro54864 en ensayos de competición. Los coeficientes de unión pueden determinarse de cualquier manera conocida, por ejemplo, por análisis de Scatchard. También podría ser necesario distinguir entre agonistas y antagonistas de PTBR. Esto puedo hacerse en experimentos in vitro o in vivo, siguiendo la respuesta de una célula tras la unión del ligando al receptor. Un agonista producirá una respuesta celular, que dará lugar a una actividad aumentada o nueva o a la inhibición de una actividad que ya tenía lugar en la célula. Por el contrario, un antagonista no tendrá efecto en la respuesta celular, sino que más bien tendrá el efecto de prevenir la unión de agonistas a los mismos sitios receptores. Puede ser deseable la selección de antagonistas de modo que la lectura sea funcional para encontrar moléculas que activan el receptor sin afectar al sitio(s) de unión del ligando(s) nativo(s). Los antagonistas pueden seleccionarse de modo similar.

55

Por ejemplo, los siguientes procedimientos son adecuados para identificar antagonistas y agonistas de PTBR que son útiles en los procedimientos de la presente invención: 60

1. La proliferación de células epiteliales renal, fibroblastos o de músculo liso derivadas a partir de riñón normal o riñón poliquístico de mamífero (incluyendo humano). 2. La regulación de apoptosis inducida en células epiteliales renales o fibroblastos derivados de riñón normal o riñón poliquístico de mamífero (incluyendo humano).

65

3. Seguir la formación in vitro de quistes por células derivadas de mamíferos humanos o no humanos con enfermedad poliquística del riñón. 4. La expresión de un fenotipo que indica la pérdida de diferenciación de las células epiteliales renales. 8

ES 2 246 588 T3 5. Alteraciones en la conductancia iónica o en los fenómenos eléctricos dependientes de la conductancia iónica en las células epiteliales renales o de células intersticiales a partir de riñón normal o riñón poliquístico. 5

6. Modulación en la secreción de las células renales o circulantes de factores proteicos, lipídicos o de carbohidratos asociados con la expresión o progresión de la enfermedad poliquística del riñón, incluyendo citoquinas y factores lipídicos producidos en los quistes o alrededor de ellos. C. Otros antagonistas de PTBR

10

15

Los antagonistas de PTBR de la presente invención no se limitan a ligandos de PTBR. Otros antagonistas de PTBR incluyen (1) variantes de un PTBR nativo que retiene la capacidad para unir un ligando endógeno de PTBR pero es deficiente en su capacidad para mediar una respuesta biológica, (2) receptores solubles, (3) anticuerpos que unen de forma específica un ligando endógeno de PTBR en o cerca de su sitio de unión al receptor de modo que bloquean la unión del ligando a su receptor nativo y (4) inhibidores selectivos de la producción in vivo de un ligando endógeno de PTBR, tales como reguladores transcripcionales de la expresión de un ligando endógeno PTBR in vivo. Otro antagonista preferido de PTBR es una molécula bioorgánica, normalmente un compuesto activo por vía oral que se basa en estudios de modelado sintético y/o molecular, que es capaz de prevenir la interacción entre un receptor nativo de PTBR y su ligando endógeno. Pueden identificarse estos antagonistas de PTBR usando el mismo tipo de ensayos que los discutidos anteriormente.

20

D. Disponibilidad de antagonistas y agonistas de PTBR

25

30

35

40

45

50

Los antagonistas y agonistas de PTBR de la presente invención pueden ser pequeñas moléculas, por ejemplo, compuestos orgánicos o péptidos que puede sintetizarse por técnicas conocidas de síntesis química. Algunos antagonistas o agonistas de PTBR serán polipéptidos, por ejemplo, ligandos de PTBR de secuencia nativa, o fragmentos, variantes o derivados de los mismos, y pueden producirse por tecnología de ADN recombinante, síntesis química o una combinación de estas técnicas o técnicas similares. Algunos agonistas o antagonistas de PTBR están disponibles en el mercado, por ejemplo en Hoffmann-La Roche AG (Nutley, NJ) y Synthelabo (Francia). Los ligandos de PTBR, agonistas o antagonistas, de la presente invención también pueden ser anticuerpos agonistas o antagonistas de un PTBR. Los procedimientos de preparación de anticuerpos monoclonales son conocidos en la técnica. Pueden obtenerse anticuerpos policlonales en un mamífero, por ejemplo, con una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Típicamente, el agente inmunizante y/o el adyuvante se inyectarán en el mamífero por inyecciones múltiples subcutáneas o intraperitoneales. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante con una proteína conocida por ser inmunogénica en el mamífero que está siendo inmunizado, tales como albúmina sérica o inhibidor de tripsina de soja. Los ejemplos de adyuvantes que pueden emplearse incluyen adyuvante completo de Freund y MPL-TDM. De acuerdo con este enfoque, pueden prepararse anticuerpos monoclonales usando procedimientos de obtención de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975). En un procedimiento de obtención de hibridoma, un ratón, un hámster u otro animal hospedador apropiado, típicamente se inmunizan con un agente inmunizante para permitir que los linfocitos produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán de forma específica al agente inmunizante. De forma alternativa, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Generalmente, si se desean células de origen humano se usan linfocitos de sangre periférica (“PBL”) o si se desean fuentes de mamíferos no humanos se usan células esplénicas o de nódulo linfático. Después, los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilénglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academia Press, (1986) pág. 59-103]. Las líneas celulares inmortalizadas normalmente son células de mamífero inmortalizadas, especialmente células de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son las que se fusionan de forma eficaz, mantiene la expresión estable de anticuerpo a alto nivel por parte de las células productoras de anticuerpo seleccionadas y son sensibles a medios tales como medio HAT.

60

Después, puede evaluarse la presencia de anticuerpos monoclonales en el medio de cultivo en el que se cultivan las células del hibridoma dirigidos contra el PTBR usado en particular. Preferiblemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por las células del hibridoma se determina por inmunoprecipitación y por un ensayo de unión in vitro, tales como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA). Estas técnicas y ensayos son conocidos en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse por el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

65

Después de identificar las células de hibridoma deseadas, los clones puede subclonarse por procedimientos de dilución límite y cultivarse por procedimientos convencionales [Goding, supra]. Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640. De forma alternativa, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como ascitis en un mamífero.

55

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse a partir del medio de cultivo o del líquido ascítico por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por 9

ES 2 246 588 T3 ejemplo, proteína A-Sepharosa, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. 5

10

15

20

25

30

35

40

45

De forma alternativa, los anticuerpos monoclonales pueden hacerse por procedimientos de ADN recombinante, tales como los descritos en la Patente de EE. UU. Nº 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse fácilmente y secuenciarse usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Las células de hibridomas analizadas anteriormente sirven como fuente preferida de este ADN. Una vez aislado, el ADN puede situarse en vectores de expresión, que después se transfectan en células hospedadoras tales como células CSO, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otra forma no producen proteína de la inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinante. Pueden humanizarse los anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpo, tales como Fv, Fab, Fab’, (F(ab’)2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión al antígeno. Los anticuerpos humanizados contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. Más específicamente, los restos de anticuerpos humanizados de una región determinante de complementariedad (CDR) de una inmunoglobulina humana (el receptor) se sustituyen por restos de un CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tales como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, también se sustituyen restos de regiones estructurales de FV de la inmunoglobulina humana por restos no humanos correspondientes. Adicionalmente, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias del CDR o de la región estructural importadas [Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332:323329 (1988)]. Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene introducido en él uno o más restos de una fuente no humana. Esos restos de aminoácidos no humanos a menudo se denominan como restos “importados”, que típicamente se toman a partir de un dominio variable “importado”. La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science, 239:1534-1536 (1988)], sustituyendo CDR o secuencias de CDR de roedores en las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Además, pueden producirse anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluyendo bibliotecas de expresión en fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks y col. J. Mol. Biol., 222;581 (1991)]. Las técnicas de Cole y col., y de Boerner y col. también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985) y Boerner y col., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. De forma similar, pueden hacerse anticuerpos humanos introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógena se han inactivado parcial o completamente. Tras la inmunización, se observa la producción de anticuerpo que recuerda mucho en todos los sentidos a los vistos en humanos, incluyendo reordenamiento génico, ensamblaje y repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. Nº 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425 y 5.661.016, y las siguientes publicaciones científicas: Marks y col., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg y col., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild y col., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995). Los anticuerpos pueden ser biespecíficos, en los que una especificidad es para un PTBR y la otra especificidad para otra proteína, tal como, un segundo PTBR diferente, un epítope diferente del mismo PTBR o un ligando de PTBR. D. Composiciones que comprenden agonistas y antagonistas de PTBR

50

Los agonistas y antagonistas de PTBR (ligandos y otros) pueden administrarse a un paciente en dosis terapéuticamente eficaces para tratar (incluyendo prevención) una enfermedad quística específica, por ejemplo, enfermedad poliquística del riñón. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de un compuesto suficiente para dar lugar al tratamiento deseado.

55

La toxicidad y eficacia terapéutica de estos compuestos puede determinarse por procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o en animales de experimentación, por ejemplo, determinando la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéutica eficaz en el 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y los terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la proporción DL50 /DE50 . Se prefieren los compuestos que muestran índices terapéuticos mayores. Aunque pueden usarse compuestos que muestran efectos tóxicos secundarios, debe tenerse cuidado al diseñar un sistema de suministro que dirija estos compuestos al sitio del tejido afectado para minimizar el daño potencial en las células no afectadas y, por tanto, reducir los efectos secundarios.

60

65

Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y de estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificaciones para su uso en humanos. Las dosificaciones de estos compuestos se encuentran preferiblemente en un intervalo de concentraciones en circulación que incluye la DE50 de menor o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la ruta de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el procedimiento de la invención, la dosis terapéuticamente 10

ES 2 246 588 T3

5

eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para alcanzar un intervalo de concentración plasmático que incluye la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que alcanza una inhibición de la mitad del máximo de los síntomas) según se determina en cultivo celular. Esta información puede usarse para determinar con exactitud las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, por cromatografía líquida de alta resolución. Una dosis diaria típica de un agonista o antagonista de PTBR de la presente invención podría oscilar de aproximadamente 1 µg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso del cuerpo del paciente o más por día, dependiendo de los factores mencionados anteriormente, preferiblemente de aproximadamente 10 µg/kg/día a 10 mg/kg/día.

10

Las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la presente invención pueden formularse de manera convencional usando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. De este modo, los compuestos y sus sales y solvatos fisiológicamente aceptables pueden formularse para la administración por inhalación o insuflación (a través de la boca o de la nariz) o por administración oral, bucal, parenteral o rectal.

15

Para la administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, comprimidos o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropril metilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina, hidrógeno fosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o almidón glicolato sódico); o agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato sódico). Los comprimidos pueden recubrirse por procedimientos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Estas preparaciones líquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles deshidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arábica); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres aceitosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados) y conservantes (por ejemplo, metil o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales tamponadoras, agentes colorantes y edulcorantes según sea apropiado.

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Las preparaciones para administración oral pueden formularse de forma adecuada para proporcionar la liberación controlada del compuesto activo. Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de manera convencional. Para la administración por inhalación, los compuestos para su uso de acuerdo con la presente invención se suministran de forma conveniente en forma de una presentación de pulverizador aerosol a partir de paquetes a presión o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y los cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un inhalador o insuflador pueden formularse para que contenga una mezcla del compuesto en polvo y una base de polvo adecuada, tal como lactosa o almidón. Los compuestos pueden formularse para la administración parenteral por inyección, por ejemplo por inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones por inyección pueden presentarse en forma de unidad de dosificación, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes o dispersantes. De forma alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso. Los compuestos también pueden formularse en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen base de supositorio convencional tales como mantequilla de cacao u otros glicéridos. Además de las formulaciones descritas previamente, los compuestos también pueden formularse como una preparación de depósito. Estas formulaciones que actúan a largo plazo pueden administrarse por implantación (por ejemplo, de forma subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. De este modo, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo como una emulsión en un aceite adecuado) o resinas de intercambio iónico o como derivados ligeramente solubles, por ejemplo, como una sal ligeramente soluble. Las composiciones pueden, si se desea, presentarse en un paquete o dispositivo distribuidor que pueden contener una o más formas de unidad de dosificación conteniendo el ingrediente activo. Por ejemplo, el paquete puede contener una hoja de metal o de plástico, tal como un envase blister. El paquete o dispositivo distribuidor pueden estar acompañados de instrucciones para la administración. Si un agonista o antagonista se administra conjuntamente con otro agonista o antagonista, o con otro agente que tiene similar actividad biológica, los diferentes ingredientes activos pueden formularse conjuntamente en un vehículo transportador apropiado para formar una composición farmacéutica. Los agonistas de PTBR de la presente invención pueden, por ejemplo, combinarse o administrarse conjuntamente de cualquier manera con otros agentes terapéuticos usados en el tratamiento de la enfermedad diana, por ejemplo, enfermedad poliquística del riñón, incluyendo taxol y 11

ES 2 246 588 T3 derivados de taxol, TNF-α, anti-hipertensivos, incluyendo inhibidores ACE, factores proteicos dirigidos a terapia o sus receptores, etc. E. Terapia génica 5

10

15

20

25

30

35

40

Las enfermedades quísticas, por ejemplo, la enfermedad poliquística del riñón, pueden tratarse de acuerdo con la presente invención también mediante terapias de base génica, usando transferencia ex vivo o in vivo de un gen que codifica un polipéptido ligando de PTBR u otro polipéptido agonista o antagonista de PTBR. En la forma ex vivo de administración génica, las células derivadas del paciente o de otras fuentes, primero se modifican fuera del cuerpo introduciendo un gene o genes en particular. Después, estas células modificadas se reintroducen en el cuerpo del paciente, alcanzando así distribución local, regional o generalizada. Hay una diversidad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere a células cultivadas in vitro, o in vivo en las células del hospedador deseado. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico en células de mamífero in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, procedimiento de precipitación con fosfato cálcico, etc. Las técnicas de transfección in vivo actualmente preferidas incluyen transfección con vectores virales (típicamente retrovirales) y transfección mediada por proteína de la cubierta viral-liposoma (Dzau y col., Trends in Biotechnology 11:205-210 (1993)). En algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que se dirija a las células diana, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de la superficie celular o la célula diana, un ligando para un receptor de la célula diana, etc. Cuando se emplean liposomas, pueden usarse como diana y/o para facilitar la captación, proteínas que se unen a una proteína de la superficie celular asociada con endocitosis, por ejemplo, proteínas de la cápside o fragmentos de las mismas trópicos para un tipo de célula en particular, anticuerpos para proteínas que experimentan internalización durante el ciclo celular y proteínas que se dirigen a una localización intracelular y potencian la vida media intracelular. La técnica de endocitosis mediada por receptor se describe, por ejemplo, en Wu y col., J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987) y Wagner y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990). Para revisión de marcadores génicos conocidos actualmente y protocolos de terapia génica véase Anderson y col., Science 256:808-813 (1992). Las tecnologías más avanzadas para el uso de ácidos nucleicos en el transcurso de terapia génica usan sistemas retrovirales para suministrar genes en la célula (Wilson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 439-443 (1990) y Kasid y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 473-477 (1990). La transferencia génica eficaz en el riñón es relativamente difícil, especialmente puesto que el rizón es un órgano estructuralmente complejo que tiene un índice mitótico relativamente bajo. Además, la organización arquitectónica del riñón es crítica para la función propia del órgano. Por consiguiente, el suministro génico eficaz a un tipo celular en particular dentro del riñón es relativamente difícil de alcanzar. Un procedimiento específico para transferir genes en el riñón se describe, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. Nº 5.869.230 expedida el 9 de febrero de 1999. De acuerdo con este enfoque, se introduce un vector que lleva el material genético de interés en la vasculatura del riñón en condiciones que permiten la infección del riñón pero que protege a éste de daño isquémico, por ejemplo, manteniendo el riñón a baja temperatura (por ejemplo, en hielo) durante la incubación con el vector de transferencia génica. Los ejemplos siguientes ilustran, pero no limitan, la invención. Todas las referencias citadas a lo largo de la memoria descriptiva, incluyendo los ejemplos, se incorporan expresamente en este documento por referencia.

45

Ejemplo 1 Expresión diferencial de PTBR en un modelo in vivo de enfermedad renal como se determina por ensayo de micromatriz de ADN 50

55

El perfil de expresión de genes representativos se valoró en tejidos normales y tejidos obtenidos de sujetos que sufren una enfermedad, especialmente enfermedad cardiaca, renal o inflamatoria. La identificación de los genes expresados de forma diferencial implicaba las siguientes etapas: (1) construcción de bibliotecas de ADNc normalizado o substraído a partir del ARNm extraído de las células o tejidos de animales sanos y de un modelo animal de la enfermedad; (2) purificación de ADN; (3) obtener una micromatriz de ADN para el análisis de expresión y (4) incubar la micromatriz de ADN con una sonda para identificar los genes de los clones que se expresan de forma diferencial usando ADNc marcado a partir de células o tejidos sanos o enfermos. (1) Modelo in vivo de enfermedad renal

60

65

Como modelo in vivo de enfermedad renal, se usó un modelo de rata de una forma hereditaria de enfermedad poliquística autosómica dominante del riñón (ADPKD), basado en la observación de que ADPKD se desarrolla en ratas Han:SPRD (Kaspareit-Rittinghaus y col., Transplant Proc. 6:2582-3 (1990); Cowley y col., Kidney Int. 43:52234 (1993)). Los quistes renales y la insuficiencia renal eran evidentes en ratas macho heterocigotos de seis meses de edad (Cy/+), mientras que las ratas control (+/+) no mostraban signos de quistes o de insuficiencia renal. Se sacrificaron cinco animales enfermos (Cy/+) y uno normal (+/+) y se retiraron los riñones.

12

ES 2 246 588 T3 (2) Preparación de bibliotecas de ADNc normalizado y substraído

5

10

15

20

25

El ARNm poli A+ se aisló a partir de los riñones de animales normales y enfermos, siguiendo las técnicas conocidas en la técnica, tal como las descritas por Ausubel y col, eds., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley e hijos (Nueva York, NY 1993). Usando técnicas bien conocidas en la técnica pueden procesarse grandes números de muestras de tejidos, tal como, por ejemplo, el procedimiento de aislamiento de ARN en una única etapa de Chomczynski (Patente de EE. UU. Nº 4.843.155) que expresamente se incorpora a este documento como referencia en su totalidad. Los procedimientos para hacer bibliotecas de ADNc normalizado también son bien conocidos en la técnica, véase por ejemplo, Soares y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(20): 9228-32 (1994) y Bonaldo y col., Genome Res. 6(9): 791806 (1996). Siguiendo el procedimiento de Bonaldo y col., supra, se genera una versión normalizada de biblioteca de ADNc de tejido normal y enfermo. En particular, se purificó ARN poli A+ a partir de muestras de tejido normal y enfermo proporcionadas por el modelo in vivo de enfermedad renal descrito anteriormente. En primer lugar, se generó una biblioteca de ADNc clonado direccionalmente por procedimientos convencionales. Brevemente, se generó un ADNc de doble cadena cebando la síntesis de la primera cadena por transcripción inversa usando cebadores oligo dT que contenían un sitio de restricción Not I. Tras la síntesis de la segunda cadena, se añadieron adaptadores Xba I al extremo 5’ del ADNc, se seleccionaron los ADNc > 500 pb y se ligaron en los sitios de restricción correspondientes del vector de fago pCR21 (Invitrogen, San Diego, CA). A partir de la biblioteca de ADNc total, se generó una biblioteca normalizada como se detalla a lo largo del texto (Bonaldo y col., supra) y se describe aquí brevemente. El vector de fago pCR2.1 contiene un origen de replicación F1. De este modo, la biblioteca de ADNc puede propagarse como un fago de cadena sencilla con un virus auxiliar apropiado. El ADN circular de cadena sencilla se extrajo de la biblioteca del fago y sirvió como ADN “de muestra” para la etapa de hibridación de la normalización. El otro componente de la hibridación, el ADN “conductor”, se generó a partir de la biblioteca mediante amplificación por PCR usando un conjunto específico de cebadores para la región del vector que flanquean las inserciones clonadas. El ADN de muestra purificado (50 ng) y el ADN conductor (0,5 µg) se combinaron en NaCl 120 mM, formamida al 50%, Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 5 mM y SDS al 1%. En la reacción de hibridación se incluyeron un par de oligonucleótidos (10 µg de cada uno), correspondientes con una secuencia polienlazadora (la misma cadena que la del ADN de muestra) que está presente en el producto de PCR, para bloquear la hibridación de secuencias específicas del vector comunes entre el ADN de muestra y el conductor.

30

35

La mezcla de reacción, en aceite, se calentó 3 min a 80ºC y la hibridación se realizó a 30ºC durante 24 h (Co t calculada ”5). Los círculos de cadena sencilla se purificaron a partir de la mezcla de reacción por cromatografía en hidroxilapatita (HAP), se convirtió en ADN de doble cadena y se electroporó en bacterias para producir una biblioteca de ADNc normalizado representativa de los genes expresados en el ventrículo izquierdo de la rata. Para evaluar la eficacia del protocolo de normalización, se valoró la frecuencia de unos cuantos clones (ANP, BNP, actina y miosina) tanto en la biblioteca de partida como en la biblioteca normalizada. Se redujo la frecuencia de ADNc abundantes (actina y miosina) y ésta era aproximadamente equivalente para los clones de ADNc poco frecuentes (ANP y BNP). La frecuencia de un clon en las dos bibliotecas se determinó con técnicas de selección convencionales por inmovilización de colonias en membranas de nailon e hibridación con sondas de ADN marcadas radiactivamente.

40

45

50

55

60

Ciertos genes, no expresados en tejido normal, y activados en tejidos enfermos, pueden estar ausentes de la biblioteca de ADNc normalizado generada a partir de tejido normal. Para obtener clones específicos de enfermedad para incluir en la micromatriz de ADN, puede repetirse el enfoque de normalización resumido anteriormente usando tejido enfermo obtenido del modelo de enfermedad apropiado. Sin embargo, puesto que la mayoría de los genes se expresan normalmente entre el tejido normal y el tejido enfermo, la obtención de micromatrices de bibliotecas normalizadas de tejido enfermo y normal pueden introducir redundancia significativa. En una realización preferida, se reduce la redundancia de clones, todavía se obtienen ADNc que se expresan específicamente, así como sustancialmente elevados, en tejido enfermo. Para obtener ADNc específico de la enfermedad, puede hacerse una biblioteca substraída usando protocolos similares a los usados para generar bibliotecas normalizadas. Se usa una vez más el procedimiento de Bonaido y col., supra descrito aquí brevemente Para hacer una biblioteca extraída, se genera una biblioteca de ADNc total del tejido obtenido a partir del modelo de enfermedad. La biblioteca de ADNc se clona direccionalmente en el vector pCR2.1 y se deriva un ADN de muestra de cadena sencilla como se ha descrito anteriormente para la normalización de la biblioteca. El ADN conductor se genera por amplificación por PCR de las inserciones clonadas a partir de la biblioteca de ADNc total preparada del riñón normal. La hibridación se da entre secuencias que son comunes en los riñones normales y enfermeros. Para esta biblioteca substraía, la reacción se realiza más a fondo (Cor calculada ”27) que para la normalización usando más conductor (1,5 µg frente a 0,5 µg) y tiempo de hibridación más largo (48 h frente a 24 h). La purificación de los círculos de cadena sencilla que no hibridan por cromatografía en HAP, la conversión en ADN de doble cadena y la electroporación en bacterias produce una biblioteca de ADNc substraída enriquecida en genes que se expresan en riñones de rata enferma. (3) Análisis de micromatrices de ADN

65

Se estableció un protocolo en placa de microvaloración para la amplificación por PCR de ADN y su posterior purificación, que proporciona ADN de calidad y cantidad aceptable para la impresión en micromatrices de ADN de uso en una realización preferida de la presente invención. De forma específica, los cebadores de PCR se sintetizan para amplificar una inserción de ADN del vector pCR2.1, que se usaba para la construcción de la biblioteca. Tras 30 ciclos 13

ES 2 246 588 T3 de amplificación, cada producto de PCR se pasa a través de una columna de filtración en gel para retirar cebadores no incorporados y sales. Para mantener la robustez, las columnas se empaquetan en placas con filtro de 96 pocillos y el manejo del líquido se realiza de forma automatizada. La producción, por reacción de PCR, generalmente es de 2-5 µg, ADN suficiente para imprimir varios cientos de chips. 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Para ensayar la calidad del ADN que se prepara con este procedimiento de PCR; se produjo una micromatriz de ADN con las 96 muestras purificadas de una única placa de microvaloración. Usando un robot procesador de líquido (Biomek 2000, Beckman), se tomaron alícuotas de 85 µl de la mezcla de reacción de PCR de cada pocillo de una placa de 96 pocillos de 0,2 ml de pared delgada. La mezcla de reacción contenía 0,2 mM de cada dNTP, 1,25 unidades de Taq polimerasa y tampón Taq 1x (Boehringer Mannheim). Los cebadores, 1 µm de cada uno, son de regiones del vector que flanquean el sito de clonación de pCR2.1 e incluyen una amina primaria 5’ con un enlace de carbono 6 para facilitar la unión del producto de ADN a la superficie vítrea de la micromatriz. Se añadió a cada polillo 1,0 µl de cultivo bacteriano de clones de ADNc individual. Las condiciones de PCR son: 2 min, 95ºC para desnaturalizar, después 30 ciclos de 95ºC, 30 seg/65ºC, 40 seg/72ºC, 1 min, 30 seg y una extensión final de 72ºC, 5 min, usando un termociclator PTC 100 de MJResearch. Los productos de PCR se purificaron por filtración en gel sobre Sephacryl 400 (Sigma). Brevemente, se cargaron 400 µl de Sephacryl 400 prehinchado en cada pocillo de una placa de filtro de 96 pocillos (PallBiosupport) y se centrifugaron en un platillo a 800g durante 1 min. Los pocillos se lavaron 5 veces con SSC 0,2x. Las mezclas de reacción de PCR se cargaron en la columna y el ADN purificado (flujo a través) se recogió a 800g durante 1 min. Las muestras se secaron a 50ºC durante la noche y se colocaron en la micromatriz de ADN. Se sintetizaron un par de sondas fluorescentes por transcripción inversa de ARN poli A+ usando, independientemente, Cy3 dCTP y Cy5 dCTP (Amersham). En 16,5 µl, se desnatularizaron a 65ºC, 5 min, 1 µg de ARN poli A+ y 2 µg de oligo dT 21 mer, y se hibridaron a 25ºC, 10 min. La transcripción inversa se realizó durante 2 horas a 37ºC con Superscript RT (Life Technologies, Gaithersburg, MD) en tampón 1x, 10 unidades de ribonucleasa de bloqueo, dATP/dGTP/dTTP 500 µM de cada uno, dCTP 280 µM, Cy5 o Cy3 dCTP 40 µM, y 200 unidades de RT. El ARN se degrada en NaOH 0,1 M, 65ºC durante 10 min. El ADNc marcado se purificó por filtración sucesiva con columnas Chroma Spin a 30 revoluciones (Clontech) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras se desecaron a temperatura ambiente en la oscuridad usando un Speed-Vac cubierto. Se aplicaron sondas de hibridación al chip de ensayo y se recogieron los datos esencialmente como se describe en Schena y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(20):10649 (1996). La intensidad de la señal de hibridación de cada elemento reflejaba el nivel de expresión del ARNm de cada gen en el ventrículo de rata. Se almacenan los datos digitalizados y se preparan para análisis. Se incluyen una serie de elementos de ADN de control en cada chip para asegurar la consistencia del marcaje y de la hibridación entre experimentos y para ayudar compensar la señal cuando se usan dos canales de fluorescencia. Para cada elemento hibridado con sondas marcadas dobles, se determinó la intensidad de señal absoluta y relativa. Los resultados de estos y otros experimentos indican que estos procedimientos para la producción de ADN molde y de sondas de ADNc marcados son adecuados para generar micromatrices de ADN de alta calidad dentro de una realización preferida de los procedimientos de la presente invención. La evaluación de la expresión de cientos de miles de genes genera una gran cantidad de datos que pueden manejarse por medio de paquetes de programas informáticos disponibles en el mercado que facilitan el manejo de este tipo y cantidad de datos. Los datos de expresión pueden almacenarse, analizarse y clasificarse a partir de cada experimento usando estos programas. Además, la expresión de cada clon puede seguirse de un experimento a otro usando metodologías conocidas. (4) Detección de genes expresados de forma diferencial usando análisis de micromatrices de ADN Como se ha descrito en detalle anteriormente, se aplicaron sondas a las micromatrices de ADN para hibridación y los datos se recogieron básicamente como se describe en Schena y col., supra. La intensidad de la señal de hibridación de cada elemento reflejaba el nivel de expresión del ARNm para cada gen. Para cada elemento hibridado con sondas marcadas dobles, se determina la intensidad de señal absoluta y relativa, que se traduce en los niveles de presión de los genes del sujeto. Los datos numéricos generados reflejan el nivel de expresión relativo del gen en la patología en comparación con el nivel de expresión del gen en estado normal o no patológico, en el modelo de enfermedad PKD cinco diseñado anteriormente y como determina el análisis por micromatriz. Los datos se presentan como valores de expresión diferencial con números positivos indicativos de los genes expresados a niveles mayores en el tejido enfermo en relación con el tejido normal, y valores negativos indicativos de expresión menor en la enfermedad. Mientras que en general los datos de las micromatrices de ADN son los valores medios de experimentos múltiples realizados con matrices de ADN separadas, en el caso presente se realizó un experimento y se obtuvo el ARN de un animal (n-1). En una realización preferida, los clones que tienen una reproducibilidad, valorada en análisis de micromatrices de ADN, elevada o disminuida aproximadamente en al menos dos veces, se pusieron en micromatrices de ADN en chips secundarios separados y se determinaron sus niveles de expresión. Se entiende, sin embargo, que también son interesantes los genes expresados de forma diferencial que muestran un cambio en la expresión de menos de aproximadamente dos veces, por ejemplo, menos de una, media o un cuarto, o un cambio en la expresión mayor de aproximadamente dos veces, por ejemplo, mayor de tres, cinco, diez, cien o mil veces.

65

Usando ADNc obtenido a partir del modelo de enfermedad renal in vivo, se construyeron micromatrices de ADN y se incubaron con una sonda como se ha descrito anteriormente. Se ha encontrado que un gen, originalmente denominado clon de ID Nº: P0242_B03 e identificado posteriormente como el equivalente en rata del gen del receptor 14

ES 2 246 588 T3 de la benzodiazepina del tipo periférico humano (PTBR), se sobreexpresa con un factor de 2 en el modelo de rata de enfermedad poliquística del riñón (PKD) descrito anteriormente, en comparación con el tejido de riñón normal. Adicionalmente, se encontró que el gen de un ligando nativo de PTBR, DBI se subexpresa con un factor de -1,9 en tejido de riñón enfermo, en comparación con el tejido normal. 5

(5) Identificación de genes humanos expresados de forma diferencial

10

15

Los clones expresados de forma diferencial obtenidos del análisis de la micromatriz de ADN obtenido del modelo de enfermedad descrito anteriormente, se secuenciaron y se comparó la coincidencia con genes humanos conocidos de bases de datos de secuencias génicas humanas conocidas. La figura 1 muestra los datos de alineamiento comparando la secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica el gen P0268 de rata expresado de forma diferencial con la secuencia del ADNc humano correspondiente con PTBR (SEC ID Nº: 1 y 2). La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos de PTBR humano (SEC ID Nº: 3). La figura 3 muestra los datos de alineamiento comparando la secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la proteína DBI de rata expresada de forma diferencial (ligando PTBR nativo) con la secuencia del ADNc humano correspondiente a DBI (SEC ID Nº: 4 y 5). La figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos de DBI humana. Ejemplo 2

20

Efecto de un agonista de PTBR en la proliferación de células ADPKD humanas En este experimento, se examinó el efecto de concentraciones de 10−12 a 10−6 M del agonista de PTBR conocido Ro5-4864 sobre el índice de proliferación de células de la enfermedad poliquística autosómica dominante del riñón (ADPKD).

25

Se cultivaron células epiteliales de riñones ADPKD humanos de las cúpulas de los quistes y se mantuvieron en cultivo primario durante varios pases. Estas células muestran varias propiedades fenotípicas de quistes intactos, incluyendo la orientación epitelial, la secreción de fluido en respuesta a estimulación con AMPc y de proliferación celular y se han usado para estudios de mecanismos celulares de secreción de fluidos y proliferación celular. 30

35

40

45

50

El índice de proliferación celular se determinó usando el procedimiento de Ensayo MTT 96 de valoración celular de Promega. Este ensayo es una modificación del descrito por Mosmann T, 1983 J. Immunol. Meth. 65, 55. Se encontró que este procedimiento, que mide la densidad óptica (D.O.) de un producto de reacción dependiente de proliferación (MTT), se correlacionaba directamente con determinaciones directas del número de células usando la técnica del hematocitómetro clásico. La relación entre el número de células y la D.O. fue lineal y r2 era > 0,98. Para determinar el efecto de agonistas en el índice de proliferación, se pusieron aproximadamente 4000 células en cámaras individuales de una placa de 96 pocillos. Las células se incubaron inicialmente en medio DME/F12 suplementado sólo con penicilina, estreptomicina, ITS y FBS al 1%. Después de 24 horas, se redujo el FBS al 0,002% (ITS suprimido) para detener el crecimiento. Esta pequeña cantidad de suero era necesaria para potenciar la unión de la célula a la superficie del plástico. Después, se cultivaron las células ADPKD humanas durante 48 horas tras la adición de AMPc (un estimulador de la proliferación celular) a una concentración de 100 µM. También se examinaron un grupo control y un grupo con forskolin. Estudios preliminares determinaron que se mantenía el crecimiento durante todo este intervalo completo. Después de esto, se examinó el efecto de un intervalo de concentraciones de 10−12 a 10−6 M del agonista de PTBR conocido Po5-4864 sobre el índice de proliferación de células PTBR tratadas previamente con AMPc o no tratadas (línea de referencia de proliferación). Los resultados se ilustran de forma gráfica en la figura 6. Cada conjunto de datos mostrado en la figura 6 es la media y se obtiene a partir de seis determinaciones. Por lo tanto, los resultados son, desde un punto de vista estadístico, altamente significativos. Los datos demuestran que para todas las concentraciones examinadas, Ro5-4864 actuaba como un potente inhibidor de la proliferación celular, que bloqueaba tanto la proliferación celular basal como la proliferación celular estimulada por AMPc. La observación visual de las células apoya la conclusión de que el agonista de PTBR Ro5-4864 actúa deteniendo el crecimiento celular y no matando a las células.

55

60

65

15

ES 2 246 588 T3 REIVINDICACIONES

5

10

1. El uso de un ligando de un receptor de benzodiazepina de tipo periférico (PTBR) para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de una enfermedad que implica la formación de quistes en un paciente que tiene o con riesgo de desarrollar dicha enfermedad, en el que el ligando de PTBR es un compuesto orgánico seleccionado entre el grupo compuesto por benzodiazepinas, isoquinolina carboxamidas, imidazopiridinas, 2-aril-3-indolacetamidas y pirrolobenzoxazepinas. 2. El uso de la reivindicación 1, en el que la composición farmacéutica adicionalmente comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. 3. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho paciente es un mamífero.

15

4. El uso de la reivindicación 3, en el que dicho mamífero es humano. 5. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha enfermedad es la enfermedad poliquística del riñón (PKD).

20

6. El uso de la reivindicación 5, en el que dicha PKD es una enfermedad poliquística autosómica dominante del riñón (ADPKD). 7. El uso de la reivindicación 5, en el que dicha PKD es una enfermedad poliquística autosómica recesiva del riñón (ARPKD).

25

30

8. El uso de una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho tratamiento es la prevención o inhibición de la expansión del quiste. 9. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho paciente ha sido diagnosticado de una mutación asociada con la enfermedad poliquística del riñón. 10. El uso de la reivindicación 9, en el que dicha mutación está en el gen PKD1, PKD2 o PKD3. 11. El uso de una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho ligando es un agonista de PTBR.

35

12. El uso de la reivindicación 11, en el que dicho agonista de PTBR es Ro5-4864. 13. El uso de la reivindicación 11 ó 12, en el que dicho agonista retrasa o previene el desarrollo de la hipertensión.

40

14. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho ligando es para administrar en combinación con un agente terapéutico adicional. 15. El uso de la reivindicación 14, en el que dicho agente terapéutico adicional es un agente que inhibe el suministro de proteínas de membrana a la membrana de una célula de dicho paciente.

45

16. El uso de la reivindicación 15, en el que dicho agente terapéutico adicional se selecciona entre el grupo compuesto por taxol, citocalasina-B, citocalasina-D, faloidina y un derivado de cualquiera de los anteriores. 17. El uso de la reivindicación 16, en el que dicho agente terapéutico adicional es TNF-α.

50

55

60

65

18. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que dicha composición farmacéutica es para administrar por vía intravenosa, intraperitoneal, intraarterial, subcutánea, oral o intramuscular. 19. Una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad que implica la formación de quistes, que comprende una cantidad eficaz de un ligando de un receptor de benzodiazepina de tipo periférico (PTBR) en el que el ligando de PTBR es un compuesto orgánico seleccionado entre el grupo compuesto por benzodiazepinas, isoquinolina carboxamidas, imidazopiridinas, 2-aril-3-indolacetamidas y pirrolobenzoxazepinas, mezclado con taxol o un derivado de taxol y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 20. La composición de la reivindicación 19, en la que dicha enfermedad es una enfermedad poliquística del riñón (PKD). 21. Un procedimiento de diagnóstico o pronóstico in vitro para determinar la presencia o actividad de una enfermedad quística o la susceptibilidad para el desarrollo de una enfermedad quística, que comprende seguir un cambio en el nivel de expresión de PTBR o de un ligando endógeno de PTBR. 22. El procedimiento de la reivindicación 21 que comprende seguir la tasa de expansión del quiste.

16

ES 2 246 588 T3 23. El procedimiento de la reivindicación 21 ó 22, en el que dicho nivel de expresión de PTBR o de un ligando endógeno de PTBR se sigue en una muestra de biopsia, una muestra de sangre o una muestra de orina. 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

17

ES 2 246 588 T3

18

ES 2 246 588 T3

19

ES 2 246 588 T3

20

ES 2 246 588 T3

21

ES 2 246 588 T3

22

ES 2 246 588 T3

23