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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 212 570

51 Int. Cl. : A61K 31/135, A61P 9/10

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A61P 25/00, A61P 25/14 A61P 25/16, A61P 25/28 C07C 211/42, C07C 215/64 C07C 215/74, C07C 217/74 G01N 33/566, G01N 33/68

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 99928342 .7

86 Fecha de presentación: 27.05.1999

87 Número de publicación de la solicitud: 1083889

87 Fecha de publicación de la solicitud: 21.03.2001

54 Título: Compuesto tetrahidronaftaleno y su utilización para el tratamiento de enfermedades neurodegenera

tivas. 30 Prioridad: 01.06.1998 US 87577 P

73 Titular/es: Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc.

U.S. Route, 202 Raritan, New Jersey 08869-0606, US

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.07.2004

72 Inventor/es: Reitz, Allen, B.;

Demeter, David, A.; Lee, Daniel, H., S.; Wang, Hoau-Yan; Chen, Robert, H.; Ross, Tina, Morgan; Scott, Malcolm, K. y Plata-Salaman, Carlos, R.

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Ungría López, Javier

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16.07.2004

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 212 570 T3 DESCRIPCIÓN Método para tratar trastornos neurodegenerativos. 5

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Campo de la invención La invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula I en la fabricación de un medicamento para tratar trastornos neurodegenerativos. Más particularmente, al uso de un compuesto de fórmula I en la fabricación de un medicamento para tratar trastornos neurodegenerativos (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer) inhibiendo la interacción del amiloide beta con receptores nicotínicos de la acetilcolina alfa-7. Antecedentes de la invención

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Los trastornos neurodegenerativos tales como la enfermedad de Alzheimer (AD) y la enfermedad de Parkinson (PD) afectan a los seres humanos con gran sufrimiento y pérdidas económicas. La AD se caracteriza por ovillos neurofibrilares, placas neuríticas y muerte de células neuronales. La AD aparece en forma familiar, de aparición temprana (< 60 años) o aparición tardía (> 60 años), siendo la última la más habitual. La AD es la causa principal de demencia relacionada con la edad y de la disfunción cognitiva (Wisniewski, T.; Ghiso, J.; Frangione, B. Neurobiol. of Disease 1997, 4, 313-328). La proteína precursora amiloide (APP), β-amiloide1−40 (Aβ1−40 ) y la β-amiloide1−42 (Aβ1−42 ) están profundamente implicadas en la patología de AD. Los péptidos Aβ se derivan de la APP por procesamiento proteolítico. Se han obtenido importantes pruebas que implican a los péptidos Aβ, particularmente Aβ1−42 en la AD a partir de distintas mutaciones identificadas recientemente que son responsables de ciertos tipos de AD heredada. Tales mutaciones en los genes presenilina (PS1 y PS2) son probablemente la causa de la forma más frecuente de AD familiar de aparición temprana. (Rogaev, E.I. Molecular Biology 1998, 32, 59). En estos casos, como con las mutaciones APP, se observa más Aβ1−42 en relación a Aβ1−40 . Algunos estudios extensos han mostrado que la Aβ1−42 tiene una mayor capacidad que la Aβ1−40 para agregarse en las fibras amiloides que constituyen las placas características de la AD (Lansbury P. T., Jr. Accts. Chem. Res. 1996, 29, 317). Aunque la Aβ1−40 está presente generalmente en mayor medida en el líquido cerebroespinal que la Aβ1−42 , la Aβ1−42 es el péptido principal que se encuentra en las placas AD. Los péptidos Aβ pueden inhibir la función colinérgica del neurotransmisor independientemente de la neurotoxicidad (Auld, D.S.; Kar, S.; Quirion, R. Trends Neurosci. 1998, 21, 43). Los péptidos Aβ se unen a varias sustancias naturales tales como apoR3, apoE4, apoK, transtiretina y albúmina. Además, se ha informado que Aβ interactúa con un receptor unido a la membrana para productos finales de glicacion avanzada y con el receptor de eliminador de clase A (SR) asociado con la producción de especies oxígeno reactivas. La estimulación del subtipo alfa-7 de receptores nicotínicos de la acetilcolina (nAChRs) puede proteger a las neuronas frente a la citotoxicidad Aβ (Kihara, T. et al. Ann. Neurol. 1997, 42, 159). Además, se ha descubierto que un conjunto de compuestos que activan nAChRs, especialmente del subtipo alfa-7, tienen actividad in vivo en modelos de la mejora del conocimiento (Patente de Estados Unidos Nº 5.741.802 expedida el 21 de Abril de 1988). A continuación se describe la unión específica de Aβ1−40 y Aβ1−42 al subtipo alfa-7 de nAChRs. Este nuevo descubrimiento tiene amplias ramificaciones para la etiología y el tratamiento de AD. Los nAChR son miembros de la familia de canal iónico controlada por ligando y parecen estar formados con cinco subunidades proteicas que se asocian alrededor de un poro central (Lindstrom, J. Molecular Neurobiology 1997, 15, 193). Estas subunidades incluyen α1-α9, β1-β4, γ, δ y ε. El subtipo α7 forma homómeros funcionales que se unen a la α-bungarotoxina, un péptido de 75 aminoácidos, con gran afinidad (065-1,7 nM Kd ) y a la nicotina con afinidad relativamente baja (aprox. micromolar Kd ) (Holladay, M.W.; Dart, M.J.; Lynch, J.K.; J. Med. Chem., 1997, 40, 4169). Los compuestos que bloquean la agregación de péptidos Aβ son fármacos potencialmente útiles para el tratamiento de AD. Por ejemplo, la rifampicina inhibe la agregación y la neurotoxicidad de Aβ y puede mostrar un efecto in vivo en la reducción de la placa en comparación con controles de la misma edad (Tomiyama, T. et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 6839). Para bloquear la interacción de los péptidos Aβ con nAChR α7, los compuestos se pueden unir a nAChR α7, al mismo Aβ o a ambos. Cualquiera de estos mecanismos de acción proporcionaría una protección significativa frente a la neurotoxicidad mediada con Aβ y la inhibición de la función colinérgica mediada por nAChR y sería extremadamente útil para el tratamiento de AD. La unión de Aβ1−42 a nAChR α7 proporciona una base para la cristalización o deposición de Aβ en depósitos insolubles, que tiene el potencial de crecer como depósitos de amiloide fibrilar característicos de la AD. Por lo tanto, bloquear la interacción de la Aβ1−42 con nAChR alfa-7 reduciría la cantidad de Aβ insoluble agregado formada previniendo de esta forma la neurotoxicidad y patología asociada a tales depósitos de amiloide agregado. En consecuencia, es un objeto de la invención proporcionar el uso de un compuesto como el definido en las reivindicaciones 1 a 4. Otro objeto de la invención es proporcionar un método para identificar compuestos que inhiben la unión de péptidos Aβ con nAChR α7, por unión a péptidos Aβ o a nAChR α7. Sumario de la invención

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La presente invención se refiere al uso de un compuesto eficaz para inhibir la unión de un péptido de amiloide beta, preferiblemente Aβ1−42 a nAChR alfa-7, preferiblemente, nAChR alfa-7 humanos en la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno neurodegenerativo, el uso como se define en la reivindicación 1. Como los nAChR alfa-8 y alfa9 son similares con relación a la estructura y función de los nAChR alfa-7, es posible que el bloqueo de la interacción 2

ES 2 212 570 T3 del β-amiloide con nAChR alfa-8 y alfa-9 también tenga un beneficio terapéutico.

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Los trastornos neurodegenerativos incluidos dentro de la presente invención incluyen, sin limitación, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Pick, enfermedad difusa de cuerpos de Lewy, parálisis progresiva supernuclear (síndrome de Steel-Richardson), degeneración multisistema (síndrome de Shy-Drager), enfermedades de neuronas motoras incluyendo esclerosis lateral amiotrófica, ataxias degenerativas, degeneración cortical basal, complejo ALS-demencia de Parkinson de Guam, panencefalitis esclerosante subaguda, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, sinucleinopatías, afasia primaria progresiva, degeneración estriatonigral, enfermedad de Machado-Joseph/ataxia espinocerebral de tipo 3 y degeneraciones olivopontocerebelares, enfermedad de Gilles de la Tourette, parálisis bulbar y pseudobulbar, atrofia muscular espinal y espinobulbar (enfermedad de Kennedy), esclerosis primaria lateral, paraplejia espástica familiar, enfermedad de Werdnig-Hoffmann, enfermedad de Kugelberg-Welander, enfermedad de Tay-Sach, enfermedad de Sandhoff, enfermedad espástica familiar, enfermedad de Wohlfart-Kugelberg-Welander, paraparesis espástica, leucoencefalopatía progresiva multifocal y enfermedades prión (incluyendo la enfermedad de CreutzfeldJakob, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, Kuru y el insomnio fatal familiar).

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Otras enfermedades incluidas dentro de la presente invención incluyen la demencia relacionada con la edad y otras demencias y enfermedades con pérdida de memoria incluyendo demencia vascular, enfermedad de materia blanca difusa (enfermedad de Binswanger), demencia de origen endocrino o metabólico, demencia por trauma en la cabeza y daño cerebral difuso, demencia pugilistica y demencia del lóbulo frontal. También lo están otros trastornos neurodegenerativos que son resultado de una isquemia o infarto cerebral incluyendo oclusión embólica y oclusión trombótica así como hemorragias intracraneales de cualquier tipo (incluyendo, sin limitación, epidural, subdural, subaracnoide e intracerebral) y lesiones intracraneales e intravertebrales (incluyendo, sin limitación, contusión, penetración, cizallamiento, compresión y laceración). Preferiblemente, el trastorno neurodegenerativo se selecciona entre la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, síndrome de Tourette, esclerosis lateral amiotrófica, pérdida de memoria relacionada con la edad, senilidad y demencia relacionada con la edad, más preferiblemente, el trastorno neurodegenerativo es la enfermedad de Alzheimer. Debido a que, más preferiblemente, el trastorno neurodegenerativo es la enfermedad de Alzheimer, también definida como amiloidosis, otras enfermedades dentro de la presente invención incluyen otras amiloidosis que comparten algunas características que incluyen, sin limitación, angiopatía cerebral hereditaria, amiloide hereditaria no neuropática, síndrome de Down, macroglobulinemia, fiebre mediterránea secundaria familiar, síndrome de MuckleWells, mieloma múltiple, amiloidosis pancreática y cardiaca, artropatía de hemodiálisis crónica y amiloidosis Finnish y de Iowa.

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Está incluido en la invención el uso de un compuesto que inhibe la unión de un péptido amiloide beta (preferiblemente Aβ1−42 ) a un nAChR alfa-7 (preferiblemente un nAChR alfa-7 humano) en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo en un sujeto (preferiblemente, un ser humano) en necesidad del mismo.

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Otra ilustración de la invención es el uso de un compuesto que inhibe la unión de un péptido amiloide beta (preferiblemente Aβ1−42 ) a un nAChR alfa-7 (preferiblemente un nAChR alfa-7 humano) en la preparación de un medicamento para: a) mejorar la memoria, b) interrumpir el progreso del deterioro mental observado en pacientes con la enfermedad de Alzheimer, c) tratar la demencia, d) prevenir la demencia en un paciente con Alzheimer y e) tratar y/o prevenir otras manifestaciones clínicas de la enfermedad de Alzheimer que incluyen, sin limitación, deficiencias cognitivas y del lenguaje, apraxias, depresión, delirios y otros síntomas y signos neuropsiquiátricos y el movimiento y anormalidades en la forma de andar de un paciente con Alzheimer.

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En otro aspecto de la invención es un compuesto de fórmula I: 50

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en la que R1 es hidrógeno o alquilo C1 -C4 ; R2 se selecciona entre hidrógeno, alquilo o arilo C1 -C6 o aralquilo C7 -C10 ; 65

R3 se selecciona entre hidrógeno, alquilo C1 -C6 , alquenilo C3 -C10 , cicloalquilo C3 -C8 alquilo C1 -C6 , heteroaril alquilo C1 -C4 , arilo sustituido o no sustituido o aralquilo C7 -C10 sustituido o no sustituido en el que el sustituyente del arilo o aralquilo son uno o más sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo compuesto por 3

ES 2 212 570 T3 halógeno, hidroxi, alquilo C1 -C6 y alcoxi C1 -C6 sustituido o no sustituido en el que los sustituyentes del alcoxi son uno o más sustituyentes seleccionados independientemente entre amino, alquilamino C1 -C6 , dialquilamino C1 -C6 , pirrolidinilo, piperidinilo, azepinilo o morfolino; o 5

R2 y R3 , junto con el nitrógeno al que están unidos, forman un anillo heterocíclico de cinco o seis miembros seleccionado entre pirrolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo o piperazinilo; R4 es alquilo C1 -C6 , arilo o aralquilo C7 -C10 ; y

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Cada uno de R5 y R6 se selecciona independientemente entre hidrógeno, alquilo C1 -C6 , alquenilo C3 -C10 , alquilcarbonilo C1 -C8 o difenilfosfinilo; y sales farmacéuticamente aceptables y profármacos del mismo.

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En los compuestos preferidos de fórmula I, R1 es hidrógeno; R2 se selecciona entre hidrógeno o alquilo C1 -C4 ;

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R3 se selecciona entre alquilo C1 -C4 , alquenilo C3 -C10 , cicloalquil C5 -C6 alquilo C1 -C4 , heteroaril-alquilo C1 -C4 , o aralquilo C7 -C10 sustituido o no sustituido, donde el sustituyente del aralquilo son uno o más sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo compuesto por halógeno, hidroxi, alquilo C1 -C4 y alcoxi C1 -C4 sustituido o no sustituido, donde los sustituyentes del alcoxi son uno o más sustituyentes seleccionados independientemente entre amino, alquilamino C1 -C4 , dialquilamino C1 -C4 , pirrolidinilo o piperidinilo; o R2 y R3 junto con el nitrógeno al que están unidos, forman un anillo morfolinilo; R4 es alquilo C1 -C4 ; y

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Cada uno de R5 y R6 se seleccionan independientemente entre alquilo C1 -C4 , alquenilo C3 -C6 , alquilcarbonilo C1 -C6 o difenilfosfinilo. En una subclase de compuestos de fórmula I con la fórmula 35

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en la que R1 es hidrógeno o alquilo C1 -C4 ; R2 y R3 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C1 -C6 arilo o aralquilo C7 -C10 ; y 50

R4 es alquilo C1 -C6 , arilo o aralquilo C7 -C10 ; y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

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Los compuestos de fórmula I son compuestos nuevos que bloquean la interacción del amiloide beta con nAChR alfa-7. Más específicamente, los compuestos de fórmula I inhiben la unión de Aβ1−42 con nAChR alfa-7 humanos por unión a Aβ1−42 . La orientación entre el átomo de nitrógeno y R4 en el anillo adecuado puede ser cis o trans. Preferiblemente, el compuesto es 5,8-dihidroxi-trans-2-di(N-propilamino)-3-metil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno y sales farmacéuticamente aceptables del mismo. Otros compuestos útiles en la presente invención inhiben la unión de Aβ1−42 con nAChR alfa-7 humanos por uniéndose directamente a nAChR alfa-7 humanos. Un ejemplo de tal compuesto que se une a nAChR alfa-7 humanos en la α-bungarotoxina. Descripción detallada de la invención La presente invención se refiere al tratamiento de trastornos neurodegenerativos inhibiendo la unión de péptidos de amiloide beta a nAChR alfa-7. Los trastornos neurodegenerativos incluidos dentro de la presente invención inclu4

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yen, sin limitación, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Pick, enfermedad difusa de cuerpos de Lewy, parálisis progresiva supernuclear (síndrome de Steel-Richardson), degeneración multisistema (síndrome de Shy-Drager), enfermedades de neuronas motoras incluyendo esclerosis lateral amiotrófica, ataxias degenerativas, degeneración cortical basal, complejo ALS-demencia de Parkinson de Guam, panencefalitis esclerosante subaguda, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, sinucleinopatías, afasia primaria progresiva, degeneración estriatonigral, enfermedad de Machado-Joseph/ataxia espinocerebral de tipo 3 y degeneraciones olivopontocerebelares, enfermedad de Gilles de la Tourette, parálisis bulbar y pseudobulbar, atrofia muscular espinal y espinobulbar (enfermedad de Kennedy), esclerosis primaria lateral, paraplejia espástica familiar, enfermedad de Werdnig-Hoffmann, enfermedad de KugelbergWelander, enfermedad de Tay-Sach, enfermedad de Sandhoff, enfermedad espástica familiar, enfermedad de WohlfartKugelberg-Welander, paraparesis espástica, leucoencefalopatía progresiva multifocal y enfermedades prión (incluyendo la enfermedad de Creutzfeld-Jakob, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, Kuru y el insomnio familiar grave). Otras enfermedades incluidas dentro de la presente invención incluyen la demencia relacionada con la edad y otras demencias y enfermedades con pérdida de memoria incluyendo demencia vascular, enfermedad de materia blanca difusa (enfermedad de Binswanger), demencia de origen endocrino o metabólico, demencia por trauma en la cabeza y daño cerebral difuso, demencia pugilistica y demencia del lóbulo frontal. También lo están otros trastornos neurodegenerativos que son resultado de una isquemia o infarto cerebral incluyendo oclusión embólica y oclusión trombótica así como hemorragias intracraneales de cualquier tipo (incluyendo, sin limitación, epidural, subdural, subaracnoide e intracerebral) y lesiones intracraneales e intravertebrales (incluyendo, sin limitación, contusión, penetración, cizallamiento, compresión y laceración). Preferiblemente, el trastorno neurodegenerativo se selecciona entre la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, síndrome de Tourette, esclerosis lateral amiotrófica, pérdida de memoria relacionada con la edad, senilidad y demencia relacionada con la edad, más preferiblemente, el trastorno neurodegenerativo es la enfermedad de Alzheimer. Debido a que, más preferiblemente, el trastorno neurodegenerativo es la enfermedad de Alzheimer, también definida como amiloidosis, otras enfermedades dentro de la presente invención incluyen otras amiloidosis que comparten algunas características que incluyen, sin limitación, angiopatía cerebral hereditaria, amiloide hereditaria no neuropática, síndrome de Down, macroglobulinemia, fiebre mediterránea secundaria familiar, síndrome de MuckleWells, mieloma múltiple, amiloidosis pancreática y cardiaca, artropatía de hemodiálisis crónica y amiloidosis Finnish y de Iowa. Los términos “amiloide beta” y “péptido de amiloide beta” o “beta-amiloide” como se usan en este documento, se refieren a péptidos de amiloide beta e incluyen los péptidos Aβ1−40 , Aβ1−42 y Aβ1−43 y sus fragmentos. Los ejemplos de fragmentos de péptidos de amiloides beta que han demostrado tener actividad biológica y son útiles en los métodos de la presente invención incluyen, sin limitación, el fragmento 1-28 y el fragmento 25-35 (por ejemplo, Yatin SM, Aksenov M, Butterfield DA. Neurochem. Res 1999 Mar; 24(3):427-35; Hirakura Y, Satoh Y, Hirashima N, Suzuki T, Kagan BL, Kirino Y. Biochem Mol Biol Int 1998 Nov;46(4):787-94; Mazziotti M, Perimutter DH. Biochem J 1998 Jun 1:332 (Pt 2):517-24; Perivc S. Bohm M, Meesters E, Meihardt A. Pergande G. Muller, EW. Mech Ageing Dev 1998 Mar 16;101(1-2):1-19; Muller WE. Eckert GP. Scheuer K. Cairns NJ. Maras A. Gattaz WF. Amyloid 1998 Mar;5 (1):10-5; Butterfield DA, Martin L. Carney JM, Hensley K. Life Sci 1996;58(3):217-28; Forloni G, Lucca E, Angeretti N, Della Torre P, Salmona M. J Neurochem 1997 Nov;69(5):2048-54; Heese K, Hock C, Otten U. J Neurochem 1998 Feb;70(2)699-707; Blanchard BJ. Konopka G, Russell M, Ingram VM. Brain Res 1997 Nov 21;776(1-2):40-50: Wu A, Derrico CA, Hatem L, Colvin RA. Neuroscience 1997 Oct; 80(3):675-84; Muller WE, Romero FJ, Perovic S, Pergande G, Pialoglou P. J Neurochem 1997 Jun;68(6):2371-7; Suh YH. J Neurochem 1997 May;68(5):1781-91; Parpura-Gill A, Beitz D, Uemura E. Brain Res 1997 Apr 18;754(1-2):65-71; Fletcher TG, Keire DA. Protein Sci 1997 Mar;6(3):666-75; Scorziello A, Meucci O, Calvani M, Schettini G. Neurochem Res 1997 Mar;22(3):257-64); MiguelHidalgo JJ, Vecino B, Fernandez-Novoa K, Alvarez A, Cacabelos R. Eur Neuropsychopharmacol 1998 Aug;8(3):2038;Maneiro E, Lombardi VR, Lagares R, Cacabelos R. Methods Find Exp Clin Pharmacol 1997 Jan-Feb;19(1):5-12).

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El término “sujeto” como se usa en este documento, se refiere a un animal, preferiblemente a mamífero, más preferiblemente a un ser humano, que ha sido objeto del tratamiento, observación o experimento. 55

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El término “cantidad terapéuticamente eficaz” como se usa en este documento, significa aquella cantidad de un compuesto activo o agente farmacéutico que provoca una respuesta biológica o medicinal en un sistema de tejido, animal o humano, que busca el investigador, veterinario, médico u otro clínico, que incluye la mejora de los síntomas de la enfermedad o del trastorno que se está tratando. El término “alquilo” significará alcanos de cadena lineal o ramificada de uno a diez átomos de carbono, o cualquier número dentro de este intervalo. Por ejemplo, los radicales alquilo incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo, n-pentilo, 3-(2-metil)butilo, 2-pentilo, 2-metilbutilo, neopentilo, n-hexilo, 2hexilo y 2-metilpentilo. Los radicales alcoxi son éteres de oxígeno formados con los grupos alquilo de cadena lineal o ramificada descritos previamente. Los grupos cicloalquilo contienen de 3 a 8 carbonos en anillo y preferiblemente de 5 a 7 carbonos. De forma similar, los grupos alquenilo y alquinilo incluyen alquenos y alquinos de cadena lineal y ramificada que tienen de 2 a 10 átomos de carbono, o cualquier número dentro de este intervalo. El término “arilo” indica grupos aromáticos tales como fenilo y naftilo. 5

ES 2 212 570 T3 El término “aralquilo C7 -C10 ” significa un grupo alquilo sustituido con un grupo arilo en el que la cantidad total de átomos de carbono está entre 7 y 10 (por ejemplo, bencilo, feniletilo, fenilpropilo). 5

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El término “heteroarilo” como se usa en este documento representa un sistema de anillo aromático monocíclico estable de cinco o seis miembros sustituido o no sustituido o un sistema de anillo heteroaromático condensado con benceno de nueve o diez miembros sustituido o no sustituido o un sistema de anillo heteroaromático bicíclico que consta de átomos de carbono y de uno a cuatro heteroátomos seleccionados entre N, O o S, y en el que los heteroátomos de nitrógeno o azufre pueden estar opcionalmente oxidados el heteroátomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado. El grupo heteroarilo puede estar unido a cualquier heteroátomo o átomo de carbono que tenga como resultado la creación de una estructura estable. Los ejemplos de grupos heteroarilo incluyen, sin limitación, piridilo, piridazinilo, tienilo, furanilo, imidazolilo, isoxazolilo, oxazolilo, pirazolilo, pirrolilo, tiazolilo, tiadiazolilo, triazolilo, bencimidazolilo, benzofuranilo, benzotienilo, bencisoxazolilo, benzoxazolilo, benzopirazolilo, indolilo, benzotiazolilo, benzotiadiazolilo, benzotriazolilo, adeninilo o quinolinilo. Los grupos heteroarilo preferidos incluyen piridilo, pirrolilo, pirazinilo, tiadiazolilo, pirazolilo, tienilo, triazolilo y quinolinilo.

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El término “N(CH2 )5 ” significa un grupo piperidinilo. El término “C6 H11 ” significa un grupo ciclohexilo. 20

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Cuando un grupo particular esta “sustituido” (por ejemplo, arilo, aralquilo), ese grupo puede tener uno o más sustituyentes, preferiblemente de uno a cinco sustituyentes, más preferiblemente de uno a tres sustituyentes, más preferiblemente de uno a dos sustituyentes, seleccionados independientemente entre la lista de sustituyentes. Con la nomenclatura convencional utilizada en esta memoria descriptiva, se describe primero la porción terminal de la cadena lateral designada, seguida de la funcionalidad adyacente en dirección al punto de unión. De esta forma, por ejemplo, un sustituyente “fenil alquilamido C1 -C6 alquilo C1 -C6 ” se refiere a un grupo de fórmula

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Los compuestos que son útiles en la presente invención para inhibir la reacción de Aβ1−40 y Aβ1−42 con el subtipo alfa-7 de nAChR con el propósito de una intervención terapéutica directa o para selecciona compuestos que actúan mediante este mecanismo incluyen compuestos de fórmula I, especialmente 5,8-dihidroxi-trans-2-di(N-propilamino)3-metil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno (Compuesto 9), (-)-nicotina, (rac)-epibatidina, α-bungarotoxina y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Ciertos fragmentos de péptidos de los nAChR alfa-7 humanos se unen al amiloide beta y se pueden usar en lugar del nAChR alfa-7 junto con el amiloide beta con el propósito de buscar en bibliotecas para encontrar compuestos que bloquean la interacción del amiloide beta y el nAChR alfa-7 humano. Entre estos fragmentos de péptidos del nAChR alfa-7 humano están el nAChR193-224 alfa-7 y otros péptidos más pequeños derivados del mismo, como se muestra en la Tabla.

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TABLA Compuesto

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Mejora de la inhibición de ACh mediada por Aβ1−42 Liberación en los sinaptosomas corticales de la rata (%) nAChR193-224 alfa-7 humano 81% a 10 µM 79% a 1 µM Ac-NGEWDLVGIPGKRSERFYECCKEPYPDVTFTV-NH2 nAChR200-214 alfa-7 humano 79% a 10 µM 71% a 1 µM Ac-GIPGKRSERFYECCK-NH2 nAChR206-216 alfa-7 humano 81% a 10 µM 77% a 1 µM Ac-SERFYECCKEP-NH2 nAChR206-216 alfa-7 humano oxidado (cíclico) CC: 84% a 10 µM 82% a 1 µM Ac-SERFYECCKEP-NH2 nAChR206-216 alfa-7 humano 22% a 10 µM 10% a 1 µM

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ES 2 212 570 T3 TABLA (continuación) Compuesto 5

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Mejora de la inhibición de ACh mediada por Aβ1−42 Liberación en los sinaptosomas corticales de la rata (%)

SERFYECCKEP nAChR210-213 alfa-7 humano Ac-YECC-NH2

72% a 10 µM 59% a 1 µM

Se ha empleado el código convencional de una letra para los aminoácidos de los compuestos. Este código se describe en Lehninger, A.I. “Biochemistry” Second Edition, Worth Publishers, Inc., New York, 1976, pág. 73-75. Para el uso en la medicina, las sales de los compuestos de esta invención se refieren a “sales farmacéuticamente aceptables” no tóxicas. Sin embargo, otras sales pueden ser útiles en la preparación de compuestos de acuerdo con esta invención o de sus sales farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables apropiadas de los compuestos de esta invención incluyen sales de adición ácida que se pueden formar, por ejemplo, mezclando una solución del compuesto con una solución de un ácido farmacéuticamente aceptable tal como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido acético, ácido benzoico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido carbónico o ácido fosfórico. Además, si los compuestos de la invención tienen un resto ácido, las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos incluyen sales de metales alcalinos, por ejemplo sales de sodio o potasio; sales de metales alcalinotérreos, por ejemplo, sales de calcio o magnesio y sales formadas con ligandos orgánicos adecuados, por ejemplo sales de amoniaco cuaternario. La presente invención incluye dentro de su alcance los profármacos de los compuestos de esta invención. Un profármaco es inactivo cuando se administra, pero se vuelve activo in vivo. El profármaco se transforma en el fármaco padre químicamente o mediante enzima(s) específica(s). Higuchi, T.; Stella, V., Eds. “Pro-Drugs as Novel Drug Delivery Systems”; American Chemical Society; Washington, DC. 1976. En general, tales profármacos serán derivados funcionales de los compuestos que se pueden transformar in vivo fácilmente en el compuesto requerido. De esta forma, en los métodos de la presente invención, el término “administrar” abarcará el tratamiento de los distintos trastornos descritos con el compuesto descrito específicamente o con un compuesto que puede no describirse específicamente, pero que se transforma in vivo en el compuesto especificado después de su administración al paciente. Los procedimientos convencionales para la selección y preparación de derivados de profármacos adecuados se describen, por ejemplo, en “Design of Prodrugs”, ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985. Si los compuestos de acuerdo con esta invención, tienen al menos un centro quiral, pueden existir consecuentemente en forma de enantiómeros. Si el compuesto tiene dos o más centros quirales, pueden existir además en forma de diastereómeros. Debe apreciarse que todos los isómeros y mezclas de los mismos están abarcados dentro del alcance de la presente invención. Además, algunas de las formas cristalinas de los compuestos pueden existir en forma de polimorfos, y se pretende que estén incluidos como tales en la presente invención. Además, algunos de los compuestos pueden formar solvatos con agua (es decir, hidratos) o disolventes orgánicos convencionales, y también se pretende que dichos solvatos estén abarcados dentro del alcance de esta invención. La (-)-nicotina es (-)-1-metil-2-(3-piridinil)pirrolidina y está disponible fácilmente en Sigma Chemical Company.

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La (+/-)Epibatidina es exo-(+/-)-2-(6-cloro-3-piridinil)-7- azabiciclo[2.2.1]heptano y está disponible fácilmente en Sigma Chemical Company. 60

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ES 2 212 570 T3 La α-bungarotoxina es un péptido de 74 aminoácidos que está disponible en el mercado en Research Biochemicals Inc. La α-bungarotoxina y su secuencia de aminoácidos se describe en Lee, C.Y. Annu. Rev. Pharmacol. 1972, 12, 265-281. 5

125 I-Aβ1−40 , fluo-Aβ1−40 y los anticuerpos nAChR anti-alfa-7 están disponibles en el mercado en Amersham Pharmacia Biotech, Advanced Bioconcepts y Research Biochemicals International, respectivamente.

La 125 I-α-α-bungarotoxina está disponible comercialmente en Amersham Pharmacia Biotech. 10

El compuesto se puede administrar a un paciente que sufre un trastorno neurodegenerativo por cualquiera vía convencional de administración incluyendo, sin limitación, intravenosa, oral, subcutánea, intramuscular, intradérmica, bucal, intracerebral y otras rutas parenterales. La cantidad de compuesto que es eficaz para tratar un trastorno neurodegenerativo está entre 0,01 mg por kg y 10 mg por kg de peso corporal del sujeto.

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El tratamiento de los trastornos neurodegenerativos descrito se puede realizar usando una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los compuestos definidos en este documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede contener entre 0,5 mg y 200 mg de compuesto, y puede constituirse en cualquier forma adecuada para el modo de administración seleccionado. Los vehículos incluyen excipientes farmacéuticos inertes y necesarios incluyendo, sin limitación, aglutinantes, agentes de suspensión, lubricantes, aromatizantes, endulcorantes, conservantes, tintes y recubrimientos. Las composiciones adecuadas para la administración oral incluyen formas sólidas, tales como píldoras, cápsulas, gránulos, comprimidos, caplets y polvos, y formas líquidas tales como soluciones, siropes, elixires y suspensiones. Las formas útiles para la administración intracerebral y para otras vías de administración parenteral incluyen soluciones, emulsiones y suspensiones estériles.

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Los especialistas en la técnica pueden determinar fácilmente las dosificaciones óptimas a administrar y variarán con el compuesto particular usado, la forma de administración, la potencia de la preparación y el estado de la enfermedad. Además, los factores asociados con el paciente en particular que se esté tratando, incluyendo la edad del paciente, el peso, la alimentación, la actividad física y el tiempo de administración, y las co-morbididades asociadas y las enfermedades clínicas darán como resultado en la necesidad de ajustar las dosificaciones.

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La presente invención también proporciona herramientas de diagnóstico útiles para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer. La enfermedad de Alzheimer (AD) muestra anomalías neuropatológicas en el sistema olfativo localizado en la cavidad nasal. Éstas incluyen la presencia de neuritos distróficos que muestran inmunoreactividad a la proteína tau, neurofilamentos, apolipoproteína E y otras proteínas, proteína tau anormal, aumento de la superóxido dismutasa y deposición de amiloide beta en las células sensoriales primarias (receptores olfativos) y en las fibras nerviosas del tejido de la mucosa nasal (Arnold et al., Ann N Y Acad Sci 1998 Nov 30;955:762-75; Hock et al., Eur Neurol 1998 Jul;40(1):31-6; Johnson et al., Neurobiol Aging 1994 Nov-Dec;15(6):675-70; Kulkarni-Narla et al., Exp Neurol 1996 Aug;140(2):115-25; Lee et al., Exp Neurol 1993 May;121(1):93-105; Tabato et al., Neurology 1991 Mar;41(3):3914; Talamo et al., Ann N Y Acad Sci 1991;640:1-7; Yamagishi et al., Ann Otol Rhinol Laryngol 1998 May; 107 (5 Pt 1):421-6; Yamagishi et al., Ann Nippon Jibiinkoka Gakkai Kaiho 1994 Jan;97(1):51-60). Estas observaciones recapitulan el perfil neurológico y las anomalías neurodegenerativas (por ejemplo, cambios en el citoesqueleto, inmunoreactividad a proteínas y deposición de amiloide beta) observadas en los sistemas nerviosos centrales de pacientes con AD. El acceso a estas neuronas y fibras sensoriales se puede realizar con biopsias nasales en pacientes con AD (por ejemplo, Feron et al., Arch. Otolaryngol Head Neck Surg 1998 Aug;123(8):861-6).

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Los neuroblastos olfativos (neuronas olfativas obtenidas mediante biopsia e introducidas en cultivo de células primarias) de pacientes AD producen fragmentos carboxi terminales de la proteína precursora del amiloide (APP) que contienen amiloide beta (A-beta) (Crino et al., Ann Otol Rhinol Laryngol 1995 Aug;104(8):655-61. Crino et al. mostró el marcaje de A-beta en el tercio nasal del neuroepitelio olfativo y en los axones con proyección a través de la lámina propia de pacientes AD. La pigmentación con Tioflavina-S que detecta la deposición de amiloide se observó también en el tercio basal del neuroepitelio olfativo en pacientes de AD. Los receptores alfa-7 nicotínicos de la acetilcolina están presentes en las neuronas olfativas induciendo probablemente células olfativas receptoras en la cavidad nasal (Alkondon et al., Neurosci Lett 1994 Aug 1;176(2):152-6; Alkondon et al., Eur J Neurosci 1997 Dec:9(12):2734-42; Bouvet et al., Neurosci Res 1988 Feb;5(3):214-23; Edwards et al., Experientia 1987 Aug 15;43(8):868-73; Edwards et al., Experientia 1988 Mar 15;44(3):208-11; Seguela et al. J Neurosci 1993 Feb;13(2):596-604). El péptido amiloide beta aumenta el Ca2+ no citosólico en los linfoblastos AD. (Ibarreta et al., Alzheimer Dis Assoc Disord 1997 Dec; 11(4):220-7 y aumenta las respuestas de Ca2+ inducidas con mitógeno en linfocitos humanos preparados recientemente (Eckert et al., Life Sci 1994;55(25-26):2019-29. La proteína precursora del amiloide (APP) se puede inducir en la superficie celular de linfocitos humanos mediante estimulación (Bullido et al., Biochim Biophys Acta 1996 Aug 21;1313(1):54-62) y aumentó las ocurrencias de la isoforma APP-770 en pacientes con AD (Ebstein et al., Brain Res Mol Brain Res 1996 Jan; 35(1-2):260-8). Las células linfoblastoides de pacientes con AD familiar de aparición pronta y tardía muestran una mayor expresión de ARNm de beta-APP y proteína (Matsumoto et al., Eur J Biochem 1993 Oct 1;217(1):21-7). Los linfocitos de pacientes con AD también muestran un mayor nivel de ARNm del receptor nicotínico alfa-7 (Hellstrom Lindahl et al., Brain Res Mol Brain Res 1999 Mar 20;66(1-2):94-103). Basándose en información descrita anteriormente, se propone que el análisis de la interacción receptor nicotínico alfa 7 de la acetilcolina-péptidos amiloide beta en las células de la sangre en circulación y en neuronas olfativas 8

ES 2 212 570 T3 neuroepiteliales/procesos neuronales de los neuroblastos obtenidos de pacientes con AD se podría usar como herramientas de diagnóstico de AD, marcajes de la progresión de AD y prognosis y marcajes de la eficacia terapéutica para cualquier intervención o tratamiento que tenga como objetivo la AD. 5

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De esta forma, la presente invención proporciona métodos para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer, controlar el progreso y la prognosis de la enfermedad de Alzheimer y/o controlar la eficacia terapéutica de cualquier intervención o tratamiento de la enfermedad de Alzheimer como se define en la reivindicación 9. Los compuestos de fórmula I, tales como 5,8-dihidroxi-trans-2-di(N-propilamino)-3-metil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno (Compuesto 9), se preparan de acuerdo con los procedimientos descritos en los Esquemas y Ejemplos que se proporcionan a continuación. Las abreviaciones usadas en la presente memoria descriptiva, y en particular en los Esquemas y Ejemplos, son las siguientes

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Ac Ach AcOH BSA DMF DMSO Et3 N EtOAc FCS i-Pr Me Mel nAChR pH PCC TEA THF TLC

= = = = = = = = = = = = = = = = = =

acetilo acetilcolina ácido acético albúmina de suero bovino N,N-dimetilformamida dimetilsulfóxido trietilamina acetato de etilo suero de ternera fetal isopropilo metilo yoduro de metilo receptor nicotínico de la acetilcolina fenilo clorocromato de piridinio trietilamina tetrahidrofurano cromatografía de capa fina Esquema 1

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ES 2 212 570 T3

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Los compuestos de la invención se pueden preparar como se muestra en el Esquema 1. Primero se realiza una reacción de Diels-Alder en benzofenona (1) con un dieno apropiado tal como isopreno para dar una diona tal como (2). Después, la isomerización catalizada con base de (2) produce un compuesto 1,4-dihidroxifenilo (3), que se transforma en éter de dimetilo (4). La hidroboración seguida de oxidación da un alcohol (5), que se oxida posteriormente para dar cetona (6). La aminación reductora con una amina tal como propilamina se realiza usando un agente reductor hidruro apropiado tal como cianoborohidruro sódico, para dar, por ejemplo, el compuesto 7. Después, este material se puede someter a una reacción de aminación reductora tal por ejemplo con propionaldehído para producir (8). Después, el compuesto (8) se trata con HBr en ácido acético para escindir los éteres metílicos y formar el compuesto dihidroxi (9). Alternativamente, se puede usar BBr3 para escindir los éteres metílicos y formar el compuesto dihidroxi (9). Además, se puede usar poco BBr3 para proporcionar compuestos en los que sólo se ha retirado uno de los éteres metílicos para producir compuestos con un hidroxi y un grupo metoxi. Esquema 2

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En el Esquema 2 se ilustra otra forma más de preparar compuestos de la presente invención. Se deshidrata un alcohol propargílico adecuado, tal como 3-hidroxi-3metil-1-butino (10, R4 = Me), para dar una enina tal como el compuesto 11. Después, este material se somete a una reacción de aminomercuración para producir un 2-amino-1,4butadieno tal como el compuesto (12). La reacción de Diels-Alder del compuesto (12) con la benfenona (11) da (13) que se puede isomerizar como en el Esquema 1 con una base para dar el compuesto 1,5-dihidroxi (14). La reducción catalítica del enlace doble de (14) con hidrógeno y paladio en carbono, tal como paladio al 10% en carbono, produce compuestos de la invención tales como (15). Los compuestos de tipo 9 se pueden tratar con una base tal como trietilamina en un disolvente adecuado tal como dioxano o cloruro de metileno junto con electrófilos tales como haluros de ácido, haluros fosfinilo o haluros de alquilo para dar los productos de sustitución de uno o ambos hidroxilos fenólicos. Tales compuestos pueden ser activos por sí mismos o servir como profármacos para un compuesto 9. 10

ES 2 212 570 T3 Los siguientes Ejemplos se describen para ayudar en la comprensión de la invención y no pretenden limitar en forma alguna la invención descrita en las reivindicaciones que se proporcionan a continuación de los mismos. Ejemplo 1 5

Preparación de 5,7-dihidroxi-trans-2-di(N-propilamino)-3-metil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno (9) a. 5,8-dihidroxi-2-metil-1,4-dihidronaftaleno (3) 10

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A una solución de p-benzoquinona (10,00 g, 92,5 mmol) en una solución 1 M de perclorato de litio, en nitrometano (300 ml) se le añadió isopreno (9,24 ml, 92, 3 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno durante 4 horas. La mezcla de reacción se dividió entre EtOAc (500 ml) y agua (200 ml). La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato sódico y se concentró para dar 2 en forma de sólido pardo. La reacción se repitió con 15 g de benzoquinona para producir más 2. Estos dos ensayos se combinaron y se usaron sin purificación adicional. A una solución de 2 (35,00 g, 199 mmol) en cloruro de metileno (400 ml) se le añadió trietilamina (40 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El producto se precipitó con la adición de hexano (300 ml). El sólido se recogió por filtración y se secó en un desecador al vacío durante una noche para proporcionar 3 en forma de sólido pardo claro. H RMN (300 MHz, DMSO-d6 ): δ 1,75 (2, 3H), 3,00-3,01 (m, 2H), 3,09 (s, 2H), 5,53 (s, 1H), 6,43 (s, 2H), 8,498,52 (m, 2H). 1

b. 5,8-dimetoxi-2-metil-1,4-dihidronaftaleno (4) 25

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A una solución fría (-78ºC) de hidroquinona 3 (17,00 g, 96,6 mmol) en DMF en una atmósfera de nitrógeno se le añadió hidruro sódico no lavado al 60% en aceite mineral (8, 90 g, 222,5 mmol). La mezcla de reacción resultante se calentó a temperatura ambiente durante un periodo de 30 minutos y se trató posteriormente con yoduro de metilo (14,3 ml, 230 mmol). Después de agitar la mezcla de reacción durante 1 hora a temperatura ambiente la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (1,5 l) y se lavó con salmuera (3 x 500 ml). La solución orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró, se concentró y el residuo se purificó en gel de sílice (elución con acetato de etilo al 20%) para producir 4 en forma de aceite amarillo claro que solidificó después de dejar en reposo. H RMN (300 MHz, CD3 OD): δ 1,77 (s, CH3 ), 3,07-3,09 (m, 2H), 3,16 (s a, 2H), 3,73 (s, 3H), 3,75 (s, 3H), 5,525,53 (m, 1H), 6,65 (s, 2H). 1

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c. 5,8-dimetoxi-trans-2-hidroxi-3-metil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno (5)

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Una solución de 4 (5,00 g, 24,5 mmol) en tetrahidrofurano (100 ml) se enfrió a 0ºC y se trató con un complejo de borano 1M-tetrahidrofurano (24,5 ml, 24,5 mmol) y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Después se añadieron lentamente 12 ml de una solución de NaOH 3N a la reacción en agitación seguido de la adición de 6 ml de peróxido de hidrógeno acuoso al 6%. Después de agitar durante 30 minutos, la mezcla resultante se diluyó con 500 ml de acetato de etilo y se lavó con salmuera (2 x 100 ml). La capa orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró y el residuo se purificó en gel de sílice (acetato de etilo al 30%/hexano) para dar 5 en forma de sólido blanco. H RMN (300 MHz, CDCl3 ): δ 1,13 (d, 3H, J = 6,51 Hz), 1,60 (d, 1H), 1,75-1,90 (m,1 H), 2,26 (dd, 1H; J = 10,0 Hz, 17,57 Hz), 2,48 (dd, 1H, J = 8,93 Hz, 17,10 Hz), 2,96 (dd, 1H, J = 5,31, 17,7 Hz), 3,16 (dd, 1H, J = 5,33, 5,35 Hz), 3,63-3,69 (m, 1H), 3,78 (s, 6H), 6,62 (s, 2H). 1

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d. 5,8-dimetoxi-3-metil-2-tetralona (6)

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Una solución de alcohol 5 (10 g, 45 mmol) y diclorometano (200 ml) a -30ºC se trató gota a gota con cloruro de oxalilo (4,92 g, 0,275 mmol). La reacción se agitó a -30ºC durante 30 minutos, se enfrió a -60ºC y se añadió lentamente DMSO (6,4 ml) durante 15 minutos. La reacción se agitó durante una hora, se enfrió a -78ºC durante 30 minutos y después se trató gota a gota con trietilamina (40 ml). La reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 1 hora, seguido de la adición de agua y diclorometano mezclando minuciosamente. La capa orgánica se separó, se secó con MgSO4 , se filtró y el disolvente se evaporó hasta un aceite. La purificación de este material usando cromatografía ultrarrápida (sílice ultrarrápido, 70:30 hexano/EtOAc) produjo 6 en forma de sólido blanco cristalino.

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H RMN (300 MHz, CDCl3 ): δ 6,7 (q, 2H), 3,78 (s, 3H), 3,75 (s, 3H), 3,5 (dd, 2H), 3,3 (m, 1H), 2,55 (m, 2H), 1,2 (d, 3H). 1

e. 5,8-dimetoxi-2-N-propilamino-3-metil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno (7) 65

A una solución de 6 (0,15 g, 0,68 mmol) en acetonitrilo (10 ml) se le añadió cianoborohidruro sódico (0,085 g, 1,30 mmol), 0,05 ml de ácido acético y N-propilamina (0,08 ml, 1,3 mmol). La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante una noche y se vertió en 10 ml de solución de NaOH 1N. La mezcla se extrajo con EtOAc, se secó 11

ES 2 212 570 T3 sobre sulfato sódico, se concentró y el residuo se purificó por TLC preparativa (elución con acetato de etilo al 30% en hexano) para dar la amina 7 en forma de aceite incoloro. H RMN (300 MHz, CD3 OD): δ 0,85 (d, 3H, J = 7,07 Hz), 0,93-0,97 (m, 3H), 1,09 (t, 2H), 1,49-1,61 (m, 2H), 2,12-2,42 (m, 2H), 2,51-2,76 (m, 4H), 2,82-3,08 (m, 2H), 3,73 (s, 3H), 3,74 (s, 3H), 6,65 (s, 2H). 1

5

f. 5,8-dimetoxi-trans-2-di(N-propilamino)-3-metil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno (8) 10

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A una solución de 7 (0,11 g, 0,42 mmol) en acetonitrilo (10 ml) se le añadió cianoborohidruro sódico (0,05 g, 0,6 mmol), 0,03 ml de ácido acético y propionaldehído (0,045 ml, 0,60 mmol). La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante una noche y se vertió en 10 ml de solución de NaOH 1N. La mezcla se extrajo con EtOAc, se secó sobre sulfato sódico, se concentró y el residuo se purificó por TLC preparativa (elución con acetato de etilo al 30% en hexano) para dar la amina 7 en forma de aceite incoloro. H RMN (300 MHz, CD3 OD): δ 0,84 (d, 3H, J = 6,94 Hz), 0,92 (t, 2H, J = 7,30-7,32 Hz), 1,27-1,59 (m, 4H), 2,332,42 (m, 2H), 2,54-3,02 (m, 8H), 3,73 (s, 3H), 3,76 (s, 3H), 6,66 (s, 2H). 1

Los compuestos 19, 21, 25, 27, 29, 35, 37, 39, 41, 52 y 54 se prepararon de forma similar. 20

25

Para separar los enantiómeros de 8, se pasaron 2,869 g de 8 a través de una columna cromatográfica líquida de alta presión CHIRALPAK®AD™ basada en celulosa quiral (8 cm x 30 cm) a 25ºC usando hexano/alcohol isopropílico (99/1) como eluyente para dar dos partes en forma de aceites. La parte 1 (18) tenía un exceso enantiomérico 98,6% (e.e.) y la parte 2 (17) tenia un e.e. de 97,7%. La parte 1 (0,306 g, 1,0 mmol) con ácido fumárico se disolvió en etanol (2 ml) con calentamiento. El etanol se evaporó y el residuo se trituró con éter dietílico produciendo la sal fumarato de 18 en forma de sólido blanco. La sal fumarato de 17 se obtuvo de forma similar con la parte 2 (0,301 g, 1,0 mmol) y ácido fumárico (0,141 g, 1,2 mmol). g. 5,8-dihidroxi-trans-2-di(N-propilamino)-3-metil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno (9)

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Una mezcla de 8 (1,4 g, 4,6 mmol) y 3,5 ml de HBr acuoso al 48% en ácido acético (3,5 ml) se agitó a 100ºC en una atmósfera de nitrógeno durante una noche. Después, la mezcla de reacción se enfrió a 0ºC y se extrajo con éter dietílico (20 ml). La solución orgánica se neutralizó con NaHCO3 acuoso y se separó. La capa acuosa se extrajo con éter (20 ml) y las soluciones combinadas de éter se secaron sobre Na2 SO4 , se filtraron y se concentraron para dar 9. H RMN (600 MHz, CDCl3 ): δ 0,86-0,92 (dt, 6H), 1,13 (d, 3H, J = 6,42 Hz), 1,42-1,50 (m, 4H), 1,88-1,93 (m, 1H), 2,23-2,28 (m, 1H), 2,39-2,52 (m, 6H), 2,61-2,63 (m, 1H), 2,90 (dd, 1H, J = 4,75, 16,28 Hz), 2,95 (dd, 1H, J = 5,05, 16,75 Hz), 4,84 (s a, 2H), 6,50 (dd, 2H, J = 8,52 Hz). Cl-MS: m/e MH+ 278 (40%). 1

De forma similar, 17 y 18 se transformaron en 15 y 16. Adicionalmente, la desmetilación de los éteres metílicos apropiados por el procedimiento descrito en este documento condujo a la preparación de los compuestos 20, 22, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 40, 42, 53 y 55. En el transcurso de la desmetilación de 37, también se retiró el éter butílico para obtener 38. Ejemplo 2

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Preparación de 5,8-dihidroxi-cis-2-(1-morfolinil)-3-metil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno (24) a. 5,8-dimetoxi-cis-2-(1-morfolinil)-3-metil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno (23) 50

55

La cetona 6 (0,299 g, 1,36 mmol) se disolvió en tolueno (1 ml) seguido de la adición de morfolina (0,130 g, 0,13 ml, 1,5 mmol) y Ti(i-PrO4 ) (0,611 g, 0,64 ml, 2,15 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 15 horas a temperatura ambiente. Se añadió metanol (2 ml) seguido de la adición por porciones de NaBH4 (0,15 g, 3m9 mmol) durante 1 hora. Se añadieron diclorometano y NaOH 1 N mezclando minuciosamente y la capa orgánica se separó, se secó con MgSO4 , se filtró y se evaporó a un aceite. La purificación de este material usando cromatografía ultrarrápida (sílice ultrarrápido, 75/25 hexano/EtOAc) produjo el producto 23. H RMN (300 MHz, DMSO-d6 ) δ 6,6 (s, 2H), 3,6 (d, 6H), 3,5 (s, 4H), 3,2 (s, 4H), 3,2 (s, 6H), 2,8 (d, 1H), 2,7 (d, 1H), 2,3 (m,2H), 2,05 (m, 2H), 0,6 (d, 3H). 1

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b. 5,8-dihidroxi-cis-2-(1-morfolinil)-3-metil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno (24) Una solución de 23 (20 mg, 0,066 mmol) y diclorometano (2 ml) a -78ºC se trató con una solución 1M de BBr3 en diclorometano (1 ml, 1 mmol) y se agitó durante 1 hora a -78ºC. Después de calentar a temperatura ambiente, se añadió metanol (5 ml) y se evaporaron los disolventes. Se realzó dos veces una adición de metanol al residuo seguido de evaporación. El residuo se disolvió en acetonitrilo (25 ml) y se trató con trietilamina (2 ml). Después de agitar durante 2 horas, se añadieron agua y acetato ed etilo mezclando minuciosamente. La capa orgánica se separó, se secó con MgSO4 , se filtró y el disolvente se evaporó para producir 24 en forma de aceite. 12

ES 2 212 570 T3 1 H RMN (300 MHz, CD3 OD) δ 6,7 (s, 2H), 3,4 (m, 4H), 3,3 (m, 1H), 2,6 (m, 5H), 1,9 (m, 1H), 1,5 (m, 2H), 1,05 (d, 3H), 0,9 (m, 3H).

Ejemplo 3 5

Preparación de 5,8-dimetoxi-cis y trans-2-(N-propil-N-propargil)amino-3-metil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno (31 y 33)

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La cetona 6 (1 g, 4,5 mmol) se disolvió en acetonitrilo (75 ml) seguido de la adición de ácido acético (0,54 ml, 9 mmol, 2 eq.) y propargilamina (0,6 ml, 9 mmol, 2 eq.). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió cianoborohidruro sódico (0,6 g, 9 mmol, 2 eq.) en porciones (3x) durante 1,5 horas (cada 30 minutos) y la mezcla de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. Se añadió acetato de etilo y NaOH 1N mezclando minuciosamente y la capa orgánica se separó, se secó con MgSO4 , se filtró y se evaporó a un aceite. El producto se purificó con cromatografía ultrarrápida (50:50 acetato de etilo/hexano) para producir un aceite de 5,8-dimetoxi-cis y trans-2-N-(propargil)amino-3-metil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno (1,2 g, 100%). Este material se disolvió en acetonitrilo junto con propionaldehído (0,65 g, 9 mmol, 2 eq.) y ácido acético (0,5 ml, 9 mmol) y se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. Una hora después, se añadió cianoborohidruro sódico (0,6 g, 9 mmol, 2 eq.) en porciones (3x) durante 1,5 horas (cada 30 minutos). La mezcla de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. Se añadió acetato de etilo y NaOH 1N mezclando minuciosamente y la capa orgánica se separó, se secó con MgSO4 , se filtró y se evaporó a una mezcla de productos 31 y 33. La purificación de este material por cromatografía ultrarrápida (sílice ultrarrápido, 80:20/hexano:éter) produjo los productos 31 y 33. Compuesto 31: 1 H RMN (300 MHz, CDCl3 ) δ 6,6 (s, 2H9, 3,8 (s, 6H), 3,4 (q, 2H), 3,0 (dd, 2H), 2,6 (m, 4H), 2,2 (m, 2H), 1,85 (m, 1H), 1,5 (m, 2H), 1,1 (d, 3H), 0,9 (t, 3H). Compuesto 33: 1 H RMN (300 MHz, CDCl3 ) δ 6,6 (s, 2H), 3,78 (s, 3H), 3,75 (s, 3H), 3,6 (q, 2H), 3,05 (dd, 1H), 2,75 (m, 2H9, 2,61 (m, 3H9, 2,3 (m, 2H), 2,1 (s, 1H), 1,55 (m, 2H), 0,9 (t, 3H), 0,8 (d, 3H). Ejemplo 4

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Preparación de 5-[2-(3-metil)butenil]-8-hidroxi-trans-2-di(N-propilamino)-3-metil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno (43); y 5-hidroxi-8-[2-(3-metil)butenil]-trans-2-di(N-propilamino)-3-metil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno (44) El diol 9 (0,3 g, 1,2 mmol) se disolvió en acetona (40 ml) seguido de la adición de carbonato de potasio (0,19 g) y 1bromo-3-metil-2-buteno (0,1 ml, 0,87 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 48 horas a temperatura ambiente. Se añadieron diclorometano y agua mezclando minuciosamente y la capa orgánica se separó, se secó con MgSO4 , se filtró y el disolvente se evaporó para producir un aceite. La purificación de este material por cromatografía ultrarrápida (sílice ultrarrápido, 70:30/hexano:éter) produjo los productos 43 y 44. La asignación estructural regioquímica entre ambos es incierta. Compuesto 43: 1 H RMN (300 MHz, CDCl3 ) δ 6,5 (s, 2H), 5,5 (t, 1H), 4,4 (m, 2H), 3,0 (m, 2H), 2,4 (m, 8H), 1,8 (m, 1H), 1,72 (s, 3H),1,65 (s, 3H), 1,4 (m, 4H), 1,1 (dd, 3H), 0,85 (t, 6H). Compuesto 44: 1 H RMN (300 MHz, CDCl3 ) δ 6,55 (s, 2H), 5,45 (t, 1H), 4,4 (m, 2H), 3,05 (dd, 1H), 2,85 (dd, 1H), 2,4 (m, 7H), 1,65 (s, 3H), 1,6 (s, 3H), 1,55 (m, 2H), 1,4 (m, 4H), 1,1 (m, 4H), 1,1 (d, 3H), 0,9 (t, 6H). Ejemplo 5

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Preparación de 5-hidroxi-trans-2-di(N-propilamino)-3-metil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno (45); y 5-metoxi-8-hidroxitrans-2-di(N-propilamino)-3-metil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno (46) El compuesto 8 (1,85 g, 6 mmol) se disolvió en diclorometano (20 ml) y se enfrió a -78ºC, seguido de la adición de tribromuro de bromo (6 ml de una solución 1M, 6 mmol, 1 eq.). La mezcla de reacción se agitó a -78ºC durante 1 hora y después se calentó a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción se inactivó con metanol (5 ml) y el disolvente se evaporó (la inactivación con metanol se repitió dos veces más). El aceite resultante se secó durante una noche al vacío (Hg 5 mm). El residuo se disolvió en diclorometano y se añadió NaHCO3 , se mezcló minuciosamente y la capa orgánica se separó, se secó con MgSO4 , se filtró y el disolvente se evaporó para producir una mezcla de dos regioisómeros 45 y 46 (1:1). La purificación de una mezcla (200 mg) se realizó con una HPLC de fase inversa (columna C18, 69:30:1/agua:acetonitrilo:ácido trifluoroacético) para producir 45 y 46 en forma de sales trifluoroacetato. Compuesto 45 (sal TFA): 1 H RMN (300 MHz, CDCl3 ) δ 6,65 (q, 2H), 4,7 (bs, 1H), 3,7 (s, 3H), 35 (m, 1H), 3,3 (m, 1H), 3,0 (m, 4H), 2,7 (m, 2H), 2,3 (m, 1H), 2,0 (m, 5H), 1,15 (d, 3H), 0,9 (m, 6H). Compuesto 46 (base libre): 1 H RMN (300 MHz, CDCl3 ) δ 6,55 (q, 2H), 4,3 (bs, 1H), 3,75 (s, 3H), 3,05 (dd, 1H), 3,0 (dd, 1H), 2,6 (m, 1H), 2,4 (m, 6H), 2,2 (m, 1H), 1,8 (m, 1H), 1,4 (m, 4H), 1,1 (d, 3H), 0,85 (t, 6H). La regioquímica de la estructura de 46 se confirmó mediante un análisis de conectividades HMBC (Correlación Heteronuclear de Enlace Múltiple) y efectos nOe. La estructura de 46 se estableció por conectividad entre el sustituyente metoxi del anillo aromático y el metileno bencílico adyacente al carbono sustituido con metilo. Ejemplo 6

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Preparación de 5,8-dimetoxi-2-[N-(éster L-alanil metilo)]-3-metil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno (48) La cetona 6 (1 g, 4,5 mmol) se disolvió en acetonitrilo (75 ml) y ácido acético (0,54 ml, 9 mmol, 2 eq.) y se 13

ES 2 212 570 T3

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añadió éster de alanin metilo (1,3 g, 9 mmol, 2 eq.). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y después se añadió cianoborohidruro sódico (0,6 g, 9 mmol, 2 eq.) en porciones (3x) durante 1,5 horas (cada 30 minutos). La mezcla de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. Se añadió acetato de etilo y NaOH 1N mezclando minuciosamente y la capa orgánica se separó, se secó con MgSO4 , se filtró y se evaporó a un aceite. El producto se purificó con cromatografía ultrarrápida (50:50/acetato de etilo:hexano) para producir 48 en forma de aceite. Compuesto 48, (mezcla de estereoisómeros cis y trans) 1 H RMN (300 MHz, CDCl3 ) δ 6,64 (d, 2H), 4,2 (m, 1H), 3,85 (m, 3H), 3,75 (s, 6H), 3,5 (m, 1H), 3,1 (m, 2H), 2,8 (m, 2H), 2,55 (m, 1H), 2,3 (m, 1H), 1,7 (m, 3H), 1,2 (m, 3H). Ejemplo 7 Preparación de 5,8-dimetoxi-2-[N-(éster de L-alanil metilo)-N-propil]-3-metil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno

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El compuesto 48 (0,28 g, 0,8 mmol) se disolvió en acetonitrilo junto con propionaldehído (0,1 ml, 1,6 mmol, 2 eq.) y ácido acético (0,2 ml, 1,6 mmol y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Una hora después se añadió cianoborohidruro sódico (0,2 g, 1,6 mmol, 2 eq.) en porciones (3x) durante 1,5 horas (cada 30 minutos). La mezcla de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. Se añadió acetato de etilo y NaOH 1N mezclando minuciosamente y la capa orgánica se separó, se secó con MgSO4 , se filtró y se evaporó a un aceite. El producto se purificó con cromatografía ultrarrápida (80:20/hexano:éter) para producir (mezcla 1:1 de estereoisómeros cis y trans) 47. 1 H RMN (300 MHz, CDCl3 ) δ 6,6 (d, 2H), 3,75 (s, 6H), 3,7 (d, 4H), 3,0 (m, 2H9, 2,65 (m, 3H), 2,2 (m, 1H), 1,7 (m, 2H), 1,45 (m, 2H), 1,25 (d, 3H), 1,0 (m, 3H), 0,8 (t, 3H). Ejemplo 8

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Preparación de 5-difenilfosfinoil-8-hidroxi-trans-2-di(N-propilamino)-3-metil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno (58); y 5,8-bis(difenilfosfinoil)-3-metil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno (59) El compuesto 9 (0,5 g, 2,0 mmol) se disolvió en dioxano (100 ml) a 0ºC. Se añadió trietilamina (6 ml) y la mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante 30 minutos, seguido de la adición de cloruro de diclorofenilfosfinilo (0,84 ml, 4,4 mmol).La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Después se añadió NaHCO3 y diclorometano mezclando minuciosamente. La capa orgánica se separó, se secó con MgSO4 , se filtró y se evaporó a un aceite en bruto que se purificó por cromatografía ultrarrápida (70:30/hexano:éter) para producir 59 y 58. Compuesto 59: 1 H RMN (300 MHz, CDCl3 ) δ 7,85 (d, 4H), 7,8 (d, 4H), 7,5 (m, 12H), 6,8 (q,2H), 3,0 (m, 2H), 2,4 (m, 7H), 1,8 (m, 1H), 1,4 (m, 4H), 1,05 (d, 3H), 0,85 (t, 6H). Compuesto 58: (mezcla 1:1 de regioisómeros): 1 H RMN (300 MHz, CDCl3 ) δ 7,85 (m, 4H), 7,5 (m, 6H), 6,6 (q, 1H), 6,48 (s, 1H), 6,21 (d, 1H), 2,9 (m, 3H), 2,3 (m, 9H), 1,65 (m, 1H), 1,4 (m, 1H), 1,05 (d, 3H), 0,85 (m, 6H). De forma similar, partiendo de 32, se prepararon los compuestos 57 y 56. Además, de forma similar, partiendo de 9, se prepararon los compuestos 49-51 usando los reactivos apropiados. Ejemplo 9

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Preparación de 5,8-dimetoxi-cis-2-[N-(4-(2-1-piperidinil)etoxi)fenil)]amino-3-metil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno (60)

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Una solución de 1-(2-cloroetoxi)-4-nitrobenceno (2,01 g, 0,01 mol), piperidina (2,55 g, 0,03 mol) y tolueno (10 ml) se calentó a reflujo durante una noche. La mezcla de reacción se filtró y el filtrado se evaporó para dar 2,97 g de 1-[2-(1-piperidinil)etoxi]-4-nitrobenceno en forma de aceite naranja, MS M+ (m/e) 251,18. Este material (1,25 g, 0,004 mol) se hidrogenó en etanol (25 ml) en presencia de un catalizador Pd/C al 10% a 40 psig y a 25ºC durante una noche. La filtración y la evaporación de la mezcla de reacción dio 0,95 g de 4-[2-(1-piperidinil)etoxi]anilina en forma de aceite pardo claro. MS M+ (m/e) 221,24. Una solución de este aceite (0,220 g, 1,0 mmol), 3-metil-5,8-dimetoxi2-tetralona (6, 0,206, 0,94 mmol) y 1,2-dicloroetano (3,5 ml) se trató con triacetoxiborohidruro sódico (0,300 g, 1,4 mmol) y ácido acético (0,060 g, 1,0 mmol) y la mezcla resultante se agitó durante una noche a 25ºC. La reacción se trató con una solución de hidróxido sódico 3N con agitación enérgica. La capa orgánica se separó, se lavó con una solución saturada de cloruro sódico, se secó sobre carbonato de potasio, se filtró y se evaporó para dar un aceite rojo. Este material se purificó por cromatografía líquida de alta presión de fase inversa C18 produciendo el compuesto 60 en forma de sólido rosa. 1 H RMN (300 MHz, CDCl3 ) δ 7,10-7,22 (m, 2H), 6,52-6,82(m, 4H), 4,25-4,33 (m, 2H), 3,603,80 (m, 3H), 3,75 (s, 3H), 3,71 (s, 3H), 3,48-3,38 (m, 2H), 2,80-3,05 (m, 4H), 1,80-2,10 (m, 4H), 1,10-1,50 (m, 3H), 1,00 (d, 3H). MS M+ (m/e) 425,38. Los compuestos que se muestran en la Tabla 1 se prepararon de acuerdo con los procedimientos descritos en este documento.

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ES 2 212 570 T3 TABLA 1

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Ejemplo 10 50

Como realización específica de composición oral, se formulan 100 mg de Compuesto 9 del Ejemplo 1 con lactosa suficientemente fina para proporcionar una cantidad total de 580 a 590 mg para rellenar una cápsula dura de gelatina de tamaño O. Ejemplo 11

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La unión de Aβ1−42 y Aβ1−40 a nAChR alfa-7 se puede demostrar en experimentos de unión competitiva con α-bungarotoxina Se incubaron membranas celulares SK-N-MC con 0,5 nM de 125 I-α-bungarotoxina en presencia de distintas concentraciones de Aβ1−42 y Aβ1−40 a 25ºC durante una hora. La mezcla del ensayo se filtró rápidamente y se determinó la radioactividad retenida en el filtro. Estos estudios mostraron que la Aβ1−42 y la Aβ1−40 inhibían la unión de 125 I-α-bungarotoxina de forma dependiente de la concentración con valores IC50 de 1 pM y 100 pM, respectivamente.

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ES 2 212 570 T3 Ejemplo 12 La unión de Aβ1−42 a nAChR alfa-7 está apoyada por experimentos de unión competitiva con 125 I-Aβ1−40 y proporciona una base para la deposición de amiloide, y por tanto, a la formación de placa incipiente 5

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Se inmovilizaron nAChR alfa-7 en perlas de itrio SPA unidas a aglutinina de trigo y se dejaron incubar con 125 IAβ1−40 en presencia de distintas concentraciones de Aβ1−40 o Aβ1−42 fría. Los datos mostraron que 0,1 femtoM de Aβ1−42 fría inhibía completamente la unión, sugiriendo que la Aβ1−42 interactuaba con gran afinidad con los nAChR alfa-7. Sin embargo, en presencia de 10 nM de Aβ1−42 fría, la unión total de 125 I-Aβ1−40 a nAChR alfa-7 aumentó espectacularmente. Este aumento se atribuye a que la unión de mayores concentraciones de Aβ1−42 inducía la precipitación de los péptidos Aβ en las membranas. La incubación prolongada a bajas concentraciones reveló también que la unión total aumentó en las reacciones incluso con 100 pM de Aβ1−42 fría. En los experimentos de control, 80 pM 125 I-Aβ1−40 no se unía de forma apreciable al igual que 1 pM a 1 nM de Aβ1−40 a 30 µg de membranas de melanoma Bowes. De esta forma, la deposición de Aβ puede tener lugar en membranas celulares biológicas que contienen nAChR alfa-7, pero no tiene lugar de forma no específica en membranas de control, lo que sugiere que los nAChR alfa-7 pueden sembrar específicamente la agregación de β-amiloide en sistemas biológicos. Ejemplo 13

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La unión de Aβ1−42 a nAChR alfa-7 es de mayor afinidad que la unión de Aβ1−40 a nAChR alfa-7 Se permitió a los nAChR alfa-7 interactuar con Aβ1−40 o Aβ1−42 y la mezcla se inmunoprecipitó con anticuerpos de nAChR anti-alfa-7. Las transferencias Western de las proteínas inmunoprecipitadas identificaron solamente la presencia de Aβ1−42 , indicando que la interacción Aβ1−42 /nAChR alfa-7 es robusta y de gran afinidad. Como se ha demostrado anteriormente que la Aβ1−40 se une al receptor alfa-7, el no detectar la Aβ1−40 en este experimento de co-precipitación sugiere que la interacción Aβ1−40 /nAChR alfa-7 es de menor afinidad que la interacción Aβ1−42 /nAChR alfa-7. Ejemplo 14

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El compuesto 9 inhibió la agregación de Aβ Se sabe que los Aβ forman agregados que conducen a la formación de placas de amiloide que son características de la enfermedad de Alzheimer. Este fenómeno se puede demostrar in vitro usando placas Synthaloid, recubiertas con centros de cristalización de Aβ y Aβs marcados para detectar la agregación. Este ensayo de agregación se ha validado usando 125 I-Aβ1−40 y fluo-Aβ1−40 en una solución tampón que contenía HEPES 50 mM, pH 7,4, BSA al 0,1%, FCS al 10% e inhibidores de proteasa. Se incubó aproximadamente 500 pM de 125 I-Aβ1−40 o 100 nM de fluo-Aβ1−40 en 100 µl de cada uno de los pocillos de la placa Synthaloid de 96 pocillos durante 2,5 horas a temperatura ambiente en presencia o ausencia de inhibidores. Al final de la incubación, la proteína no unida se retiró de los pocillos mediante tres lavados con la solución tampón anterior. La cantidad de proteína unida que representaba la agregación de Aβ se midió por conteo de escintilación o con medidas de fluorescencia. Se descubrió que el compuesto 9 inhibía potencialmente la agregación de Aβ con IC50 10 nM. Los estudios de tiempo también mostraron que la incubación prolongada de agregados de amiloide con Compuesto 9 tenía como resultando la disgregación. Los compuestos que inhiben la agregación Aβ con un IC50 < 100 micromolar pueden ser eficaces en la inhibición de la unión de Aβ a alfa-7 de tal manera que tengan un efecto terapéutico positivo útil para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos. Ejemplo 15

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El compuesto 9 bloqueó el efecto de Aβs en la liberación de acetilcolina de los sinaptosomas Se incubaron sinaptosomas de cobayas con 3 H-colina 0,1 µM y se sometieron a repetidos lavados para retirar la 3 H-colina no incorporada. Los sinaptosomas se trataron con K+ 65 mM durante 30 segundos para provocar la liberación de 3 H-acetilcolina. Mientras que la Aβ1−40 y la Aβ1−42 a 100 pM inhibían la liberación de acetilcolina de estas preparaciones (inhibición del 33% para Aβ1−40 y Aβ1−42 ), se descubrió que el pretratamiento de los sinaptosomas con 10 nM de Compuesto 9 y 100 pM de Aβ1−40 o Aβ1−42 antes de la estimulación con K+ no tenía efecto en la liberación de acetilcolina. Ejemplo 16

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El compuesto 9 inhibió la unión de 125 I-Aβ1−40 a nAChR alfa-7

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Para determinar el efecto de compuesto 9 en 125 I-Aβa nAChR alfa-7, se inmovilizaron nAChR alfa-7 que contenían membranas de células SK-N-MC en perlas de itrio SPA unidas a aglutinina de trigo y se dejaron incubar con 125 IAβ1−40 en presencia de distintas concentraciones de compuesto 9. El resultado demostró que el Compuesto 9 inhibía eficazmente la unión de 125 I-Aβ1−40 a células SK-N-MC con un IC50 300 pM. Los compuestos que inhiben la unión de Aβ a nAChR alfa-7 con un IC50 < 1 micromolar pueden tener un efecto terapéutico positivo para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos. 17

ES 2 212 570 T3 Ejemplo 17 Ensayo de unión del péptido al fragmento 206-216 de nAChR alfa-7 humano 5

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Se añadió una cantidad de 2-5 µg del péptido de 11 aminoácidos comprendido por el fragmento 206-216 del nAChR α7 (A-Ac, C(O)NH2 ) a una placa de microtitulación de 96 pocillos en 50 ml de HEPES 10 mM, pH 7,4 o cualquier tampón 50ul. Se añadió 125 I-β-amiloide1−40 (2000Ci/mmol, 50 pM) a los pocillos en presencia y ausencia de inhibidores (1 µm a 10 µM) disueltos en 1 µl de DMSO al 30 o al 100%. Los ligandos no unidos se retiraron y la radioactividad unida se midió usando un aparato de recuento por escintilación líquida Microbeta. La unión del ligando se puede inhibir con α-bungarotoxina, con el péptido y con el Compuesto 9. A continuación, en la Tabla 2 se proporcionan datos biológicos de compuestos representativos de la invención. TABLA 2

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ES 2 212 570 T3 REIVINDICACIONES 5

1. El uso de un compuesto eficaz para inhibir la unión de un péptido de amiloide beta con los receptores nicotínicos alfa-7 de la acetilcolina en la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno neurodegenerativo, en el que el compuesto tiene fórmula I

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en la que R1 es hidrógeno o alquilo C1 -C4 ; R2 se selecciona entre hidrógeno, alquilo o arilo C1 -C6 o aralquilo C7 -C10 ; 25

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R3 se selecciona entre hidrógeno, alquilo C1 -C6 , alquenilo C3 -C10 , cicloalquilo C3 -C8 alquilo C1 -C6 , heteroaril alquilo C1 -C4 , arilo sustituido o no sustituido o aralquilo C7 -C10 sustituido o no sustituido, donde el sustituyente del arilo o aralquilo son uno o más sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo compuesto por halógeno, hidroxi, alquilo C1 -C6 y alcoxi C1 -C6 sustituido o no sustituido en el que los sustituyentes del alcoxi son uno o más sustituyentes seleccionados independientemente entre amino, alquilamino C1 -C6 , dialquilamino C1 -C6 , pirrolidinilo, piperidinilo, azepinilo o morfolino; o R2 y R3 , junto con el nitrógeno al que están unidos, forman un anillo heterocíclico de cinco o seis miembros seleccionado entre pirrolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo o piperazinilo;

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R4 es alquilo C1 -C6 , arilo o aralquilo C7 -C10 ; y Cada uno de R5 y R6 se selecciona independientemente entre hidrógeno, alquilo C1 -C6 , alquenilo C3 -C10 , alquilcarbonilo C1 -C8 o difenilfosfinilo;

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y sales farmacéuticamente aceptables y profármacos del mismo. 2. El uso de la Reivindicación 1, en el que los receptores alfa-7 nicotínicos de la acetilcolina son receptores alfa-7 nicotínicos de la acetilcolina de seres humanos.

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3. El uso de la Reivindicación 2, en el que el trastorno neurodegenerativo se selecciona entre el grupo compuesto por la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Pick, enfermedad difusa de cuerpos de Lewy, parálisis progresiva supernuclear (síndrome de Steel-Richardson), degeneración multisistema (síndrome de Shy-Drager), enfermedades de neuronas motoras incluyendo esclerosis lateral amiotrófica, ataxias degenerativas, degeneración cortical basal, complejo ALS-demencia de Parkinson de Guam, panencefalitis esclerosante subaguda, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, sinucleinopatías, afasia primaria progresiva, degeneración estriatonigral, enfermedad de MachadoJoseph/ataxia espinocerebral de tipo 3 y degeneraciones olivopontocerebelares, enfermedad de Gilles de la Tourette, parálisis bulbar y pseudobulbar, atrofia muscular espinal y espinobulbar (enfermedad de Kennedy), esclerosis primaria lateral, paraplejia espástica familiar, enfermedad de Werdnig-Hoffmann, enfermedad de Kugelberg-Welander, enfermedad de Tay-Sach, enfermedad de Sandhoff, enfermedad espástica familiar, enfermedad de Wohlfart-Kugelberg-Welander, paraparesis espástica, leucoencefalopatía progresiva multifocal y enfermedades prión (incluyendo la enfermedad de Creutzfeld-Jakob, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, Kuru y el insomnio fatal familiar), demencia relacionada con la edad, demencia vascular, enfermedad de materia blanca difusa (enfermedad de Binswanger), demencia de origen endocrino o metabólico, demencia por trauma en la cabeza y daño cerebral difuso, demencia pugilistica y demencia del lóbulo frontal, trastornos neurodegenerativos que son resultado de una isquemia o infarto cerebral incluyendo oclusión embólica y oclusión trombótica así como hemorragias intracraneales de cualquier tipo, lesiones intracraneales e intravertebrales, angiopatía cerebral hereditaria, amiloide hereditaria no neuropática, síndrome de Down, macroglobulinemia, fiebre mediterránea secundaria familiar, síndrome de Muckle-Wells, mieloma múltiple, amiloidosis pancreática y cardiaca, artropatía de hemodiálisis crónica y amiloidosis Finnish y de Iowa. 4. El uso de la reivindicación, en el que el trastorno neurodegenerativo es la enfermedad de Alzheimer.

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ES 2 212 570 T3 5. Un método para identificar compuestos útiles para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos que implica la selección de compuestos de ensayo para su capacidad de bloquear la interacción de un péptido seleccionado entre el grupo compuesto por 125 I-Aβ1−40 , Aβ1−40 y Aβ1−42 con los receptores nicotínicos de acetilcolina. 5

6. Un compuesto de fórmula I:

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en la que R1 es hidrógeno o alquilo C1 -C4 ; R2 se selecciona entre hidrógeno, alquilo o arilo C1 -C6 o aralquilo C7 -C10 ; 25

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R3 se selecciona entre hidrógeno, alquilo C1 -C6 , alquenilo C3 -C10 , cicloalquilo C3 -C8 alquilo C1 -C6 , heteroaril alquilo C1 -C4 , arilo sustituido o no sustituido o aralquilo C7 -C10 sustituido o no sustituido en el que el sustituyente del arilo o aralquilo son uno o más sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo compuesto por halógeno, hidroxi, alquilo C1 -C6 y alcoxi C1 -C6 sustituido o no sustituido en el que los sustituyentes del alcoxi son uno o más sustituyentes seleccionados independientemente entre amino, alquilamino C1 -C6 , dialquilamino C1 -C6 , pirrolidinilo, piperidinilo, azepinilo o morfolino; o R2 y R3 , junto con el nitrógeno al que están unidos, forman un anillo heterocíclico de cinco o seis miembros seleccionado entre pirrolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo o piperazinilo;

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R4 es alquilo C1 -C6 , arilo o aralquilo C7 -C10 ; y Cada uno de R5 y R6 se selecciona independientemente entre hidrógeno, alquilo C1 -C6 , alquenilo C3 -C10 , alquilcarbonilo C1 -C8 o difenilfosfinilo;

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y sales farmacéuticamente aceptables y profármacos del mismo. 7. El compuesto de la Reivindicación 6, en el que R1 es hidrógeno;

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R2 se selecciona entre hidrógeno o alquilo C1 -C4 ;

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R3 se selecciona entre alquilo C1 -C4 , alquenilo C3 -C10 , cicloalquil C5 -C6 alquilo C1 -C4 , heteroaril-alquilo C1 -C4 , o aralquilo C7 -C10 sustituido o no sustituido en el que el sustituyente del aralquilo son uno o más sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo compuesto por halógeno, hidroxi, alquilo C1 -C4 y alcoxi C1 -C4 sustituido o no sustituido en el que los sustituyentes del alcoxi son uno o más sustituyentes seleccionados independientemente entre amino, alquilamino C1 -C4 , dialquilamino C1 -C4 , pirrolidinilo o piperidinilo; o R2 y R3 junto con el nitrógeno al que están unidos, forman un anillo morfolinilo;

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R4 es alquilo C1 -C4 ; y Cada uno de R5 y R6 se seleccionan independientemente entre alquilo C1 -C4 , alquenilo C3 -C6 , alquilcarbonilo C1 -C6 o difenilfosfinilo; 60

y sales farmacéuticamente aceptables del mismo. 8. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un compuesto de la Reivindicación 6. 65

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9. Un método para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer, controlar el progreso y/o prognosis de la enfermedad de Alzheimer y/o controlar la eficacia terapéutica de cualquier intervención o tratamiento de la enfermedad de Alzheimer que comprende analizar en muestra de ensayo obtenida de un sujeto la interacción de un péptido amiloide beta con los receptores nicotínicos alfa-7 de la acetilcolina, comprendiendo dicha muestra células de sangre circulantes y/o cuerpos de células neuronales olfativas neuroepiteliales o sus procesos neuronales.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluida en la mencionada reserva. 22