PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTÁNDAR Calibración Interlaboratorio

Proyecto HERPEMOL Caracterización de la situación sanitaria del litoral español relativa a la infección por virus herpes en moluscos bivalvos y evaluación del impacto de la enfermedad. JACUMAR PN 2011-2013

Calibración Interlaboratorio

HERPEMOL

Índice

1

1. Introducción

3

2. Objetivos

6

2.1. Objetivo general

6

2.2. Objetivos específicos

6

3. Generalidades de las técnicas 3.1. Técnica histológica

7

3.2. Técnica molecular

7

4. Equipos e instrumentos

10

5. Materiales y reactivos

11

6. Material proporcionado por el CIMA

12

7. Preparación de las muestras

13

7.1. Análisis Histológico

12

7.2. Análisis Molecular

15

7.2.1. Condiciones previas de trabajo

15

7.2.2. Extracción de ADN de muestras.

15

7.2.3. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) y ensayo de restricción (RFLPs) empleando los cebadores C2-C6 y los reactivos comunes para todos los laboratorios participantes.

17

7.2.4. PCR-RFLPs empleando los cebadores C2-C6 y los reactivos habituales de cada laboratorio participante.

18

7.2.5. PCR empleando los cebadores HerpF-HerpR y los reactivos comunes para todos los laboratorios participantes.

19

7.2.6. PCR empleando los cebadores HerpF-HerpR y los reactivos habituales de cada laboratorio participante.

19

8. Análisis de resultados.

2

7

21

8.1. Interpretación histológica.

21

8.2. Interpretación molecular.

21

8.2.1. PCR-RFLPs empleando los cebadores C2-C6.

21

8.2.2. PCR empleando los cebadores HerpF -HerpR

21

9. Hoja de Resultados

22

10. Bibliografía citada

23

Calibración Interlaboratorio

1. Introducción

HERPEMOL

En las últimas décadas, según datos de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE), la producción mundial de moluscos se ha visto seriamente afectada por numerosas enfermedades,. Debido al severo impacto que producen en el desarrollo socioeconómico en muchos países, algunas de estas enfermedades se han convertido en una seria restricción primaria para el desarrollo y sostenibilidad del cultivo de moluscos. Actualmente, se considera que la principal causa asociada a los brotes de enfermedades y epizootias es la transferencia de agentes infecciosos a través del transporte de moluscos vivos. La dinámica de libre comercio y el legítimo deseo de los países de buscar nuevas alternativas para la producción de alimento y de desarrollo socioeconómico, hacen que se pasen por alto factores sanitarios esenciales que, de no considerarse en su justo contexto, pueden hacer fracasar los cultivos de moluscos (Cáceres-Martínez y Vásquez-Yeomans, 2008). Las infecciones de origen vírico en moluscos se empezaron a estudiar a partir de los años 60 del siglo pasado, aunque su interés se ha incrementado notablemente con el desarrollo de la acuicultura. El primer caso de infección por un virus tipo-herpes en moluscos bivalvos fue registrado por Farley y col. (1972) en Crassostrea virginica. Desde entonces

se

han

notificado

numerosos

casos

de

infecciones

por

virus,

presumiblemente pertenecientes a la familia Herpesviridae, en diferentes especies de bivalvos en todo el mundo; entre ellas podemos citar Crassostrea gigas (Hine et al., 1992), C. angulata (Arzul et al., 2001a), C. rivularis (Arzul et al., 2001a), Ostrea edulis

1

(Nicolas et al., 1992), O. angasi (Hine y Thorne 1997), Tiostrea chilensis (Hine et al., 1998), Ruditapes decussatus (Renault and Arzul, 2001), R. philippinarum (Renault, et al 2001a), y Pecten maximus (Arzul et al., 2001b). También cabe destacar el reciente registro de mortalidades masivas de semilla de ostra plana O. edulis asociadas a infecciones por virus herpes en Galicia (Villalba y col. 2010). La mayoría de estas notificaciones están relacionadas con mortandades elevadas de larvas y juveniles, siendo la población adulta aparentemente menos sensible a la infección (Arzul et al., 2002; Renault y Novoa, 2004). El desarrollo de un método para purificar partículas virales tipo-herpes a partir de tejido fresco de larvas de C. gigas infectadas, facilitó la extracción del ADN viral y la caracterización parcial de su genoma (Le Deuff and Renault, 1999). La posterior secuenciación completa del genoma (GenBank Nº AY509253) reveló una baja relación con otros herpesvirus. El virus aislado a partir de larvas de C. gigas infectadas se clasificó formalmente como un miembro de los Herpesviridae, y se bautizó con el nombre de “Ostreid Herpesvirus 1” (OsHV-1) (Minson et al. 2000). A lo largo de los años

3

Calibración Interlaboratorio

HERPEMOL

2008 y 2009 se observaron en Francia mortalidades anómalas que han ido en aumento y parecen afectar a casi todo el litoral. Estas mortalidades también se detectaron en el verano del 2008 y 2009 en Irlanda y en el verano del 2009 en las Islas Anglonormandas. Dado que las mortalidades parecían asociadas a los movimientos comerciales de los ostiones C. gigas procedentes de Francia, las autoridades competentes de estos Estados miembro y de las Islas Anglonormandas adoptaron medidas de confinamiento, evitando los desplazamientos de los ostiones a partir de las zonas afectadas, con el fin de controlar la situación generada por la enfermedad. Estas mortalidades parecen estar relacionadas con la presencia de un nuevo genotipo recombinante de virus herpes, denominado OsHV-1 µvar. Asociado a estas mortalidades también se han descrito varias especies de vibrios y múltiples factores ambientales. Actualmente, el virus herpes de los ostreidos tipo 1 µvar, recibe la consideración de enfermedad emergente por la OIE. En Marzo de 2010, la Comisión Europea aprobó el Reglamento 175/2010 “por el que se aplica la Directiva 2006/88/CE del Consejo en lo referente a las medidas de lucha contra el aumento de la mortalidad de los ostiones de la especie Crassostrea gigas en relación con la detección del herpesvirus de los ostreidos tipo 1 µvar (OsHV-1 µvar)”. Dicha Normativa dejo de estar vigente en Abril de 2011. El diagnóstico de la infección por virus herpes se ha realizado tradicionalmente mediante microscopía óptica, como una primera aproximación, seguido de un estudio

1

de microscopía electrónica de transmisión para completar el diagnóstico (Hine and Thorne 1997). Estos métodos presentan varias limitaciones, ya que requieren un elevado tiempo de dedicación, no son válidos para realizar estudios epidemiológicos y tienen una baja sensibilidad. Debido a estas limitaciones, se desarrollaron otros métodos basados en técnicas inmunohistoquímicas y genómicas. Actualmente los más empleados son los métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que permite la detección del ADN viral (Renault et al. 2000a; Renault y Arzul 2001a; Batista y col. 2005). La PCR se considera una herramienta adecuada para el diagnóstico de las infecciones por OsHV-1, debido a su especificidad, alta sensibilidad en comparación con otros métodos, fácil procesado de las muestras, disponibilidad de reactivos, eficiencia del tiempo empleado y coste. Sin embargo, dado que la PCR sólo detecta ácidos nucleicos virales como técnica confirmatoria se debe emplear la histología, la hibridación in situ o tests de reconocimiento antigénico, especialmente ante nuevos registros geográficos u hospedador. En aquellas regiones endémicas, el diagnóstico por PCR se considera suficiente para diagnosticar la presencia de OsHV-1 (Batista et al. 2007). La pérdida de estandarización en los protocolos a desarrollar así como en su interpretación es uno de los principales impedimentos para la implantación de

4

Calibración Interlaboratorio

métodos de diagnóstico efectivos, siendo la reproducibilidad entre los laboratorios un

HERPEMOL

factor crítico. El procedimiento a ensayar no solo se basa en realizar una prueba diagnóstica, sino también en reproducir la misma sensibilidad, discernir falsas interpretaciones y mejorar los procedimientos para controlar la posible contaminación. Esta pérdida de reproducibilidad es más pronunciada con las técnicas moleculares debido a la sensibilidad de los reactivos, la complejidad de los equipos y la necesidad de personal bien formado. Por ello, la validación basada sobre un criterio consensuado es un prerrequisito para la adopción con éxito de la metodología diagnóstica. Para realizar una correcta intercalibración de la metodología es necesario replicar varios grupos de ensayo, tanto para el manejo de las herramientas moleculares como para el diagnóstico histológico.

1

5

Calibración Interlaboratorio

HERPEMOL

2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo general: El objetivo de esta línea de trabajo se centra en unificar los criterios diagnósticos y validar, entre los grupos de investigación implicados, las pruebas diagnósticas (histología y PCR), con el fin de que los resultados de evaluación de la situación sanitaria (línea de trabajo 3) sean armoniosos y coherentes a nivel nacional.

2.2. Objetivos específicos: (1) Establecer los criterios comunes para el diagnóstico histológico. (2) Establecer

procedimientos debidamente pormenorizados para una extracción

correcta del ADN, mediante los kits comerciales actualmente disponibles en el mercado. (3) Establecer el procedimiento de PCR mediante la descripción de los protocolos utilizados para el diagnóstico del OsHV-1 y su variante OsHV-1 µvar. (4) Establecer el procedimiento de RFLPs para el diagnóstico del OsHV-1 y su variante OsHV-1 µvar.

1

(5) Validar la sensibilidad y reproducibilidad de los resultados de PCR-RFLPs empleando los reactivos que se usan habitualmente en cada uno de los laboratorios participantes. (6) Validar la sensibilidad y reproducibilidad de los resultados de PCR empleando una nueva pareja de cebadores (HerpF/R) diseñados durante el desarrollo del proyecto.

6

Calibración Interlaboratorio

3. GENERALIDADES DE LAS TÉCNICAS

HERPEMOL

3.1 Técnica Histológica. Denominamos proceso histológico a una serie de métodos y técnicas utilizados para poder estudiar las características morfológicas y moleculares de los tejidos. El proceso histológico comienza con la obtención del tejido objeto de estudio. Las muestras son habitualmente fijadas con unas soluciones líquidas (fijadores), que mantienen durante el procesado posterior del tejido las estructuras celulares y moleculares en sus posiciones iniciales. Normalmente, tras la fijación se procede a incluir el tejido para posteriormente obtener secciones. Cuanto más delgada queramos que sea nuestra sección más tenemos que endurecer nuestra muestra. Esto se consigue embebiendo el tejido con sustancias

líquidas

que

posteriormente

polimerizarán

(resinas)

o

se

volverán

consistentes (ceras). Los medios de inclusión son normalmente no hidrosolubles como la parafina, por lo que tenemos que sustituir el agua de los tejidos por solventes orgánicos liposolubles y posteriormente añadir el medio de inclusión. Tras la inclusión se procede a cortar los tejidos. Existen diferentes aparatos de corte que permiten conseguir secciones ultrafinas (del orden de nanómetros), semifinas (de 0.5 a 2 µm), finas (entre unas 3 y 10 µm) y gruesos (mayores a 10 µm). Estas secciones hay que procesarlas para poder observarlas. Normalmente las secciones se tiñen con colorantes que son hidrosolubles, por lo que hay que eliminar el medio de inclusión para que los colorantes pueden unirse al tejido. Los tejidos

1

procesados se observan con los microscopios.

3.2. Técnica Molecular La técnica de la Reacción en cadena de la Polimerasa, consiste básicamente en la amplificación de un segmento específico del genoma del virus. Este segmento específico, como se menciona, debe ser seleccionado como único y característico para cada tipo de microorganismo que se quiera diagnosticar, de esta manera, estaremos trabajando con una técnica que contará con una alta sensibilidad y especificidad para el diagnóstico de una enfermedad. Una vez identificada esta región o segmento a amplificar, se deben diseñar los partidores o en inglés primers, que establecerán el marco de acción de esta amplificación, el desarrollo de este diseño es importantísimo y fundamental para la obtención de un resultado apropiado.

7

Calibración Interlaboratorio

HERPEMOL

El resto de los reactivos que requiere la reacción, consisten básicamente en un buffer o solución tamponada, presencia de sales de Magnesio, dinucleótidos de los 4 tipos: Adenina (A), Citosina (C), Guanina (G) y Timina (T), agua y la enzima Polimerasa. La reacción en sí, consiste en tres etapas, desnaturalización de la hebra, anillamiento con los partidores e hibridización, estas tres etapas ocurren en varios ciclos (usualmente entre 30 y 40) en tres distintas temperaturas, para este efecto se emplean equipos que se denominan termocicladores.

Desnaturalización 95°C

Anillamiento 50-60ºC

Extensión 75ºC

2do Ciclo

Primer Ciclo

1

Una vez finalizada la reacción, se debe visualizar o detectar si se amplificó el segmento deseado, esto, en el caso que se trate de PCR convencional, el producto de la reacción de PCR es sacado del termociclador, cargado en un gel de agarosa, corrido en una cámara de electroforesis y visualizado en un transiluminador ultravioleta. En biología molecular, el término polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción o RFLP (del inglés Restriction Fragment Length Polymorphism) se refiere a secuencias específicas de nucleótidos en el ADN que son reconocidas y cortadas por las enzimas de restricción (también llamadas endonucleasas de restricción) y que varían entre individuos. Las secuencias de restricción presentan usualmente patrones de distancia, longitud y disposición diferentes en el ADN. Lo que permite diferenciar entre diferentes individuos de una población, entre cepas o variantes de la misma especie o entre diferentes especies. Se debe tener bastante precaución cuando se trabaja con material genético, con el fin de evitar la presencia de inhibidores de ARN o ADN, principalmente enzimas que destruyen ácidos nucleicos, es por esta razón que se trabajan con materiales libres

8

Calibración Interlaboratorio

de ARN-ADNasas. Se deben cambiar de guantes con frecuencia y se deben tener

HERPEMOL

algunos equipos de uso exclusivo para cada etapa, es decir, para la extracción, amplificación y etapa de post-amplificación (en el caso de la PCR convencional).

1

9

Calibración Interlaboratorio

HERPEMOL

4. EQUIPOS E INSTRUMENTOS - Uso general Cámara de Flujo Laminar Clase II, con luz germicida UV. Nevera (2ºC - 6ºC). dos juegos completos de pipetas (2 µl, 20 µl, 200 µl y 1 000 µl); el primero para la extracción del ADN y el segundo para la preparación de la mezcla de RCP.

- Extracción de ADN Microcentrifuga. Vortexer. Baño de agua o placa caliente a 56ºC. Espectrofotómetro ADN/ARN o nanodrop.

- PCR Termociclador

- Electroforesis de agarosa

1

Horno microondas o incubador-agitador balanza un sistema de electroforesis horizontal un dispositivo de UV para la lectura de los geles de agarosa un sistema de documentación de imágenes

10

Calibración Interlaboratorio

5. MATERIALES Y REACTIVOS Puntas de micropipeta con filtro de diversos calibres. Guantes sin talco, ADN/ARNasa Free. Tubos eppendorf de 1,5 ml y de 0,5 ml ADN/ARNasa free.

- Extracción de ADN Kit de extracción de ADN: QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN). Etanol (96-100%), grado Biología Molecular. PBS (Phosphate-buffered saline).

HERPEMOL

- Uso general

- PCR de calibración Agua destilada estéril RNAase free, grado Biología Molecular. Cebadores (10µm) Dideoxinucleótidos dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTT) Master Mix (20 mM) (suministrado con Gold Star Mix, Eurogentec) Taq ADN polimerasa (suministrado con Gold Star Mix, Eurogentec). Tampón 10 X (suministrado con Gold Star Mix, Eurogentec). MgCl 2 (suministrado con Gold Star Mix, Eurogentec) (25 mM) - Electroforesis de agarosa 50 X TAE (puede comprarse listo para usar): Tris base (40 mM): 242 g

1

Ácido acético glacial (40 mM): 57,1 ml Na2EDTA.2H2O (1 mM): 18,61 g dH2O para 1 litro Ajustar al pH 8 Agarosa Bromuro de etidio (0,5 µg/ml) Colorante azul para carga: Azul de bromofenol 0,25 % Xileno cianol FF 0,25 % Sacarosa 40 % Mantener a 4 °C. Marcador de peso molecular: bandas a intervalos regulares de 100 a 1000 pb.

11

Calibración Interlaboratorio

HERPEMOL

6. MATERIAL PROPORCIONADO POR EL CIMA.

1

12

Preparaciones histológicas. Etiquetadas del 1 al 60. Tejido en etanol al 96%. Etiquetados del 1 al 60. Alícuota de primers HerpF/R (10 micromolar). Plásmido control positivo con el fragmento C2-C6 de OsHV-1 µvar. Plásmido control positivo con el fragmento HerpF/R de OsHV-1 µvar. Plásmido control positivo con el fragmento HerpF/R de OsHV-1.

Calibración Interlaboratorio

7. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

el centro receptor de las ostras (Crassostrea gigas) control e infectadas por virus herpes que se van a emplear en la prueba de intercalibración. También es el laboratorio encargado de realizar las preparaciones histológicas que se van a distribuir en la prueba, así como de conservar tejido de ostra para el análisis molecular. Con esta finalidad, la vianda de cada ostra se separó de la concha, y se dividió en dos fragmentos, uno para diagnóstico molecular y otro para histología. De esta forma, de cada preparación histológica disponemos de su réplica en el análisis molecular. A su

HERPEMOL

El Laboratorio de Patología del Centro de Investigacións Mariñas (CIMA) ha sido

vez, el fragmento de vianda destinada a la extracción de ADN, se dividió en tres porciones y cada una de ellas se conservó en tubos individuales con etanol 99%.

7.1. Análisis Histológico. A continuación se detalla el protocolo de preparación de las muestras histológicas realizado en el laboratorio de Patología del Centro de Investigacións Mariñas (CIMA).

- Fijación. Separar un fragmento de vianda, éste se coloca en una cajita perforada (cassette), convenientemente rotulada. El cassette con el fragmento de vianda se introduce en disolución de Davidson (disolución de fijación) durante 24h a 4ºC.

1

Transcurrido este periodo, se lava con agua bajo el grifo durante unos 10 min. En caso de que se prefiera conservar el fragmento de vianda durante un tiempo indefinido antes de la inclusión en parafina, el cassette con el fragmento se mantiene en etanol de 70º. Solución de Davidson (Shaw y Battle 1957) Glicerina

400 mL

Formaldehído 40%

300 mL

Etanol de 96º

1200 mL

Agua de mar filtrada

1200 mL

Se puede preparar una solución con los compuestos señalados arriba y mantenerla por tiempo indefinido. Justo antes de la utilización del fijador hay que mezclar 1 parte de ácido acético glacial con 9 partes de la solución anterior.

13

Calibración Interlaboratorio

HERPEMOL

- Inclusión, formación de bloques de parafina y obtención de cortes histológicos. Para la inclusión en parafina y posterior formación de bloques se procede siguiendo los pasos de la tabla insertada a continuación, utilizando un procesador automático LEICA TP 1020. Posteriormente, utilizando una consola Tissue Tek (Miles Scientific), se forma un bloque de parafina con un molde metálico, del cual se obtienen cortes de 5 µm de espesor con un micrótomo de rotación. Estos cortes primero se depositan en un baño de flotación con agua a 40oC para que se estiren y a continuación se recogen sobre un portaobjetos que se deja secar en estufa a 40º C para su posterior tinción.

↓ Etanol de 80o

1h

Etanol absoluto

1h

Etanol de 96o

2h

Xileno y etanol absoluto (1:1)

1h

Etanol de

96o

1h

Xileno

1h

Etanol de

96o

1h

Xileno

1h

Etanol absoluto

2h

Parafina y xileno (1:1)

3h a 65oC

Etanol absoluto

2h→

Parafina (con vacío)

3h a 65oC

- Tinción hematoxilina de Harris-eosina (adaptado de Howard et al. 2004) utilizando teñidor automático LEICA AUTOSTAINER XL.

1

Desparafinar Hidratar

5 min

Xileno

10 seg

Etanol absoluto

6 seg

Etanol absoluto

6 seg

Etanol de

96o

6 seg

Etanol de

70o

6 seg

Etanol de 50o

6 seg

Agua destilada

2 min

Tinción

Hematoxilina de Harris

8 min

Lavar

Agua bajo el grifo

Diferenciar

Etanol ácido (0,04% HCl en etanol de

Lavar

Agua bajo el grifo

Azular

Contratinción Diferenciar Deshidratar

14

Xileno

5 min 70o)

3 min 5 min

NaHCO3, una cucharada en 250 mL de 30 seg agua destilada Etanol de 96o

3 min

Eosina amarilla

15 seg

Etanol de

96o

6 seg

Etanol de

96o

6 seg

Etanol absoluto

6 seg

Etanol absoluto

6 seg

Calibración Interlaboratorio

Aclarar

6 seg

Xileno

15 min

Histomount (Montador automático LEICA CV5030)

7.2. Análisis Molecular 7.2.1. Condiciones de trabajo previas. Antes de comenzar con las extracciones, se deben colocar pipetas “limpias”,

HERPEMOL

Montar

Xileno

gradillas, puntas, etc. en una cámara de bioseguridad que se haya limpiado previamente. La exposición a la luz ultravioleta germicida, por varias horas o por toda la noche puede ser beneficiosa para la degradación de ADN contaminante de las pipetas y otros equipos. El manipulador debe llevar bata de laboratorio y guantes durante todas las fases que se describen a continuación. Preferiblemente, la bata y los guantes deben cambiarse tras cada paso principal: Extracción de ADN, preparación de la mezcla de PCR, distribución de las muestras, amplificación y transferencia al gel. Se recomienda llevar a cabo estas fases en diferentes salas. En particular, la amplificación y la transferencia al gel/la electroforesis deberían efectuarse en una sala separada de la extracción del ADN, la preparación de la mezcla de PCR y la distribución del ADN.

1

7.2.2. Extracción de ADN de muestras (método QIAamp® DNA Mini Kit, QIAGEN). La extracción del ADN se efectuará utilizando el kit QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN) siguiendo las instrucciones del protocolo de ensayo con tejidos, en el siguiente orden: (1)

Poner entre 10 y 50 mg de tejidos en un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml, y añadir 180 µl de tampón ATL.

(2)

Añadir 20 µl de proteinasa K, mezclar con agitador vortex e incubar a 56 °C hasta que el tejido quede completamente lisado (hasta el día siguiente). Agitar con vortex ocasionalmente durante la incubación para dispersar la muestra. Centrifugar brevemente el tubo de microcentrifugación de 1,5 ml para retirar las gotas de la tapa.

15

Calibración Interlaboratorio

HERPEMOL

(3)

Añadir 200 µl de tampón AL a la muestra, mezclar con agitador vortex con sacudidas durante 15 s e incubar a 70 °C durante 10 minutos. Centrifugar brevemente el tubo de microcentrifugación de 1,5 ml para retirar las gotas de la tapa.

(4)

Añadir 200 µl de etanol (96-100 %) a la muestra y mezclar con agitador vortex con sacudidas durante 15 s. Centrifugar brevemente el tubo de microcentrifugación de 1,5 ml para retirar las gotas de la tapa.

(5)

Aplicar cuidadosamente la mezcla del paso 4 a la columna QIAamp (en un tubo de recogida de 2 ml) sin mojar el borde. Cerrar el tapón y centrifugar a 10.000 rpm durante 1 min. Poner la columna de centrifugación QIAamp en un tubo de recogida limpio de 2 ml (suministrado en el kit) y desechar el tubo que contiene el filtrado.

(6)

Abrir con cuidado la columna de centrifugación QIAamp y añadir 500 µl de tampón AW1 sin mojar el borde. Cerrar el tapón y centrifugar a 10.000 rpm durante 1 min. Poner la columna de centrifugación QIAamp en un tubo de recogida limpio de 2 ml (suministrado en el kit) y desechar el tubo de recogida que contiene el filtrado.

(7)

1

Abrir con cuidado la columna de centrifugación QIAamp y añadir 500 µl de tampón AW2 sin mojar el borde. Cerrar el tapón y centrifugar a toda velocidad (14.000 rpm) durante 3 min.

(8)

(Optativo) Poner la columna de centrifugación QIAamp en un tubo de recogida nuevo de 2 ml (no suministrado en el kit) y desechar el tubo de recogida que contiene el filtrado. Centrifugar a toda velocidad (14.000 rpm) durante 1 min.

(9)

Poner la columna de centrifugación QIAamp en un tubo de microcentrifugación limpio de 1,5 ml (no suministrado en el kit) y desechar el tubo de recogida que contiene el filtrado. Abrir con cuidado la columna de centrifugación QIAamp y añadir 100 µl de agua destilada. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente y centrifugar a 10.000 rpm durante 1 min.

(10) Controlar la calidad y la eficacia de la extracción [por ejemplo, midiendo la DO (260 nm) bajo el espectrofotómetro o tras la electroforesis en gel de agarosa]. (11) Preparar la dilución de las muestras para tener una concentración final de ADN de 50-100 ng/µl. (12) Las soluciones de ADN se guardan a 4 °C hasta que se efectúen los análisis por PCR.

16

Calibración Interlaboratorio

7.2.3. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) y ensayo de restricción (RFLPs)

participantes. - Mezcla de reacción. (1) Descongelar el vial, mezclar y dejar en hielo. (2) A 25 µl de Gold Star Mix, añadir 0,01 nmoles de primers, 100 ng de ADN molde y enrasar con H2O a un volumen final de 50 µl.

HERPEMOL

empleando los cebadores C2-C6 y reactivos comunes para todos los laboratorios

Tabla 1. Mezcla de reacción para la PCR. Volumen por tubo 2X PCR MIx

25µl

MgCl2 (25 mM)

2µl

C2 (10 µM)

1 µl

C6 (10 µM)

1 µl

ADN

-

dH2O

Enrasar a 50µl

- Controles. Se emplearán dos tipos de controles: (1) Controles negativos. Se añadirá a la mezcla de reacción (49 µl) 1 µl de dH2O.

1

Tienen por objeto detectar una posible contaminación reactiva del entorno de trabajo. Debería incluirse un control negativo por cada diez muestras o después de cada lote de muestras. ES L 52/8 Diario Oficial de la Unión Europea 3.3.2010. (2) Controles positivos consistirán en ADN plasmídico que contiene la región objetivo del genoma C2-C6 del OsHV-1. Su objetivo es comprobar la eficacia de la PCR. Debe incluirse un control positivo por cada análisis por PCR.

- Amplificación. El protocolo de amplificación se detalla a continuación: Desnaturalización inicial: 2 min a 94 °C. 35 ciclos: desnaturalización 1 min a 94 °, amplificación 1 min a 58 °, elongación 1 min a 72 °C Elongación final: 5 min a 72 °C.

17

Calibración Interlaboratorio

HERPEMOL

- Electroforesis (1) Pesar 1,5 g de agarosa, añadir 100 ml de 1X TAE y calentar hasta que se funda la mezcla. (2) Tras enfriar la solución, añadir bromuro de etidio (5 µl para 100 ml de gel de agarosa) y poner la solución en un molde específico equipado con peines. (3) Cuando el gel se polimeriza, se retiran los peines y el gel se dispone en un sistema de electroforesis horizontal que contiene 1X TAE suficiente para cubrir el gel de agarosa. (4) Mezclar 10 µl de productos de PCR con 2 µl de colorante azul (6X) y disponer en las ranuras. (5) Reservar una ranura para el marcador de peso molecular (5 µl). (6) Aplicar un voltaje de 5-10 V/cm entre 30 min y 1 hora hasta que el colorante azul haya recorrido la distancia adecuada a través del gel. (7) Observar el gel con luz UV y documentar.

- Ensayo de enzimas de restricción (RFLPs).

1

Para discriminar entre la infección por el herpesvirus OsHV-1 o su variante OsHV1 µvar, se realizará un ensayo de restricción con la enzima MfeI (NBE). Las reacciones de restricción se realizarán en un volumen final de 50 µl conteniendo 1 µg de ADN, 5 µl de tampón de la enzima y 1 U de la enzima de restricción MfeI. Las digestiones se realizarán durante 1h a 37 ºC, seguido de una incubación de 10 min a 65 ºC para inactivar la enzima. Para visualizar los patrones de restricción, 15 µl del ADN digerido se mezclará con 1 µl de colorante azul para carga. Las condiciones de electroforesis serán las indicadas en el apartado anterior.

7.2.4. PCR-RFLPs empleando los cebadores C2-C6 y los reactivos habituales de cada laboratorio participante. Los

apartados

relativos

a

controles,

amplificación

y

electroforesis

se

corresponden con lo descrito previamente en el apartado 7.2.3. El apartado de mezcla de reacción queda sujeto a las condiciones de los reactivos que cada laboratorio use de forma rutinaria. La enzima Taq polimerasa que se use definirá las condiciones de concentración apropiadas para los dNTPs y los cebadores Sería necesario tener en cuenta la concentración incrementada de MgCl2. Indicar lo mismo

18

Calibración Interlaboratorio

en el uso de la restrictasa en los RFLPs. Señalar que en la PCR cantidad de ADN molde

7.2.5. PCR empleando los cebadores HerpF-HerpR y los reactivos comunes para todos los laboratorios participantes. Los primers HerpF y HerpR se han diseñado con el objetivo de disponer de unos primers de secuencia conocida que permitan la identificación inequívoca del virus herpes OsHV-1 y a variante OsHV-1 µvar, evitando análisis complementarios como RFLPs o secuenciación. La secuencia de estos primers es la siguiente:

HERPEMOL

es 100 ng y en los RFLPs la cantidad de ADN molde es 1 µg.

HerpF: 5’- CCC CGG GGA AAA AGT ATA AA- 3’ HerpR: 5’- GTG ATG GCT TTG GTC AAG GT -3’

- Los apartados relativos a mezcla de reacción, control negativo y electroforesis se corresponden con lo descrito previamente en el apartado 7.2.3. - Como control positivo se empleará ADN plasmídico que contiene la región objetivo del genoma HerpF y HerpR del OsHV-1. Su objetivo es comprobar la eficacia de la PCR. Debe incluirse un control positivo por cada análisis por PCR. - El protocolo de amplificación se detalla a continuación: Desnaturalización inicial: 2 min a 94 °C.

1

35 ciclos: - desnaturalización 1 min a 94 °C, - amplificación 1 min a 52 °C, - elongación 1 min a 72 °C Elongación final: 5 min a 72 °C. - Electroforesis. Se seguirá el protocolo descrito en el apartado 7.2.3, pero con la siguiente modificación en el paso (1) del protocolo descrito. (1) Pesar 3 g de agarosa, añadir 100 ml de 1X TAE y calentar hasta que se funda la mezcla. Los geles se realizarán al 3%.

7.2.6. PCR empleando los cebadores HerpF-HerpR y los reactivos habituales de cada laboratorio participante.

19

Calibración Interlaboratorio

HERPEMOL

Los apartados relativos a controles, amplificación y electroforesis se corresponden con

1

20

lo descrito previamente en el apartado 7.2.3. El apartado de mezcla de reacción queda sujeto a lo descrito en el apartado 7.2.4. El empleo del control positivo, el protocolo de amplificación y las condiciones de electroforesis se describen en el apartado 7.2.5.

Calibración Interlaboratorio

8. ANÁLISIS DE RESULTADOS.

De acuerdo con Renault et al. (2000), el cambio histológico más destacado en semilla de ostras (Crassostrea gigas y Ostrea edulis) como consecuencia de la infección por OsHV-1es la presencia de núcleos anormales en el tejido conjuntivo, principalmente en el manto, los palpos labiales y la glándula digestiva. La anormalidad de los núcleos consiste en que hay células de tipo fibroblasto con núcleos de tamaño mayor que el normal y en ellos la cromatina está depositada en la periferia; además, en células ovoides que probablemente son hemocitos el núcleo está muy

HERPEMOL

8.1. Interpretación histológica.

condensado. La infección no está asociada con una reacción inflamatoria masiva y no es frecuente detectar necrosis en las áreas con núcleos anormales. Por tanto, debemos considerar como signo de la infección la presencia en el tejido conjuntivo de núcleos grandes con cromatina formando un anillo (Fig. 1, en op. cit.). Los núcleos muy condensados son menos orientativos, pues se trata de un signo de apoptosis.

8.2. Interpretación molecular. 8.2.1. PCR-RFLPs empleando los cebadores C2-C6. PCR: En aquellos geles de agarosa al 1,5 % con resultado negativo de todos los controles negativos y resultado positivo de todos los controles positivos,

1

la presencia de una banda de aproximadamente 700 pb es indicativo de infección por OsHV-1 (710 pb) o OsHV-1 µvar (696 pb). RFLPs: Tras el ensayo de restricción, la presencia en los geles de agarosa al 1,5 % de una banda de 710 pb es indicativo de infección por OsHv-1. La presencia de dos bandas, una de 192 pb y otra de 504 pb es indicativo de infección por OsHV-1 µvar.

8.2.2. PCR empleando los cebadores HerpF y HerpR. PCR: En aquellos geles de agarosa al 3 % con resultado negativo de todos los controles negativos y resultado positivo de todos los controles positivos, la presencia de una banda de 173 pb es indicativo de infección por OsHV-1 y una banda de 157 pb es indicativo de infección por OsHV-1 µvar.

21

Calibración Interlaboratorio

HERPEMOL

9. HOJA DE RESULTADOS En cada una de las hojas de resultados se debe identificar el laboratorio que ha realizado

el

ensayo

de

intercalibración,

cubriendo

para

ello

el

apartado

“LABORATORIO”. Una vez finalizados los análisis, las tablas correctamente cubiertas con los resultados se enviarán via e-mail a CETMAR. Los resultados obtenidos en la prueba de intercalibración quedarán reflejados en las tablas que se anexan, cubriéndolas de la forma que se indica en las siguientes instrucciones:

RESULTADOS HISTOLÓGICOS Las preparaciones histológicas en las que se observen signos de infección por herpesvirus se indicará en la tabla correspondiente con el signo

+ en la

columna “resultado”. La ausencia de signos de infección se indicará con el signo -. Cualquier otra particularidad digna de ser reseñada se indicará en la columna de observaciones.

RESULTADOS MOLECULARES

1

Los casos positivos de amplificación por PCR se indicará con el signo

+ en la

columna “PCR”. Los casos de amplificación negativos por PCR se indicarán con el signo

-

en

la columna “PCR”. La identificación positiva por RFLPs del virus herpes OsHV-1 o la variante OsHV1 µvar se indicará con el signo + en la columna de “RFLPs” que corresponda. La identificación negativa por RFLPs del virus herpes OsHV-1 o la variante OsHV-1 µvar se indicará con el signo

-

en la columna de “RFLPs” que

corresponda. En la columna de observaciones se indicará aquellas muestras que siendo positivas por PCR no pudieron ser analizadas por RFLPs, debido a la baja concentración de ADN en el producto de PCR, señalándolo como

“No

analizables”. Cualquier otra particularidad digna de ser reseñada se indicará en la columna de observaciones.

22

Calibración Interlaboratorio

10. BIBLIOGRAFIA CITADA

ostreid herpesvirus-1. Virology, 290(2), 342-349. Arzul I, Renault T, Lipart C (2001b). Experimental herpes-like viral infections in marine bivalves:

demonstration

of

interspecies transmission. Diseases

of

aquatic

organisms, 46(1), 1-6. Arzul I, Renault T, Thebault A, Gerard A (2002). Detection of oyster herpesvirus DNA and proteins in asymptomatic Crassostrea gigas adults. Virus Research, 84(1-2), 151160.

HERPEMOL

Arzul I, Nicolas J-L, Davison A J., Renault T (2001a). French scallops: A new host for

Batista F, Arzul I, Pepin J-F, Ruano F, Friedman C S., Boudry P, Renault T (2007). Detection of ostreid herpesvirus 1 DNA by PCR in bivalve molluscs: A critical review. Journal of Virological Methods, 139(1), 1-11. Batista F, Taris N, Boudry P, Renault T (2005). Detection of ostreid herpesvirus-1 (OsHV-1) by PCR using a rapid and simple method of DNA extraction from oyster larvae. Diseases of aquatic organisms, 64(1), 1-4. Cáceres-Martínez J, Vásquez-Yeomans R (2008). La patologia en moluscos bivalvos: principales problemas y desafios para la produccion de bivalvos en America Latina. En A. Lovatelli, A. Farias e I. Uriarte (eds). Estado actual del cultivo y manejo de moluscos bivalvos y su proyeccion futura: factores que afectan su sustentabilidad en America Latina. Taller Tecnico Regional de la FAO. 20-24 de agosto de 2007, Puerto Montt, Chile. Farley C A, Banfield W G, Kasnic GJr & Foster W S (1972). Oyster herpes-type virus.

1

Science 178, 759-760. Hine P M, Thorne T (1997). Replication of herpes-like viruses in haemocytes of adult flat oysters Ostrea angasi: an ultrastructural study. Diseases of Aquatic Organisms 29, 189-196. Hine P M, Wesney B, Besant P (1998). Replication of a herpes-like virus in larvae of the flat oyster Tiostrea chilensis at ambient temperatures. Diseases of Aquatic Organisms 32, 161-171. Hine P M, Wesney B, Hay BE (1992). Herpesvirus associated with mortalities among hatchery-reared larval Pacific oysters, Crassostrea gigas. Diseases of Aquatic Organisms 12, 135-142. Howard D. W., E. J. Lewis, B. J. Keller y C. S. Smith, 2004 Histological Techniques for Marine Bivalve Mollusks and Crustaceans. NOAA Technical Memorandum NOS NCCOS 5, 2nd edition, Oxford, Maryland, EE UU.

23

Calibración Interlaboratorio

HERPEMOL

Le Deuff RM, Renault T (1999). Purification and partial genome characterization of a herpes-like virus infecting the Japanese oyster, Crassostrea gigas. Journal of General Virology 80, 1317-1322. Minson AC, Davison A, Eberle R, Desrosiers RC, Fleckenstein B, McGeoch DJ, Pellet PE, Roizman B, Studdert DMJ (2000). Family Herpesviridae. In Virus Taxonomy. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses , pp. 203-225. Edited by M. H. V. van Regenmortel, C. M. Fauquet, D. H. L. Bishop, E. B. Carstens, M. K. Estes, S. M. Lemon, J. Maniloff, M. A. Mayo, D. J. McGeoch, C. R. Pringle & R. B. Wickner. San Diego: Academic Press. Nicolas JL, Comps M, Cochennec N (1992). Herpes-like virus infecting Pacific oyster larvae, Crassostrea gigas. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 12, 11-13. Renault T, Arzul I (2001) Herpes-like virus infections in hatchery reared bivalve larvae in Europe : specific viral DNA detection by PCR. Journal of Fish Diseases, 24:161-167. Renault T, Le Deuff RM, Chollet B, Cochennec N, Gérard A. 2000. Concomitant herpeslike virus infections in hatchery-reared larvae and nursery cultured spat Crassostrea gigas and Ostrea edulis. Dis Aquat Org 42:173-183. Renault T, Lipart C, Arzul I (2001). A herpes-like virus infects a non-ostreid bivalve species: virus replication in Ruditapes philippinarum larvae. Diseases of aquatic organisms,

1

45(1), 1-7 Renault T, Novoa B (2004). Viruses infecting bivalve molluscs. Aquatic Living Resources, 17(4), 397-409. Villalba A, Ramilo A, Abollo E, Fuentes J 2010. Mass mortality of European flat oyster Ostrea edulis spat associated with a viral infection in Galicia (NW Spain. Aquaculture Europe 2010 (Oporto, Octubre)

24