UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE BIOANALISIS

“Importancia de las Citocinas”

M O N O G R A F I A

Que para obtener el Título de:

LICENCIADO EN QUIMICA CLINICA i

i

Presenta:

.nrfCa

ROSA M ARIA P ER A LTA V A Z Q U E Z Asesor: Q.C. SAN D R A MURRIETA

X A LAPA, VER.

1999.

AGRADECIMIENTOS.

A DIOS Por su amor, su fé y su compañía.

A MIS PADRES Abel y Mercedes con mucho cariño, por haberme permitido concluir mis estudios y por contar con ellos en todo momento.

A MIS HERMANOS Abel y Claudia por crecer juntos y por estar conmigo cuando más los necesito.

A RAFAEL Con mucho amor, te agradezco el ser mi estímulo y tu apoyo incondicional para la realización de esta tesis.

A SANDRA MURRIETA Por ser una gran compañera y la asesora de este trabajo.

AL HONORABLE JURADO: Q.C. HECTOR ESCOBAR HENRIQUEZ. Q.C. SANDRA LUZ GONZALEZ HERRERA. Q.C. MARIA TERESA CRODA TODD. DR. FRANCISCO MALPICA.

INDICE: CAPITULO UNO. 1 - CITOCINAS. 1 .1 - Definición de citocinas. 1.2 - Descubrimiento y caracterización. 1 .3 - Propiedades generales. 1.4 - Funciones generales. 1.5 - Nomenclatura y clasificación. 1.6 - Bioquímica y fisiología.

Pag. i

n ■OliOT? > r i* \I »

CAPITULO DOS. 2 - CITOCINAS QUE MEDIAN LA INMUNIDAD NATURAL. 2.1 - Interferón tipo 1. 2.2 - Factor de necrosis tumoral. 2.3 - Interleucina-1. 2.4 - Interleucina - 6 . 2.5 - Quimiocinas.

CAPITULO TRES. 3 - CITOCINAS QUE REGULAN LA ACTIVACIÓN, PROLIFERACIÓN Y DIFERENCIACIÓN LINFOCITARIA. 3.1 - Interleucina-2. 3.2 - Interleucina -4. 3.3 - Factor transformador de crecimiento |3

CAPITULO CUATRO. 4 - CITOCINAS QUE REGULAN LA INFLAMACIÓN DE ORIGEN INMUNITARIO. 4.1 - Interferón y 4.2 - Linfotoxina. 4.3 - Interleucina-10. 4.4 - Interleucina -5. 4.5 - Interleucina-12. 4.6 - Factor de inhibición de la migración. CAPITULO CINCO. 5 - CITOCINAS QUE ESTIMULAN LA HEMATOPOYESIS 5.1 - Ligando de c-KIT. 5.2 - Interleucina -3. 5.3 - Factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos 5.4 - Factor estimulador de colonias de monocitos-macrófagos. 5.5 - Factor estimulador de colonias de granulocitos. 5.6 - Interleucina-7. 5.7 - Otras citocinas estimuladoras de colonias.

1 1 2

3 5 6

7

8 9 10 13 16 17

19 20 23 24

26 27 29 30 30 31

32

33 36 37 37 38 38 39 39

CAPITULO SEIS. 6 - ALGUNOS TEMAS CLÍNICOS RELACIONADOS CON LAS CITOCINAS 6.1 - Mielopoyesis. 6.2 - Oncología. 6.3 - Producción de citocinas por los tumores. 6.4 - Citocinas en el tratamiento de cáncer. 6.5 - Citocinas en el caso de sepsis. 6.6 - Otro rol: las vacunas.

CAPITULO SIETE. 7 - ENSAYOS Y BIOENSAYOS. 7.1 - Ensayos. 7.2 - Bioensayos. 7.3 - Inmunoensayos. 7.4 - Ensayos de Citocinas (ELISA y LIA). 7.5 - La necesidad de una estandarización. 7.6 - Aplicaciones clínicas.

“ 40 40 41 41 41 42

44 44 45 45 47

48

CONCLUSIONES.

49

BIBLIOGRAFIA.

50

CAPITULO UNO. 1.1 - DEFINICION: Las atocinas son proteínas de tamaño pequeño a mediano ó glicoproteínas utilizadas por las células inmunes e inflamatorias para comunicarse entre sí y para controlar el medio interior en el cual operan, con actividades potentes y biológicas diversas. La evidencia reciente sugiere que éstas son de inmensa importancia para controlar los sucesos locales y sistémicos de la respuesta inmune, la inflamación, hemopoyesis, el desarrollo neonatal y óseo, reparación de heridas (respuesta sistèmica a la lesión), y las interacciones entre las diferentes vías biológicas. Las atocinas pueden ser producidas como moléculas precursoras grandes que pueden ser procesadas mediante la proteólisis mediada por las enzimas hacia las formas de peso molecular más bajo. En ciertos ejemplos la forma precursora más grande es inactiva, mientras que las otras formas precursoras pueden tener actividad biológica. Las mitades de carbohidratos de las citocinas glicosiladas no parecen ser necesarias para la actividad biológica, pero pueden afectar su farm acodinam ia.(3,5) Las citocinas son moléculas secretadas característicamente en varias cantidades, las cuales son rápidamente sobrereguladas en respuesta a varios estímulos ambientales (incluyendo las concentraciones aumentadas de otras citocinas). Estas pueden tener efectos sobre sus células de origen (efectos autócrinos), sobre células adyacentes de otros tipos (efectos parácrinos) ó sistemáticamente (efectos endocrinos). En general, las citocinas se sintetizan en respuesta a estímulos inflamatorios ó antigénicos y actúan en forma local, de manera autócrina ó parácrina como se mencionó anteriormente, uniéndose a receptores de alta afinidad de las células diana. Ciertas proteínas pueden producirse en una cantidad suficiente para circular y ejercer acciones endocrinas. El término citocina describe a un grupo de péptidos con efectos inmunorregulatorios, siendo estos péptidos distintos de los factores de crecimiento que modulan la proliferación de células no inmunes. Numerosas enfermedades pueden ser explicadas basándose en una producción no balanceada de citocinas. Su secreción anormal puede prolongar los estragos patológicos, mientras que ciertas enfermedades pueden ser exacerbadas ó causadas por la secreción anormal de citocinas, como un fenómeno secundario después de un suceso iniciador, tal como la infección viral ó bacterial. Las anormalidades en la producción de las citocinas están involucradas en las enfermedades mediadas por células inmunes, tales como las alergias, el asma extrínseco, artritis reumatoide, el lupus eritematoso sistèmico, síndrome de Sjogrin, la

pancitopenia autoinmune y la psoriasis. Estas están involucradas en las malignidades tales como el mieloma múltiple, la leucemia aguda, la leucemia linfocítica crónica, la enfermedad de Hodking, el linfoma de Burkitt y la enfermedad de Castleman. La producción anormal de citocinas ocurre en las enfermedades inflamatorias incluyendo la pancreatitis, el síndrome de fuga capilar, la mielodisplasia, el mixoma cardiaco, la osteoporosis, rechazo de injertos, la curación de heridas, la falla renal y la malaria cerebral.(3,5)'

1.2 - DESCUBRIMIENTO Y CARACTERIZACIÓN. El descubrimiento de una citocina puede relacionarse con la investigación de una enfermedad infecciosa ó de una respuesta inmunitaria inducida por un antígeno. Los primeros estudios sobre las citocinas se realizaron a partir de 1950 y las describían como “numerosos factores proteicos producidos por diferentes células que mediaban funciones particulares en bioanálisis particulares ” . (12 20>En la segunda fase de investigación, en la década de los 70’s se llevó a cabo la purificación y caracterización parcial de muchas citocinas y se observó primero que diversos efectos mediados por citocinas, estaban a menudo producidos por las mismas moléculas. Por ejemplo: El Interferón (IFN-y) fue descubierto por virólogos como “una proteína antiviral derivada de la célula T” y de forma independiente por inmunólogos como “activador de las funciones de los macrófagos derivados de las células T . ( )' Una importante hipótesis generada en ese momento fue que las citocinas eran sintetizadas principalmente por leucocitos que actuaban básicamente sobre (otros) leucocitos y por ello las denominaron interleucinas (IL). Por ejemplo: A un coestimulador de la actividad de los timocitos derivados de los macrógafos se le llamó IL-1, y a un factor de crecimiento derivado de la célula T se le llamó IL-2. No obstante las preparaciones de citocinas de las que se disponían en ese tiempo solían ser impuras, y muchos de los anticuerpos anticitocina no eran absolutamente específicos de esta citocina, por lo que fue una de las limitantes metodológicas que evitaron la identificación firme de los factores activados como la misma molécula ó moléculas distintas. La edad de oro de las investigaciones de las citocinas fue en la década de los 80’s donde se realizó la clonación y expresión molecular de citocinas individuales y la producción de anticuerpos neutralizantes completamente específicos, a menudo

3

monoclonales. Esto permitió una identificación propiedades de la molécula de citocina. (12'20)-

definitiva

de

la estructura

y

En esta etapa de investigación, fue más que una culminación del trabajo previo, porque además, se descubrieron muchas citocinas nuevas y se revelaron muchas propiedades inesperadas de citocinas conocidas. Los últimos 50 años han presenciado el reconocimiento y caracterización de muchas hormonas producidas por células especializadas. Desde los experimentos de Rich y Lewis en 1932, sin embargo, ha estado claro que las células con funciones específicas tales como la inmunidad y la fagocitosis son capaces de producir moléculas de señalamiento solubles.(20)El desarrollo de la tecnología de DNA en los últimos 10 años se ha convertido en una serie de factores y actividades que ha demostrado que está formado por un gran número de péptidos bien definidos que llevan los signos de actividad, crecimiento y diferenciación de un amplio rango de células. Su importancia en el diagnóstico y tratamiento de la enfermedad es probablemente enorm e.(9)'

1.3 - PROPIEDADES GENERALES. Aunque las citocinas son un grupo de diversas proteínas, comparten varias propiedades... I)

Las citocinas se producen durante las fases efectoras de la inm unidad natural y específica, y sirven para m ediar y regular las respuestas inm unitarias e inflam atorias. En la inmunidad natural, los productos microbicidas, como el lipopolisacárido (LPS), estimulan directamente a los fagocitos mononucleares a secretar sus citocinas. Por el contrario las citocinas derivadas de las células T se producen en respuesta sobre todo al reconocimiento específico de antígenos extraños. Sin embargo, estas distinciones no son absolutas porque las citocinas producidas por un tipo celular suelen regular la síntesis de citocinas por otras células.

II)

La secreción de citocinas es breve, autolimitada. En general, las citocinas no se almacenan como moléculas pre-formadas, y su síntesis se inicia por una nueva transcripción genética. Esta activación suele ser transitoria, y los RNAm que modifican las citocinas suelen ser inestables. La combinación de un periodo corto de transcripción con un RNAm de vida corta, asegura que la síntesis de citocinas sea transitoria. Algunas citocinas pueden controlarse además por ciertos mecanismos, como la liberación proteolítica de un producto activo a partir de un precursor inactivo. Una vez sintetizadas, las citocinas suelen secretarse con rapidez, lo que dá lugar a un pico de liberación de citocinas cuando se necesita.

4

III)

Muchas atocinas son producidas po r muchos tipos celulares. La fuente celular de estas moléculas no suele ser una característica que las distinga. Pero como ya se ha mencionado entre las células que intervienen en su formación están los fagocitos mononucleares, linfocitos T activados y linfocitos.

IV)

Las citocinas actúan sobre diferentes tipos celulares. Esta propiedad se llama pleiotrofismo. Al concepto de que las citocinas son básicamente moléculas producidas por los leucocitos que actúan en particular sobre los leucocitos (interleucinas) se le considera demasiado restringido.

V)

Las citocinas tienen a menudo m últiples efectos diferentes sobre la misma célula diana. Algunos efectos pueden ser simultáneos, mientras que otros ocurren en franjas de tiempo diferentes(es decir, minutos, horas o d ía s ).(3,5)

VI)

Las acciones de las citocinas son a menudo redundantes. Muchas funciones atribuidas originalmente a un a citocina comparten propiedades de varias citocinas diferentes. Esta observación se ha reforzado con el estudio de los ratones =Knock-out= que carecen de genes de una citocina particular que puede mostrar solo alteraciones sutiles en sus respuestas inmunitarias,

VII)

Las citocinas a menudo influyen en la síntesis de otras citocinas. Produciendo cascadas en las que una segunda o tercera citocina pueden mediar los efectos biológicos de la primera. La capacidad de una citocina de aumentar o suprimir la producción de otras citocinas puede proporcionar importantes mecanismos reguladores positivos y negativos para las respuestas inmunitarias e inflamatorias.

VIII)

Las citocinas a menudo influyen en la acción de otras citocinas. Dos citocinas pueden interaccionar para antagonizar sus acciones, producir efectos aditivos ó, en algunos casos, producir efectos mayores de los previstos e incluso distintos, un tipo de acción que se llama “sinèrgica”.

IX)

Las citocinas, como otras hormonas polipeptídicas, inician su acción uniéndose a receptores específicos en la superficie de la célula diana. La célula diana relevante puede ser la misma célula que secreta la citocina (acción autócrina) una célula cercana (acción parácrina) o, como las verdaderas hormonas, una célula distante que se estimula a través de las citocinas secretadas a la circulación (acción endocrina). En consecuencia solo necesitan producirse cantidades muy pequeñas de citocinas para desencadenar efectos biológicos.

X)

La expresión de muchos receptores de citocinas está regulada p o r señales específicas. Esta señal puede ser otra citocina ó incluso la misma citocina que se une al receptor, permitiendo la amplificación positiva ó la retroalimentación ne gativa .(3,5)-

5

XI)

La m ayor parte de las respuestas celulares a las atocinas precisan RNAm nuevo y la síntesis proteica. El mecanismo por el que la unión de la citocina a un receptor de superficie celular estimula transcripción se explicará más detalladamente. Algunos estudios recientes han identificado secuencias de nucleótidos en las regiones adyacentes a los genes, cuya transcripción se activa por la acción de las citocinas. Se cree que las citocinas estimulan la producción ó la unión de factores nucleares reguladores específicos a estas secuencias diana, y que tal unión produce la transcripción.

XII)

Para muchas células diana, las citocinas actúan como reguladores de la división celular, es decir, como factores de proliferación. Algunos inmunólogos prefieren que las citocinas se clasifiquen con los factores de proliferación celular epitelial y mesenquimal en un grupo funcional mayor de moléculas reguladoras polipeptídicas. Sin embargo ahora se prefiere separar a aquellas moléculas cuyas acciones básicas son la mediación de la defensa del huésped (es decir, las citocinas), de aquellas moléculas cuya función básica reside en la reparación de tejidos (es decir, los factores de proliferación celular polipeptídicos epitelial y mesenquimal). (3'5)'

1.4 - FUNCIONES GENERALES. A continuación, se han organizado a las citocinas específicas en 4 clases de funciones amplias: A) M ediadores de la Inm unidad natural. Desencadenadas por agentes infecciosos a partir de los fagocitos mononucleares. En donde se encuentran: • Interferón tipo 1. • Factor de necrosis tumoral. • lnterleucina- 1 . • lnterleucina- 6 . • Quimiocinas. B) Citocinas que regulan la activación, proliferación y diferenciación linfocitaria. Que surgen en respuesta al reconocimiento de antígenos específicos por los linfocitos: • lnterleucina- 2 . • lnterleucina-4. • Factor transformador del crecimiento (5 C) Reguladoras de la inflam ación de origen inmunitario. Que activan a células inflamatorias inespecíficas en respuesta a antígenos específicos por los linfocitos T: • Interferón y. • Linfotoxina. • lnterleucina- 10 . • lnterleucina-5. • lnterleucina- 12 .

6

D) a to c in a s que estim ulan la proliferación y diferenciación de los leucocitos inm aduros (hematopoyesis). • Ligando de c-KIT: • lnterleucina-3. • Factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos. • Factor estimulador de colonias de monocitos- macrófagos. • Factor estimulador de colonias de granulocitos. • lnterleucina-7. • Otras citocinas estimuladoras de colonias. Esta clasificación se basa en las que perecen ser las principales de las diferentes acciones biológicas de una citocina, aunque como se verá más adelante, muchas citocinas pueden actuar en más de una c la s e .

4.2 - LINFOTOXINA La linfotoxina es una glupoproteína de 21-24 kD que presenta una homología de aproximadamente un 30% con el TNF, y compite con él por la unión a los mismos receptores celulares (como ya se mencionó, la LT se denomina a veces TNF-(3). En los seres humanos, los genes de la LT y del TNF se localizan dentro del MHC del cromosoma 6 . La LT la producen exclusivamente los linfocitos T activados, y a menudo se produce junto al IFN-y en tales células. La LT, humana, al contrario que la TNF, contiene 1 ó 2 oligosacáridos unidos por enlaces N (responsables de la variedad del tamaño molecular). Además, la LT se sintetiza como una verdadera proteína secretora sin región transmembranosa. Recientemente se ha descrito un tercer miembro de la familia TNF/LT. El producto genético llamado provisionalmente LT-(3 es una proteína de superficie celular que se une a la LT para formar un complejo de superficie que media los efectos de la LT sobre otras células. La mayor parte de los estudios han encontrado pocas diferencias entre los efectos biológicos del TNF y de la LT, compatible con su unión al mismo receptor. La más importante distinción entre estas citocinas parece ser que la LT la sintetizan solo las células T, deriva predominantemente de los fagocitos mononucleares. En general, las cantidades de LT, sintetizadas por las células T son mucho menores que la de TNF sintetizadas por los fagocitos mononucleares estimulados por el LPS. Por lo tanto, la LT habitualmente actúa como un factor parácrino y no como mediador de lesión sistèmica. Aunque ni el TNF ni la LT son tóxicos para las células normales (no neoplásicas), ambos pueden participar en la lisis de células diana mediada por los LTC..

UNFOCITOST

de colonias de granuloatos -

Los nombres asignados al CFS reflejan los tipos de colonias que surgen en estos análisis. Es interesante señalar que muchos de los CFS se localizan en un grupo de genes en el cromosoma 5 humano, incluyendo a la IL-3 y el G M -CbK La IL-4 y la IL-5 se han localizado en este mismo complejo. Algunas de las acciones de los CSF están influidas por otras atocinas Por ejemplo, el TNF, la LT, el IFN-y y el TGF-p inhiben la proliferación de las células progenitores de la médula ósea. Por el contrario, la IL-1 y la IL-6 aumentan la respuesta a los CSF En general, se cree que las citocinas son necesarias para la normal función de la médula ósea y para proporcionar un medio de ajuste fino en respuesta a la estimulación. Algunos de los CSF específicos se enumeran a continuación

;s

A A ^ 'r it

i

C E L U L A O lA N A

C E L U L A f?

Activación

lntertucina-3

CSF granulocitosmacrófagos

24 Kd (monómero)

1

Ligando de c- KIT

CSF de granulocitos

lnterteucina-7

Célula madre pluripotencial

Progenitora inmadura

Proliferación y diferenciación de todas las lineas celulares.

1

22 Kd (dimero)

1

22 KD (dimero)

Célula T, fagocito mononuclear Célula endotelial. fibroblasto

Progenitora inmadura

diferenciación de 1 todas las lineas celulares.

1

40kD (dimero)

Fagocito. mononuclear, endotelial

Progenitora inmadura

diferenciación de todas las lineas celulares

1

19 kD (dimero)

1

25 kD (monómero)

célula

célula

Progenitora inmadura

Proliferación i diferenciación todas las celulares

Fibroblasto, células estromales de la médula ósea

Progenitora inmadura

Proliferación diferenciación linfocito.

Fagocito, mononuclear, endotelial

Abreviaturas. CSF. ftjet or estimular te de colonias. kD kilodalton -------------------------------

de

Célula T. fagocito mononuclear Célula endoteliai, fibroblasto

de

CSF de macrófagos

Célula estromal médula ósea T

y! de lineas

y a

36

5.1 - LIGANDO DE c-KIT La célula madre pluripotencial expresa un receptor de tirosín cinasa en la membrana que se ha identificado como el producto proteico del oncogén celular cKIT. La porción extracelular de este receptor contiene 5 dominios de Ig. A la citocina que interactúa con este receptor se le ha llamado Ligando de c-K IT y también se le denomina factor de la célula madre. El ligando de c-KIT se sintetiza en las células estromales de la médula ósea (incluidos los adipocitos. Los fibroblastos y las células endoteliales) en dos formas: • •

Proteína transmembranosa de aproximadamente 27 kD Proteína secretada de aproximadamente 24 kD.

Estos productos diferentes son el resultado de la religación alternativa del mismo gen. La forma soluble de este ligando no existe en una cepa de ratones mutantes llamada Factor A cero}3,5) El ratón con el factor acero tiene huecos selectivos en la poblaciones celulares derivadas de su médula ósea (por ejemplo, una producción inadecuada de mastocitos y eosinófilos), que se llevado a la conclusión de que la forma superficial celular del ligando de c-KIT es más importante que la forma soluble, para la estimulación de la maduración de las células madre a varias líneas hematopoyéticas. Todavía no es posible purificar un número elevado de células madre para su análisis directo. Muchas de las conclusiones sobre el ligando de c-KIT y otros CSF de acción precoz, derivan de experimentos en los que se exponen poblaciones enriquecidas con células madre a citocinas en cultivo, y se analizan las tipos de colonias que surgen. A partir de este tipo de experimentos, se cree que el ligando de c-KIT es necesario para que la célula madre sea sensible a otros CSF, pero este no produce la formación de colonias por sí solo. Los cultivos de células de médula ósea que contienen células estromales no necesitan un aporte exógeno del ligando de c-KIT ya que estas células no lo expresan.(3)-

37

5.2 - INTERLEUCINA - 3 La interleucina 3 (IL-3) también conocido como factor estim ulante de colonias de m últiples líneas (multi-CSF) es un producto de 20 a 26 kD de las células T CD4+ que actúa sobre la mayor parte de los progenitores de la médula ósea inmaduros, y que promueve la expansión de células que se diferencian en todos los tipos de células maduras conocidos. La IL-3 es un miembro de la familia de citocinas de 4 hélices. En el ratón la subunidad transductora de señales es única. La mayor parte de los análisis funcionales de la IL-3 se han hecho en ratones. Se ha encontrado que la IL-3 también promueve la proliferación y el desarrollo de los mastocitos a partir de progenitores de médula ósea, una acción aumentada por la IL-4. La IL-3 es producida por las células T cooperadoras CD4+ de los subgrupos TH1 yTH2. La IL-3 humana se ha identificado mediante la clonación de DNA complementario (DNAc) de una molécula homologa a la IL-3 de ratón. Aunque la citocina 3 es sintetizada por algunos clones de células T humanas, ha sido más arduo establecer la función de esta citocina en sistemas experimentales de hematopoyesis en seres humanos. De hecho, muchas acciones atribuidas a la IL3 múrida parece que las realiza el CSF de granulocitos macròfago humano. No se sabe si estos resultados experimentales reflejan diferencias entre especies ó en la condiciones experimentales. Si se trata de una diferencia entre especies, puede relacionarse con la diferente estructura del receptor de la IL-3.(3,11)

5.3 - FACTOR ESTIMULADOR DE COLONIAS DE GRANULOCITOSMACROFAGOS. El factor estimulador de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF) es una glucoproteína de 22 kD sintetizada por las células T activadas y por los fagocitos mononucleares activados, las células endoteliales y los fibroblastos. El GM-CSF es un miembro de la familia de citocinas de 4 hélices. Su receptor consta de una subunidad única y una subunidad transductora de la señal 150 KD. Como se dijo antes, esta última subunidad la comparte el receptor de la IL-5, y en los seres humanos pero no en los ratones, el receptor de la IL-3. El GM-CSF del ratón actúa básicamente en los progenitores de la médula ósea ya comprometidos en el desarrollo a leucocitos, y por ello actúa sobre poblaciones más diferenciadas que la IL-3. En los sistemas humanos, sin embargo, el GM-CSF también promueve la proliferación de células que todavía no se han comprometido en evolucionar a leucocitos (por ejemplo, plaquetas y progenitores de hematíes) reemplazando a la IL-3. El GM-CSF también activa a leucocitos maduros. Por ejemplo, imita a algunas de las acciones del IFN-y como activador de macrófagos, aunque es menos potente.

38

El GM-CSF no se detecta en la pertérícos el GM-CSF en los lugares en que se produc®_°® ® pueden intervenir principalmente en la nroducido por la células T y macrofagos p«teoen respuestas inmunitanas activación Se los leucocitos maduros e n ^ " / é . f c o s pueden estar mediados por inflamatorias, “ T |as células endoteliales ó los fibroblastos de la el GM-CSF producido por la células i , médula ósea.

a He

Se ha utilizado

para e s S a /l^ r e T u p e r a c ió n de la -

- —

e de 13 médu'a ~

5 .4 . f a c t o r e s t im u l a d o r d e c o l o n ia s d e m o n o c t o s - m a c r o f a g o s El factor estimulador de co|0™a* Sétulas endoteliales y los £ llamado CSF-1. es sintetizado.por'a ^ " ^ a d a m e n t e 40 kD i * ™ * ™ fibroblastos. El polipetido secretado re(aciona estructuraímente con el c-KIT.

celular normal del oncogen viral v-fms. Fl M-CSF actúa básicamente sobre aquellos en el desarrollo a monocitos, y

la cédulas sobre

&e\M C SF no circula, y el principal efecto —

,oca' den,r° de *

medular.(5)

FACTOR ESTIMULADOR DE COLONIAS DE GRANULOCITOS.

55

'

E1 fa c o r estimulador de colones

las

mismas

células g ue

° £

C le m e n te forma un dímero. El G-C^ f ^

de'°a fe m to de citocinas de 4 hélices a. Al contrano que otros C normalmente circula. Actúa básicamente sobre i r ^ a r r o llo a granulocitos, de nuevo

P

. . .

15.7)

médula .15,71

^

Un^ Q . CSF „

comprometidos en

pob|aclón más madura que la que P Duecie actuar a distancia, la

5 6 - INTERLEUCINA IN i tn L c u w n « »- 7■ La interleucina - 7

B T fm a y o rep a rte d rio semodelos de " S ^ c o m —desarrollo n que la IL-3 o el GM-CSF. nivel de

¿

s

p

o ia Estudios

recientes sugieren ^

: »

r o

b

, a m

e n

t e

s o

u y precozmente

b

r e

c é l u

, a

s

3 1

m

, s m

o

IL-7 puede también estimula y q q 4+ y c ü 8+ inmaduras en el timo.

2 ¡: - »

rio la IL-7 en el timo.

ú n m

- “

e 81ori9e" ce,u,ar

on pxceso la IL-7 muestran un en ,a módula ósea y en los „ i d o s

n ra rc a ^ linfoides periféricos.

s 7 . OTRAS CITOCINAS ESTIMULADORAS DE COLONIAS. La IL-9 es una proteína de 3 ° a 4C> kD que ^ Sin embargo, no, »

~

d e ^o s mastocitos^

,ín6aS 3

« b e si

"

8U Pre° UrSOreS

'e M a ^ g u lic ió n de las

normales (diferentes e a h matop0yesis ¡n vitro. respuestas inmunttanas o en ,a hem P , La IL-11 es un citocina de la n z a r s e e x p e l—

^

^

-ras su activación (que puede

m e n te mediante agentes farmacologtcos).

ua IL-11 estimula la r P e g a c a n o p o y e t * t y d e X X T ' f m a cró fa g o ^y quizás d e s o irá s H n e a s ^ ^ u la re s a p a rtirle precursores medulares.

40

CAPITULO SEIS ALGUNOS TEMAS CLINICOS RELACIONADOS CON LAS CITOCINAS 6.1 - MIELOPOYESIS. c n r 9r s F n MCSF v ^ N ^ ^ e c l a ^ a proIrteraclóR1 y 'diferenciación de las GMCSF, GCSF, MCSF y . sorDrendente número de factores de células mieloides. En los humanos aP una región sobre el brazo largo del crecimiento mielopoyetico han :sido ^ eventos de translocalizacion o cromosoma 5 frecuentemen codificación de genes para GMCSF, MCSF, desalojamiento vistas en ai euc . s¡do localizados en la región IL-3, IL-4, IL-5, y el receptor celular pa a el m l ^ ,|n v |v 0 sug¡ere que estas 5P23-35. La evidencia de ambos * s,® breregu|ación de la m ie lo p o y e s is j^e n el aumento d e M ic e de liberación de células sanguíneas hacia la circulación.

.

6 2 . ONCOLOGIA (CITOCINAS COMO FACTOR DE CRECIMIENTO AUTOCRINO)

Los sistemas experimentales indicari que 'a jr a n s .o m ja c ^ ocurrir mediante un circuito ae,oqr' ° ' Muchas lineas celulares malignas, y ejemplo, el factor de < = ^ ' ^ 0slX t a ™ y responden a la citocinas y factores de tumores extraídos de Pacientef ; . ^ ? ' as noS han nevado a la hipótesis de que las crecimiento. Estas y otras cara factores de citocina/crecimiento, y de sus ^

e

"

ee x p r e s ^ R e c e p to re s , pueden yacer bajas formas de malignidad.

Alguna evidencia indica que este m e c a m s m abtPó c rjt0 y e| sarcoma d e ^a p o sL ^o m le "é tfa cto r decrecim iento de fibroblastos puede tomar este rol. Matsuda ha demostrado q u e la ^ puede producir y responder a !a como el origen de la IL-6 , pero co pacientes con mieloma, las. f ulas áP f e

«

U'aha, ^ >h ^ ¡madamente el 50% de los responden a la IL -6 y que la anti IL-6 de ,a tim ,dina terciada, sugiriendo que la C i m i e n t o a u to c h n o -

41

6.3 - PRODUCCIÓN DE CITOCINAS POR LOS TUMORES. Ambos nodulos linfáticos, el de mixoma cardiaco y el hiperplásico de la enfermedad de Kastleman puede producir altas cantidades de 11-6. Esto es interesante porque ambas condiciones están asociadas con la activación de células B policlonales, la hipergamaglobulinemia, la fiebre y la producción de proteínas de fase aguda. En la enfermedad de Kastleman puede existir también el mieloma múltiple. La removisión de los nodulos linfáticos involucrados resultan de la recuperación completa.(25)

6.4 - LAS CITOCINAS EN EL TRATAMIENTO DEL CANCER. Los interferones y el TGF-(3 tiene propiedades inhibidoras de crecimiento para un amplio rango de tipo de células. La utilidad clínica de los IFN ha sido resumida como = buena en la leucemia de células velludas, regular en otros cánceres hematólogicos y mala en los tumores sólidos =. La IL-2 ha sido infundida en pacientes con cáncer metastásico con algo de mejoramiento en la carga de células de tumor. Cuando se combina con las células destructivas activadas con la linfoquinas (las células destructivas naturales expuestas a la IL-2), las respuestas son un tanto mejoradas pero, aún así, son desilucionantes.(25)

6.5 - CITOCINAS EN LOS CASOS DE SEPSIS. Las concentraciones aumentadas del TNF en el suero han sido observadas en humanos y en animales después de inyección de endotoxinas, con un punto máximo de 2 horas y un retomo a la línea de base a las 6 horas. Varios estudios han medido el TNF y otras citocinas en la sepsis. En las sepsis muy severa negativa de Gram, las concentraciones de TNF están aumentadas en la mayoría de los pacientes, a veces hasta muy altos valores, mientras que la IL-1 y el TNF están aumentados en 20% de los casos. En un grupo de pacientes admitidos a una unidad de cuidados intensivos con choque séptico, el TNF está aumentado en solamente el 25% de los casos. Sin embargo, todas las concentraciones antes mencionadas indicaron una correlación reciente de las concentraciones de TNF y la mortandad en el choque séptico. Es difícil definir un valor por encima del cual la procnosis disminuye marcadamente, particularmente porque la concentraciones vistas en la mayoría de las pacientes con choque séptico severo son menores que aquellas en los voluntarios humanos después de una inyección de endotoxina sin consecuencias dañinas. La sepsis, la concentraciones de TNF, fueron mantenidas durante 2-6

horas sugiriendo que ia vibración sostenida de l a e n d o n a duradón y .a resultado. Ademas, el TNF circula

^

A p lica d o como el único y¡J que ,a relaclon con otras

^

dt^'inas'y^a'en doto xina circulatoria misma debe ser importante.

Actualmente la esta clase de información en el techa*

^ S “ e, ¡ndicador de protección, dada la

'

— Cabe mencionar que no solamenJ ^ ^ b ^ m n ' ^ r c T

“ .

i

—

*

quemaduras y en los recha.os

■ • _4.„ (1.22.25)

de injerto.'

6.7 OTROKUL. ROL:i_no LAS vVACUNAS 6 7 - -OTRO /-ww Además de la co n sid e ra ció n j*i la I M 2> c o n o, un

—

r

«

b = a e t ^

r ded°o e s « r fu " e SxIm fnadosV on el mismo ratones mostraron una respuesta " £ ^ ^ ^ £

—

—

*

0

0

* » de forma TH2 de

s r j ^ s ; »

*

te d o re s .

Varios otros modelos de « c u n a s ^ leishmaniasis el investigador

IL-6 , en los primeros no humanos en * están están siendo siendo investigados investigaos todavía.■

ca u s a -

"

r

s

S

En ,a

¡ da dPderep e n s i E a ha demostrado — do con

y

enfermedades

H

S

s

»

: a l

, e

i i d

0

43

asociado con la esquistosomiasis (una infección helmíntica propia del agua). Este daño es causado principalmente por la reacción del sistema inmune a los huevecillos del parásito, los cuales son depositados en el hígado e inducen una vigorosa respuesta TH2 asociada con la formación de masas de tejido inflamado, ó granulomas, y el engrasamiento del tejido conectivo conocido como fib ro s is .(3)

44

CAPITULO SIETE

ENSAYOS Y BIOENSAYOS. 7.1 - ENSAYOS DE CITOCINAS Virtualmente todas las citocinas pueden ser mediadas con un apropiado bioensayo, esto no es sorprendente ya que la mayoría de las citocinas fueron originalmente descritas como factores biológicamente activas y fueron subsecuentemente purificadas y biológicamente caracterizadas. Sin embargo, los bioensayos no son ideales y los sistemas apropiados de inmunoensayo serán requeridos antes de que la medición de las citocinas pueda volverse un adjunto útil para la Química Clínica.

7.2 BIOENSAYOS. El problema más importante con los bioensayos es que estos no son específicos. Como ejemplo se encuentran los intentos para desarrollar un bioensayo específico para la IL-1,, aunque el ensayo general de proliferación de timocitos fué descrita como un ensayo específico de IL-1, muchas citocinas han demostrado que influyen en este. La IL -6 y el TNF pueden reemplazar a la IL-1, y la IL-2 e IL-4 pueden sinergizar con la IL-1. En un intento para evitar estos problemas, se han desarrollado varias modificaciones en la metodología. Utilizando anticuerpos neutralizadores específicos, uno puede demostrar que la actividad reside en la IL-1 ó IL-6 . Saturando el ensayo con IL-2 ó IL -4 se puede desechar la influencia de estas citocinas en el examen de muestra. Cabe mencionar, que la actividad biológica medida en algunos bioensayos es menos que el aparentemente medido por el inmunoensayo -ta l vez a causa de los factores inhibidores- en las moléculas de enlace de las citocinas ó las citocinas biológicamente activas pero inmunoreactivas. Las moléculas de enlace de las citocinas en el suero y en la orina han sido descritas para la IL-1, la IL-6 y el TNF. La mayoría de los bioensayos de citocinas son un trabajo intenso, caro y sujeto a considerable influencia del operador. Aunque obviamente no es ajustable para los exámenes de laboratorio y de rutina de Química Clínica, estos tienen algunas ventajas que los hacen invaluables, al menos que el roll de los ensayos de citocinas esté siendo determinado. Generalmente estos son muy sensitivos, detectando citocinas en forma de monogramas por milímetro Además, los materiales requeridos para el bioensayo son a menudo más fácilmente aprendidos que los del inmunoensayo; es particularmente difícil obtener buenos anticuerpos específicos para algunas citocinas. Por lo tanto la aplicación de bioensayos puede identificar cuales áreas garantizan la inversión en el desarrollo de un inmunoensayo.(5,23)

45

7.3 - INMUNOENSAYOS DE CITOCINAS. Aunque los inmunoensayos tienen varias ventajas distintas sobre los bioensayos (métodos simples para usar y controlar), la introducción de los inmunoensayos de citocinas hacia los exámenes de laboratorio de Química Clínica no es directa. Los inmunoensayos de varias citocinas están ahora disponibles de fuentes comerciales, pero son de alto costo y en general han sido validados como herramientas de investigación, a menudo solamente para los cultivos celulares. En muchos casos, estos inmunoensayos carecen de sensibilidad para su uso con plasma, y algunos están sujetos a la interferencia del factor reumatoide ó los anticuerpos hetereofílicos. Estos son imprecisos y a menudo no demuestran perfiles de recuperación aceptable de plasma, fluido cerebroespinal ó líquido sinovial. Por lo tanto, cuando sea posible, los laboratorios que se interesan en la medición de citocinas en número sustancial de tomas necesitarían establecer sus propios ensayos. En esta forma ellos pueden asegurar la validez de sus resultados y motivar a la producción de reactivos tales como los anticuerpos específicos de citocinas.(3,5)

7.4 - ENSAYOS DE CITOCINAS La formación de colonias eritroides en los ensayos de colonia de la médula ósea, la estimulación de la eritropoyesis en los ratones policitémicos post-hipóxicos y la estimulación de la síntesis heme en las células de la médula ósea ratas- humanos pueden ser analizadas mediante un examen de ELISA ó por un radioinmunoensayo (RIA). La GM-CSF estimula la proliferación de los granulocitos y el macròfago tanto como la diferenciación y activación de la histamina. Este tiene un potente efecto sobre varias líneas de células, es difícil de detectar en la sangre periférica aun en la infección bacterial ó la endotoxemía, pero puede ser detectada en el fluido cerebro espinal durante la meningitis bacterial. Este también puede ser examinado por el examen ELISA Y RIA. Los bioensayos para el G-CSF son realizados al examinar la formación de la colonia de granulocitos en los ensayos de colonia de la médula ósea, el mejoramiento de la producción de superóxidos en los neutrófilos, ó la proliferación de una línea de células murinas. El G-CSF ha demostrado ser útil para movilizar las células tallo de la médula ósea humana hacia la sangre periférica, poniéndola disponible para su recolección, para uso posterior en la trasplantación de células tallo. La G-CSF también ha sido utilizada para medir la toxicidad de la quimio y radioterapia en médula ósea y puede inducir el reclutamiento de células malignas. Otra de las funciones es la proliferación de líneas específicas de la células leucémicas. El factor de células de tallo es un cofactor de la hemopoyesis temprana, producida por las células estromales. Este tiene una actividad relativamente pobre

sido desarrolladas. Por otro lado, la IL-2

s

» - - — La

i l -3

estimula

"

los

ensayos de formac ofreciendo examenes EL

—

res; ; '

" u e d e T e ' " “^ «

o

basófilos ^

por la

^ )L 3 P

r Aiuias j y NK y

La 1L 4 activa las células B, induce ' ^ P ^ f u n e T s d'e o é fu ts específicas

s

?

s

?

S

=

s s f ®

S

i H S

2¿

=

S

S

«

5W ssE

de células. Los ELISA en est

^ ^ proliferación de

LA |L -6 estimula la secreción de an' ICU^ ° al¡zada al medir la proliferación de IOS «mocitos y la hemop,cyesis J r t a p u r * • el mitógeno ó la línea p t e y * ™ líneas de células, la cél“ j f s de®ec,ada% o r su mejoramiento de la

tóboratórios^estón W ^a n d ^ d^ada^tarla^aj^examen ^

r S S m q

* *

T '3

aaaaya

un factor de pronósticos en Íos pacientes^oort míe,orna múltiple.

^

El factor de necrosis d® ^ d ^ r a c t i v a c i ó n T s t ó o c l á s i c a , la estim ularon activación de

PT

T

0< o Z o ^ de factor decrecimiento

Sleucocitorhumano H ^ LA?.eM( S 3,f,23)s s s s s w las moléculas de adhesión.

s s « - 4- .

47

7 5 C TO cS um Tn^S 3 rASETEsfDADEpORBSNTE0STANSARIZACIÓN. I

mprliciones de laboratorio de las citocinas

r sr

pr

condusiones errén eas.A

analizar ciertas cltoc,n

xr¿ i

«

rpsDonder a diferentes atocinas y a su v

‘

P

,‘zzszsr¿£Z-rj,« ' " Z

Z

—

v

s

s

9 lo s estándares de la citocinas humanas y£ r| f 0^ disponibles en el Instituto Naciona de Estándar g

^

S

‘S

/ "

g

^

t

a

t t TGF-

m.csf

s ,* ¿ r S í: ” s s s v s - .« r ;" " rr® .

internacionales. La nat

. ,

0f

x

s

~

m uso

s

~¡

¡dadoso del espécimen.

* * s z ó sse°n « s r s r s (jc 0 con sus ensayos apropiados,

aumentado d e ja s e preparado para apoyar en el

g

Las técnicas exactas son el requisito obvio para anaHaar es

¡ r s m„ié c u la s