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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

A61K 31/135 (2006.01) A61K 31/485 (2006.01) A61P 25/30 (2006.01) A61P 25/36 (2006.01)

ESPAÑA

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11 Número de publicación: 2 283 049

51 Int. Cl.:

TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 98904609 .9

86 Fecha de presentación : 21.01.1998

87 Número de publicación de la solicitud: 1003494

87 Fecha de publicación de la solicitud: 31.05.2000

54 Título: (d)-metadona, un analgésico no opiáceo.

30 Prioridad: 22.01.1997 US 35308 P

73 Titular/es:

CORNELL RESEARCH FOUNDATION, Inc. 20 Thornwood Drive, Suite 105 Ithaca, New York 14850, US

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

72 Inventor/es: Inturrisi, Charles, E.

16.10.2007

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Elzaburu Márquez, Alberto

ES 2 283 049 T3

16.10.2007

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid

ES 2 283 049 T3 DESCRIPCIÓN (d)-metadona, un analgésico no opiáceo. 5

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. nº de Serie 60/035.308, presentada el 22 de Enero de 1997, que se incorpora aquí por referencia. Este invento fue desarrollado con fondos públicos para el “National Institute on Drug Abuse”, números DA01457, DA07274, DA00255 y DA00198. El Gobierno de EE.UU. puede tener ciertos derechos.

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Campo del invento

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El presente invento se refiere al tratamiento del dolor y de la tolerancia y la dependencia física asociadas con el uso repetido de opiáceos para el dolor, utilizando d-metadona. Además, el presente invento se refiere al tratamiento de la tolerancia, la dependencia física y/o el deseo vehemente asociados con la adicción a narcóticos, usando d-metadona. Antecedentes del invento

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La tolerancia y la dependencia física son consecuencias previsibles de la administración crónica de morfina y opiáceos similares a la morfina. Estas propiedades farmacológicas de los opiáceos son indeseables tanto para el adicto a opiáceos como para el paciente aquejado de dolores. En el adicto a opiáceos, la tolerancia a los efectos de un opiáceo sobre el estado de ánimo da lugar a un rápido aumento de la dosis. Además, su retirada es un estímulo poderoso que engendra una conducta de búsqueda de fármacos. Para el paciente aquejado de dolores, la tolerancia a la analgesia por opiáceos requiere un aumento de la dosis, lo que puede dar lugar a un aumento de efectos negativos [C. E. Inturrisi, “Opioid Analgesic Therapy in Cancer Pain”, Advances in Pain Research and Therapy (compilado por K. M. Foley, J. J. Bonica y V. Ventafridda), páginas 133-154, Raven Press, New York, EE.UU. (1990) (“Inturrisi”)]. El desarrollo de dependencia física expone, tanto al paciente aquejado de dolores como al adicto a opiáceos, al riesgo del síndrome de abstinencia si se interrumpe bruscamente la administración de opiáceos o si se administra involutariamente un antagonista de opiáceo (Inturrisi). Por lo tanto, los fármacos no opiáceos que pudieran atenuar y/o invertir la tolerancia a opiáceos y la dependencia física de opiáceos serían agentes auxiliares útiles en el tratamiento del dolor. Estos mismos fármacos, al reducir o eliminar los síntomas de la abstinencia, podrían ser administrados al adicto a opiáceos para facilitar la desintoxicación de opiáceos y durante el tratamiento de mantenimiento. Además, los fármacos no opiáceos que modulan la tolerancia y la dependencia, sin alterar los efectos analgésicos de los opiáceos, podrían proporcionar una importante nueva herramienta con la que investigar los mecanismos bioquímicos y moleculares de la analgesia, el deseo vehemente, la tolerancia y la dependencia física debidas a los opiáceos. Por lo tanto, se puede presentar un potente argumento para la evaluación farmacológica preclínica de moduladores no opiáceos de la tolerancia a opiáceos y/o la dependencia de opiáceos en sistemas modelo tanto “analgésicos” como de “abuso de fármacos”. Estudios recientes [Trujillo et al., “Inhibitíon of Morphine Tolerance and Dependence by the NMDA Receptor Antagonist MK-801”, Science, 251: 85-7 (1991) (“Trujillo”); Marek et al, “Excitatory Amíno Acid Antagonísts (Kynurenic Acid and MK-801) Attenuate the Development of Morphine Tolerance in the Rat”, Brain Res., 547: 7781 (1991); Tiseo et al., “Attenuation and Reversal of Morphine Tolerance by the Competitive N-methyl-D-aspartate Receptor Antagonist, LY274614”, J. Pharmacol. Exp. Ther., 264: 1090-96 (1993) (“Tiseo I”); Kolesnikov et al., “Blockade of mu and kappa1 Opioid Analgesíc Tolerance by NPC177442, a Novel NMDA Antagonist”, Life Sci., 53: 1489-94 (1993); Kolesnikov et al, “Blockade of Tolerance to Morphine but not to κ Opioids by a Nitric Oxide Synthase Inhibitor”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5162-66 (1993); Tiseo et al., “Modulation of Morphine Tolerance by the Competitive N-methyl-D-aspartate Receptor Antagonist LY274614: Assessment of Opioid Receptor Changes”, J. Pharmacol. Exp. Ther., 268: 195-201 (1994) (“Tiseo II”); Elliott et al., “The NMDA Receptor Antagonists, LY274614 and MK-801, and the Nitric Oxide Synthase Inhibitor, NG-Nitro-L-arginine, Attenuate Analgesic Tolerance to the Mu-Opioid Morphine but not to Kappa Opioids”, Pain, 56: 69-75 (1994) (“Elliot I”); Elliott et al., “Dextromethorphan Attenuates and Reverses Analgesic Tolerance to Morphine”, Pain, 59: 361-368 (1994) (“Elliot II”); C. E. Inturrisi, “NMDA Receptors, Nitric Oxide, and Opioid Tolerance”, Reg. Peptides, 54: 129-30 (1994)] han demostrado que el sistema de receptores de aminoácidos excitantes (EAA; del inglés, excitatory amino acid) y el sistema del óxido nítrico (NO) están implicados en la tolerancia a, y la dependencia de, la morfina. Desde el decenio de 1980, se han identificado EAAs, incluyendo el glutamato y el aspartato, como neurotransmisores en el sistema nervioso central (CNS; del inglés, central nervous system) de los vertebrados. Un aspecto importante de un EAA, el N-metil-D-aspartato (“NMDA”), es que abre un canal de membrana distintivo caracterizado por un bloqueo de Mg2+ dependiente del voltaje y una elevada permeabilidad a iones de calcio. Aumentos fisiológicos del calcio intracelular después de la activación del receptor pueden iniciar diversos cambios metabólicos en la célula, incluyendo una activación, mediada por calcio-calmodulina, de la óxido nítrico sintetasa (NOS; del inglés, nitric oxide synthase) que conduce a la producción de NO [Bredt et al., “Nitric Oxide a Novel Neuronal Messenger”, Neuron, 8: 311 (1992)]. La activación de receptores de NMDA puede también alterar la expresión de genes reguladores celulares, tal como c-fos [Bading et al., “Regulation of Gene Expression in Hippocampal Neurons by Distinct Calcium Signaling Pathways”, Science, 260: 181-86 (1993); Rasmussen et al., “NMDA Antagonists and Clonidine Block C-fos Expression during Morphine Withdrawal”, Synapse, 20: 68-74 (1995)]. Sin embargo, los aumentos grandes y prolongados del calcio intracelular, tales como los que pueden tener lugar por una excesiva estimulación del receptor de NMDA, son tóxicos para la célula. La estimulación de receptores de EAA/NMDA puede representar la base patofisiológica de la degeneración neuronal en estados agudos o crónicos [Meldrum et al., “Excitatory Amino 2

ES 2 283 049 T3 Acid Neurotoxicity and Neurodegenerative Disease” en Trends in Pharmacological Sciences: The Pharmacology of Excitatory Amino Acids, A Special Report, compilado por D. Lodge y L. Collingridge, Cambridge, Reino Unido, Elsevier, páginas 54-62 (1991)]. Por lo tanto, los antagonistas del receptor de EAA, especialmente los antagonistas del receptor de NMDA, representan un área principal del desarrollo de fármacos. 5

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En particular, estudios recientes han demostrado que la administración conjunta de antagonistas del receptor de NMDA atenúan o invierten el desarrollo de tolerancia a los efectos analgésicos de la morfina en roedores [Marek et al., “Delayed Application of MK-801 Attenuates Development of Morphine Tolerance in the Rat”, Brain Res., 548: 7781 (1991) (“Marek”); Trujillo; Tiseo I; Tiseo II; Elliot I; Elliot II]. Marek discute el papel de MK-801, un antagonista o bloqueador del receptor de NMDA, en la reducción de la dependencia de morfina en animales de laboratorio. Sin embargo, se ha hallado que MK-801 es tóxico y, por lo tanto, es inadecuado para uso farmacéutico. Los antagonistas del receptor de NMDA que están actualmente disponibles para uso clínico incluyen ketamina, dextrometorfano y memantina. La utilidad de la ketamina está limitada porque está sólo disponible para uso por inyección y produce habitualmente un profundo efecto psicotomimético y otros efectos indeseables en las dosis requeridas para los efectos analgésicos. La utilidad del dextrometorfano está limitada porque los pacientes con una ausencia genéticamente determinada de citocromo P-4502D6 (la enzima que metaboliza fármacos en el hígado) no pueden tolerar aumentos de dosis. El dextrometorfano está también sujeto a interacciones fármaco-fármaco con fármacos habitualmente utilizados que pueden afectar a su perfil de eficacia y de efectos secundarios. Además, el dextrometorfano es rápidamente eliminado del organismo, lo que exige una administración frecuente. La memantina, un fármaco utilizado para trastornos del movimiento, está actualmente bajo investigación clínica y aún se ha de determinar su índice terapéutico. Choi et al., “Opioids and Non-Opioid Enantiomers Selectively Attenuate NMDA Neurotoxicity on Cortical Neurons”, European Journal of Pharmacology, 155: 27-35 (1998), sugieren que enantiómeros opioides y no opioides de opiáceos podrían proporcionar un procedimiento terapéutico en estados morbosos en que está implicada una neurotoxicidad mediada por el receptor de NMDA. Gorman et al., “Both d- and l-methadone bind to the NMDA receptor”, Society for Neuroscience Abstracts, 22: 63 (1996), describen que ambos isómeros de la metadona racémica presentan una afinidad moderada por el receptor de NMDA, a diferencia de la l-morfina, la hidromorfona o la naltrexona. Kristensen et al., “Stereoselective Pharmacokinetics of Methadone in Chronic Pain Patients”, Ther. Drug Monit., 18: 221-227 (1996), describen el tratamiento de pacientes con dolor crónico usando metadona racémica. En el Documento US 5.502.058 se describe el tratamiento del dolor con antagonistas del receptor de NMDA. En los Documentos US 5.556.838 y EP 0608.893 se describe el tratamiento de la drogadicción con sustancias que bloquean los receptores de NMDA. Como la morfina, la metadona se une preferentemente al tipo mu del receptor de opioides [A. Neil, “Affinities of Some Common Opioid Analgesics Towards Four Binding Sites in Mouse Brain”, Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol., 328: 24-9 (1984)] y produce efectos de conducta similares a los de la morfina en roedores y seres humanos [G. D. Olsen et al., “Clinical Effects and Pharmacokinetics of Racemic Methadone and its Optical Isomers”, Clin. Pharmacol. Ther., 21: 147-157 (1076) (“Olsen”); Smits et al., “Some Comparative Effects of Racemic Methadone and its Optical Isomers in Rodents”, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol., 7: 651-662 (1974) (“Smits”)]. La forma clínicamente disponible y comúnmente usada de la metadona es la mezcla racémica (d,l-metadona). El isómero l es responsable de las propiedades opioides, mientras que el isómero d es débil o inactivo como opiáceo [Horng et al., “The Binding of the Optical Isomers of Methadone, α-Methadol, A-Acetylmethadol and Their N-demethylated Derivatives to the Opiate Receptors of Rat Brain”, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol., 14: 621-29 (1976) (“Horng”)]. La d-metadona no produce actividad locomotriz de tipo opiode en ratones (Smits), es inactiva en ratas después de una administración intraventricular [Ingoglia et al., “Localization of d- and l-methadone after Intraventricular Injection into Rat Brain”, J. Pharmacol. Exp. Ther., 175: 84-87 (1970)] y es un analgésico 50 veces menos potente que la lmetadona en seres humanos (Olsen). Además, la l-metadona tiene una capacidad 30 veces mayor que la d-metadona para desplazar la unión de [3 H]naloxona (Horng). Por lo tanto, las propiedades analgésicas opioides de la d,l-metadona se atribuyen a la l-metadona. No se ha investigado el uso de d,l-metadona.

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El presente invento se dirige a superar estas deficiencias. Breve descripción de los dibujos 55

La Figura 1A es una curva representativa del desplazamiento de [3 H]MK-801 5 nM por opiáceos seleccionados y dextrometorfano (1 a 100 µM) en membranas de cerebro anterior de rata. La unión específica fue aproximadamente el 75% de la unión total. La Figura 1B es una curva representativa del desplazamiento de [3 H]MK-801 5 nM por d,lmetadona, sus isómeros d y l, y dextrometorfano (0,1 a 300 µM) en membranas de médula espinal de rata. La unión específica fue aproximadamente el 55% de la unión total.

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La Figura 2 muestra una curva de dosis-respuesta para l- y d-metadona intratecales (IT) en el ensayo de retirada de la cola en ratas. La l-metadona produjo antinocicepción (analgesia) dependiente de la dosis, con un valor de dosis eficaz mediana (ED50 ; del inglés, effective dose 50%) de 15,6 µg/rata [7,0-29,8 µg, intervalo de confianza (CI; del inglés, confidence interval) de 95%]. La d-metadona no produjo efectos antinociceptivos con dosis que variaban de 20 a 460 µg/rata. La Figura 3 muestra que la naloxona bloquea los efectos antinociceptivos (analgésicos) de la l-metadona intratecal (IT) en el ensayo de retirada de la cola en ratas. Se administraron (IT) 80 µg de l-metadona/rata, 80 µg de 3

ES 2 283 049 T3 l-metadona/rata + 30 µg de naloxona/rata, o 30 µg de naloxona/rata a ratas y se midieron las latencias de la retirada de la cola antes de, y 15, 30, 45, 60 y 75 minutos después de, la administración de los fármacos. Se determinó el porcentaje de respondedores al analgésico en cada grupo. 5

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Las Figuras 4A-B muestran que la d-metadona intratecal (IT) reduce, dependientemente de la dosis, el comportamiento de sacudidas inducido con formalina durante la fase 2 de la respuesta a formalina. Se administró d-metadona en una dosis IT de 32, 160 ó 320 µg/rata o disolución salina (0 µg/rata) a ratas 15 minutos antes de la inyección intraplantar de 50 µl de formalina al 5%. La Figura 4A muestra el número de sacudidas [media + error estándar de la media (SEM; del inglés, standard error of the mean)] observadas durante la fase 1 (0-10 minutos después de la formalina). La Figura 4B muestra el número de sacudidas (media + SEM) observadas durante la fase 2 (10-60 minutos después de la formalina). *Significativamente diferente (P < 0,05) del grupo de tratamiento con disolución salina (0 µg). La Figura 5 muestra que, en el ensayo de la formalina, los efectos antinociceptivos de la d-metadona intratecal (IT) no son invertidos por naloxona. Se administraron (IT) 250 µg de d-metadona/rata con o sin la administración concurrente de 30 µg de naloxona/rata, 15 minutos antes de la inyección intraplantar de formalina. No se observó diferencia alguna entre los dos grupos tratados con fármacos en cuanto al número de sacudidas que tuvieron lugar durante la fase 2. Ambos grupos tratados con fármacos fueron significativamente diferentes (*P < 0,05) del grupo de tratamiento con disolución salina. Sumario del invento El presente invento se refiere al uso de una sustancia seleccionada del grupo que consiste en d-metadona, d-metadol, d-alfa-acetilmetadol, l-alfa-acetilmetadol, d-alfa-normetadol, l-alfa-normetadol, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y mezclas de los mismos, en la fabricación de un medicamento para tratar el dolor en un sujeto que tiene un receptor de NMDA. La sustancia puede ser usada sola o en combinación con otras sustancias que alivian el dolor. Otro aspecto del presente invento se refiere al uso de una sustancia seleccionada del grupo que consiste en dmetadona, d-metadol, d-alfa-acetilmetadol, l-alfa-acetilmetadol, d-alfa-normetadol, l-alfa-normetadol, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y mezclas de los mismos, en la fabricación de un medicamento para tratar la adicción a una sustancia narcótica o adictiva en un sujeto que tiene un receptor de NMDA. El presente invento proporciona un tratamiento seguro y eficaz para el dolor y para la tolerancia a, y la dependencia física de, narcóticos. La d-metadona no está sujeta a las interacciones genéticas ni farmacológicas del dextrometorfano y no parece que produzca efectos psicotomiméticos. Además, la d-metadona, cuando se utiliza como parte de una mezcla racémica, presenta un largo historial de seguridad. Además, la d-metadona tiene una semivida de eliminación (aproximadamente 24 horas) mucho mayor que la de otros antagonistas del receptor de NMDA clínicamente disponibles. Por lo tanto, la d-metadona puede ser utilizada en combinación con las formas de opiáceos de acción más prolongada, tales como morfina y oxicodona, para proporcionar un conveniente programa de dosificación de una o dos veces al día. Descripción detallada del invento

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El presente invento se refiere al uso de una sustancia seleccionada del grupo que consiste en d-metadona, d-metadol, d-alfa-acetilmetadol, l-alfa-acetilmetadol, d-alfa-normetadol, l-alfa-normetadol, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y mezclas de los mismos, en la fabricación de un medicamento para tratar el dolor en un sujeto que tiene un receptor de NMDA. La sustancia puede ser usada sola o en combinación con otras sustancias que alivian el dolor.

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Otro aspecto del presente invento se refiere al uso de una sustancia seleccionada del grupo que consiste en dmetadona, d-metadol, d-alfa-acetilmetadol, l-alfa-acetilmetadol, d-alfa-normetadol, l-alfa-normetadol, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y mezclas de los mismos, en la fabricación de un medicamento para tratar la adicción a una sustancia narcótica o adictiva en un sujeto que tiene un receptor de NMDA.

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El presente invento es mejor entendido por medio de una discusión sobre receptores y vías para transducción de señales. Las células de los animales superiores se comunican normalmente por medio de cientos de clases de moléculas de señalización extracelular, incluyendo proteínas, péptidos pequeños, aminoácidos, nucleótidos, esteroides, retinoides, derivados de ácidos grasos, e incluso gases disueltos, tales como el óxido nítrico y el monóxido de carbono. Éstas moléculas de señalización transmiten una “señal” a otra célula (una “célula diana”), que afecta generalmente a una función celular. A los receptores para las moléculas de señalización extracelular se hace colectivamente referencia como “receptores de señalización celular”.

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Muchos receptores de señalización celular son proteínas transmembranales presentes en la superficie celular; cuando se unen a una molécula de señalización extracelular (un ligando), se activan para generar una cascada de señales intracelulares que alteran el funcionamiento de la célula. Por contraste, en algunos casos, los receptores están dentro de la célula y el ligando de señalización ha de entrar en la célula para activarlos; por lo tanto, éstas moléculas de señalización deben ser suficientemente pequeñas e hidrófobas para difundirse a través de la membrana plasmática de la célula. 4

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Además de la unión del ligando a los receptores, los receptores pueden ser bloqueados para evitar la unión del ligando. Cuando una sustancia se une a un receptor, la estructura tridimensional de la sustancia se ajusta a un espacio creado por la estructura tridimensional del receptor, en una configuración de esfera y hueco. Cuanto mejor se ajusta la esfera al hueco, más fuertemente es mantenida. Este fenómeno es llamado “afinidad”. Si la afinidad de una sustancia es mayor que la del ligando original, competirá con el ligando y se unirá más frecuentemente al sitio de unión. Una vez unida, se pueden enviar señales a las células a través del receptor, causando que las células respondan de cierto modo. Esto es llamado “activación”. Tras la activación, el receptor activado regula entonces directamente la transcripción de genes específicos. Pero la sustancia y el receptor deben tener ciertas características, al margen de la afinidad, para activar la célula. Deben formarse enlaces químicos entre átomos de la sustancia y átomos de los receptores. En algunos casos, esto conduce a un ligero cambio en la configuración del receptor, cambio que es suficiente para comenzar el proceso de activación (llamado “transducción de señales”). Como resultado, pueden prepararse sustancias que se unan a receptores y los activen (llamadas “agonistas del receptor”) o los inactiven (llamadas “antagonistas del receptor”). El complejo del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) desempeña importantes funciones en numerosos procesos del sistema nervioso central (CNS), incluyendo potenciación de memoria y de larga duración, regulación de la degeneración neuronal, y protección frente al daño excitotóxico [Monaghan et al., “The Excitatory Amino Acid Receptors: Their Classes, Pharmacology, and Distinct Properties in the Function of the Central Nervous System”, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 29: 365-402 (1989), que se incorpora aquí por referencia]. También parece que los receptores de NMDA están implicados en el procesamiento de información nociceptiva [A. H. Dickenson et al., “Dextromethorphan and Levorphanol on Dorsal Horn Nociceptive Neurones in the Rat”, Neuropharmacology, 30: 1303-1308 (1991)]. Además, estudios previos han mostrado que antagonistas del receptor de NMDA atenúan e invierten el desarrollo de tolerancia a la morfina mu-opioide sin alterar las propiedades analgésicas de la morfina [Elliot et al., “N-methyl-D-aspartate (NMDA) Receptors Mu and Kappa Opioid Tolerance, and Perspectives on New Analgesic Drug Development”, Neuropsychopharmacology, 13: 347-356 (1995), que se incorpora aquí por referencia].

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Ebert et al., “Ketobemidone, Methadone and Pethidine are Non-Competitive Antagonists in the Rat Cortex and Spinal Cord”, Neurosci. Lett., 187: 165-68 (1995), que se incorpora aquí por referencia, han comunicado que la metadona racémica posee una baja afinidad µM por el receptor de NMDA en membranas corticales de rata y reduce la despolarización, inducida por NMDA, in vitro en preparaciones de médula espinal y cuña cortical de rata. Por contraste con este hallazgo, en el presente invento se ha identificado que tanto el isómero d como el l de la metadona pueden unirse al sitio no competitivo (MK-801) del receptor de NMDA [Gorman et al., “The d- and l- Isomers of Methadone Bind to the Non-Competitive Site on the N-methyl-D-aspartate (NMDA) Receptor in Rat Forebrain and Spinal Cord”, Neurosci. Lett., 223: 5-8 (1997), que se incorpora aquí por referencia] en membranas de cerebro anterior y médula espinal de rata con una afinidad aproximadamente igual a la del dextrometorfano, un reconocido antagonista del receptor de NMDA [Elliot et al., “Dextromethorphan Suppresses Both Formalin-Induced Nociceptive Behavior and the Formalin-Induced Increase in Spinal Cord c-fos mRNA”, Pain, 61: 401-09 (1995), que se incorpora aquí por referencia]. Aunque sin pretender un respaldo teórico, se cree que la d-metadona actúa de un modo similar en el tratamiento del dolor y el tratamiento de la dependencia física de, y la tolerancia a, una sustancia narcótica. Por lo tanto, la d-metadona, cuando se administra a un sujeto en una cantidad eficaz, puede unirse a un receptor de NMDA del sujeto y bloquearlo. Preferiblemente, el receptor de NMDA está situado en los sistemas nerviosos central y periférico. El sistema nervioso central incluye el cerebro y la médula espinal, mientras que el sistema nervioso periférico incluye neuronas sensorias (nociceptores periféricos), nervios, y su terminación central en la médula espinal dorsal. Preferiblemente, los receptores de NMDA están situados en las terminaciones presinápticas centrales de neuronas sensorias y en sitios postsinápticos de la médula espinal y el cerebro. Aunque el presente invento incluye todos los sujetos, se prefieren los mamíferos, siendo particularmente preferidos los seres humanos. Aunque se prefiere la d-metadona, otras sustancias que bloquean el receptor de NMDA y, como tales, son útiles en la práctica del presente invento son los isómeros d de compuestos análogos a d-metadona, tales como, d-metadol, dalfa-acetilmetadol y d-alfa-normetadol, mezclas de los mismos, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Además, isómeros l de compuestos análogos a metadona, tales como, l-alfa-acetilmetadol y l-alfa-normetadol, mezclas de los mismos, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, son útiles en la práctica del presente invento. El receptor de NMDA desempeña un papel importante en la transmisión del dolor al modular tanto la potenciación progresiva (“wind-up”), un fenómeno fisiológico por el que neuronas de la médula espinal se vuelven anormalmente activas tras una estimulación repetitiva de las fibras C [Dickenson et al., “Evidence for a Role of the NMDA Receptor in the Frequency Dependent Potentiation of Deep Rat Dorsal Horn Nociceptive Neurones Following C Fibre Stimulation”, Neuropharmacology, 26: 1235-38 (1987), que se incorpora aquí por referencia], como la sensibilización central, el fenómeno más general por el que neuronas sensorias disminuyen los umbrales de activación, amplían el tamaño del campo receptivo y se disparan espontáneamente en las secuelas de la estimulación periférica nociva [Woolf et al., “The Induction and Maintenance of Central Sensitization is Dependent on N-methyl-D-aspartic Acid Receptor Activation; Implications for the Treatment of Post-Injury Pain Hypersensitivity States”, Pain, 44: 293-99 (1991); Dubner et al., “Activity-Dependent Neuronal Plasticity Following Tissue Injury and Inflammation”, Trends Neurosci., 15: 96-103 (1992), que se incorporan aquí por referencia]. El bloqueo del receptor de NMDA con un antagonista del receptor de NMDA produce antinocicepción en una diversidad de modelos de dolor en animales. Por lo tanto, la d-metadona, aunque tiene poca actividad opioide, es antinociceptiva porque posee actividad antagónica sobre el receptor de NMDA in vivo. Además, la d-metadona contribuye a los efectos analgésicos de otros fármacos analgésicos. 5

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La activación del receptor de NMDA, un subtipo de los receptores de aminoácidos excitantes, provoca diversos cambios en la actividad funcional de las células nerviosas, y, en particular, en su capacidad de excitabilidad o inhibición en presencia de una sustancia adictiva, a través de un aumento de la concentración de Ca++ intracelular. Las principales consecuencias de la activación del receptor de NMDA incluyen las siguientes secuencias, o cascadas, de sucesos que tienen lugar en las células nerviosas: a) translocación y activación de proteína quinasas, tal como la proteína quinasa C → fosforilación de sustratos proteicos, tales como enzimas citosólicas, proteínas de canal, proteínas receptoras, etc. → cambios en la actividad funcional;

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b) iniciación de expresión génica precoz (c-fos, c-jun, zif-268, etc.) por Ca++ intracelular aumentado o proteína quinasas activadas por Ca++ → expresión de genes funcionales responsables de la producción de enzimas celulares (tales como proteína quinasas), proteínas receptoras (tal como el receptor de NMDA), proteínas de canales iónicos (tales como los canales de K+ , Na+ y Ca++ ), neuropéptidos (tal como dinorfina), etc. → cambios en la actividad funcional;

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c) activación de enzimas y otros componentes celulares inducida por Ca++ /calmodulina (u otras proteínas ligantes de Ca++ ) → activación de sistemas de Ca++ /calmodulina-proteína quinasa, tal como Ca++ /calmodulina quinasa II → autofosforilación de enzimas (por ejemplo, Ca++ /calmodulina quinasa II) u otras proteínas funcionales → cambios en la actividad funcional;

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d) activación, inducida por Ca++ /calmodulina, de la óxido nítrico sintasa constitutiva así como inducción de óxido nítrico sintasa inducible → producción de óxido nítrico → i) producción de guanosina monofosfato cíclica a través de la activación de la guanosina ciclasa, para dar lugar a activación de proteína quinasas y expresión génica precoz; ii) modificación directa de proteínas, tales como enzimas, proteínas receptoras y/o proteínas de canal; iii) modificación de la membrana lipídica y/o modificación de ácido nucleico a través de la supresión de radicales libres; iv) provocación de neurotoxicidad a mayores niveles de óxido nítrico; v) acciones retrógradas en células gliales o neuronas adyacentes, tales como facilitación de la liberación de glutamato/activación del receptor de NMDA y/o inhibición de receptores de NMDA postsinápticos → cambios en la actividad funcional;

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e) interacciones con el sistema de adenosina monofosfato cíclica/proteína quinasa A, el sistema de fosfolipasa C-inositol trifosfato-Ca++ /diacilglicerol proteína quinasa, el sistema de fosfolipasa A2-ácido araquidónico/prostanoides/leucotrienos → cambios en la actividad funcional provocados por sistemas de segundo mensajero distintos de los sistemas de receptor de NMDA/Ca++ /Ca++ -calmodulina/proteína quinasa; y

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f) interacciones con otros subtipos de receptores de aminoácidos excitantes, incluyendo receptores no de NMDA y receptores metabotrópicos, así como procesos intracelulares subsiguientes a la activación de estos subtipos de receptores de aminoácidos excitantes → cambios en la actividad funcional provocados por la activación del receptor no de NMDA y el receptor metabotrópico.

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Una sustancia que bloquee el receptor de NMDA evitará eficazmente que tengan lugar todas las principales secuencias intracelulares de procesos anteriormente mencionadas. Sin embargo, incluso con la activación del receptor de NMDA, aún es posible inhibir el desarrollo de tolerancia a, y/o dependencia de, una sustancia adictiva al combinar la sustancia adictiva con una sustancia que bloquea al menos una de las principales secuencias intracelulares de procesos anteriormente mencionadas. Además, aún es posible tratar el dolor al administrar una sustancia que bloquea al menos una de las principales secuencias intracelulares de procesos anteriormente mencionadas. De este modo, por ejemplo, una sustancia que interfiere en la translocación y activación de proteína quinasa C o en la activación, inducida por calmodulina, de la óxido nítrico sintasa constitutiva así como en la inducción de óxido nítrico sintasa inducible es también útil para la práctica de este invento. En un método para tratar el dolor, se administra d-metadona, u otros isómeros d o isómeros l de compuestos análogos a la misma, a un sujeto que padece dolor, por lo que la d-metadona, o los otros isómeros d o isómeros l de compuestos análogos a la misma, bloquean el receptor de NMDA o las consecuencias intracelulares de la activación del receptor de N-metil-D-aspartato. Además, la d-metadona, o los otros isómeros d o isómeros l de compuestos análogos a la misma, que bloquean el receptor de NMDA o las consecuencias intracelulares de la activación del receptor de N-metil-D-aspartato, pueden administrarse en combinación con otra sustancia, tal como un analgésico narcótico u otras sustancias adictivas. La d-metadona trata el dolor al inhibir el desarrollo de tolerancia a, y/o la dependencia de, el analgésico narcótico o la sustancia adictiva. Además, la d-metadona puede ser combinada con otros analgésicos, tales como analgésicos adyuvantes, para proporcionar una interacción sinérgica para el tratamiento del dolor. El analgésico (narcótico o adyuvante), la sustancia adictiva, o las sustancias sedantes o hipnóticas (a las que aquí se hace colectivamente referencia como “fármacos analgésicos”) se administran antes, con o después de la administración de la d-metadona o de los otros isómeros d o isómeros l de compuestos análogos a la misma que bloquean el receptor de NMDA o las consecuencias intracelulares de la activación del receptor de N-metil-D-aspartato.

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A continuación se describen los tipos de “fármacos analgésicos”.

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Los analgésicos narcóticos incluyen opiáceos, derivados de opiáceos, opioides, y sus sales farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos específicos de analgésicos narcóticos incluyen alfentanilo, alfaprodina, anileridina, becitramida, buprenorfina, butorfanol, codeína, dezocina, dihidrocodeína, difenoxilato, etilmorfina, fentanilo, heroína, hidrocodona, hidromorfona, isometadona, levometorfano, levorfanol, meptazinol, metazocina, metopón, morfina, nalbufina, nalmefeno, extractos de opio, extractos fluidos de opio, pentazocina, propoxifeno, opio pulverulento, opio granulado, opio bruto, tintura de opio, oxicodona, oximorfona, petidina (meperidina), fenazocina, piminodina, metadona racémica, racemetorfano, racemorfano, sufentanilo, tebaína, tramadol y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Para una discusión detallada sobre estos y otros analgésicos narcóticos, se puede hacer referencia a Jaffe et al., “Opioid Analgesics and Antagonists”, Goodman and Gilman’s Pharmacological Basis of Therapeutics, compilado por Goodman et al., 9ª edición, MacMillan and Company, New York, EE.UU., páginas S21-SS6 (1996) (“Jaffe”), que se incorpora aquí por referencia. Otros analgésicos narcóticos y/o sustancias adictivas que pueden utilizarse aquí incluyen acetorfina, acetildihidrocodeína, acetilmetadol, alilprodina, alfacetilmetadol, alfameprodina, alfametadol, bencetidina, bencilmorfina, betacetilmetadol, betameprodina, betametadol, betaprodina, clonitaceno, cocaína, metilbromuro de codeína, N-óxido de codeína, ciprenorfina, desomorfina, dextromoramida, diampromida, dietiltiambuteno, dihidromorfina, dimenoxadol, dimefeptanol, dimetiltiambuteno, butirato de dioxafetilo, dipipanona, drotebanol, etanol, etilmetiltiambuteno, etonitaceno, etorfina, etoxeridina, furetidina, hidromorfinol, hidroxipetidina, cetobemidona, levomoramida, levofenacilmorfano, metildesorfina, metildihidromorfina, morferidina, metilbromuro de morfina, metilsulfonato de morfina, N-óxido de morfina, mirofina, nicocodeína, nicomorfina, nicotina, noracimetadol, norlevorfanol, normetadona, normorfina, norpipanona, fenadoxona, fenampromida, fenomorfano, fenoperidina, piritramida, folcodina, proheptazoína, properidina, propiram, racemoramida, tebacón, trimeperidina, y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Aún otras sustancias que pueden ser utilizadas en la práctica del invento incluyen los sedantes y los hipnóticos; por ejemplo, benzodiazepinas tales como clordiazepóxido, clorazepato, diazepam, flurazepam, halazepam, ketazolam, borazepam, oxazepam, prazepam, temazepam, triazolam y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, barbituratos tales como amobarbital, barbital, butabarbital, mefobarbital, metohexital, pentobarbital, fenobarbital, secobarbital, talbutal, tiamilal, tiopental y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y otros sedantes e hipnóticos tales como hidrato de cloral, meprobamato, metacualona, metiprilón y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Aún otros analgésicos y analgésicos adyuvantes incluyen (1) anestésicos locales, incluyendo bupivacaína, lidocaína, mepivacaína, mexiletina, tocainida y otros enumerados en “Local Anesthetics”, Goodman and Gilman’s Pharmacological Basis of Therapeutics, compilado por Goodman et al., 9ª edición, MacMillan and Company, New York, EE.UU., páginas 331-347 (1996), que se incorpora aquí por referencia; (2) acetaminofeno, salicilatos incluyendo el ácido acetilsalicílico, fármacos antiinflamatorios no esteroides incluyendo derivados del ácido propiónico (ibuprofeno, naproxeno, etc.), derivados del ácido acético (indometacina, ketorolaco y otros), ácidos enólicos (piroxicam y otros) e inhibidores de la ciclooxigenasa II (por ejemplo, SC-58635), y otros enumerados en “Analgesicantipyretic and Antiinflammatory Agents and Drugs Employed in the Treatment of Gout, Goodman and Gilman’s Pharmacological Basis of Therapeutics, compilado por Goodman et al., 9ª edición, MacMillan and Company, New York, EE.UU., páginas 617-657 (1996), que se incorpora aquí por referencia; (3) los analgésicos adyuvantes se usan para potenciar la eficacia analgésica de otros analgésicos (por ejemplo, opiáceos), tratar síntomas concurrentes que exacerban el dolor y proporcionar analgesia a tipos de dolor específicos (por ejemplo, el dolor neuropático). Incluyen corticosteroides (dexametasona), anticonvulsivos (fenitoína, carbamazepina, valproato, clonazepam y gabapentina), neurolépticos (metotrimeprazina), antidepresivos (amitriptilina, doxepina, imipramina y trazodona), antihistamínicos (hidroxicina) y psicoestimulantes (dextroanfetamina y metilfenidato) [A. Jacox et al., “Management of Cancer Pain. Clinical Practice Guideline No. 9”, Publicación de la AHCPR nº 94-0592, Rockville, Maryland, EE.UU., Agency for Health Care Policy and Research, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, páginas 65-68 (1994), que se incorpora aquí por referencia].

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El presente invento se dirige al tratamiento de todos los tipos de dolor. En particular, se incluyen los dolores agudo, subagudo y crónico. Los tipos específicos de dolor crónico incluyen los dolores neuropático, somático y visceral. 55

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Clínicamente, el dolor puede ser clasificado temporalmente como agudo, subagudo o crónico; cuantitativamente como suave, moderado o intenso; fisiológicamente como somático, visceral o neuropático; y etiológicamente como médico o psicogénico. El dolor agudo (tal como el dolor posoperatorio o el dolor traumático agudo) presenta típicamente síntomas objetivos e hiperactividad asociada del sistema nervioso autónomo, estando presentes taquicardia, hipertensión y diaforesis. El dolor crónico se presenta durante periodos de tiempo de tres meses o más, de forma recurrente. La naturaleza cuantitativa (es decir, la intensidad) del dolor es el factor principal a la hora de elegir la terapia farmacológica. El dolor neuropático es una variedad común del dolor crónico. Puede ser definido como el dolor que resulta de un funcionamiento anormal del sistema nervioso periférico y/o central. Un componente crítico de este funcionamiento anormal es una respuesta exagerada de células nerviosas relacionadas con el dolor en la periferia o en el sistema nervioso central. El dolor somático resulta de la activación de receptores periféricos y nervios eferentes sensorios somáticos, sin daño en el nervio periférico ni en el CNS. El dolor visceral es el resultado de receptores nociceptivos viscerales y nervios eferentes viscerales que se activan, y se caracteriza por una sensación profunda y dolorosa en forma de calambres, a menudo referida a zonas cutáneas. 7

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Además, la d-metadona (y los compuestos análogos, las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y las mezclas de los mismos) es útil en un método para tratar la adicción a narcóticos. La adicción a narcóticos es definida como aquélla en que un sujeto tiene una tolerancia a, y una dependencia física de, y/o un deseo físico vehemente de, un analgésico narcótico y/o una sustancia adictiva (como se describió anteriormente). En el método, la d-metadona es administrada a un sujeto que tiene una dependencia física de, una tolerancia a, y/o un deseo vehemente de, un analgésico narcótico o una sustancia adictiva. La d-metadona puede ser aquí preparada en cualquier forma adecuada que sea apropiada para el uso deseado; por ejemplo, administración oral (incluyendo formas de liberación inmediata y de liberación continua), rectal o parenteral (por ejemplo, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraventricular, epidural e intratecalmente), instilación intranasal, aplicación a membranas mucosas, tales como las de la nariz, la garganta y los tubos bronquiales, instilación en paredes de órganos huecos o vasos sanguíneos recién vascularizados, o administración tópica, tal como por medio de un dispositivo para distribución transdérmica, tal como un parche. Las formas de dosificación adecuadas para uso oral incluyen tabletas, polvos dispersables, gránulos, cápsulas, suspensiones, jarabes y elixires. Los compuestos pueden ser administrados solos o con diluyentes o vehículos farmacéuticos adecuados. Los diluyentes y vehículos inertes para tabletas incluyen, por ejemplo, carbonato cálcico, carbonato sódico, lactosa y talco. Las tabletas pueden también contener agentes granulantes y disgregantes tales como almidón y ácido algínico, agentes aglutinantes tales como almidón, gelatina y goma arábiga, y agentes lubricantes tales como estearato magnésico, ácido esteárico y talco. Las tabletas pueden quedar sin revestir o pueden ser revestidas mediante técnicas conocidas para retrasar la disgregación y la absorción. Los diluyentes y vehículos inertes que pueden ser utilizados en cápsulas incluyen, por ejemplo, carbonato cálcico, fosfato cálcico y caolín. La suspensiones, jarabes y elixires pueden contener excipientes convencionales, tales como, por ejemplo, metilcelulosa, goma tragacanto y alginato sódico, agentes humectantes, tales como lecitina y estearato de polioxietileno, y conservantes, tales como, por ejemplo, p-hidroxibenzoato de etilo.

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Las formas de dosificación adecuadas para administración parenteral incluyen disoluciones, suspensiones, dispersiones, emulsiones, y similares. Pueden ser también fabricadas en forma de composiciones sólidas estériles que pueden ser disueltas o suspendidas en un medio inyectable estéril inmediatamente antes de su uso. Pueden contener agentes suspendedores o dispersivos conocidos en la técnica.

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La dosificación preferida del fármaco analgésico o la d-metadona puede variar ampliamente, de aproximadamente 5 a aproximadamente 300 mg/día. Se apreciará que la cantidad preferida real de la d-metadona y del fármaco analgésico que se van administrar de acuerdo con el presente invento variará de acuerdo con la composición concreta formulada y con el modo de administración. Los expertos en la técnica pueden tener en consideración muchos factores que pueden modificar la acción de la d-metadona, tales como, por ejemplo, el peso corporal, la dieta, el momento de la administración, la vía de administración, el índice de excreción, el estado del sujeto, las combinaciones de fármacos, y las sensibilidades y gravedades de las reacciones. La administración puede ser llevada a cabo continua o periódicamente dentro de la dosis tolerada máxima. Los índices de administración óptimos para un conjunto dado de estados pueden ser determinados por los expertos en la técnica utilizando ensayos convencionales para administración de dosis, a la vista de los datos experimentales aquí proporcionados.

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Para caracterizar adicionalmente las propiedades ligantes de la d,l-metadona así como de sus isómeros d y l, se compararon las capacidades de los diferentes isómeros de la metadona para desplazar a [3 H]MK-801, un antagonista no competitivo del receptor de NMDA [Wong et al., “[3 H]MK-801 Labels on Site on the N-methyl-D-aspartate Receptor Channel Complex in Rat Brain Membranes”, J. Neurochem., 50: 274-281 (1988)], y [3 H]CGS-19755, un antagonista competitivo del receptor de NMDA [Murphy et al., “Characterization of the Binding of [3 H]CGS-19755: A Novel Nmethyl-D-aspartate Antagonist with Nanomolar Affinity in the Rat Brain”, Br. J. Pharmacol., 95: 932-938 (1988), que se incorpora aquí por referencia] en membranas sinápticas de cerebro anterior y médula espinal de rata. Para determinar si fármacos opioides prototípicos también mostraban afinidad por el receptor de NMDA, se estudiaron la morfina, la hidromorfona, y la naltrexona, un antagonista. Con fines de comparación, también se evaluó el dextrometorfano, un antagonista no competitivo del receptor de NMDA [Ebert et al., “Identification of a Novel NMDA Receptor in Rat Cerebellum”, Eur. J. Pharmacol., Mol. Pharmacol. Sect., 208: 49-52 (1991); Netzer et al., “Dextromethorphan Blocks N-methyl-D-aspartate-Induced Currents and Voltage-Operated Inward Currents in Culture Cortical Neurons”, Eur. J. Pharmacol., 238: 209-216 (1993), que se incorporan aquí por referencia]. Se obtuvieron machos de rata Sprague Dawley (250 a 300 g) de Taconic Farms (Germantown, New York, EE.UU.). Se obtuvieron [3 H]MK-801 (actividad específica = 751,1 · 109 Bq/milimol) y [3 H]CGS-19755 (actividad específica = 288,6 · 1010 Bq/milimol) de New England Nuclear (Boston, Massachusetts, EE. UU.). La d.l-metadona y los isómeros d-metadona [(S)-(+)-metadona·HCl] y l-metadona [(R)-(-)-metadona·HCl] se obtuvieron de Lilly Research Laboratory (Indianápolis, Indiana, EE.UU.).

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Se prepararon membranas sinápticas de cerebro anterior (FB; del inglés, forebrain) (es decir, el cerebro completo menos el cerebelo y el tronco cerebral) y médula espinal (SPCD; del inglés, spinal cord) (es decir, la sección lumbosacra) de rata de acuerdo con los procedimientos modificados de Wong et al., “[3 H]MK-801 Labels on Site on the N8

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methyl-D-aspartate Receptor Channel Complex in Rat Brain Membranes”, J. Neurochem., 50: 274-281 (1988), que se incorpora aquí por referencia]. Se reunió tejido de 4 a 6 ratas, se homogeneizó en 50 ml de una disolución 0,32 M de sacarosa enfriada con hielo [homogeneizador Brinkmann Polytron (Westbury, New York, EE.UU.), ajustado a 5] y luego se centrifugó a 3000 x g durante 5 minutos a 4ºC. El sobrenadante y la capa de tampón fueron luego centrifugados a 21.500 x g durante 15 minutos a 4ºC. El sedimento P2 fue resuspendido en tampón 5 mM de TrisHCl enfriado con hielo, pH de 7,4, y fue incubado con Triton X al 0,04% a 37ºC durante 20 minutos. La suspensión fue centrifugada a 39.000 x g durante 14 minutos a 4ºC, y el sedimento fue luego resuspendido en tampón enfriado con hielo y vuelto a centrifugar a 39.000 x g del modo descrito un total de 3 veces. Se resuspendió el sedimento en 2 ml de disolución 0,32 M de sacarosa y se congelaron partes alícuotas a -70ºC durante al menos 24 horas. El día del ensayo, una parte alícuota de membranas fue descongelada a la temperatura ambiental y lavada 4 veces (39.000 x g, 1,5 minutos a 4ºC), y el sedimento fue luego homogeneizado en el tampón del ensayo de unión hasta alcanzar una concentración final de 200 a 300 µg de proteína (cerebro anterior) o de 300 a 400 µg de proteína (médula espinal), del modo determinado por Lowry et al., “Protein Measurement with Folin Phenol Reagent”, J. Biol. Chem., 193: 265-275 (1951), que se incorpora aquí por referencia, en un volumen total de ensayo de 250 µl.

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Para el cerebro anterior, el ensayo de unión de [3 H]MK-801 fue llevado a cabo del modo previamente descrito por Ebert et al., “Ketobemidone, Methadone and Pethidine are Non-Competitive Antagonists in the Rat Cortex and Spinal Cord”, Neurosci. Lett., 187 (3): 165-168 (1995), que se incorpora aquí por referencia. Muestras triplicadas de las membranas fueron incubadas durante 4 horas a temperatura ambiental en un tampón 5 mM de Tris-HCl/HEPES, pH de 7,6, que contenía glicocola 1 µM, ácido l-glutámico 50 µM, [3 H]MK-801 5 nM, y el fármaco competidor o el testigo de tampón en un volumen final de 250 µl. La unión inespecífica fue definida mediante la adición de MK-801 no marcado 200 µM. Para la médula espinal, las concentraciones de glicocola y ácido l-glutámico fueron aumentadas a 30 µM y 50 µM, respectivamente, para mejorar la unión, y el tiempo de incubación fue reducido a 2 horas. Los ensayos de unión de [3 H]CGS-19755 fueron llevados a cabo de acuerdo con los procedimientos modificados de Murphy et al., “Characterization of the Binding of [3 H]CGS-19755: A Novel N-methyl-D-aspartate Antagonist with Nanomolar Affinity in the Rat Brain”, Br. J. Pharmacol., 95: 932-938 (1988), que se incorpora aquí por referencia. Muestras triplicadas de cerebro anterior fueron incubadas durante 50 minutos a 4ºC en Tris-HCl 50 mM, pH de 7,8, que contenía [3 H]CGS-19755 10 nM y el fármaco competidor o el testigo de tampón en un volumen final de 250 µl. La unión inespecífica fue definida mediante la adición de ácido l-glutámico no marcado 100 µM. El ligando unido fue separado del ligando libre por filtración usando un recolector celular Brandel de 24 pocillos (Gaithersberg, Maryland, EE.UU.), seguida de dos lavados con 2 ml de tampón de unión enfriado con hielo. La cantidad de ligando unido al filtro (papel de filtro Brandel GF/B, preincubado durante 30 minutos en polietilenimina al 0,05%) fue medida mediante el uso de un contador de centelleo para muestras líquidas después de 12 horas en 5 ml de líquido de centelleo Ecoscint. La unión específica fue definida como las cpm unidas totales medias menos las cpm unidas inespecíficas medias. Los ensayos fueron repetidos de 2 a 4 veces. Los valores de concentración inhibitoria para 50% (IC50 ; del inglés, inhibitory concentration 50%) fueron determinados mediante un análisis de regresión lineal del modo descrito por Y. Katz et al., “Interactions Between Laudanosine, GABA, and Opioid Subtype Receptors: Implication for Laudanosine Seizure Activity”, Brain Res., 646: 235-241 (1994), que se incorpora aquí por referencia. Los valores de Ki fueron calculados de acuerdo con Cheng et al., “Relationship Between the Inhibition Constant (Ki ) and the Concentration of Inhibitor which Causes 50 Percent Inhibition of an Enzymatic Reaction”, Biochem. Pharmacol., 22: 3099-3104 (1973), que se incorpora aquí por referencia. La Figura 1A muestra curvas representativas del desplazamiento de la unión de [3 H]MK-801, producido por opiáceos seleccionados y dextrometorfano en cerebro anterior. En los intervalos de concentración ensayados, la morfina, la hidromorfona y la naltrexona no desplazaban a [3 H]MK-801 (no se muestran datos para la hidromorfona ni la naltrexona). Sin embargo, la d,l-metadona, la d-metadona y la l-metadona producían curvas de desplazamiento similares a la del dextrometorfano, aunque parecía que el isómero opioide activo l era ligeramente más potente que su isómero opioide inactivo d y que la d,l-metadona. La Figura 1B muestra curvas de desplazamiento representativas para los compuestos de interés en médula espinal. Puesto que los ensayos iniciales indicaban que los valores de IC50 eran menores en médula espinal que en cerebro anterior, se ensayaron los compuestos en concentraciones menores. La d,l-metadona, sus isómeros d y l, y el dextrometorfano presentaban curvas de desplazamiento similares. En la Tabla 1 siguiente, un resumen de los valores medios de Ki permite comparar la capacidad de los compuestos de interés para desplazar la unión de [3 H]MK-801 y [3 H]CGS-19755.

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Los compuestos de interés desplazaban al antagonista competitivo [3 H]CGS-19755 del receptor de NMDA sólo en concentraciones elevadas (no mostrado). La morfina, la hidromorfona y la naltrexona no desplazaban a [3 H]MK-801 y no fueron ensayadas frente a [3 H]CGS-19755. Sin embargo, la d,l-metadona, sus isómeros d y l y el dextrometorfano mostraban una afinidad moderada por el sitio no competitivo (MK-801) del receptor de NMDA en médula espinal y cerebro anterior, dando lugar a valores de Ki en el intervalo µM (Tabla 1). Estos resultados confirman un comunicado previo relativo a que la d,l-metadona presenta actividad antagónica sobre el receptor de NMDA en membranas corticales y de médula espinal de rata [Ebert et al., “Ketobemidone, Methadone, and Pethidine are Non-Competitive Antagonists in the Rat Cortex and Spinal Cord”, Neurosci. Lett., 187 (3): 165-168 (1995) (“Ebert I”), que se incorpora aquí por referencia], y amplían esos resultados previos al demostrar que tanto el isómero d como el l de la metadona se unen específicamente al sitio no competitivo del receptor de NMDA en membranas sinápticas de cerebro anterior y médula espinal de rata. El valor de Ki para la d,l-metadona es aproximadamente 10 veces mayor que el previamente comunicado por Ebert I. En este ejemplo, se usó cerebro anterior de rata, mientras que Ebert I utilizó membranas corticales. Previamente se había hallado una mayor afinidad por [3 H] MK-801 en membranas corticales de rata que en cerebro anterior [Gudehithlu et al., “Effect of Morphine Tolerance and Abstinence on the Binding of [3 H]MK-801 to Brain Regions and Spinal Cord of the Rat”, Brain Research, 639: 269472 (1994), que se incorpora aquí por referencia]. En realidad, los valores determinados de Ki para el dextrometorfano eran también aproximadamente 10 veces mayores en cerebro anterior que los previamente comunicados en membranas corticales [Ebert et al., “Identification of a Novel NMDA Receptor in Rat Cerebellum”, Eur. J. Pharmacol. Mol. Pharmacol. Sect., 208: 49-52 (1991) (“Ebert II”), que se incorpora aquí por referencia]. Los valores de Ki eran también de 2 a 3 veces menores en médula espinal que en cerebro anterior. Por lo tanto, las diferencias en las regiones del CNS utilizadas podrían explicar los diferentes valores de Ki . Puesto que ambos isómeros de metadona presentan afinidades similares por el receptor de NMDA, no parece que esta propiedad sea estereoespecífica. Además, ninguno de los otros opiáceos ensayados mostró afinidad por el receptor de NMDA, lo que sugiere que ésta no es una propiedad de los opiáceos prototípicos. Resulta interesante que las curvas de inhibición y los valores de Ki de la d,l-metadona, la d-metadona y la lmetadona sean similares a los del dextrometorfano, un establecido antagonista del receptor de NMDA [Ebert II; Netzer et al., “Dextromethorphan Blocks N-methyl-D-aspartate-Induced Currents and Voltage-Operated Inward Currents in Culture Cortical Neurons”, Eur. J. Pharmacol., 238: 209-216 (1993), que se incorpora aquí por referencia]. Por lo tanto, la metadona puede poseer propiedades similares a las del dextrometorfano. El dextrometorfano atenúa las respuestas nociceptivas en el ensayo de la formalina [Elliot et al., “Dextromethorphan Suppresses Formalin-Induced Nociceptive Behavior and the Formalin-Induced Increase in c-fos mRNA”, Pain, 61: 401-409 (1995), que se incorpora 10

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aquí por referencia], y suprime el “wind-up” de neuronas de médula espinal [Dickenson et al., “Dextromethorphan and Levorphanol on Dorsal Horn Nociceptive Neurones in the Rat”, Neuropharmacology, 30: 1303-1308 (1991), que se incorpora aquí por referencia], un fenómeno asociado con modelos nociceptivos de sensibilización central [Coerre et al., “Contribution of Central Neuroplasticity to Pathological Pain: Review of Clinical and Experimental Evidence”, Pain, 52: 259-285 (1993), que se incorpora aquí por referencia]. Además, el dextrometorfano atenúa e invierte el desarrollo de tolerancia a morfina [Elliott et al., “Dextromethorphan Attenuates and Reverses Analgesic Tolerance to Morphine”, Pain, 59: 361-368 (1994), que se incorpora aquí por referencia], una propiedad compartida por los antagonistas MK-801 y LY272614 del receptor de NMDA [Elliott et al., “The NMDA Receptor Antagonists LY274614 and MK-801, and the Nitric Oxide Synthase Inhibitor, NG-Nitro-L-arginine, Attenuate Analgesic Tolerance to the Mu-opioid Morphine but not to Kappa Opioids”, Pain, 56: 69-74 (1994), que se incorpora aquí por referencia]. Puesto que la d,l-metadona reducía las despolarizaciones inducidas por NMDA en preparaciones de cortes cerebrales, ejerce un antagonismo funcional en el receptor de NMDA (Ebert I). Puesto que tanto el isómero d como el l presentan perfiles de unión similares al de la d,l-metadona en el receptor de NMDA, parece razonable suponer que los isómeros también actúan como antagonistas del receptor de NMDA.

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Estos resultados pueden tener ciertas implicaciones clínicas. Compuestos como la d-metadona y el dextrometorfano, con propiedades bloqueadoras del receptor de NMDA, que carecen de las propiedades de los opiáceos en cuanto a producir tolerancia y dependencia pueden ser agentes auxiliares útiles para el dolor neuropático [Elliot et al., “Nmethyl-D-aspartate (NMDA) Receptors Mu and Kappa Opioid Tolerance, and Perspectives on New Analgesic Drug Development”, Neuropsychopharmacology, 13: 347-356 (1995), que se incorpora aquí por referencia]. Además, la combinación de morfina con un antagonista del receptor de NMDA, tal como d-metadona, puede mejorar en gran medida la eficacia de la morfina al atenuar el desarrollo de tolerancia a la morfina, como se ha mostrado para el dextrometorfano [Elliott et al., “Dextromethorphan Attenuates and Reverses Analgesic Tolerance to Morphine”, Pain, 59: 361-368 (1994), que se incorpora aquí por referencia].

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El isómero l de la metadona posee actividad opioide, mientras que el isómero d es débil o inactivo como opiáceo. Se ha mostrado que tanto la d-metadona como la l-metadona se unen al receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) con una afinidad µM, similar a la del dextrometorfano. Para determinar si la d-metadona tiene también una actividad antagónica funcional in vivo sobre el receptor de NMDA, se evaluó en los ensayos de formalina y de retirada de la cola en ratas en cuanto a actividad antinociceptiva (analgésica) y en un ejemplo de tolerancia a morfina en cuanto a su capacidad para atenuar la tolerancia a analgésicos. En ratas preparadas para administración intratecal (IT) de fármacos, un análisis de dosis acumulada-respuesta (CDR; del inglés, cumulative dose-response) con el ensayo de retirada de la cola (TFT; del inglés, tail-flick test) reveló un valor de ED50 de 15,6 µg/rata para la l-metadona IT. Por contraste, la d-metadona IT no producía analgesia con una dosis acumulada de 460 µg/rata. Sin embargo, la d-metadona en un intervalo de dosis de 32 a 320 µg/rata reducía, dependientemente de la dosis, el comportamiento de sacudidas inducido con formalina durante la fase 2 pero no durante la fase 1 del ensayo de formalina. Estos efectos analgésicos de la dmetadona no fueron bloqueados por una dosis IT de naloxona que antagonizaba eficazmente una dosis analgésica (ensayo de retirada de la cola) de d-metadona. La tolerancia a los efectos analgésicos de la morfina IT fue producida mediante la administración, tres veces al día, de una dosis creciente de morfina. Se administró d-metadona en una dosis de 160 µg/rata junto con la morfina, y otro grupo recibió d-metadona sola. El día 5, un análisis CDR con el TFT demostró un desplazamiento x37 en la ED50 de la morfina IT en el grupo tratado con morfina, en comparación con el valor del día 1. Por contraste, la ED50 de la morfina en el grupo de d-metadona+morfina no resultó significativamente aumentada, lo que indica que la d-metadona evitaba el desarrollo de tolerancia a la morfina. La d-metadona sola no alteró la ED50 de la morfina analizada el día 5. Estos resultados indican que la d-metadona ejerce su actividad analgésica en el ensayo de formalina mediante un mecanismo no opioide y son consistentes con la sugerencia de que estos efectos son un resultado de la actividad antagónica sobre el receptor de NMDA. Además, se ha mostrado que los antagonistas del receptor de NMDA atenúan el desarrollo de tolerancia a la morfina, y una dosis de d-metadona eficaz en el ensayo de formalina es también capaz de evitar el desarrollo de tolerancia a la morfina. Se usaron machos de rata Sprague-Dawley que pesaban de 300 a 350 g. Para la administración espinal de fármacos a la rata, se colocó un catéter en el espacio intratecal de 2 a 4 días antes de los experimentos. Bajo anestesia por halotano, se insertó un tubo de PE-10 a través de un pequeño agujero realizado en la membrana atlanto-occipital y se ensartó 9 cm bajo el espacio intratecal hasta el nivel lumbo-sacro de la médula espinal [Shimoyama et al., “Oral Ketamine Produces a Dose-Dependent CNS Depression in the Rat”, Life Sci., 60: PL9-PL14 (1997), que se incorpora aquí por referencia]. Una rata sometida a cateterismo con signos de parálisis era excluida del estudio. Al final del estudio, se introdujeron 5 µl de una disolución de azul de metadona al 1% en el catéter seguidos de 10 µl de disolución salina para confirmar la posición del catéter y la dispersión del colorante en el espacio intratecal.

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Los enantiómeros d-metadona [(S)-(+)-metadona] y l-metadona [(R)-(-)-metadona] se obtuvieron del Research Triangle Institute (Research Triangle Park, Carolina del Norte, EE.UU.) a través del Research Technology Branch of the National Institute on Drug Abuse (Rockville, Maryland, EE.UU.). La base libre de cada isómero fue disuelta en disolución salina con la ayuda de HCl 1 N hasta un pH final de 6,0. El hidrocloruro de naloxona (dosis expresada con respecto a la base libre) y el NMDA se obtuvieron de Research Biochemical International (Natick, Massachusetts, EE.UU.). El NMDA fue disuelto en disolución salina con la ayuda de hidróxido sódico, y el pH final fue ajustado a 7,0. Las disoluciones de naloxona y NMDA fueron preparadas solas y en una disolución con d- o l-metadona, como se indica más adelante, para limitar el volumen total administrado. 11

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Estudio 1: Se determinaron las potencias antinociceptivas de d- y l-metadona espinales mediante el ensayo de la retirada de la cola y el análisis de dosis acumulada-respuesta. Las dosis intratecales de cada fármaco se suministraron en un volumen de 5 µl, seguidas de 10 µl de disolución salina para limpiar el catéter. A causa de la solubilidad limitada de los isómeros, la mayor dosis acumulada ensayada fue 460 µg/rata. Se utilizó un aparato de “retirada de la cola” (EMDIE, Richmond, Virginia, EE.UU.) para aplicar calor radiante a una distancia de 5 a 8 cm de la punta de la cola. Se midió el tiempo desde el inicio del estímulo térmico hasta la retirada de la cola (latencia de la retirada de la cola). La intensidad del calor radiante fue ajustada para que las latencias de la línea de base estuvieran entre 2,5 y 3,5 segundos. Las subsiguientes latencias de respuesta fueron determinadas 15 minutos después de la d- o lmetadona espinal. Este tiempo de pretratamiento fue seleccionado a partir de un estudio del curso temporal tras 40 µg de l-metadona espinal/rata, que reveló un efecto analgésico máximo 15 minutos después de la administración del fármaco. Para evitar daño tisular, el estímulo térmico fue suprimido después de 10 segundos (latencia de corte). Una vez medidas las latencias de línea de base, se administraron dosis crecientes de d- o l-metadona hasta que cada animal llegó a ser un respondedor al analgésico [evaluación de dosis acumulada-respuesta; Elliott et al., “Dextromethorphan Attenuates and Reverses Analgesic Tolerance to Morphine”, Pain, 59: 361-368 (1994); Shimoyama et al., “Ketamine Attenuates and Reverses Morphine Tolerance in Rodents”, Anesthesiology, 85: 1357-66 (1996), que se incorpora aquí por referencia] o se alcanzó la máxima dosis de ensayo (véase más atrás). Un respondedor al analgésico fue definido como uno cuya latencia de respuesta en cuanto a la retirada de la cola era 2 o más veces el valor de la latencia de línea de base. Se convirtieron los datos de latencia en una forma de “ausencia o presencia de respuesta” determinando el porcentaje de respondedores al analgésico en cada grupo para cada dosis acumulada, y se construyó una curva de dosis-respuesta para cada isómero de metadona. Los grupos de tratamiento tenían nueve animales como valor medio. Estudio 2: Se determinó el curso temporal de la acción antagónica de la naloxona espinal sobre los efectos antinociceptivos (ensayo de la retirada de la cola) de la l-metadona espinal al administrar conjuntamente 80 µg de l-metadona/rata y 30 µg de naloxona/rata. Otros grupos recibieron 80 µg de l-metadona/rata o 30 µg de naloxona/rata.

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Estudio 3: Para examinar los efectos de la d-metadona sobre el comportamiento de sacudidas inducido con formalina, se administró espinalmente d-metadona en una dosis de 32, 160 ó 320 µg/rata o disolución salina, en un volumen de 10 µl, 15 minutos antes de la inyección intraplantar de formalina. La formalina fue diluida hasta el 5% a partir de una disolución concentrada del 100% (disolución de formaldehído al 37% en peso/peso; Fisher Scientific Company, Fairlawn, New Jersey, EE.UU.) y fue inyectada subcutáneamente en la pata trasera derecha en un volumen de 50 µl, utilizando una jeringa de vidrio de 50 µl y una aguja desechable nueva de calibre 30. Inmediatamente después de la inyección de formalina, la rata fue colocada en una cámara de ensayo y fue observada continuamente durante los siguientes 60 minutos por un observador que desconocía los grupos de ensayo. Se registró el número de sacudidas, definidas como temblores rápidos de la pata trasera que había recibido la inyección. La inyección de formalina dio lugar a una reacción bifásica de comportamientos de sacudimiento (fase 1: 0-10 minutos; fase 2: 10-60 minutos). Se observaron los evidentes efectos de comportamiento del sistema nervioso central de cada rata durante todo el experimento y se analizó la capacidad de cada rata para remontar una malla de 60 grados [Shimoyama et al., “Oral Ketamine in Antinociceptive in the Rat Formalin Test (abstract)”, 8th World Congress on Pain, 62: 129 (1996), que se incorpora aquí por referencia] inmediatamente antes de la inyección de formalina.

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Estudio 4: Se evaluaron, en el ensayo de la formalina, los efectos de la d-metadona espinal con o sin la administración concurrente de naloxona. La naloxona, en una dosis de 30 µg/rata, bloqueaba completamente los efectos de una dosis antinociceptiva aproximadamente ED90 de l-metadona espinal (80 µg/rata) en el ensayo de la retirada de la cola durante al menos 75 minutos (véase la Figura 2). Se administró espinalmente disolución salina, d-metadona en una dosis de 250 µg/rata o d-metadona en una dosis de 250 µg/rata + 30 µg de naloxona/rata a ratas 15 minutos antes de la inyección intraplantar de formalina, y un observador que desconocía los grupos de ensayo observó el comportamiento de sacudimiento inducido con formalina, como en el Estudio 3. Estudio 5: Se determinó la capacidad de la d-metadona espinal para provocar antagonismo sobre las respuestas de comportamiento nociceptivas al NMDA intratecal, estimando los valores de ED50 para los comportamientos inducidos por NMDA después de un pretratamiento con disolución salina o con d-metadona en una dosis de 250 µg/rata. El NMDA espinal produce una respuesta de comportamiento de corta duración que consiste en intensos comportamientos de mordedura, lamedura y arañamiento caudalmente dirigidos que van normalmente acompañados de vocalización [Okano et al., “Pharmacological Evidence for Involvement of Excitatory Amino Acids in Aversive Responses Induced by Intrathecal Substance P in Rats”, Biol. Pharm. Bull. (Japan), 16: 861-65 (1993), que se incorpora aquí por referencia]. Se administraron intratecalmente dosis de 0,6 a 7,3 nanomoles de NMDA/rata con un intervalo de 3 minutos entre inyecciones. Un respondedor fue definido como una rata en que el NMDA producía un arañamiento, una mordedura y una lamedura de los dermatomas caudales que tenía una duración de al menos 30 segundos. Una vez que un animal se volvía respondedor no era sometido a un ensayo ulterior.

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Análisis estadístico: los datos de dosis-respuesta del Estudio 1, en forma de “ausencia o presencia de respuesta”, fueron analizados con el programa informático BLISS-21 (Oxford University, Oxford, Inglaterra). Este programa maximizaba la función logarítmica de probabilidad para ajustar una curva sigmoidea normal gausiana a los datos de dosisrespuesta y proporcionaba el valor de ED50 y un intervalo de confianza (CI) de 95% [Umans et al., “Pharmacodynamics of Subcutaneously Administered Diacetylmorphine, 6-acetylmorphine and Morphine in Mice”, J. Pharmacol. Exp. Ther., 218: 409-15 (1981), que se incorpora aquí por referencia]. Los datos del ensayo de formalina de los Estudios 3 y 4 fueron analizados mediante un análisis de la varianza de una vía y la prueba t de Student, respectivamente. Se aceptó una significación estadística para P > 0,05. 12

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Estudio 1: Efectos de las d- y l-metadonas en el ensayo de la retirada de la cola. En la Figura 2 se comparan las actividades antinociceptivas de las l- y d-metadonas en función de la dosis espinal. La l-metadona producía una antinocicepción dependiente de la dosis, y el análisis proporcionaba un valor de ED50 de 15,6 µg/rata (7,0-29,8 µg/rata, CI de 95%) para la l-metadona espinal. Ninguna de las ratas que habían recibido d-metadona se volvió un respondedor a analgésico con una dosis espinal acumulada de 460 µg/rata, que era la máxima dosis administrada. Estudio 2: La naloxona evita el efecto de la l-metadona sobre la latencia de la retirada de la cola. La naloxona espinal en una dosis de 30 µg/rata no afectó a las latencias de línea de base en la retirada de la cola ni produjo una respuesta antinociceptiva (analgésica) (Figura 2). Sin embargo, esta dosis de naloxona espinal bloqueaba completamente los efectos antinociceptivos de una dosis de l-metadona de 80 µg/rata, de 15 a 75 minutos después de la administración del fármaco (Figura 3). Estudio 3: Efectos de la d-metadona en el ensayo de la formalina. La d-metadona espinal en una dosis de 32 µg/rata no producía efecto patente alguno sobre el sistema nervioso central, y cada rata que había recibido esta dosis fue capaz de remontar la malla de 60 grados inmediatamente antes de la inyección de formalina. La d-metadona espinal en dosis de 160 y 320 µg/rata producía una parálisis motora transitoria de los miembros traseros en el 44% y 100% de las ratas, respectivamente. El inicio de la parálisis fue aproximadamente 1 minuto después de la administración de d-metadona y duró de 30 segundos a 7 minutos. Sin embargo, al inicio del ensayo de la formalina, cada rata se había recuperado de la parálisis y era capaz de remontar la malla de 60 grados. Se han observado efectos motores similares después de la administración de una gran dosis espinal de ketamina, un antagonista del receptor de NMDA, a ratas [Chaplan et al., “Efficacy of Spinal NMDA Receptor Antagonism in Formalin Hyperalgesia and Nerve Injury Evoked Allodynia in the Rat”, J. Pharmacol. Exp. Ther., 280: 829-38 (1997), que se incorpora aquí por referencia]. Estos efectos tenían un comienzo muy rápido, asemejándose a los efectos motores de un anestésico local, y se resolvían rápidamente, probablemente como resultado de la dilución del fármaco en el líquido cefalorraquídeo espinal. La d-metadona espinal no afectaba al número de sacudidas durante la fase 1 (Figura 4A) pero reducía, dependientemente de la dosis, el comportamiento de sacudimiento de la fase 2, produciendo la dosis de 320 µg/rata una disminución del sacudimiento del 68% (Figura 4B). Estudio 4: Efectos de la naloxona sobre los efectos antinociceptivos de la d-metadona en el ensayo de la formalina. La administración conjunta de naloxona espinal en una dosis de 30 µg/rata no afectaba a la capacidad de la d-metadona espinal, en una dosis de 250 µg/rata, para reducir significativamente el sacudimiento de la fase 2 en comparación con la disolución salina espinal en el ensayo de la formalina (Figura 5). No hubo diferencia estadística alguna en el número de sacudidas de la fase 2 entre los dos grupos tratados con fármaco (Figura 5). Estudio 5: Antagonismo de los efectos de comportamiento nociceptivos del NMDA, por d-metadona. El pretratamiento con d-metadona en una dosis de 250 µg (809 nanomoles)/rata bloqueaba completamente una dosis ED99 (2,4 nanomoles/rata) de NMDA. Esta dosis de d-metadona desplazaba la curva de dosis de NMDA-respuesta a la derecha, de modo que el valor de ED50 del NMDA resultó aumentado más de 3 veces, como se muestra a continuación en la Tabla 2. TABLA 2

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Abundante evidencia sugiere que los receptores de NMDA están implicados en las respuestas nociceptivas a formalina. El pretratamiento con un antagonista competitivo del receptor de NMDA [por ejemplo, APV (ácido 3-amino5-fosfonovalérico) (del inglés, 3-amino-5-phosphonovaleric acid)] o un antagonista no competitivo del receptor de NMDA {por ejemplo, MK-801 [hidrogenomaleato de (+)-5-metil-10,11-dihidro-5H-dibenzo[a,d]ciclohepten-5,10imina], dextrometorfano o ketamina} reduce el comportamiento nociceptivo y/o las respuestas electrofisiológicas inducidas por formalina [Coderre et al., “The Contribution of Excitatory Amino Acids to Central Sensitization and Persistent Nociception After Formalin-Induced Tissue Injury”, J. Neurosci., 12: 3665-70 (1992); Haley et al., “Evidence for Spinal N-methyl-D-aspartate Receptor Involvement in Prolonged Chemical Nociception in the Rat”, Brain Res., 518: 218-26 (1990); Yamamoto et al., “Comparison of the Antinociceptive Effects of Pre- and Posttreatment with 13

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Intrathecal Morphine and MK801, an NMDA Antagonist, on the Formalin Test in the Rat”, Anesthesiology, 77: 757-63 (1992); Vaccarino et al., “NMDA Receptor Antagonists, MK-801 and ACEA-1011, Prevent the Development of Tonic Pain Following Subcutaneous Formalin”, Brain Res., 615: 331-34 (1993); Hunter et al., “Role of Excitatory Amino Acid Receptors in the Mediation of the Nociceptive Response to Formalin in the Rat”, Neurosci. Lett., 174: 217-21 (1994); Elliott et al., “Dextromethorphan Attenuates and Reverses Analgesic Tolerance to Morphíne”, Paln, 59: 36168 (1995); Shimoyama et al., “Ketamine Attenuates and Reverses Morphine Tolerance in Rodents”, Anesthesiology, 85: 1357-66 (1996), que se incorporan aquí por referencia]. Los efectos de los antagonistas del receptor de NMDA son esencialmente sobre los comportamientos de la fase 2 de la respuesta a formalina (Coderre et al., “The Contribution of Excitatory Amino Acids to Central Sensitization and Persistent Nociception After Formalin-Induced Tissue Injury”, J. Neurosci., 12: 3665-70 (1992), que se incorpora aquí por referencia]. Parece que la fase 2 del ensayo de la formalina refleja la sensibilización central. Es muy probable que la barrera de aportaciones de fibras C producidas por la formalina active los receptores de NMDA de la médula espinal, lo que da lugar a la sensibilización de neuronas del asta dorsal. Esto da lugar a la amplificación de la respuesta de la neurona del asta dorsal a las aportaciones de fibras C. Estas aportaciones de fibras C continúan durante todo el periodo de respuestas nociceptivas de comportamiento [McCall et al., “Formalin Induces Biphasic Activity in C-Fibers in the Rat”, Neurosci. Lett., 208: 45-8 (1996), que se incorpora aquí por referencia]. Los antagonistas de NMDA, al bloquear la activación de los receptores de NMDA, evitan la sensibilización de neuronas del asta dorsal y, de ese modo, reducen las respuestas nociceptivas de comportamiento a la formalina. Los antagonistas del receptor de NMDA alteran las latencias de la retirada de la cola sólo en dosis significativamente mayores que las requeridas para afectar al ensayo de la formalina (Nasstrom et al., “Antinociceptive Actions of Different Classes of Excitatory Amino Acid Receptor Antagonists in Mice”, Eur. J. Pharmacol., 212: 21-9 (1992); Elliot et al., “Dextromethorphan Attenuates and Reverses Analgesic Tolerance to Morphine”, Pain, 59: 361-68 (1995), que se incorporan aquí por referencia]. Una evaluación más directa de la actividad antagónica de la d-metadona sobre el receptor de NMDA la proporciona su capacidad para provocar antagonismo sobre comportamientos nociceptivos inducidos por NMDA. El NMDA, cuando se localiza en la médula espinal de la rata, produce comportamientos nociceptivos dependientes de la dosis sobre los que ejerce antagonismo APV, un antagonista del receptor de NMDA, pero no un antagonista de receptor no de NMDA ni un antagonista del receptor de NK-1 [Okano et al., “Pharmacological Evidence for Involvement of Excitatory Amino Acids in Aversive Responses Induced by Intrathecal Substance P in Rats”, Biol. Pharm. Bull. (Japan), 16: 861-65 (1993), que se incorpora aquí por referencia]. La Tabla 2 muestra que la misma dosis de dmetadona que es eficaz en el ensayo de la formalina (Fig. 4) también es capaz de provocar antagonismo sobre los efectos nociceptivos del NMDA. El ensayo de la retirada de la cola es un ensayo sensible a opioides y ha sido muy utilizado para evaluar los efectos analgésicos de los opioides [J. Székely, “The Most Characteristic In Vivo Effects of Opiates”, en Opioid Peptides, compilado por J. I. Székely y A. Z. Rónai, páginas 29-109, CRC Press, Boca Ratón, FLorida, EE.UU. (1982), que se incorpora aquí por referencia]. Los antagonistas de opioides, tal como la morfina, son eficaces en cuanto a suprimir respuestas nociceptivas agudas tales como las producidas en el ensayo de la retirada de la cola, así como las respuestas nociceptivas producidas durante las fases 1 y 2 del ensayo de la formalina [Yaksh et al., “Central Pharmacology of Nociceptive Transmíssion”, en The Textbook of Pain, compilado por P. D. Wall y R. Melzack, páginas 165-200, Churchill Livingstone, Londres (1994), que se incorpora aquí por referencia]. La actividad o falta de actividad de un fármaco, en función de la dosis, en el ensayo de la retirada de la cola (Fig. 2) y en el ensayo de la formalina (Fig. 4, A y B), así como la capacidad de la naloxona, un antagonista del receptor de opioides, para bloquear (Fig. 3) o no poder bloquear (Fig. 5) un efecto antinociceptivo, pueden ser utilizadas para determinar si un fármaco está actuando esencialmente por un mecanismo opioide o no opioide. Parece evidente que la d-metadona actúa como agente no opioide en los ensayos llevados a cabo en este estudio. Además, la capacidad de un fármaco no opioide tal como la d-metadona para afectar a la fase 2 pero no a la fase 1 del ensayo de la formalina (Fig. 4, A y B) y provocar antagonismo sobre comportamientos nociceptivos inducidos por NMDA (Tabla 2), cuando se considera junto con la demostración de que la d-metadona es un antagonista no competitivo del receptor de NMDA in vitro [Gorman et al., “The d- and l- Isomers of Methadone Bind to the Non-Competitive Site on the N-methyl-D-aspartate (NMDA) Receptor in Rat Forebrain and Spinal Cord”, Neurosci. Lett., 223: 5-8 (1997), que se incorpora aquí por referencia], sugiere acusadamente que la d-metadona es antinociceptiva in vivo en virtud de su actividad antagónica sobre el receptor de NMDA. De esta manera, la metadona racémica clínicamente disponible puede poseer actividad antagónica in vivo sobre el receptor de NMDA además de su bien establecida actividad de agonista del receptor de opioides. Los antagonistas del receptor de NMDA han potenciado los efectos antinociceptivos de la morfina [Chapman et al., “The Combination of NMDA Antagonism and Morphine Produces Profound Antinociception in the Rat Dorsal Horn”, Brain Res., 573: 321-23 (1992); Mao et al., “Oral Administration of Dextromethorphan Prevents the Development of Morphine Tolerance and Dependence in Rats”, Pain, 67: 361-68 (1996), que se incorporan aquí por referencia]. Por lo tanto, la actividad antagónica del isómero d de la metadona sobre el receptor de NMDA puede potenciar los efectos opioides antinociceptivos de la l-metadona. Además, los antagonistas del receptor de NMDA atenúan el desarrollo de tolerancia a la morfina (Tiseo et al., “Attenuation and Reversal of Morphine Tolerance by the Competitive N-methyl-D-aspartate Receptor Antagonist, LY274614”, J. Pharmacol. Exp. Ther., 264: 1090-96 (1993); Elliott et al, “Dextromethorphan Attenuates and Reverses Analgesic Tolerance to Morphine”, Pain, 59: 361-68 (1995); Shimoyama et al., “Ketamine Attenuates and Reverses Morphine Tolerance in Rodents”, Anesthesiology, 85: 1357-66 (1996), que se incorporan aquí por referencia]. Por lo tanto, la actividad antagónica de la d-metadona sobre el receptor de NMDA puede actuar para atenuar el desarrollo de tolerancia al componente opioide de la metadona racémica. Clínicamente, los antagonistas del 14

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receptor de NMDA son eficaces en el tratamiento de síndromes de dolor neuropático [Backonja et al., “Response of Chronic Neuropathic Pain Syndrome to Ketamine: A Preliminary Study”, Pain, 56: 51-7 (1994); Eide et al., “Relief of Post-Herpetic Neuralgia with the N-methyl-D-aspartic Acid Receptor Antagonist Ketamine: A Double-Blind, CrossOver Comparison with Morphine and Placebo”, Pain, 58: 347-54 (1994); Max et al., “Intravenous Infusion of the NMDA Antagonist, Ketamine, in Chronic Posttraumatic Pain with Allodynia: A Double-Blind Comparison to Alfentanil and Placebo”, Clin. Neuropharmacol., 18: 360-68 (1995), que se incorporan aquí por referencia] que a menudo pueden ser menos sensibles a un opiáceo tal como la morfina. De este modo, como resultado de su actividad antagónica sobre el receptor de NMDA, la metadona racémica puede ejercer acciones antinociceptivas que son diferentes de las de otros opioides mu, tales como la morfina y la hidromorfona, que no se unen a receptores de NMDA [Gorman et al., “The d- and l-Isomers of Methadone Bind to the Non-Competitive Site on the N-methyl-D-aspartate (NMDA) Receptor in Rat Forebrain and Spinal Cord”, Neurosci. Lett., 223: 5-8 (1997), que se incorpora aquí por referencia]. Comunicados de casos anecdóticos han sugerido el tratamiento exitoso, con metadona, de síndromes dolorosos que eran insensibles a la morfina [Leng et al., “Successful Use of Methadone in Nociceptive Cancer Pain Unresponsive to Morphine”, Palliative Med., 8: 153-55 (1994); J. S. Gardner-Nix, “Oral Methadone for Managing Chronic Nonmalignant Pain”, J. Pain Symptom Manage., 11: 321-28 (1996), que se incorporan aquí por referencia].

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En conclusión, la d-metadona espinal es antinociceptiva en el ensayo de la formalina en rata y causa antagonismo de comportamientos nociceptivos inducidos por NMDA. Parece que esta actividad in vivo es el resultado de la actividad antagónica sobre el receptor de NMDA. Queda por determinar el grado de afectación de esta actividad por la farmacología de metadona racémica.

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Se produjo tolerancia a los efectos analgésicos de morfina IT mediante la administración, 3 veces al día, de una dosis creciente de morfina (10 µg IT/rata el día 1, 20 µg/rata el día 2, y 40 µg/rata el día 3). Otras ratas recibieron d-metadona (160 µg/rata) y dosis crecientes de morfina o d-metadona + disolución salina. Los días 1 y 5, se usó la dosis acumulada de morfina-respuesta para estimar el valor de ED50 de la morfina. El día 5, un análisis CDR con el TFT demostró un elevado grado de tolerancia, ya que la ED50 de la morfina IT en el grupo tratado con morfina se desplazó x37 a la derecha, es decir, se requería 37 veces más morfina para alcanzar el mismo efecto analgésico en comparación con el valor del día 1. Por contraste, la ED50 de la morfina en el grupo de d-metadona+morfina no resultó significativamente aumentado, lo que indica que la d-metadona evitó el desarrollo de tolerancia a la morfina (Tabla 3). Estos resultados indican que la d-metadona puede evitar el desarrollo de tolerancia a la morfina con la misma dosis con que bloqueaba los comportamientos nociceptivos mediados por el receptor de NMDA (véase el Ejemplo 2). Esto proporciona un fuerte respaldo a la conclusión de que la d-metadona produce analgesia (antinocicepción) y bloquea el desarrollo de tolerancia a la morfina mediante el mismo mecanismo. TABLA 3

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Aunque el invento ha sido descrito con detalle con fines de ilustración, se entiende que dicho detalle es meramente con ese fin, y los expertos en la técnica pueden hacer variaciones en el mismo sin apartarse del espíritu ni del alcance del invento que se define mediante las reivindicaciones siguientes.

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ES 2 283 049 T3 REIVINDICACIONES

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1. Uso de una sustancia seleccionada del grupo que consiste en d-metadona, d-metadol, d-alfa-acetilmetadol, l-alfaacetilmetadol, d-alfa-normetadol, l-alfa-normetadol, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y mezclas de los mismos, en la fabricación de un medicamento para tratar el dolor en un sujeto que tiene un receptor de NMDA. 2. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que la sustancia es d-metadona.

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3. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 2, en el que el receptor de NMDA es capaz de una acción biológica, y en el que la administración del medicamento es eficaz para bloquear la acción biológica del receptor de NMDA. 4. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 2, en el que el medicamento está destinado a administración en combinación con un fármaco analgésico.

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5. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 4, en el que el fármaco analgésico es un opiáceo. 6. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 4, en el que el fármaco analgésico es un analgésico adyuvante.

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7. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 2, en el que el sujeto tiene un sistema nervioso central, y en el que el receptor de NMDA está situado en el sistema nervioso central. 8. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 7, en el que el sujeto es un mamífero.

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9. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 8, en el que el mamífero es un ser humano. 10. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 4, en el que el fármaco analgésico y la d-metadona son adecuados para administración oral, parenteral o tópica.

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11. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 2, en el que el medicamento está destinado a administración en combinación con al menos un isómero d de un compuesto análogo a d-metadona. 12. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 2, en el que la d-metadona está en forma de una sal farmacéuticamente aceptable.

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13. Uso de una sustancia seleccionada del grupo que consiste en d-metadona, d-metadol, d-alfa-acetilmetadol, l-alfa-acetilmetadol, d-alfa-normetadol, l-alfa-normetadol, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y mezclas de los mismos, en la fabricación de un medicamento para tratar la adicción a una sustancia narcótica o adictiva en un sujeto que tiene un receptor de NMDA. 14. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 13, en el que la sustancia es d-metadona. 15. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 14, en el que el receptor de NMDA es capaz de una acción biológica, y en el que la administración del medicamento es eficaz para bloquear la acción biológica del receptor de NMDA.

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16. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 14, en el que el sujeto tiene un sistema nervioso central, y en el que el receptor de NMDA está situado en el sistema nervioso central. 17. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 16, en el que el sujeto es un ser humano.

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18. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 14, en el que el medicamento es adecuado para administración oral, parenteral o tópica. 19. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 14, en el que el medicamento está destinado a administración en combinación con al menos un isómero d de un compuesto análogo a d-metadona. 20. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 14, en el que la d-metadona está en forma de una sal farmacéuticamente aceptable.

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