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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k 2 135 480 kInt. Cl. : C12N 5/20, C07K 14/435

11 N´ umero de publicaci´on: 6

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˜ ESPANA

C07K 14/705, C07K 16/28 C12P 21/08, A61K 38/17 A61K 39/395, G01N 33/577

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 93913035.7 kFecha de presentaci´on : 09.06.1993 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 656 906 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 14.06.1995

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54 T´ıtulo: Nueva mol´ ecula de c´ elula endotelial que media la uni´ on de linfocitos en el hombre.

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73 Titular/es: Oy Biotie Therapies

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72 Inventor/es: Jalkanen, Sirpa y

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74 Agente: Tavira Montes-Jovellar, Antonio

30 Prioridad: 09.06.1992 US 895354

Tykist¨ okatu 6, Biocity 20520 Turku, FI

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

01.11.1999

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 135 480 T3

01.11.1999

Aviso:

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Salmi, Marko

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 135 480 T3 DESCRIPCION Nueva mol´ecula de c´elula endotelial que media la uni´ on de linfocitos en el hombre. 5

La presente invenci´on se dirige a un nuevo ant´ıgeno de adhesi´ on celular endotelial humano, denominado VAP-1, un anticuerpo monoclonal, 1B2, que reconoce el ant´ıgeno VAP-1, y la utilizaci´ on de dichas mol´eculas en el diagn´ostico y el tratamiento de enfermedades inflamatorias e infecciosas cr´ onicas y agudas caracterizadas por la migraci´on de linfocitos.

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La mayor´ıa de los linfocitos maduros recircula continuamente entre la sangre y los o´rganos linf´ aticos (Butcher, E.C., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 128, 85 (1986)). Los linfocitos salen de la sangre mediante el reconocimiento y la uni´on a c´elulas endoteliales vasculares. Despu´es, migran entre las c´elulas endoteliales hacia los tejidos circundantes. El tr´afico de linfocitos permite que todo el repertorio de especificidades de linfocitos est´e asequible para reacciones inmunes en todo el organismo; y tambi´en facilita las interacciones c´elula-c´elula requeridas para la generaci´on y el control de las respuestas inmunes. La adherencia de los linfocitos a las c´elulas endoteliales depende de las interacciones entre mol´eculas de adhesi´ on complementarias expresadas en ambos tipos celulares (Springer, T. A., Nature 346, 425 (1990), Stoolman, L. M., Cell 56, 907 (1989); Osborn, L., Cell 62, 3 (1990); Pober y Cotran, Transplantation 50, 537 (1990); Butcher, E. C., Cell 67, 1033 (1991)). En condiciones normales, los linfocitos se unen principalmente a v´enulas postcapilares especializadas denominadas v´enulas endoteliales altas (HEV). Se han descrito sistemas de reconocimiento linfocito-HEV funcionalmente separados, que median la migraci´on linfocitaria a ganglios linf´aticos perif´ericos, ´organos linf´ aticos mucosos, sinovial y piel, de una forma o´rgano-espec´ıfica (Butcher, E. C., et al., Eur. J. Immunol. 10, 210 (1980); Jalkanen, S., et al., Science 233, 556 (1986); Picker, L. J., et al., Nature 349, 796 (1991)). En inflamaci´ on, la activaci´ on de las c´elulas endoteliales produce cambios en el estado de sus mol´eculas de adhesi´ on, lo que determina en gran parte la magnitud y el tipo de influjo de leucocitos en el tejido afectado. As´ı, las mol´eculas de las c´elulas endoteliales son un elemento clave para controlar las caracter´ısticas de la respuesta inmune local, y obviamente, un detallado entendimiento de los mecanismos que regulan el tr´afico de linfocitos y la extravasaci´ on de leucocitos puede proporcionar nuevos medios para manipular cl´ınicamente la respuesta inflamatoria.

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Dado que en el hombre los ligandos de las c´elulas endoteliales que median la localizaci´on de linfocitos selectiva de tejido son en gran parte desconocidos, existe la necesidad de identificar dichas mol´eculas. Se han identificado previamente dos ligandos endoteliales basados en carbohidratos, para receptores de localizaci´on de linfocitos, con pesos moleculares de aproximadamente 50 kD y 90 kD respectivamente (Imai et al., J Cell Biol. 113, 1213 (1991)). Los presentes inventores presentaron en un resumen, en una reuni´on de la European Federation of Immunological Societies en Junio de 1991; algunos hallazgos preliminares que indican la existencia de un ant´ıgeno de c´elula endotelial previamente desconocido, implicado en la uni´on de linfocitos a v´enulas endoteliales altas (Salmi et al, EFIS 11th Meeting Abstracts, 21-12; 1991). Adem´ as, los presentes inventores presentaron en un resumen un ant´ıgeno de c´elula endotelial implicado en la uni´ on de linfocitos a v´enulas endoteliales altas, que es equivalente a la prote´ına VAP-1 presentada en la presente invenci´on. Este resumen, sin embargo, no incluye una descripci´ on efectiva que inevitablemente de c´ omo resultado dicho ant´ıgeno (Jalkanen et al., J. Cell. Biochem. Suppl. 0, Abstract W610, p. 107 (1992)). Reconociendo la importancia de controlar la inflamaci´ on, y conocedores de la necesidad de entender los ligandos de c´elula endotelial que median la localizaci´ on de linfocitos selectiva de tejidos, los inventores trataron de identificar dichas mol´eculas, tal como las expresan los vasos sinoviales humanos. Estos estudios han culminado en la identificaci´ on de una nueva mol´ecula de c´elula endotelial que media la uni´ on de linfocitos en hombre, VAP-1, y la producci´ on de anticuerpos monoclonales contra la misma. Estos anticuerpos son u ´tiles en ensayos para la valoraci´on cuantitativa y cualitativa de los niveles de VAP-1, y en tratamientos cl´ınicos dise˜ nados para antagonizar la acci´ on de VAP-1 en un paciente con necesidad de dicho tratamiento. De acuerdo con esto, la invenci´on se dirige primero a una prote´ına de adhesi´ on vascular 1 (VAP-1) endotelial humana substancialmente purificada y aislada, que tiene un peso molecular de 90 kD, determinado mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras, y que es reconocible por el anticuerpo monoclonal que se obtiene de la l´ınea celular de hibridoma que tiene el n´ umero de acceso DSM ACC 2041.

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ES 2 135 480 T3 La prote´ına VAP-1 est´a esencialmente libre de los contaminantes naturales que se asocian con dicha prote´ına VAP-1 en el hospedante humano o animal. La invenci´on tambi´en se dirige a la prote´ına VAP-1 aislada. 5

La invenci´on tambi´en se dirige a anticuerpos contra la prote´ına VAP-1, especialmente a anticuerpos monoclonales, o a uno de sus fragmentos de uni´ on anti-VAP-1, y a composiciones que contienen dichos anticuerpos. Esta invenci´on proporciona el anticuerpo monoclonal 1B2, as´ı como la l´ınea celular de hibridoma que lo produce (DSM ACC2041). 10

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La invenci´on tambi´en se dirige a un m´etodo para antagonizar la uni´ on de c´elulas endoteliales a linfocitos mediada por VAP-1, comprendiendo dicho m´etodo inhibir in vitro la reacci´on de adhesi´ on linfocito-c´elula endotelial mediada por VAP-1, proporcionando cantidades de un anticuerpo monoclonal anti-VAP-1, suficientes para bloquear los lugares VAP-1 de la c´elula endotelial que participan en dicha reacci´on, especialmente cuando dicha reacci´on de adhesi´ on linfocito-c´elula endotelial est´a asociada con una enfermedad como inflamaci´ on (cr´ onica o aguda), artritis, artritis reumatoide, infecci´ on, dermatosis, enfermedad inflamatoria intestinal, y enfermedad autoinmune. La invenci´on tambi´en se dirige a un m´etodo de diagn´ ostico de un estado morboso que est´ a mediado por la uni´ on de c´elulas endoteliales a linfocitos mediada por VAP-1, en un sujeto, comprendiendo dicho m´etodo detectar la uni´ on de anticuerpos anti-VAP-1 a c´elulas VAP-1 positivas extra´ıdas de dicho sujeto, y diagnosticar dicho estado morboso en base a dicha uni´ on, incluyendo dicho estado morboso inflamaci´ on (cr´onica o aguda), artritis, artritis reumatoide, infecci´ on, dermatosis, enfermedad inflamatoria intestinal, y enfermedades autoinmunes.

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La invenci´on tambi´en se dirige a una composici´on farmac´eutica para utilizaci´ on en la inhibici´ on de la reacci´on de adhesi´ on linfocito-c´elula endotelial mediada por VAP-1, que comprende un anticuerpo antiVAP-1 o uno de sus fragmentos de uni´ on anti-VAP-1, y opcionalmente un excipiente farmac´euticamente aceptable. 30

La invenci´on tambi´en se dirige a una composici´ on para diagn´ ostico para utilizaci´on en el diagn´ ostico de la uni´ on de c´elulas endoteliales a linfocitos mediada por VAP-1 en un paciente, que comprende un anticuerpo anti-VAP-1 o uno de sus fragmentos de uni´ on anti-VAP-1 y, opcionalmente, un excipiente. 35

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Figura 1. Distribuci´ on de VAP-1 en tejidos humanos. (A) En membrana sinovial inflamada, el mAb 1B2 ti˜ ne intensamente vasos similares a HEV. (B) En am´ıgdala, la expresi´ on de VAP-1 var´ıa desde intensa (cabezas de flecha) a muy d´ebil (flechas) o negativa. (C) La tinci´on con inmunofluorescencia de una am´ıgdala muestra la expresi´ on prominente de VAP-1 en superficie luminal de los vasos (flechas). (D) En ap´endice, solo se ven algunas HEV d´ebilmente te˜ nidas (cabezas de flecha). Aumentos: A es x100, B es x250, C y D son x400. Figura 2. VAP-1 es una prote´ına de 90 kD. Pista 1: tinci´ on con plata de VAP-1 inmunopurificada. Pistas 2-3: C´elulas de estroma de am´ıgdala marcadas con 125 I se inmunoprecipitaron, bien con mAb 1B2 (pista 2) o bien con mAb 3G6 como testigo (l´ınea 3). Las bandas en el a´rea de 180-200 kD no est´an siempre presentes. Los pesos moleculares est´andar se indican a la izquierda. Extractos de am´ıgdala empobrecidos de linfocitos se solubilizaron en soluci´on tamp´ on de lisis (NaCl 150 mM, Tris base 10 mM, MgCl2 0,15 mM, NP-40 al 1 %, PMSF 1 mM y aprotinina al 1 %) durante la noche a 4◦ C. El lisado se o mediante el paso del centrifug´ o a 10000 x g durante 30 minutos a 4◦ C. El sobrenadante se pre-clarific´ lisado a trav´es de una columna de Sepharose CL-4B (Pharmacia, Suecia). Despu´es se aplic´o secuencialmente a tres columnas de Sepharose 4B activada con CNBr, tratadas con suero de rat´ on normal, con mAb de IgG1 irrelevante y con mAb de 1B2 (5 mg/ml, columna de 5 ml de volumen). La columna se lav´o extensamente con la soluci´on de tamp´ on de lisis. Despu´es, el material unido a la columna de 1B2 se eluy´o con trietanolamina 50 mM, se liofiliz´o y se resolvi´o en SDS-PAGE (7,5 %, reducido), y se visualiz´ o utilizando tinci´ on de plata.

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Figura 3. VAP-1 est´ a implicada en la uni´on de linfocitos a HEV. La uni´ on de linfocitos a HEV de am´ıgdala, ganglio linf´ atico perif´erico (PLN), sinovial y ap´endice y la uni´ on de granulocitos a HEV de am´ıgdala se examin´ o en presencia y ausencia de mAb de 1B2 utilizando el ensayo in vitro de secci´on congelada. Los resultados de tres experimentos independientes se presentan como porcentajes de la uni´on a testigo con errores est´andar (100 %=n´ umero de c´elulas unidas en secciones tratadas con 3G6). Figura 4. La VAP-1 aislada soporta la uni´ on de linfocitos. VAP-1 inmunopurificada y prote´ınas tes3

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tigo (1E12, una mol´ecula de c´elula endotelial no relacionada que soporta la uni´ on de linfocitos, y BSA) se absorbieron en vidrio, y se determin´ o la uni´ on de linfocitos. (A) Los resultados de dos experimentos independientes se presentan como porcentajes de la uni´ on a testigo (100 %=n´ umero de c´elulas unidas a VAP-1 o 1E12 unidas a la placa, tras tratamiento con mAb de 3G6). La se˜ nal de fondo no espec´ıfica (uni´ on a BSA) se sustrajo de todos los an´ alisis. (B) Uni´ on de linfocitos a un pocillo recubierto de VAP-1 en presencia de mAb 3G6. (C) Uni´ on de linfocitos a un pocillo recubierto de VAP-1 en presencia de mAb 1B2. VAP-1 y 1E12 se purificaron mediante afinidad a partir de extractos de am´ıgdala como se indica en la Figura 2. La VAP-1 purificada, la 1E12 y la BSA inactivada por calor se diluyeron en Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCl2 2mM CaCl2 2mM con β-octil-glucopiranosido al 0,01 % como detergente. Las prote´ınas se absorbieron sobre pocillos de vidrio (portaobjetos de c´amara Lab-Tek, Nunc) durante 16 horas a +4◦ C. Despu´es de bloquearlos en PBS que conten´ıa BSA a 1 mg/ml durante 30 minutos a temperatura ambiente, se a˜ nadieron sobrenadantes de 1B2 o 3G6 a los pocillos y se continu´o la incubaci´ on durante 30 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, c´elulas mononucleares de sangre perif´erica recientemente aisladas, se incubaron en RPMI 1640 que conten´ıa FCS al 10 % y Hepes 10 mM, durante astico. 1 hora a 37◦C, en botellas de cultivo celular, para empobrecer en los monocitos adherentes al pl´ Los linfocitos no adherentes (1,8 x 106 c´elulas/pocillo), en 100 µl de RPMI 1640 se aplicaron en cada pocillo. Despu´es de una incubaci´ on de 30 minutos a 37◦ C, las c´elulas no adherentes se retiraron mediante pipeteo. Las partes superiores de los pocillos se retiraron, los portaobjetos se lavaron en una corriente suave de PBS, y se fijaron en PBS fr´ıo que conten´ıa glutaradehido al 1 %. Despu´es, las c´elulas se ti˜ neron utilizando la tinci´ on Diff-Quick. Las c´elulas unidas se cuantificaron mediante recuento visual del n´ umero de c´elulas en cada pocillo (´area total de 50 mm2 /muestra). Figura 5. VAP-1 est´ a sobre-regulada en el intestino inflamado. En el intestino normal, solo se observan unos cuantos vasos d´ebilmente positivos en la l´amina propria (A, en esta a´rea, las v´enulas son pr´ acticamente negativas para VAP-1). En el intestino inflamado (colitis ulcerosa), se ven numerosas v´enulas positivas para VAP-1 (flechas) tanto en B) l´ amina propria, como en C) fol´ıculos linfoides organizados. Las c´elulas que contienen peroxidasa end´ ogena (c´elulas cebadas) muestran reactividad no espec´ıfica. e, c´elulas epiteliales del intestino; lp, l´ amina propia. Aumento x250. Figura 6. Inducci´ on de VAP-1 en dermatosis cr´onica. Biopsias de piel de a´rea normal (A) y de lesi´on psori´ asica (B) del mismo paciente revelan la inducci´on de VAP-1 en los vasos d´ermicos (cabezas de flecha) en los lugares de inflamaci´ on. Pueden verse infiltrados perivasculares de leucocitos alrededor de las v´enulas VAP-1 positivas. e, epidermis. Aumento x200. C) La expresi´ on de VAP-1 (calificada de + a ++++) en piel normal y enferma se determin´o en biopsias pareadas (no afectada y afectada) de los mismos pacientes. En los par´entesis se muestra el n´ umero de pacientes que pertenecen a cada grupo. Figura 7. La inflamaci´on inducida por VAP-1 media la uni´ on de linfocitos. Se realiz´ o un ensayo de uni´ on en secci´on congelada, en el cual se analiz´o la uni´ on de PBL a v´enulas positivas para Factor VII en l´amina propria inflamada. Los ensayos de inhibici´ on se hicieron mediante preincubaci´on de las secciones tisulares con mAbs 1B2 y 3G6. Los resultados se presentan como porcentajes de la uni´on a testigo, con errores est´ andar (es decir, la uni´ on de PBL en presencia de mAb 3G6 define el 100 % de uni´ on). Las interacciones entre los receptores de superficie de los leucocitos y sus ligandos sobre las c´elulas endoteliales vasculares controla cr´ıticamente el tr´ afico de linfocitos entre la sangre y los diversos o´rganos linf´ aticos, as´ı como la extravasaci´on de leucocitos a los lugares de inflamaci´on. Describimos aqu´ı una nueva mol´ecula de adhesi´ on a c´elula endotelial humana de 90 kD (VAP-1), definida mediante un anticuerpo monoclonal 1B2. La VAP-1 se expresa preferentemente en v´enulas endoteliales altas (HEV) de vasos sinoviales, ganglios linf´ aticos perif´ericos y am´ıgdala, y el 1B2 inhibe marcadamente la uni´ on de linfocitos a HEV en estos tejidos, contrariamente a lo que ocurre en aquellos lugares mucosos. Adem´as, los linfocitos se unen a VAP-1 aislada mediante inmunoafinidad, de una forma que puede inhibirse con 1B2. El patr´ on de expresi´ on, el peso molecular y las propiedades funcionales definen a VAP-1 como un nuevo ligando endotelial para linfocitos. Nosotros concluimos que VAP-1 es una nueva mol´ecula vascular implicada directamente en el tr´ afico de linfocitos en el hombre. Producci´ on de anticuerpos Para la identificaci´ on inicial de la prote´ına VAP-1, se produjeron anticuerpos monoclonales contra vasos sinoviales, mediante inmunizaci´ on de un animal apropiado, como los ratones, con elementos del estroma de la membrana sinovial humana. Dichos elementos del estroma de la membrana sinovial humana pueden obtenerse utilizando m´etodos conocidos en la t´ecnica. El estroma sinovial puede aislarse mediante empobrecimiento de linfocitos del tejido sinovial. El tejido sinovial se corta, y el tejido cortado se presiona a trav´es de un tamiz de acero inoxidable. Los elementos del estroma se recolectan de la parte 4

ES 2 135 480 T3 superior del tamiz.

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El inmun´ ogeno se administra preferentemente junto con un adyuvante, tal como, por ejemplo, el adyuvante incompleto de Freund; sin embargo, puede utilizarse cualquier adyuvante apropiado. El inmun´ ogeno y el adyuvante se inyectan seg´ un cualquier r´egimen o protocolo que de como resultado la inducci´ on de s´ıntesis de anticuerpos. Por ejemplo, la inyecci´on del inmun´ ogeno (elementos del estroma sinovial que contienen aproximadamente 1 µg de ant´ıgeno VAP-1 por inyecci´on) tres veces, con intervalos de una semana, en las patas de ratones Balb/c libres de pat´ ogenos espec´ıficos, inducir´ a la respuesta inmune. Los linfocitos de los ganglios linf´ aticos popl´ıteos se a´ıslan utilizando m´etodos conocidos en la t´ecnica, como se describi´o antes, mediante la presi´on de los ganglios linf´aticos cortados a trav´es de un tamiz de acero inoxidable, y la recolecci´on de los linfocitos liberados del flujo que pasa a su trav´es, y se fusionan con c´elulas de mieloma de rat´on no secretoras NS-1 (disponibles de ATCC, N◦ TIB 18), utilizando protocolos est´andar. Los hibridomas pueden analizarse utilizando cualquier m´etodo apropiado, tal como la tinci´ on con inmunoperoxidasa de secciones congeladas. Se clon´ o dos veces un hibridoma (1B2, subclase IgG1 ) que produc´ıa un anticuerpo que reaccionaba con el endotelio vascular de la membrana sinovial, mediante diluci´ on limitante, y se seleccion´ o para an´ alisis posteriores. El ant´ıgeno reconocido por el mAb 1B2 se denomin´ o VAP-1 (para Vascular Adhesion Protein-1).

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Los anticuerpos utilizados en los m´etodos de la invenci´ on como prote´ınas de uni´ on a VAP-1 son preferiblemente anticuerpos monoespec´ıficos, es decir, anticuerpos con una especificidad solo contra VAP-1, o uno de sus fragmentos antig´enicos. Los anticuerpos monoespec´ıficos pueden ser tanto policlonales como monoclonales.

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Los anticuerpos policlonales pueden prepararse mediante inyecci´on en un animal adecuado, de una preparaci´ on substancialmente pura de VAP-1, seguida de una o m´ as inyecciones de refuerzo a intervalos adecuados.

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Se prefiere, sin embargo, utilizar anticuerpos monoclonales (o sus derivados biol´ogicamente activos, tales como fragmentos Fab’, F(ab’)2 o Fv), dirigidos contra el ant´ıgeno VAP-1, en los m´etodos de la invenci´on. Debe notarse que los anticuerpos monoclonales pueden provenir de cualquier fuente adecuada, y pueden as´ı seleccionarse de, por ejemplo, anticuerpos monoclonales murinos o humanos. El anticuerpo tambi´en puede producirse mediante clonaci´ on de una secuencia de DNA que codifica el anticuerpo, o uno de sus derivados biol´ogicamente activos, en una c´elula adecuada, por ejemplo, una c´elula microbiana, de planta, animal o humana, y cultivo de la c´elula bajo condiciones que conduzcan a la producci´ on del anticuerpo o los derivados biol´ ogicamente activos en cuesti´on, y recuperaci´ on del anticuerpo o de sus derivados biol´ ogicamente activos, del cultivo. Los anticuerpos utilizados en los reactivos de la invenci´on deben estar preferentemente en forma substancialmente pura, para mejorar la precisi´ on del m´etodo. Caracter´ısticas de VAP-1

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La VAP-1 aislada tiene un peso molecular de 90 kD bajo condiciones reductoras, y de 100 kD bajo condiciones no reductoras.

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Para aislar el ant´ıgeno VAP-1, la fuente preferida de prote´ına VAP-1 es un extracto de am´ıgdala empobrecido en linfocitos. Estos extractos se preparan mediante la empobrecimiento de linfocitos de tejido de am´ıgdala, mediante presi´ on del tejido cortado a trav´es de un tamiz de acero inoxidable. Los elementos del estroma se recolectan de la parte superior del tamiz. Sin embargo, cualquier tipo de c´elula que exprese VAP-1 puede utilizarse en el procedimiento posterior, ya que el procedimiento ejemplificado se basa en la afinidad de VAP-1 por el mAb 1B2 para el aislamiento final.

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Todas las etapas deben realizarse a temperaturas refrigeradas (alrededor de 4◦ C). Las c´elulas se lisan on tamp´ on que contiene agentes para la suavemente (por ejemplo durante la noche a 4◦ C) en una soluci´ inhibici´ on de la proteolisis, tal como una soluci´on tamp´ on que contiene NaCl 150 mM, Tris-base 10 mM, MgCl2 0,15 mM, NP40 al 1 %, PMSF 1 mM y aprotinina al 1 %. Dichos extractos preferentemente se liberan de los residuos de la lisis celular mediante una centrifugaci´ on suave a, por ejemplo, 10.000 x g durante 30 minutos. El sobrenadante se aplica entonces a una serie de columnas de afinidad, que proporcionan como agente de afinidad, sucesivamente, (1) suero de rat´ on normal, (2) mAb IgG1 no espec´ıfico (tal como 1E12 o cualquier otro mAb IgG1 no espec´ıfico disponible comercialmente) y (3) mAb 1B2. El 5

ES 2 135 480 T3 material unido a la columna de mAb 1B2 se eluye con trietanolamina 50 mM y se liofiliza. Utilizando esta aproximaci´ on, se aisla VAP-1 del estroma de am´ıgdala. Pueden utilizarse otros m´etodos equivalentes conocidos en la t´ecnica. 5

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Como se detecta utilizando el anticuerpo monoclonal 1B2, en c´elulas, la VAP-1 es abundante en v´enulas similares a HEV en membranas sinoviales inflamados. La VAP-1 no est´a presente en los leucocitos infiltrantes, ni en ning´ un componente del tejido conjuntivo del estroma sinovial. En ganglios linf´ aticos perif´ericos y am´ıgdala, la VAP-1 parece estar presente en la mayor´ıa de HEV. La VAP-1 se localiza principalmente en la cara luminal de las c´elulas endoteliales. Se ve una tinci´on granular de VAP-1 en el citoplasma de las c´elulas endoteliales, y tambi´en en la superficie opuesta a la luminal. Especialmente en am´ıgdala, los niveles de VAP-1 var´ıan mucho entre diferentes HEV, y pocas HEV individuales (con morfolog´ıa rolliza t´ıpica) carecen completamente de VAP-1. En el ap´endice y en la l´amina propria del intestino, solo parecen estar presentes algunas v´enulas d´ebilmente te˜ nidas. Se encuentra expresi´on d´ebil de VAP-1 sobre c´elulas similares a las dendr´ıticas en centros germinales y en c´elulas musculares lisas de arterias, venas y pared intestinal. En contraste, la VAP-1 est´ a pr´ acticamente ausente de la superficie luminal de los grandes vasos. Adem´as de los leucocitos en secciones tisulares, las siguientes c´elulas no parecen expresar VAP-1: linfocitos de sangre perif´erica, monocitos, c´elulas NK, granulocitos y leucocitos aislados de am´ıgdala, la l´ınea celular linfoblastoide T CCRF-CEM (CCL 119, ATCC); las l´ıneas linfoblastoides B KCA e IBW-4 (l´ıneas celulares B transformadas con EBV, obtenidas originalmente de E. Engleman, Universidad de Stanford), una l´ınea celular monoc´ıtica U937 (CRL 1593, ATCC); y las l´ıneas celulares leuc´emicas KG-1 (CCl 246; ATCC); KG-1a (CCL 246.1, ATCC) y K562 (CCL 243, ATCC); la l´ınea celular endotelial EaHy-926 (una l´ınea celular de hibridoma entre carcinoma y c´ elulas endoteliales, Edgell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3724 (1983)); y cultivos primarios de c´elulas musculares lisas, fibroblastos y queratinocitos, y la l´ınea celular epitelioide HeLa (CCL 2, ATCC). Las c´elulas endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), aisladas mediante el m´etodo de Jaffe (J. Clin. Invest. 52:2745 (1973)) no expresaron VAP-1 ni basalmente ni despu´es de tratamiento durante 4 h o 20 h con IL-1 (20, 100 U/ml), TNF (200 U/ml) o LPS (0,1, 1,0 µg/ml). La comparaci´on de VAP-1 con las m´oleculas de c´elula endotelial conocidas que median la uni´ on de leucocitos revela varias diferencias. Las mol´eculas de adhesi´ on intercelular 1 y 2 (ICAM-1 e ICAM-2), la mol´ecula de adhesi´ on de c´elula vascular 1 (VCAM-1), la selectina E (ELAM-1) y la selectina P (CD62, PADGEM, GMP 140) son todas expresadas sobre HUVEC, tanto basalmente como tras inducci´ on mediante mediadores inflamatorios (Springer, T.A., Nature 346:425 (1990); Stoolman, L.M., Cell 56:907 (1989); Osborn, L., Cell 62:3 (1990); Pober y Cotran, Transplantation 50:537 (1990); Butcher, E.C., Cell 67:1033 (1991); de Fougerolles, A.R.,et al., J. Exp. Med 174, 253 (1991); Osborn L., et al., Cell 59:1203 (1989), Bevilacqua, M.P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 9238 (1987); McEver, R.P., et al., J. Clin Invest 84, 92 (1989); Hattori, R., et al., J. Biol. Chem. 264, 7768 (1989); Wellicome, S.M.,et al., J. Immunol. 144, 2558 (1990); Pober, J.S., et al., J. Immunol. 137, 1893 (1986); Dustin, M.L., et al., J. Immunol. 137, 245 (1986). En contraste, VAP-1 no se expresa ni constitucionalmente ni es inducible mediante tratamiento con IL-1, TNFa o LPS, en la superficie ni en el citoplasma de las HUVEC. Las distribuciones tisulares de estas mol´eculas son claramente diferentes- tambi´en, la distribuci´ on es diferente cuando se analiza en secciones paralelas de am´ıgdala (datos no mostrados). Las ICAM ti˜ nen la superficie luminal de la mayor´ıa de los vasos grandes y peque˜ nos y ciertos leucocitos (de Fougerolles, A.R., et al., J. Exp. Med. 174, 253 (1991); Dustin, M.L., et al., J. Immunol. 137, 245 (1986)). Las VCAM-1 y ELAM-1, por otra parte, solo ti˜ nen unas pocas v´enulas en tejidos inflamados (Rice, G.E., et al., J. Exp. Med. 171, 1369 (1990); Rice, G.E., et al., Am. J. Pathol. 138, 385 (1991); Cotran, R.S., et al., J. Exp. Med., 164, 661 (1986)). En lugar de esto, VAP-1 se expresa fuertemente en la amplia mayor´ıa de las HEV en lugares no mucosos, y est´a ausente de todas las c´elulas blancas y l´ıneas celulares ensayadas. Los pesos moleculares de las mol´eculas de adhesi´ on conocidas son tambi´en claramente diferentes del de VAP-1, con la excepci´on de ICAM-1 (ICAM-2 es una mol´ecula de 60 kD, VCAM-1 de110 kD, selectina E de 115 kD y selectina P de 140 (Stoolman, L.M., Cell, 56:907 (1989); Osborn, L., Cell 62:3 (1990); y de Fougerolles, A.R.,et al., J. Exp. Med. 174, 253 (1991)). Adem´ as, VAP-1 est´a principalmente implicada en la uni´ on de linfocitos, mientras que ICAM y selectinas E y P tambi´en median eficazmente la adhesi´on de leucocitos polimorfonucleares (Springer, T.A., Nature 346, 425 (1990); Stoolman, L.M., Cell 56, 907 (1989); Osborn, L., Cell 62, 3 (1990); Pober y Cotran, Transplantation 50, 537 (1990); Butchar, E.C., Cell 67, 1033 (1991)). La u ´ nica mol´ecula de adhesi´on descrita hasta el momento implicada en la uni´ on de linfocitos en el hombre y que no se expresa sobre HUVEC es el ant´ıgeno definido por MECA-79 (Berg, E.L., et al., J. Cell Biol. 114:343 (1991)). Sin embargo, es un agente director espec´ıfico a tejido de los ganglios linf´aticos perif´ericos. Adem´as, VAP-1 no se co-expresa en todas las v´enulas positivas para 6

ES 2 135 480 T3 MECA-79, y el mAb 1B2 no reconoce el ant´ıgeno MECA-79 purificado.

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As´ı, el patr´ on de expresi´ on, la funci´ on y el peso molecular de VAP-1 indican que no es id´entica a ninguna de las mol´eculas endoteliales previamente definidas implicadas en la uni´on de linfocitos, y que el grado de inflamaci´ on se correlaciona con el nivel de expresi´on de VAP-1 in vivo. Estos resultados muestran que VAP-1 es relevante para entender la recirculaci´on fisiol´ ogica de linfocitos en el hombre, y es especialmente valiosa para analizar los mecanismos moleculares de la localizaci´on selectiva de tejidos de los linfocitos.

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Utilizaciones de VAP-1 y de compuestos de uni´ on a VAP-1

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Los compuestos de uni´on a VAP-1 comprendidos en la presente invenci´ on son anticuerpos anti-VAP-1 o sus fragmentos de uni´on anti-VAP-1. Otros posibles compuestos de uni´ on a VAP-1 pueden ser adecuados para utilizarse para los mismos prop´ ositos que los indicados posteriormente para los compuestos de uni´ on a VAP-1, comprendidos en la presente invenci´ on.

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La presente invenci´on se refiere a un reactivo para diagn´ ostico para la detecci´on de prote´ına VAP-1 y de c´elulas positivas para VAP-1, en muestras tomadas del cuerpo de un ser humano o un animal. Tal reactivo puede ser un anticuerpo que reacciona con la prote´ına VAP-1 o un fragmento de dicho anticuerpo que reacciona con VAP-1, marcado, si se desea, con una substancia que permite la detecci´on de la uni´ on del anticuerpo al VAP-1, que ha de ser aislado, o a c´elulas que expresan VAP-1 sobre su superficie. Tal composici´ on de diagn´ ostico puede proveerse en un kit, proveyendo dicho kit, en contenedores separados, (a) un anticuerpo que reacciona con VAP-1, o un derivado biol´ ogicamente activo de dicho anticuerpo, preferiblemente marcado con una substancia que permite la detecci´ on de la uni´ on del anticuerpo al ant´ıgeno VAP-1; y (b) prote´ına VAP-1 purificada, para proporcionar un patr´ on para la evaluaci´ on de los resultados del ensayo.

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En otro aspecto, la presente invenci´ on se dirige a composiciones farmac´euticas para disminuir o tratar la inflamaci´ on en el cuerpo humano o animal, mediante la administraci´ on a un paciente humano o animal con necesidad de dicho tratamiento, de niveles eficaces de un compuesto de uni´ on a VAP-1, que es un anticuerpo reactivo con VAP-1, o un derivado biol´ ogicamente activo de dicho anticuerpo.

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El t´ermino “tratamiento” o “tratar” se entiende que incluye la administraci´on de compuestos de uni´ on a VAP-1 a un sujeto, con prop´ ositos que pueden incluir profilaxis, mejor´ıa, prevenci´ on o curaci´ on de enfermedades mediadas por eventos de adhesi´ on a VAP-1. Las mol´eculas particulares de uni´ on a VAP-1 que son sujeto de los m´etodos de la invenci´ on son prote´ınas de uni´ on a VAP-1 naturales y recombinantes, que son anticuerpos anti-VAP-1 o sus fragmentos de uni´on.

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Para administraci´ on a un paciente, el reactivo de la invenci´ on puede formularse de cualquier manera que lo haga adecuado para administraci´ on parenteral, nasal, ent´erica o rectal. As´ı, el reactivo puede estar en forma de, por ejemplo, una formulaci´on inyectable, formulaci´ on en aerosol, suspensi´ on, soluci´ on, enema, etc. El reactivo puede formularse con excipientes o veh´ıculos farmac´euticamente aceptables, por ejemplo, soluci´on salina isot´onica, seg´ un la pr´ actica farmac´eutica convencional. El nivel de dosis del reactivo ser´ a suficiente para proporcionar un efecto anti-inflamatorio mediante el bloqueo de los eventos de adhesi´ on a VAP-1 en el paciente. El reactivo de la invenci´ on es adecuado para diagnosticar o tratar cualquier enfermedad que incluya un aumento de la reacci´on inflamatoria mediada por adhesi´ on a VAP-1. As´ı, el reactivo es u ´ til para diagnosticar enfermedades tales como artritis, infecciones locales, dermatosis, enfermedades inflamatorias intestinales, enfermedades autoinmunes, etc. En una realizaci´ on, niveles eficaces del compuesto de uni´on a VAP-1, como se defini´o antes, son para administraci´on de modo que proporcione beneficios terap´euticos contra los efectos secundarios inflamatorios perjudiciales de la inflamaci´ on. Por un “nivel eficaz” del compuesto de uni´ on a VAP-1 se entiende un nivel en el que los efectos t´oxicos de los eventos mediados por VAP-1 son, como m´ınimo, aliviados. Por eventos mediados por VAP-1 del hospedante “excesivos”, se entiende un nivel de eventos de adhesi´ on mediados por VAP-1 en el sujeto, que exceden la norma para el estado m´edico saludable del sujeto. Por da˜ no tisular “secundario” o efectos t´oxicos se entiende el da˜ no tisular o efectos t´ oxicos que ocurren en tejidos, o´rganos y las c´elulas de los mismos, por otra parte sanos, debido a la presencia de eventos de adhesi´ on mediados por VAP-1 excesivos, incluyendo los que resultan de un est´ımulo “primario” en 7

ES 2 135 480 T3 cualquier parte del cuerpo.

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La infusi´ on de compuestos de uni´ on a VAP-1 como se definieron antes, tales como, por ejemplo, anticuerpos anti-VAP-1, en un paciente, da como resultado una uni´on de dichos anticuerpos a las c´elulas del paciente que expresan VAP-1 en su superficie, tales como HEV sinoviales, HEV de ganglio linf´ atico perif´erico y HEV de am´ıgdala, de modo que se impide su adhesi´ on a otras c´elulas mediante uni´ on a VAP-1, previniendo e inhibiendo as´ı la adherencia de linfocitos a dichos tejidos y c´elulas, y previniendo as´ı el tr´ afico de linfocitos no deseado, o el influjo en los tejidos o c´elulas afectadas, previniendo as´ı las respuestas inflamatorias no deseadas que se originan del tr´afico de leucocitos y extravasaci´on de leucocitos dirigidas por VAP-1.

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De acuerdo a esto, las composiciones farmac´euticas de la invenci´on proporcionan composiciones que contienen compuestos de uni´ on a VAP-1, como se definieron antes, en cantidades suficientes para antagonizar (total o parcialmente) la VAP-1 natural del paciente, uni´endose a dianas biol´ ogicas de VAP-1 en dicho paciente, y espec´ıficamente a c´elulas endoteliales.

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Los compuestos de uni´on a VAP-1 pueden conjugarse, tanto qu´ımicamente como mediante ingenier´ıa gen´etica, a fragmentos de otros agentes que proporcionen una capacidad de uni´ on de tales compuestos de uni´ on a VAP-1, como se definieron antes, a un lugar de acci´ on deseado. Alternativamente, otros compuestos pueden conjugarse, tanto qu´ımicamente como mediante ingenier´ıa gen´etica, a los compuestos de uni´ on a VAP-1 como se definieron antes, para aumentar o proporcionar propiedades adicionales a tales compuestos de uni´ on a VAP-1, especialmente propiedades que aumentes la capacidad del compuestos de proporcionar alivio a los efectos t´ oxicos mediados por la adhesi´ on a VAP-1. Las cantidades y reg´ımenes de administraci´on de los compuestos de uni´ on a VAP-1 como se definieron antes, pueden determinarse f´ acilmente por los que tienen experiencia normal en la t´ecnica cl´ınica de tratar enfermedades relacionadas con inflamaci´ on, tales como artritis o lesi´on tisular. Generalmente, las dosis de compuesto de uni´ on a VAP-1 para tratamiento variar´ a dependiendo de consideraciones tales como: tipo de compuesto de uni´ on a VAP-1 empleado; edad; salud; situaci´ on m´edica que se est´a tratando; tipo de tratamientos concurrentes, si existen, frecuencia de tratamiento y la naturaleza del efecto deseado; extensi´ on del da˜ no tisular; sexo; duraci´ on de los s´ıntomas; y contraindicaciones, si existen, y otras variables que deben ser ajustadas por el m´edico individual. Una dosis deseada puede ser utilizada para administrarse en una o m´ as aplicaciones para obtener los resultados deseados. Las composiciones farmac´euticas que contienen los compuestos de uni´ on a VAP-1 de la invenci´ on, tales como anticuerpo anti-VAP-1, pueden proporcionarse en formas de dosis unitaria. Las composiciones farmac´euticas que contienen los compuestos de uni´ on a VAP-1 de la invenci´ on pueden utilizarse para administrarse en cualquier excipiente farmacol´ ogico apropiado para administraci´ on. Ellos pueden utilizarse para administrarse en cualquier forma que sea profil´ actica, paliativa, preventiva o curativa de las situaciones con eventos mediados por VAP-1 en seres humanos y animales. Con el prop´ osito de definici´ on, se entiende que la expresi´ on “composiciones farmac´euticas para tratar”, y expresiones similares, a trav´es de las especificaciones y las reivindicaciones, incluye una composici´on farmac´eutica para la prevenci´on de dicha enfermedad. Las preparaciones de las prote´ınas de uni´ on a VAP-1 de la invenci´ on, como se definieron antes, para administraci´on parenteral incluyen suspensiones y emulsiones en disolventes est´eriles acuosos y no acuosos. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilen-glicol, polietilen-glicol, aceite vegetal, aceite de pescado y ´esteres org´anicos inyectables. Los excipientes acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones de agua-alcohol, incluyendo veh´ıculos parenterales m´edicos salinos y tamponados, incluyendo soluci´ on de cloruro s´ odico, soluci´ on de Ringer que contiene lactosa, o aceites fijos. Los veh´ıculos intravenosos incluyen reponedores de l´ıquidos y nutrientes, reponedores de electr´ olitos, tales como los basados en soluci´on de Ringer con dextrosa y similares. Los compuestos de uni´on a VAP-1 de la invenci´ on, como se definieron antes, pueden tambi´en utilizarse para administrarse mediante t´ecnicas de bombas, o en forma de liberaci´on sostenida, especialmente cuando la lesi´ on primaria es prolongada o retardada en lugar de ser aguda. Un ejemplo en el que la lesi´ on primaria frecuentemente es retardada o prolongada en lugar de ser aguda es una infecci´ on o lesi´on en la que el da˜ no al tejido o m´ usculo no se revela (o persiste) durante d´ıas despu´es de la infecci´on o da˜ no primarios. Las mol´eculas de uni´ on a VAP-1 de la invenci´ on pueden tambi´en suministrarse a ´organos espec´ıficos en concentraci´on elevada, mediante t´ecnicas de cat´eteres insertados adecuadamente, o mediante la proporci´ on de dichas mol´eculas como una parte de una mol´eculas (o complejo) quim´erica, dise˜ nada para alcanzar ´ organos espec´ıficos. 8

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La administraci´on en forma de liberaci´on sostenida es m´as conveniente para el paciente cuando est´an indicadas inyecciones repetidas durante periodos de tiempo prolongados. Por ejemplo, es deseable utilizar las prote´ınas de uni´ on a VAP-1 de la invenci´ on como se definieron antes, para administraci´on en forma de liberaci´ on sostenida, cuando las composiciones farmac´euticas de la invenci´on se est´an utilizando para tratar una enfermedad gen´etica o inflamatoria cr´ onica basada en una enfermedad relacionada con VAP-1, para maximizar la comodidad del paciente.

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Los compuestos de uni´on a VAP-1 de la invenci´ on pueden utilizarse en formas de dosis tales como comprimidos, c´apsulas, paquetes de polvo, o soluciones l´ıquidas para administraci´ on oral, si la actividad biol´ ogica del compuesto de uni´ on a VAP-1 no se destruye mediante el proceso digestivo y si las caracter´ısticas del compuesto permiten que se absorba a trav´es del tejido intestinal.

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Las composiciones farmac´euticas de la presente invenci´ on se preparan de una forma conocida en s´ı misma, por ejemplo, mediante t´ecnicas de mezcla convencional, granulaci´on, fabricaci´ on de grageas, disoluci´on, liofilizaci´on o procedimientos similares. Las composiciones de la presente invenci´on obvian el propio mecanismo del cuerpo para reconocer la adhesi´on a VAP-1 en su potencial m´ aximo.

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En la forma de dosis intravenosa, las composiciones de la presente invenci´ on tienen un comienzo de acci´on suficientemente r´ apido como para ser u ´tiles en el manejo agudo del da˜ no tisular potencial. Adicionalmente, una versi´ on de baja potencia es u ´ til en el manejo de enfermedades relacionadas con VAP-1 leves o cr´onicas.

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Adem´as, las composiciones de la presente invenci´on proporcionan los reactivos requeridos para el an´ alisis de laboratorio de los niveles de VAP-1 en sangre o tejido extracelular de seres humanos y animales. Las prote´ınas de uni´ on a VAP-1 que est´an sustancialmente libres de contaminantes naturales pueden aislarse y purificarse de sus fuentes naturales o recombinantes, seg´ un las condiciones y m´etodos convencionales en la t´ecnica previamente utilizada para aislar dichas prote´ınas, tales como extracci´on, precipitaci´ on, cromatograf´ıa, cromatograf´ıa de afinidad, electroforesis y similares. Los siguientes ejemplos intentan u ´ nicamente ilustrar la presente invenci´on y no limitar de ninguna forma su alcance. Ejemplos Ejemplo 1

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Distribuci´ on tisular de VAP-1

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La distribuci´on tisular de VAP-1 se determin´o mediante tinci´ on con inmunoperoxidasa de secciones de criostato. Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios (1B2 y 3G6, un mAb testigo, IgG1 de rat´on, para c´elulas T de pollo) durante 30 minutos. Despu´es de dos lavados con soluci´on salina tamponada nadi´ o IgG de oveja con fosfato (PBS, 8 g NaCl, 1,21 g KH2 PO4 y 0,34 g KH2 PO4 por litro, pH 7,2), se a˜ anti-rat´ on conjugada a peroxidasa (Dakopatt, Denmark) en PBS que conten´ıa suero AB al 5 %, durante 30 minutos. A continuaci´on, se utiliz´o como crom´ogeno hidrocloruro de 3’3’-diaminobencidina en PBS que conten´ıa per´ oxido de hidr´ ogeno al 0,03 %. Despu´es de la tinci´on, las secciones se contrati˜ neron con hematoxilina. Para la tinci´ on de inmunofluorescencia, secciones de criostato de 3 µm se cubrieron con anticuerpos primarios y se utiliz´o como segundo reactivo, IgG de oveja anti-rat´on conjugada con FITC (Sigma, St. Louis). Las tinciones inmunohistol´ ogicas revelaron que el anticuerpo monoclonal 1B2, te˜ n´ıa intensamente las v´enulas similares a HEV en membranas sinoviales inflamadas (Figura 1A). No se observ´o tinci´ on en los leucocitos infiltrantes ni en ning´ un componente del tejido conjuntivo del estroma sinovial. El ant´ıgeno reconocido por el mAb 1B2 se denomin´ o VAP-1 (por Vascular Adhesion Protein-1). En los ganglios linf´ aticos perif´ericos y am´ıgdala, el mAb 1B2 reaccionaba con la mayor´ıa de las HEV (Figura 1B). La VAP-1 se expresaba intensamente en la cara luminal de las c´elulas endoteliales (Figura 1C). Se ve´ıa una tinci´ on granular en el citoplasma de las c´elulas endoteliales, y tambi´en la superficie opuesta a la luminal era mAb 1B2 positiva. Especialmente en am´ıgdala, la intensidad de la tinci´ on variaba notablemente entre las diferentes HEV, y pocas HEV individuales con una morfolog´ıa rolliza t´ıpica eran 1B2-negativas 9

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(Figura 1D). En el ap´endice y en la l´amina propria del intestino, solamente se detectaban algunas pocas v´enulas d´ebilmente te˜ nidas. Apareci´ o tambi´en una d´ebil expresi´on de VAP-1 en las c´elulas similares a dendr´ıticas en los centros germinales y en las c´elulas musculares lisas de arterias, venas y pared intestinal. En contraste, la VAP-1 estaba pr´ acticamente ausente de la superficie luminal de los grandes vasos. Como los leucocitos en las secciones tisulares, los linfocitos, monocitos, c´elulas NK, granulocitos de sangre perif´erica y los leucocitos aislados de am´ıgdala eran todos completamente negativos en el an´ alisis FACS. Las l´ıneas celulares linfoblastoides T (CCRF-CEM), linfoblastomatoides B (KCA, IBW-4), monoc´ıticas as, la VAP-1 estaba ausente (U937) y leuc´emica (KG-1, KG-1a ¯ , K 562), todas carec´ıan de VAP-1. Adem´ de las c´elulas endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), basalmente; el tratamiento posterior con IL-1 (20, 100 U/ml) durante 4 h o 20h, TNF-µ (200 U/ml) o LPS (0,1, 1,0 µg/ml) no pudo inducir su s´ıntesis. Una l´ınea celular endotelial (EaHy-926) tambi´en era 1B2 negativa. Los cultivos primarios de c´elulas musculares lisas, fibroblastos y queratinocitos, y una l´ınea celular epiteliode (HeLa), no expresaban VAP-1. Ejemplo 2 Localizaci´ on intracelular de VAP-1

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Adem´as de los experimentos de localizaci´on tisular descritos en el Ejemplo 1, la localizaci´on intracelular de VAP-1 se estudi´ o posteriormente, mediante microscopia confocal de secciones gruesas (15 µm), cortadas de am´ıgdala. Las secciones se incubaron con mAb 1B2 o 3G6 durante 15 minutos, se lavaron dos veces con PBS y se recubrieron con Ig de oveja anti-rat´on conjugada a FITC durante otros 15 minutos. Despu´es, las muestras se montaron en glicerol que conten´ıa PBS al 10 % y fenilendiamina como agente anti-destinci´on, previo al an´ alisis con microscop´ıa confocal. Mediante inspecci´on microsc´opica, era f´ acilmente discernible que la VAP-1 est´a presente en la superficie luminal de las HEV as´ı como en gr´ anulos discretos en el citoplasma. La identidad de estos gr´ anulos no est´ a actualmente clara, pero con tinci´ on de inmunofluorescencia en dos colores, utilizando mAb 1B2 y anticuerpo anti-factor VIII, los gr´ anulos no co-localizaban. As´ı, los gr´ anulos positivos para VAP-1 no eran los cuerpos de Weibel-Palade de las c´elulas endoteliales, donde se sabe que reside la mol´ecula de adhesi´on de c´elula endotelial P-selectina.

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Ejemplo 3 Determinaci´ on del peso molecular de VAP-1 35

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Se solubilizaron extractos de am´ıgdala empobrecidos de linfocitos, en soluci´ on tamp´ on de lisis (NaCl150 mM, Tris-base10 mM, MgCl2 0,15 mM, NP40 1 %, PMSF 1mM y aprotinina 1 %) durante o a 10000 g durante 30 minutos a 4◦ C. El sobrenadante se preclarila noche a 4◦ C. El lisado se centrifug´ fic´ o, haciendo pasar el lisado a trav´es de una columna de Sepharosa CL-4B (Pharmacia, Suecia). Despu´es se aplic´o secuencialmente a 3 columnas de Sepharosa-4B activada por CnBr (Pharmacia), tratadas con suero de rat´ on normal, con mAb IgG1 irrelevante y con mAb 1B2 (5 mg/ml, volumen de columna de 5 ml). La columna se lav´o extensamente con la soluci´on tamp´ on de lisis. Despu´es, el material unido a la columna de 1B2 se eluy´o con trietanolamina 50 mM, se liofiliz´o y se resolvi´o en SDS-PAGE (7,5 %, reducido), y se visualiz´ o utilizando tinci´ on con plata. Para el marcaje con yodo, extractos de am´ıgdala empobrecidos de linfocitos, se digirieron en RPMI 1640 que conten´ıa 100 U/ml de colagenasa (tipo II de Clostridium histolyticum, Sigma), suero de ternera on suave. Despu´es fetal (FCS) al 10 %, antibi´ oticos, y Hepes 10 mM, durante 1 hora a 37◦C, con agitaci´ de la digesti´on con colagenasa, las c´elulas se lavaron con HBSS, y se marcaron en superficie con 125 I, utilizando el m´etodo de la lactoperoxidasa. Las c´elulas yodadas se lisaron con la soluci´on tamp´ on de lisis, y el lisado se clarific´o mediante centrifugaci´on a 10000 g durante 15 minutos. El lisado se preclarific´ o durante 16 horas a 4◦ C con Sefarosa activada con CnBr unida a suero de rat´on normal. La inmunoprecipitaci´on se realiz´ o con bolas de Sefarosa 4B activada con CnBr, conjugadas con mAbs 1B2 o 3G6. Las muestras se analizaron utilizando SDS-PAGE al 7,5 % bajo condiciones reductoras (2-mercaptoetanol). Para determinar el peso molecular de VAP-1, mol´eculas aisladas mediante afinidad del estroma de am´ıgdala, se sometieron a SDS-PAGE. La tinci´ on con plata del gel revel´ o una banda principal con peso molecular aparente de 90 kD bajo condiciones reductoras (Figura 2). La VAP-1 migraba ligeramente m´ as alisis de los inmunoprecipitados de c´elulas del lenta bajo condiciones no reductoras (Mr 100 kD). Los an´ estroma de am´ıgdala yodadas, confirm´ o la reactividad de mAb 1B2 con una mol´ecula de 90 kD (y con un producto de degradaci´ on un poco m´ as peque˜ no) (Figura 2). Tambi´en se ve´ıa algunas veces una banda de 180-200 kD.

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ES 2 135 480 T3 Ejemplo 4 Uni´ on de linfocito a am´ıgdala, ganglio linf´ atico perif´erico (PLN), sinovial y HEV de ap´endice, y uni´ on de granulocitos a HEV de am´ıgdala 5

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Los detalles de esta t´ecnica han sido descritos previamente (Jalkanen y Butcher, Blood 66, 577 (1985)). Brevemente, secciones congeladas reci´en cortadas de am´ıgdala humana, sinovial, ap´endice y ganglio linf´ atico perif´erico, se incubaron con sobrenadantes de 1B2 o 3G6 durante 30 minutos a 7◦C, con rotaci´on suave. Despu´es se a˜ nadieron linfocitos aislados con Ficoll (3 x 106 / secci´on) en HBSS que conten´ıa FCS al 5 % y Hepes 10 mM, y se continu´ o la incubaci´ on durante 30 minutos. Despu´es de la incubaci´on, las c´elulas no adherentes se retiraron suavemente, y las c´elulas adherentes se fijaron durante la noche en PBS fr´ıo que conten´ıa glutaraldeh´ıdo al 1 %. Las c´elulas unidas a HEV se contaron de forma ciega, en cuatro a seis secciones por tejido por muestra. Cuando se determin´ o la uni´ on de granulocitos, se hizo el ensayo de forma similar, con la excepci´ on de que los granulocitos (aislados utilizando Histopaque 1119, on sobre las Sigma), se mantuvieron en HBSS libre de Ca2+- Mg2+ -, hasta justo antes de su aplicaci´ secciones. La distribuci´on tisular de VAP-1 sobre las c´elulas endoteliales in vivo, suger´ıa que podr´ıa funcionar como un elemento de reconocimiento espec´ıfico para los leucocitos. De esta forma, se estudi´ o el papel funcional de VAP-1 en la uni´ on a HEV, mediante la utilizaci´on del ensayo in vitro de Stamper-Woodruff modificado (Jalkanen y Butcher, Blood 66, 577 (1985)). El pretratamiento de las secciones congeladas con mAb 1B2 inhib´ıa la uni´ on de linfocitos a HEV (Figura 3). El efecto inhibitorio era m´ as pronunciado en am´ıgdala y ganglio linf´ atico perif´erico, pero la uni´on a HEV sinovial tambi´en estaba significativamente reducida. La uni´on de linfocitos a HEV de ap´ endice y la uni´ on de granulocitos a HEV de am´ıgdala se afectaron menos (Figura 3). Estos hallazgos indican que la VAP-1, o bien mediaba, o se asocia cercanamente con elementos de c´elulas endoteliales que median el reconocimiento de linfocitos a HEV de ganglio linf´ atico perif´erico, am´ıgdala o sinovial. Para evaluar directamente la implicaci´ on de VAP-1 en la interacci´on linfocito-c´elula endotelial, se analiz´o la uni´ on de linfocitos a VAP-1 aislada por afinidad (Figura 4). Los linfocitos se adhirieron eficazmente a VAP-1 unida a placas. La uni´on de linfocitos a VAP-1 se inhib´ıa espec´ıficamente con mAb 1B2, pero no con un testigo mAb 3G6. El mAb 1B2 no preven´ıa la uni´ on de linfocitos a otra mol´ecula de c´elula endotelial no relacionada (Figura 4). La distribuci´ on y los resultados de uni´ on a HEV sugieren que la VAP-1 est´ a implicada principalmente en el tr´ afico de linfocitos a ganglio linf´ atico perif´erico, am´ıgdala y sinovial. Interesantemente, en am´ıgdala, la ausencia de expresi´ on de VAP-1 define un subgrupo menor de v´enulas postcapilares, que son morfol´ ogicamente indistinguibles de las positivas a 1B2. Dado que las am´ıgdalas est´ an ´ıntimamente asociadas al tracto gastrointestinal, pueden contener especificidades HEV de ambos tipos, mucosa (VAP-1 negativa) y de ganglio linf´ atico perif´erico (VAP-1 positiva). Falta por determinar como se correlacionan las diferencias fenot´ıpicas en la expresi´on de VAP-1 con la capacidad de uni´ on de linfocitos de cada HEV individual. La escasez de VAP-1 en los o´rganos linfoides mucosos implica que este ant´ıgeno endotelial puede estar regulado diferencialmente en distintos sistemas de reconocimiento de linfocitos. Adem´ as, el grado de inflamaci´ on se correlaciona con el nivel de expresi´on de VAP-1 in vivo. Ejemplo 5

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Ensayo para el efecto de 1B2 sobre la uni´ on de c´elulas a VAP-1

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Se purificaron por afinidad VAP-1 y 1E12 de extractos de am´ıgdala como se describi´ o en el Ejemplo 2. Se diluyeron VAP-1 purificada, 1E12 y BSA inactivado por calor, en Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, Na Cl 150 mM, MgCl2 2 mM, CaCl2 2mM con β-octil-glucopiran´osido al 1 % como detergente. Las prote´ınas se absorbieron en pocillos de cristal (portaobjetos de c´ amara Lab-Tek, Nunc) durante 16 horas a +4◦ C. Despu´es de bloquear en PBS que conten´ıa 1 mg/ml de BSA durante 30 minutos a temperatura ambiente, se a˜ nadieron sobrenadantes de 1B2 o 3G6 a los pocillos, y se continu´o la incubaci´ on durante 30 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, se incubaron c´elulas mononucleares de sangre perif´erica reci´en aisladas, en RPMI 1640 que conten´ıa FCS al 10 % y Hepes 10 mM durante 1 hora a 37◦ C en botellas de cultivo celular para empobrecerlas de monocitos adherentes a pl´astico. Se a˜ nadieron a cada pocillo los linfocitos no adherentes (1,8 x 106 c´elulas/pocillo), en 100 µl de RPMI 1640. Despu´es de incubarlas durante 30 minutos a 37◦ C, las c´elulas no adherentes se retiraron mediante pipeteo. Se retiraron las partes superiores de los pocillos, los portaobjetos se lavaron en una corriente suave de PBS, y se fijaron en PBS fr´ıo que conten´ıa glutaraldeh´ıdo al 1 %. Despu´es, las c´elulas se ti˜ neron utilizando la tinci´ on Diff-Quick. Se cuantificaron las c´elulas unidas mediante reuento visual del n´ umero de c´elulas en cada pocillo (´area total de 50 mm2 /muestra). 11

ES 2 135 480 T3

Ejemplo 6 Secuencia de amino´ acidos parcial de VAP-1 5

Se ha determinado una secuencia parcial de amino´ acidos del ant´ıgeno de 90 kD VAP-1. La secuencia parcial de amino´ acidos es de una longitud de 20 amino´ acidos y es: TEDGDMXLVNGASANEGXVE [SEQ ID NO.:1:]. Una b´ usqueda en las bases de datos de secuencias de prote´ınas y DNA no revela esta secuencia en ninguna otra secuencia conocida. 10

Ejemplo 7 Determinaci´ on de VAP-1 en muestras cl´ınicas que muestran respuesta inflamatoria 15

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Se obtuvieron en fresco muestras de am´ıgdalas normales, ganglios linf´aticos perif´ericos, intestino y coraz´ on, de intervenciones quir´ urgicas, y muestras de ri˜ no´n de donantes de o´rganos. Otros tejidos se obtuvieron de muestras de autopsias. Se determin´ o histopatol´ ogicamente que todos estos espec´ımenes no estaban inflamados. Se obtuvieron espec´ımenes inflamados de biopsias de piel de pacientes que sufr´ıan dermatosis cr´ onicas (psoriasis, eczema at´ opico, liquen ruber plano). Se tomaron tambi´en biopsias de control de ´areas no afectadas macrosc´opicamente de los mismos pacientes. Los espec´ımenes de intestino inflamado se obtuvieron de pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal (Enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa), que requirieron cirug´ıa con prop´ osito terap´eutico. Los espec´ımenes sinoviales fueron de sinovectom´ıas. Las muestras se ti˜ neron con inmunoperoxidasa, como se describi´ o en el Ejemplo 1. Brevemente, secciones congeladas fijadas con acetona se incubaron secuencialmente con anticuerpos primarios (sobrenadantes de cultivo o 50 µg/ml de inmunoglobulina purificada) y con reactivos de segunda fase conjugados con peroxidada apropiados, y la reacci´ on de color se revel´o utilizando H2 O2 y diaminobenzidina como sustrato. La expresi´ on de VAP-1 en las muestras de intestino y de piel (normales e inflamadas) se analiz´o por dos lectores independientes de muestras independientes sin conocimiento del diagn´ostico. Como se vi´o en el Ejemplo 1, la VAP-1 se expresa solamente en un nivel bajo en algunas v´enulas de intestino normal no inflamado (Figura 5A). En contraste, los espec´ımenes de intestino de pacientes con enfermedades inflamatorias intestinales mostraban un marcado aumento de expresi´ on de VAP-1 (Figuras 5By 5C y Tabla I). La VAP-1 se induc´ıa tanto en las v´enulas de pared plana de la l´ amina propria como en las v´enulas similares a HEV en los fol´ıculos linf´aticos organizados (placas de Peyer). Tambi´en en la piel, la inflamaci´ on cr´ onica se acompa˜ naba con aumento de s´ıntesis de VAP-1 (Figuras 6A y B). Para excluir cualquier efecto de variaci´on interindividual en los resultados, se biopsiaron y se ti˜ neron simult´ aneamente, una muestra de la lesi´on de dermatosis y una muestra de control de un a´rea de piel no afectada del mismo paciente. Tambi´en en estos espec´ımenes, el n´ umero de v´enulas VAP-1 positivas en la dermis superior era mayor en la muestra inflamada que en la muestra del a´rea de control. Adem´as, constantemente se asociaban infiltrados de leucocitos perivasculares prominentes con los vasos VAP-1 positivos. TABLA 1

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Inducci´ on de VAP-1 en enfermedades inflamatorias intestinales Espec´ımen

n

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Normal Crohn Colitis ulcerosa

9 7 7

VAP-1 -

+

++

+++

++++

0 0 0

5 0 0

3 2 0

1 3 5

0 2 2

Los espec´ımenes intestinales eran de pacientes operados por enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y tumores (´areas no afectadas de muestras de tumor representan muestras “normales”). El n´ umero de v´enulas VAP-1 positivas en cada muestra se evalu´o desde - hasta ++++. Como se describe en Material y M´etodos.

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ES 2 135 480 T3 Ejemplo 8 VAP-1 media la uni´ on a mucosa inflamada 5

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Se realizaron ensayos in vitro en secciones congeladas, como se describi´o en el Ejemplo 3. El anticuerpo monoclonal 1B2 inhib´ıa la uni´ on de linfocitos a peque˜ nos vasos de la l´ amina propria en aproximadamente 60 % (Figura 7), en dos muestras de intestino que expresaban VAP-1 abundantemente. Aunque la invenci´ on se ha descrito en relaci´ on con sus realizaciones espec´ıficas, se entender´ a que es capaz de posteriores modificaciones, y que su aplicaci´ on pretende cubrir cualquier variaci´ on, utilizaci´on o adaptaci´ on de la invenci´ on, siguiendo, en general, los principios de la invenci´ on, e incluyendo tales desviaciones de la presente descripci´on como venidas de la pr´ actica conocida o habitual en la t´ecnica a la cual pertenece la invenci´on y como tal puede aplicarse a los hechos esenciales establecidos anteriormente y como se detalla en el alcance de las reivindicaciones anexas.

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Listado de Secuencias (1) INFORMACION GENERAL 20

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(i) SOLICITANTE: (A): NOMBRE: Jalkanen, Sirpa (B): CALLE: Rauvolantie (C): CIUDAD: PIISPANRISTI (E): PAIS: FINLANDIA (F): CODIGO POSTAL: SF-20760 (i) SOLICITANTE: (A): NOMBRE: Salmi, Marko (B): CALLE: V¨ ah¨ a-H¨ ameenkatu 12 A (C): CIUDAD: TURKU (E): PAIS: FINLANDIA (F): CODIGO POSTAL: SF-20500 (ii) TITULO DE LA INVENCION: Una nueva mol´ecula de c´elula endotelial que media la uni´ on de linfocitos en el hombre (iii) NUMERO DE SECUENCIA: 1 (iv) DIRECCION PARA CORRESPONDENCIA: (A) DIRECCION: Orion Corporation, ORION-FARMOS PHARMACEUTICALS, Departamento de Patentes (B) CALLE: Orionintie 1 (C) CIUDAD: ESPOO (E) PAIS: FINLANDIA (F) CODIGO POSTAL: SF-02200 (v) FORMATO DE LECTURA EN ORDENADOR:

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(A) (B) (C) (D)

TIPO DE MEDIO: Disquete ORDENADOR: IBM PC compatible SISTEMA OPERATIVO. PC-DOS/MS-DOS PROGRAMA: formato ASCII

(vi) DATOS DE SOLICITUD PREVIA: (A) NUMERO DE SOLICITUD: US895354 (B) FECHA DE SOLICITUD: 6 de Junio de 1992

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ES 2 135 480 T3 (2)

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INFORMACION PARA LA SEQ ID NIO:1: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 amino´ acidos (B) TIPO: Amino´acido (C) CADENAS: Ambas (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: p´eptido (xi) DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO:1: Thr 1 Ser

Glu

Asp

Gly

Ala

Asn 15

Glu

Asp 5 Gly

Met

Xaa

Leu

Xaa

Val

Glu 20

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Val

Asn 10

Gly

Ala

ES 2 135 480 T3 REIVINDICACIONES

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1. La prote´ına-1 de adhesi´ on vascular (VAP-1) humana, substancialmente purificada y aislada, que tiene un peso molecular de 90 kDa, como se determin´ o mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras, que es reconocible por el anticuerpo monoclonal que se obtiene de la l´ınea celular de hibridoma que tiene el n´ umero de acceso DSM ACC 2041. 2. La VAP-1 seg´ un la reivindicaci´ on 1, en la que dicha VAP-1 se une a linfocitos.

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3. La VAP-1 seg´ un las reivindicaciones 1 o 2, en la que dicha VAP-1 se obtiene mediante un proceso de uni´ on de dicha VAP-1 al anticuerpo anti-VAP-1 que se obtiene de la l´ınea celular de hibridoma que tiene el n´ umero de acceso DSM ACC 2041 4. Un anticuerpo anti-VAP-1, o uno de sus fragmentos de uni´ on anti-VAP-1, en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento de uni´ on es espec´ıfico para la VAP-1 endotelial humana seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y en el que dicho anticuerpo no se une a prote´ınas de superficie de c´elula endotelial de vena umbilical humana (HUVEC). 5. El anticuerpo anti-VAP-1 seg´ un la reivindicaci´ on 4, en la que dicho anticuerpo anti-VAP-1 es un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal. 6. El anticuerpo anti-VAP-1 seg´ un la reivindicaci´ on 5, que es un anticuerpo monoclonal 1B2 que se une espec´ıficamente a la prote´ına de adhesi´ on vascular VAP-1, que se obtiene de una l´ınea celular de hibridoma que tiene el n´ umero de acceso DSM ACC 2041.

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7. Una l´ınea celular de hibridoma que produce un anticuerpo anti-VAP-1 seg´ un las reivindicaciones 4 ´o 5. 8. La l´ınea celular de hibridoma de la reivindicaci´ on 7, que tiene el n´ umero de acceso DSM ACC 2041

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9. Una composici´on libre de c´elulas que comprende un anticuerpo anti-VAP-1, o uno de sus fragmentos de uni´ on anti-VAP seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6. 10. Un m´etodo para antagonizar la uni´ on, mediada por VAP-1, de c´elulas endoteliales a linfocitos mediada por VAP-1, comprendiendo dicho m´etodo inhibir in vitro la reacci´on de adhesi´ on linfocito-c´elula endoctelial mediada por VAP-1, proporcionando cantidades de un anticuerpo anti-VAP-1 seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, suficientes para bloquear los lugares VAP-1 de las c´elulas endoteliales que participan en dicha reacci´ on. 11. Un m´etodo para diagnosticar en un paciente, un estado morboso que est´ a mediado por la uni´ on de c´elulas endoteliales a linfocitos mediada por VAP-1, comprendiendo dicho m´etodo: 1. retirar de dicho paciente c´elulas sospechosas de ser c´elulas positivas a VAP-1;

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2. exponer dichas c´elulas de la etapa (1) a un anticuerpo anti-VAP-1 o a uno de sus fragmentos de uni´ on anti-VAP-1 seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6; 3. detectar el anticuerpo anti-VAP-1 o uno de sus fragmentos de uni´ on anti-VAP-1 a dichas c´elulas positivas a VAP-1; y

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4. diagnosticar dicho estado morboso sobre la base de la cantidad de dicha uni´ on. 12. El m´etodo de la reivindicaci´ on 11, en el que dicho estado morboso es una enfermedad seleccionada de un grupo que consiste en inflamaci´ on (cr´ onica o aguda), artritis, artritis reumatoide, infecci´ on, dermatosis, enfermedad inflamatoria intestinal y enfermedad autoinmune.

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13. Composiciones farmac´euticas para utilizaci´on en la inhibici´ on de la reacci´on de adhesi´ on linfocitoc´elula endotelial mediada por VAP-1, que comprenden un anticuerpo anti-VAP-1 o uno de sus fragmentos de uni´ on anti-VAP-1 seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 y, opcionalmente un excipiente farmac´euticamente adecuado. 60

14. Composici´ on para diagn´ ostico para utilizaci´on en el diagn´ ostico de uni´on, mediada por VAP-1,

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ES 2 135 480 T3 de c´elulas endoteliales a linfocitos en un paciente, que comprenden un anticuerpo anti-VAP-1 o uno de sus fragmentos de uni´ on anti-VAP-1 seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 y, opcionalmente, un excipiente. 5

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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