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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k ES 2 048 904 kInt. Cl. : A23J 1/12

11 N.◦ de publicaci´ on: 5

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˜ ESPANA

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 90113171.4 kFecha de presentaci´on : 10.07.90 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 407 981 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 16.01.91

T3

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54 T´ıtulo: Concentrado de prote´ınas solubles de arroz.

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73 Titular/es: Bristol-Myers Squibb Company

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72 Inventor/es: Puski, Gabor;

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74 Agente: Carpintero L´ opez, Francisco

30 Prioridad: 11.07.89 US 377978

345 Park Avenue New York, N.Y. 10154, US

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

01.04.94

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

01.04.94

Aviso:

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Euber, John R. y Hartman, Grant H., Jr.

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

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DESCRIPCION Campo de la invenci´ on La presente invenci´on trata de composiciones alimenticias basadas en el arroz y m´etodos de preparaci´on. M´ as particularmente, la presente invenci´on trata de concentrados de prote´ınas solubles de arroz y del uso en f´ ormulas infantiles nutricionalmente completas. En lo que se refiere a m´etodos, la presente invenci´on trata de un procedimiento para preparar concentrados de prote´ınas solubles de arroz adecuados para un uso en f´ ormulas infantiles basadas en el arroz. Antecedentes de la invenci´ on El arroz es un grano con alto contenido en almid´ on y bajo contenido en prote´ınas que es un elemento principal de la dieta en muchas partes del mundo. El arroz se compone de aproximadamente un 80% de hidratos de carbono con aproximadamente un 6 - 10% de prote´ına. La prote´ına del arroz tiene una RRP alta (relaci´ on de rendimiento de prote´ına - relaci´ on de ganancia en peso de ratas a prote´ına consumida), aproximadamente de 2,18 que es casi equivalente a la de la carne de vaca (2,30), una fuente de prote´ınas considerablemente m´as costosa. Sin embargo, debido a la excesiva masa implicada, los ni˜ nos e infantes no pueden comer una cantidad suficiente de arroz para satisfacer sus requerimientos diarios de prote´ınas. Adem´ as, la prote´ına de arroz es insoluble lo que hace dif´ıcil conseguir f´ormulas alimenticias basadas en el arroz para ni˜ nos peque˜ nos. Los esfuerzos para mejorar el nivel de prote´ınas en el arroz que implican una producci´on selectiva de nuevas variedades de arroz han aumentado los niveles de prote´ınas algo pero no en la extensi´on de proporcionar cepas con niveles de prote´ınas apropiados para uso en f´ ormulas infantiles basadas en el arroz. Otro concepto ha sido el de aumentar el contenido en prote´ınas de la harina de arroz por gelatinizaci´ on y digesti´on enzim´atica del almid´on de arroz con enzimas degradantes de hidratos de carbono corrientemente conocidas como amilasas. Este tratamiento hidroliza el almid´ on para dar sac´ aridos solubles de diversos pesos moleculares tales como glucosa, maltosa, oligosac´ aridos, y dextrinas de los cuales se separa la harina de arroz insoluble enriquecida en prote´ınas, por ejemplo, por centrifugaci´ on. De este modo, por separaci´ on parcial de los hidratos de carbono solubilizados, el contenido en prote´ınas de la harina de arroz procesada aumenta correspondientemente para dar lo que se entiende aqu´ı como harina de arroz rica en prote´ınas (HARP). Entre los antecedentes t´ecnicos dentro de este a´rea general se incluyen las siguientes publicaciones. Hansen y otros, Food Technology, 35 (No. 11), p´ aginas 38 - 42 (1981) desarrollaron una harina de arroz rica en prote´ınas (con un 25% de contenido en prote´ınas) utilizando la enzima alfa - amilasa para digerir el material de almid´on del arroz molido y fragmentado disminuyendo por este motivo el contenido de almid´ on lo que da lugar a un aumento del contenido en prote´ınas comparado con el de la harina de arroz original. En el procedimiento de Hansen y otros, una papilla al 5% 2

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de harina de arroz bruta finamente molida se calienta primeramente durante 30 minutos a 100◦ C para efectuar la gelatinizaci´on, luego se digiere parcialmente por tratamiento con la enzima (alfa - amilasa), se centrifuga y la HARP insoluble se liofiliza. El nivel de prote´ınas se aument´o, seg´ un los informes, tres veces sobre el material de partida (aproximadamente desde alrededor de un 8% hasta el 25%). El sobrenadante est´ a constituido principalmente por hidratos de carbono (98,3%). Chen y otros, J. Sci., Food, Agric., 35, 1128 1135 (1984) modificaron el procedimiento de Hansen y otros, para dar no s´ olo HARP sino tambi´en un jarabe de arroz rico en fructosa a partir del arroz fragmentado. En el procedimiento de Chen y otros se mezcla una papilla del 20% del arroz molido y fragmentado con cloruro de calcio (70 mg/kg de arroz), se ajusta el pH a 6,5 y se digiere (licua) con alfa - amilasa optimamente a 90◦C durante 90 minutos. Se emplea especificamente la alfa - amilasa Termamyl 60L procedente de Novo Industri, A/S, Dinamarca. La mezcla licuada se centrifuga y se deseca la HARP insoluble. El contenido en prote´ınas de HARP fu´e similar al de Hansen y otros (aproximadamente tres veces mayor que en la materia prima). El sobrenadante se sacarifica a 60◦ C con glucoamilasa y luego se isomeriza a fructosa con glucosa isomerasa para dar un jarabe de arroz rico en fructosa que contiene un 50% de glucosa, 42% de fructosa y 3% de maltosa. Chang y otros, Journal of Food Science, 51 (No. 2), p´ aginas 464 - 467 (1986) modificaron posteriormente el procedimiento de Hansen para producir una harina de arroz con contenidos incrementados de prote´ına y calcio. De acuerdo con las condiciones del procedimiento de Chang y otros para la producci´ on de HARP result´o de inter´es el tratamiento de la papilla gelatinizada de harina de arroz con cloruro de calcio y alfa amilasa a 60◦C durante 90 minutos. El almid´on hidrolizado se separ´ o por centrifugaci´ on y se liofiliz´o la pasta insoluble para dar harina de arroz rica en prote´ınas con aproximadamente un 38% de prote´ınas, una relaci´ on RRP de 2,17 y una composici´ on de amino´ acidos similar a la de la harina de arroz de Hansen y otros. Se ha investigado tambi´en la hidr´ olisis enzim´atica del almid´on de arroz en conexi´on con el desarrollo del edulcorante de jarabe de arroz y leche de arroz como se advierte en la siguiente publicaci´ on y en las patentes de Mitchell y otros. Griffin y otros, Journal of Food Science, 54 (No. 1), p´ aginas 190 - 193 (1988) estudiaron modificaciones del procedimiento requeridas para suministrar altos rendimientos de almid´ on de arroz licuado a partir de arroz molido utilizando alfa amilasa estable al calor y un contenido en s´olidos de partida del 30% con la conclusi´ on de que las maltodestrinas de arroz podr´ıan producirse m´as efectivamente a una temperatura de procesamiento de 80◦ C. Mitchell y otros, patente de los EE.UU. No. 4.744.992, describen la producci´ on de un producto nutritivo de leche de arroz obtenido por licuaci´on de las part´ıculas de arroz en grano entero con la enzima alfa - amilasa seguida de sacarificaci´on con una enzima glucosidasa. El proce-

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dimiento no aumenta el contenido en prote´ınas y se retienen los minerales que se encuentran en el arroz en grano entero. Mitchell y otros, en una patente relacionada (patente de los EE.UU. No. 4.756.912) defecan parcialmente el producto de sacarificaci´on de la patente de los EE.UU. No. 4.744.992 para separar sustancialmente toda la fibra del arroz mientras se conservan porciones sustanciales de todos los otros componentes nutrientes para producir un edulcorante de jarabe de arroz. La harina de arroz rica en prote´ınas obtenida como se describe en los antecedentes t´ecnicos no ha demostrado que sea satisfactoria en lo que respecta al uso en f´ ormulas infantiles. Una proporci´ on por encima del 80% de prote´ına de arroz est´a constituida por glutenina que es completamente insoluble a los pH generalmente considerados aceptables para f´ ormulas infantiles. Como resultado, las f´ ormulas elaboradas con tales prote´ınas no forman dispersiones satisfactorias, tienen una sensaci´ on gustativa granulosa y abrasiva y tienden a taponar la tetina del biber´ on. La t´ecnica anterior expuesta arriba concierne principalmente a la producci´ on de HARP y/o edulcorantes del jarabe de arroz. No hay ninguna instrucci´ on con respecto a la supresi´ on o reducci´ on de a´cido f´ıtico o minerales indeseables, tales como el manganeso, selenio y aluminio, que se concentran en el producto final durante el procesamiento de la materia prima del arroz o para la provisi´ on de prote´ına de arroz solubilizada adecuada para f´ ormulas listas para el uso (LPU). Con respecto al aluminio, este mineral est´ a presente en toda la cadena alimentaria y se sabe que alimentos de origen vegetal, incluyendo el arroz, contienen mayores concentraciones de aluminio que la leche bovina o humana. Infantes con funci´ on renal normal absorben muy poco aluminio dietario y consecuentemente no parece presentar problemas la cantidad de aluminio presente en f´ ormulas infantiles. El aluminio que se absorbe se excreta eficientemente por los ri˜ nones de estos infantes. Sin embargo, pacientes con funci´ on renal alterada o infantes prematuros con funci´ on renal inmadura se consideran que presentan un alto riesgo de desarrollar transtornos metab´ olicos asociados con el aluminio, incluyendo trastornos de los huesos, a causa de una capacidad menor que la normal para excretar aluminio sist´emico a trav´es de los ri˜ nones. De este modo, entre los infantes con m´aximo riesgo de toxicidad del aluminio se incluyen aquellos que presentan una funci´ on renal alterada, que requieren una prolongada nutrici´ on parenteral, e infantes prematuros con necesidad acrecentada de calcio y f´ osforo. Se prefiere para estos infantes una f´ ormula infantil con un contenido reducido de aluminio. Por lo que respecta al selenio, se conocen muchos antes de sus efectos nutricionales los efectos t´ oxicos de este mineral por una ingesti´ on excesiva en animales y el hombre. En cuanto a lo u ´ ltimo, se reconoce ahora el selenio como un mineral traza esencial tanto en los animales como en el hombre. Se han descrito y estudiado dos enfermedades por deficiencia de selenio en el hombre en la Rep´ ublica Popular China, la enfermedad de

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Keshan y Kaschin - Beck. El margen de seguridad entre deficiencia y toxicidad para la ingesti´ on de selenio es m´as estrecho que para la mayor´ıa de los otros elementos traza. Los constituyentes alimentarios son la principal fuente de selenio por mediaci´ on de las fuentes de prote´ınas vegetales o animales. En general, la ingesti´on por alimentos del selenio en diferentes partes del mundo cae dentro del intervalo de 20 a 300 mcg por d´ıa. La ingesti´ on de selenio por los infantes es de particular inter´es debido a su r´ apido crecimiento y al aumento de los requerimientos metab´olicos. La ingesti´ on diet´etica diaria de seguridad estimada y adecuada de selenio se muestra a continuaci´on. Intervalo de ingesti´ on diet´etica diaria de seguridad estimada y adecuada de selenio∗

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Grupo de edades Infantes

(A˜ nos) 0 - 0,5 0,5 - 1,0 Ni˜ nos 1-3 4-6 Adolescentes y adultos

Ingesti´ on diaria de selenio mcg 10 - 40 20 - 60 20 - 80 30 - 120 50 - 200

∗ Academia Nacional de Ciencias de los EE.UU., Consejo Nacional de Investigaci´ on (1980). Tolerancias Diet´eticas Recomendadas. Recomendadas, Tribunal de Alimentos y Nutrici´ on, Comit´e de Tolerancias Diet´eticas, Washington, DC, pg. 195. La cantidad de selenio en el arroz depende de la regi´ on donde se haya cultivado. Por este motivo, es prudente reducir en general los niveles de arroz procesado utilizado para la preparaci´ on de f´ ormulas infantiles. La tecnolog´ıa del procedimiento de preparaci´ on de prote´ınas solubles de arroz descrito en esta solicitud de patente proporciona una reducci´on aproximadamente un 25 - 30% de la cantidad de selenio asociado con la prote´ına minimizando con ello el riesgo de que el contenido de selenio sea mayor que el intervalo de seguridad recomendado y adecuado. El a´cido f´ıtico (´ester hexaortomonofosfato de mioinositol) es la principal forma de almacenamiento de fosfato y est´ a distribuido por todas partes en plantas, particularmente en granos de cereales (incluyendo el arroz) y legumbres. Se sabe que en ciertas condiciones, el ´acido fitico en la dieta puede disminuir la absorci´ on de minerales diet´eticos tales como cinc, calcio, magnesio y hierro. El a´cido f´ıtico no esta presente en f´ ormulas infantiles basadas en leche humana o leche de vaca, pero se encuentra en f´ormulas basadas en soja. Lonnerdal y otros, Am. J. Clin. Nutr. 48 301 6 (1988), demostraron que la baja biodisponibilidad de cinc de la f´ ormula de soja comparada con la f´ ormula de leche de vaca es una funci´ on de su concentraci´on en ´acido f´ıtico y puede superarse por separaci´ on del a´cido f´ıtico. Puesto que el contenido en ´acido f´ıtico del arroz es casi tan alto como en la soja en base a las prote´ınas, es importante reducir el nivel de a´cido f´ıtico de la f´ ormula infantil basada en arroz. Sin embargo, la t´ecnica anterior no ha consignado el

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problema de la reducci´on de a´cido f´ıtico en el procesamiento de la harina de arroz. La tecnolog´ıa del procedimiento de preparaci´ on de prote´ınas solubles de arroz descrita en esta solicitud de patente reduce el contenido de ´acido f´ıtico a niveles extremadamente bajos. Con referencia al manganeso, la patente de los EE.UU. No. 4.830.861 de Puski y otros como solicitantes expedida el 16 de Mayo, 1989 (incorporada en este Documento como referencia) describe un procedimiento para preparar HARP con niveles de seguridad y adecuados de manganeso para infantes a partir de la harina de arroz comercialmente disponible que contiene ex - presamente alrededor de 150 - 260 microgramos (mcg) de manganeso por gramo de prote´ına. En los procedimientos convencionales de la t´ecnica anterior que implican una gelatinizaci´on y digesti´on enzim´atica de la harina de arroz, junto con un aumento del contenido en prote´ınas hay un concomitante enriquecimiento de manganeso a un nivel sustancialmente mayor que el que se considera seguro y adecuado para la ingesti´ on diet´etica diaria. Aparentemente, el manganeso se asocia con la prote´ına y permanece con la HARP separada m´as que con los sac´aridos solubilizados. Mientras que el manganeso se considera un elemento esencial de la dieta de mam´ıferos, se sabe tambi´en que los infantes humanos requieren solamente cantidades relativamente peque˜ nas. Los niveles de la leche humana est´an generalmente por debajo de 32 microgramos por aproximadamente un litro (cuarto de gal´ on) y los especialistas en nutrici´on pedi´ atrica apoyan las f´ ormulas infantiles con niveles relativamente bajos de manganeso. La Academia Nacional de Ciencias - Tribunal de Alimentos y Nutrici´ on (ANC - TAN) ha determinado la ingesti´on media diaria U.S. y la ingesti´ on diet´etica diaria de seguridad estimada y adecuada como sigue.

gal´ on) de prote´ına de arroz basado en f´ ormulas infantiles que contienen 14 y 20 gramos de prote´ınas se calcula como sigue para niveles particulares de manganeso de la harina de arroz. 5

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Aproximadamente un litro (cuarto de gal´ on) de la f´ ormula infantil contiene t´ıpicamente alrededor de 14 - 20 g de prote´ına. Como se dijo previamente, la HARP de la t´ecnica anterior retiene sustancialmente todo el manganeso presente en la harina de arroz que tiene niveles t´ıpicos de manganeso de 150 - 260 microgramos por gramo de prote´ına. Por este motivo, la cantidad de manganeso en aproximadamente un litro (cuarto de 4

Contenido en man- Microgramos de manganeso ganeso de harina por aprox. un litro de arroz (mcg/g (cuarto de gal´ on) prote´ınas) 14 g prot./1 20 g prot./1 aprox. aprox. 150 2100 3000 260 3640 5200

Con la suposici´on de que una dieta de infante incluye aproximadamente un litro (cuarto de gal´ on) de f´ ormula por d´ıa, la harina de arroz como fuente de prote´ınas puede contener un m´ aximo de aproximadamente 50 mcg de manganeso/g de prote´ına (ingesti´ on de manganeso diet´etico diaria de seguridad m´axima estimada y adecuada de 700 mcg/d´ıa para infantes de 0 - 6 meses dividido por 14 gramos de prote´ınas). Consecuentemente, las harinas de arroz no pueden utilizarse para fabricar HARP adecuada para f´ ormulas infantiles sin reducci´ on del manganeso puesto que contienen considerablemente m´ as manganeso como se ilustra en la Tabla 1 de m´ as abajo. TABLA 1

Fuente Alimentos Ricelanda Asociaci´ on de cosecheros de arroz de Californiab Harina de arroz Rivianac Harina de arroz de Coord

Manganeso, mcg/g de prote´ına 150 - 163 150 - 200 150 - 250 220 - 260

a. Sttutgart, AR 50

500 - 700 mcg/d´ıa 700 - 1000 mcg/d´ıa 1.000 - 3.000 mcg/d´ıa 2.500 - 5.000 mcg/d´ıa

Manganeso por aprox. un litro (cuarto de gal´ on) de la f´ ormula de harina de arroz (gramos de prote´ına x mcg de manganeso por gramo)

Contenido en manganeso de harinas de arroz comerciales

Ingesti´ on di´etetica diaria de seguridad estimada y adecuada Infantes 0 - 6 meses Infantes 6 - 12 meses Ni˜ nos y adolescentes Adultos

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Ingesti´ on diet´etica Ingesti´on diaria media U.S. Infantes 10 - 300 mcg/d´ıa Ni˜ nos, 3 a 5 a˜ nos 1.400 mcg/d´ıa Ni˜ nos, 10 a 13 a˜ nos 2.180 mcg/d´ıa Adultos 2.500 - 9.000 mcg/d´ıa

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b. Sacramento, CA c. Houston, TX

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d. ADM Milling, Rice Div., Weiner, AR. El procedimiento de Puski y otros, patente de los EE.UU. 4.830.861 proporciona HARP con manganeso especialmente reducido como sigue:

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(1) mezcla de harina de arroz y agua a un pH de 3,4 a 4,6, (2) separaci´ on de la harina de arroz insoluble lavada,

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(3) resuspensi´on de la harina de arroz lavada y ajuste a un pH adecuado para una enzima alfa - amilasa,

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(4) tratamiento con una enzima alfa - amilasa durante un tiempo suficiente para hidrolizar el almid´on hasta aproximadamente 5 - 50 equivalentes de glucosa (EG), (5) ajuste de la mezcla a un pH de 3,4 - 4,6,

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(6) separaci´ on del jarabe de arroz de la HARP insoluble baja en manganeso. La harina de arroz insoluble rica en prote´ınas y baja en manganeso es apropiada como ingrediente b´ asico para alimentos pero se requiere un procesamiento adicional para obtener unas caracter´ısticas de dispersibilidad y sensaci´on gustativa apropiadas para su utilizaci´on en f´ ormulas infantiles. Esto se lleva a cabo por: (7) tratamiento de la HARP baja en manganeso con una enzima proteolitica para hidrolizar desde un 1 a un 5% de los enlaces peptidicos, (9) inactivaci´on de las enzimas con calor a 70◦ - 80◦ C. La HARP con bajo manganeso tratada con proteasa se deshidrata por aspersi´ on para proporcionar una HARP modificada que contiene 50 mcg o menos manganeso por gramo de prote´ına. Esta HARP baja en manganeso relativamente insoluble es adecuada para f´ ormulas infantiles en polvo pero no puede utilizarse para fabricar productos l´ıquidos est´eriles para f´ormulas infantiles. Cuando se prepar´ o la f´ormula esterilizada en recipiente cerrado con una HARP baja en manganeso, el producto resultante fu´e muy granuloso con una sensaci´on gustativa abrasiva despu´es de la esterilizaci´on y estabilidad de almacenamiento pobre lo que di´ o lugar a una duraci´ on de conservaci´on inaceptable. Se sabe en general en la t´ecnica que la prote´ına del arroz es relativamente insoluble en soluciones acuosas. Es tambi´en de conocimiento general que la digestibilidad de la harina de arroz es baja comparada con la prote´ına de la leche o prote´ına de soja aislada. Esto puede ser debido a la baja solubilidad de la prote´ına de arroz. Bradbury y otros, Br. J. Nutr. 52 507 - 13 (1984) publicaron un m´etodo eficaz “in vitro” para determinar la digestibilidad de la prote´ına de arroz. El primer paso de esta t´ecnica es la digesti´on por pepsina a pH 1,5 a 37◦C durante 3 horas. El segundo paso es la digesti´ on con una mezcla de enzimas pancreaticas a pH 8,2 a 37◦C durante 16 horas. Utilizando este procedimiento, el arroz cocido tiene una digestibilidad “in vitro” de aproximadamente del 77%, MacLean J. Nutr. 108, 1740 - 47 (1978) demostr´o que la digestibilidad aparente del nitr´ ogeno en ni˜ nos de 12 - 18 meses de edad oscil´o de 52 - 78% con arroz cocido. Por este motivo resulta evidente que el arroz cocido, medido por t´ecnicas “in vitro” e “in vivo” tiene una digestibilidad baja. Con respecto al arroz en f´ ormulas infantiles o productos nutricionales, es deseable una prote´ına del arroz altamente digerible y su abastecimiento se garantiza con la presente invenci´on.

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El precedente documento EP - A - 0 350 952 se refiere a la harina de arroz rica en prote´ınas que contiene m´as de un 16% de prote´ına y con un contenido en manganeso de 50 µg o menos por gramo de prote´ına. Adem´ as se describe un procedimiento para preparar la harina de arroz rica en prote´ınas con manganeso bajo. Resumen de la invenci´ on De acuerdo con la invenci´ on, se proporciona un concentrado de prote´ınas solubles del arroz con una digestibilidad mejorada y con un contenido sustancialmente reducido de manganeso, aluminio, selenio y ´acido f´ıtico con relaci´on al contenido en base a la prote´ına de arroz, as´ı como a un procedimiento para preparar el mismo que incluye los siguientes pasos: digesti´on de una papilla de materia prima con una enzima alfa - amilasa para solubilizar el almid´on de arroz; calentamiento de la papilla de arroz a temperatura elevada; separaci´ on de los hidratos de carbono solubilizados

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del arroz de la prote´ına insoluble de arroz; tratamiento de una papilla de la prote´ına insoluble de arroz con una enzima proteasa; y separaci´ on de la prote´ına soluble de arroz del material insoluble del arroz para dar un concentrado de prote´ınas solubles de arroz con digestibilidad mejorada y bajo contenido en manganeso, aluminio, selenio y a´cido f´ıtico. El concentrado de prote´ınas solubles de arroz de esta invenci´on puede utilizarse como fuente de prote´ınas en f´ormulas infantiles l´ıquidas o pulverizadas. Es un objetivo primario de la presente invenci´on proporcionar prote´ına soluble de arroz apropiada para utilizaci´on en f´ ormulas infantiles estables durante el almacenado listas para el uso (LPU) o del concentrado. Otro objetivo de la presente invenci´ on es el de proporcionar concentrados de prote´ınas solubles de arroz (CPSA) con digestibilidad mejorada y relativamente bajos niveles de manganeso, aluminio, selenio y a´cido f´ıtico que pueden usarse en f´ ormulas infantiles El CPSA de la invenci´ on se caracteriza porque tiene: un contenido en prote´ınas mayor del 16% preferiblemente del 16 al 90% de prote´ına sobre una base de s´ olidos, un contenido en manganeso de 50 microgramos o menos por gramo de prote´ına, un contenido en aluminio menor de 15 microgramos por gramo de prote´ına,

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un contenido en selenio reducido a un m´ınimo del 25% sobre una base de prote´ınas con relaci´on a la materia prima de arroz de partida, 5

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con minerales traza y ´acido f´ıtico reducidos y con digestibilidad mejorada,

un contenido en a´cido f´ıtico menor de 15 mg por gramo de prote´ına y preferiblemente menor de 5 mg por gramo de prote´ına, y una digestibilidad de prote´ına superior al 90%. Otro objetivo es el de proporcionar un procedimiento para producir CPSA con niveles reducidos de manganeso, aluminio, selenio, ´acido f´ıtico y mejorada digestibilidad con relaci´on a la materia prima de arroz. Otro objetivo de la invenci´ on es el de proporcionar una f´ ormula infantil l´ıquida nutricionalmente completa lista para uso basada en el arroz utilizando el presente CPSA como prote´ına. Para una f´ ormula que contenga 14 g de prote´ına por aproximadamente un litro (cuarto de gal´ on), los niveles deseables de minerales traza y ´acido f´ıtico son menores de 700 microgramos de manganeso, menor de 210 microgramos de aluminio y menor de 40 microgramos de selenio y un contenido en ´acido f´ıtico inferior a 210 miligramos por aproximadamente un litro (cuarto de gal´ on). Estos y otros objetivos evidentes de la memoria descriptiva se consiguen con la invenci´ on presente de acuerdo con la descripci´on detallada que sigue. Breve descripci´ on del dibujo La FIGURA 1 es un diagrama esquem´atico que ilustra la preparaci´ on de un concentrado de prote´ınas solubles de arroz de acuerdo con la invenci´on. Descripci´ on detallada de la invenci´ on Todas las formas de arroz tales como en grano entero, arroz fragmentado, arroz de cervecer´ıa, semolas de arroz y harina de arroz pueden utilizarse como materias primas en el procedimiento presente para la preparaci´ on del concentrado de prote´ınas solubles de arroz (CPSA) con digestibilidad mejorada y contenidos reducidos de manganeso, aluminio, selenio y ´acido f´ıtico. El arroz de cervecer´ıa es particularmente preferido debido a su disponibilidad y costo relativamente bajo comparado con el arroz entero en grano y fragmentado. Sigue una detallada discusi´ on de los pasos del procedimiento y para los prop´ ositos de la memoria descriptiva presente y reivindicaciones, se definen los siguientes t´erminos: Harina de arroz rica en prote´ınas (HARP) - material preparado por eliminaci´on parcial de hidratos de carbono solubles del arroz y que contiene m´as del 16% de prote´ına insoluble sin separar minerales traza y ´acido f´ıtico. HARP bajo en manganeso - harina de arroz rica en prote´ınas que contiene menos de 50 mcg de manganeso por gramo de prote´ına.

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Residuo insoluble del arroz (RIA) - fracci´ on insoluble que queda despu´es de la separaci´on de CPSA obtenida a partir de la HARP tratada con proteasa.

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De acuerdo con la invenci´ on, se proporciona un procedimiento para la preparaci´ on de CPSA a partir del arroz que comprende:

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(a) digesti´ on de la materia prima con las part´ıculas reducidas de tama˜ no para facilitar una acci´ on enzim´atica eficiente en un medio acuoso con una enzima alfa - amilasa a un pH y temperatura adecuados durante un per´ıodo de tiempo suficiente para solubilizar una porci´ on sustancial del almid´ on de arroz y formar una papilla l´ıquida; (b) calentamiento de la papilla a temperaturas elevadas por ej. 105◦C a 130◦ C durante 30 a 60 segundos;

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Jarabe de arroz - hidratos de carbono del arroz solubles en agua. Concentrado de prote´ınas solubles del arroz (CPSA) - s´olidos solubles del arroz preparados seg´ un la presente invenci´ on que tienen por lo menos un 16% de prote´ına de arroz

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(c) separaci´ on de la HARP del jarabe de arroz; (d) tratamiento de una papilla de la HARP con una enzima proteasa a un pH y temperatura adecuados en una proporci´ on y durante un per´ıodo de tiempo suficiente para solubilizar la prote´ına de arroz; (e) separaci´ on de la prote´ına solubilizada de arroz del residuo insoluble del arroz para proporcionar un concentrado de prote´ına soluble de arroz con digestibilidad mejorada y un contenido reducido de manganeso, aluminio, selenio y ´acido f´ıtico. El paso inicial del procedimiento presente requiere la preparaci´ on de una papilla acuosa de la materia prima de arroz de partida. Como se mencion´o antes, todas las formas de grano de arroz pueden utilizarse, en este caso con arroz de cervecer´ıa, definido como part´ıculas de arroz que pasan por un tamiz con perforaciones redondas de 1,4 mm, particularmente preferido por razones econ´omicas. La u ´ nica restricci´ on es que la materia prima de arroz tiene que ser suficientemente triturada para hacer m´axima el ´area superficial efectiva expuesta a la enzima. La materia prima de arroz puede molerse hasta el tama˜ no de part´ıcula deseado antes de su dispersi´ on en agua o molturarse en h´ umedo durante el proceso. Tan pronto como se llega a una papilla bombeable, la cantidad de agua utilizada no es particularmente cr´ıtica. Sin embargo, se prefiere una relaci´ on en peso arroz - agua de 1:4 puesto que esta relaci´ on proporciona un nivel suficiente de s´ olidos en el jarabe para un procesamiento econ´ omico y puede incorporarse f´ acilmente el CPSA en la f´ormula infantil. En el paso (a), la digesti´ on de la materia prima de arroz se lleva a cabo de una manera convencional utilizando una enzima alfa - amilasa termostable tal como el Termamyl (Novo Laboratories, Inc., Wilton, CT) o Takalite (Miles, Inc., Elkhart, IN). Puede utilizarse una base o a´cido

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apropiados para ajustar el pH de la papilla dentro del intervalo o´ptimo de la enzima, generalmente alrededor de 5,5 - 9,0. En una realizaci´ on preferida, la digesti´ on se conduce al pH de la papilla de arroz (pH 6,2) minimizando de este modo los pasos del proceso y los minerales a˜ nadidos en el procedimiento requeridos para el ajuste del pH y neutralizaci´ on. La digesti´on con amilasa se lleva preferiblemente a cabo a 90 - 95◦C durante 40 minutos en presencia de calcio libre a un nivel de 100 ppm para mejorar la estabilidad al calor de la amilasa. Los niveles enzim´aticos adecuados dependen de la fuente de la enzima, temperatura, tiempo, pH y otras condiciones del procedimiento. Por ejemplo, puede utilizarse Takalite L - 340 a una concentraci´ on de 0,34% de s´olidos de arroz a 90◦ C y pH 6,2 durante 40 minutos. Como ser´a apreciado por los especialistas en la t´ecnica, pueden utilizarse temperaturas menores en tanto que se alcance una temperatura de gelatinizaci´on de arroz de aproximadamente 65 as, puede variarse el tiempo de di70◦C. Adem´ gesti´ on dependiendo de la actividad de la enzima y el grado de hidr´ olisis requerido del almid´ on. En el procedimiento de la invenci´ on, la mezcla acuosa de la enzima y la materia prima de arroz se mantiene durante un per´ıodo suficiente para hidrolizar el almid´ on de arroz hasta 5 - 50 equivalentes de glucosa (EG), preferiblemente hasta 20 - 30 EG, deseado para la f´ ormula infantil presente. El EG constituye una medida del poder de degradaci´ on total del hidrato de carbono con relaci´on a la glucosa. Para 5 - 50 EG, el almid´ on de arroz ha sido suficientemente hidrolizado (es decir, solubilizado) para proporcionar (por separaci´on de la mezcla) una harina de arroz rica en prote´ınas que tiene un nivel de prote´ınas del 16% o por encima sobre una base de s´ olidos. Los niveles de prote´ınas preferidos son de 16% a 60% aunque pueden alcanzarse niveles de prote´ına cercanos al intervalo de 90% a 100% con relaciones incrementadas de agua a arroz y pasos de lavado. La relaci´on entre el tiempo de digesti´ on y EG se muestra en la Tabla 2 siguiente.

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TABLA 2 Efecto del tiempo de digesti´ on sobre el equivalente de glucosa en el producto de digesti´ on con amilasa∗ Tiempo (minutos) 20 40 60 80

EG 18 21 24 26

∗ Takalite L - 340 al 0,34% de s´ olidos del arroz a 90◦C y pH 6,2. Despu´es de la gelatinizaci´on y digesti´on de la materia prima de arroz en el paso (a), el producto resultante de la digesti´ on con amilasa se calienta a temperatura elevada, por ej. en el intervalo de 105◦ C a 130◦C durante 30 - 60 segundos y 110◦C a 120◦C durante 40 - 50 segundos. Como ser´ a apreciado por los especialistas en la t´ecnica, puede lograrse un tratamiento t´ermico elevado

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por combinaciones alternativas de tiempo y temperatura requiriendo en general un tiempo menor para temperaturas m´ as altas y un tiempo mayor para temperaturas m´as bajas. La inyecci´ on directa de vapor (IDV) puede utilizarse en el tratamiento t´ermico. Adem´as de inactivar la enzima amilasa, el tratamiento t´ermico proporciona sorprendentemente un aumento sustancial del rendimiento de prote´ına del producto concentrado de prote´ınas solubles del arroz comparado con el rendimiento del producto fabricado sin este tratamiento t´ermico adicional. Despu´es del tratamiento t´ermico del paso (b), se separa el jarabe de arroz de la HARP insoluble por m´etodos convencionales tales como la centrifugaci´ on, filtraci´ on o decantaci´ on. La HARP as´ı obtenida contiene esencialmente todos los minerales presentes en la materia prima del arroz y en ese aspecto es similar a la HARP de los antecedentes t´ecnicos. Luego, la HARP modificada por calor del paso (c) se solubiliza con enzimas proteasa. La hidr´ olisis enzim´atica de la prote´ına se realiza a˜ nadiendo en primer lugar suficiente agua para que la fracci´ on insoluble de HARP proporcione una papilla bombeable con ajuste del pH y temperatura de acuerdo con el margen de operatividad de la enzima proteasa particular. Entre las condiciones generales del procedimiento se incluyen la diluci´ on de la fracci´ on de HARP modificada por calor hasta aproximadamente un 14% de los s´olidos totales o en el intervalo de 10 - 20% sobre una base p/p, el calentamiento de la papilla de HARP aproximadamente a 40 - 60◦C, y el ajuste del pH con una base apropiada tal como hidroxido de sodio o potasio aproximadamente a 6,5 9,0. Las enzimas proteoliticas de varias fuentes incluyendo las de origen fungal, bacteriano, vegetal y animal pueden utilizarse individualmente o en combinaci´on en el procedimiento presente. La pancreatina es una enzima particularmente preferida pues proporciona rendimientos relativamente altos de prote´ınas, se dispone con facilidad de ella (Biocon, Inc. Lexington, KY; American Laboratories, Inc., Omaha, NE) y tiene una actividad excepcionalmente alta como proteasa por unidad de coste. Combinaciones de enzimas tales como la Protease N y Prozime 6 (Amano International Enzyme Corp., Inc., froy, VA) constituyen un sistema enzim´atico alternativo eficaz. Por ejemplo, la combinaci´ on de Protease N aproximadamente al 0,5 y Prozime 6 aproximadamente al 2,2% de substrato de prote´ına solubiliza m´as prote´ına de arroz que cada una de las enzimas solas a la misma o superior concentraci´ on. Si se utiliza pancreatina, la mezcla se calienta en condiciones t´ıpicas a 50◦C y el pH se ajusta a 8,0 con un alcali tal como hidr´ oxido de potasio, hidr´ oxido de calcio, o hidr´ oxido de sodio. Durante la digesti´ on, se a˜ nade alcali adicional, por ej. KOH, para mantener el pH 8 durante 10 a 20 minutos. En este momento se permite que el pH baje hasta un pH final de aproximadamente 6,9 a 7,5. La cantidad de base utilizada se controla de modo que proporcione un contenido en potasio adecuado en el producto CPSA para su 7

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utilizaci´on en f´ ormulas infantiles. Una alternativa a lo anterior es emplear hidr´ oxido de calcio para mantener el pH 8 durante la digesti´ on y subsiguiente ajuste a pH 6,5 a 7,5 con un ´acido tal como el fosf´ orico. En condiciones t´ıpicas, se emplea pancreatina con una actividad de 200 unidades NF/mg (8PX USP) a un nivel del 1% a 4% del substrato de prote´ına. En los productos de digesti´ on con pancreatina, la temperatura influye sobre el porcentaje de prote´ına de arrozsolubilizada y sobre el porcentaje del contenido en nitr´ ogeno α - aminico del concentrado de prote´ına soluble del arroz. Los resultados de la Tabla 3 muestran que puede lograrse una aceptable solubilidad de la prote´ına en todo el intervalo de temperaturas estudiado (35◦ - 60◦C). Sin embargo el intervalo de temperaturas preferido para la solubilizaci´on e hidrolisis de las prote´ınas del arroz es de 40◦ C a 55◦C. Por razones microbiol´ogicas, la temperatura de operaci´ on ´optima esta en el final superior del intervalo de temperaturas preferido.

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Temperatura digesti´ on (◦ C) 35 40 45 50 55 60

Prote´ına solubilizada % 72,0 75,5 75,8 75,5 74,4 71,4

Contenido de nitr´ ogeno α - am´ınico del CPSA % 22,0 23,1 26,4 27,9 27,4 23,1

La digesti´on con proteasa se lleva a cabo durante un per´ıodo de 1 a 5 horas mientras que se mantiene la temperatura de incubaci´ on y condiciones de pH como se observ´o arriba. La relaci´ on entre el tiempo de digesti´ on y solubilizaci´on de prote´ına para un nivel de pancreatina del 2% se muestra m´as abajo en la Tabla 4. TABLA 4

Prote´ına solubilizada % 69,1 70,6 72,2 74,5 75,2 76,5

Contenido de nitr´ ogeno α - aminico en el CPSA % 25,4 27,5 28,8 29,6 30,2 30,9

Es evidente que la mayor parte de la solubilizaci´on de la prote´ına tiene lugar en la primera hora con relativamente poca hidr´ olisis adicional despu´es de tres horas. 8

TABLA 5 Efecto del nivel de uso de la pancreatina sobre la solubilizaci´ on e hidr´ olisis de la prote´ına de arroz

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Efecto del tiempo de digesti´ on con proteasa sobre la solubilizaci´ on e hidr´ olisis de prote´ınas Tiempo (horas) 1 1,5 2 3 4 5

Como se esperaba, la velocidad de digesti´on depende tambi´en del nivel de proteasa utilizado con relaci´on al contenido en prote´ına del producto de digesti´ on. Los resultados con la enzima pancreatina se muestran m´as abajo en la Tabla 5. La relaci´on de pancreatina a prote´ına se describe en porcentaje en peso de pancreatina con relaci´on al peso de prote´ına. Los resultados muestran que niveles de pancreatina que oscilan entre 1 y 2,5% proporcionan una solubilizaci´on satisfactoria de prote´ına. Los resultados de la Tabla 5 muestran tambi´en que el nitr´ogeno α - aminico aumenta cuando la relaci´ on de pancreatina a prote´ına aumenta de 1 a 2,5%. Puesto que se prefiere la m´axima solubilizaci´on, se utiliz´o el nivel de pancreatina del 2% en base a la prote´ına para estudiar las variables que influyen en la solubilizaci´on de la prote´ına como se muestra en las Tablas 3 y 4.

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TABLA 3 Efecto de las temperaturas de digesti´ on de prote´ınas sobre la solubilizaci´ on e hidr´ olisis de prote´ınas

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Relaci´ on enzima - prote´ına (%, p/p) 1,0 1,5 2,0 2,5

Prote´ına solubilizada (%) 71,2 74,0 75,5 75,2

CPSA contenido de nitr´ ogeno α - am´ınico (%) 24,5 26,5 27,9 29,3

Cuando finaliza la digesti´ on con pancreatina del HARP, el producto digerido de prote´ına se calienta a 85 - 90◦C durante 10 minutos para inactivar la proteasa y la fracci´ on insoluble se separa por centrifugaci´on u otros medios adecuados. Al pH de digesti´ on, el concentrado de prote´ınas solubles del arroz contiene niveles bajos de minerales traza indeseables y a´cido f´ıtico mientras que la fracci´on insoluble conten´ıa niveles relativamente altos de estas sustancias indeseables. Por este motivo, el procedimiento de la presente invenci´on separa trazas minerales indeseables y ´acido f´ıtico del material de arroz de partida lo que produce una fracci´ on de prote´ına soluble de arroz que es apropiada para su uso en f´ ormulas infantiles. El paso de separaci´ on final (e) es particularmente cr´ıtico para el presente procedimiento. En este paso, se retienen cantidades substanciales de minerales indeseables y ´acido f´ıtico en el residuo insoluble de arroz dejando el CPSA con niveles reducidos de manganeso, aluminio, selenio y a´cido f´ıtico apropiados para f´ ormulas infantiles. Se lleva a cabo preferiblemente esta separaci´ on con un control del pH entre 6 y 8 para una eliminaci´ on efectiva de manganeso y ´acido f´ıtico del CPSA. Cuando el pH de separaci´on se reduce a pH 5 o inferior, la reducci´ on del manganeso y a´cido f´ıtico en el concentrado de prote´ınas solubles de arroz es considerablemente menos eficiente. Estos compuestos tienden a permanecer en la fracci´ on soluble despu´es de la separaci´on a pH bajo como se muestra en la Tabla 6 m´as abajo. Como para el selenio, la cantidad separada con relaci´ on a la materia prima de arroz es un m´ınimo de aproxi-

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a. Hansen y otros, supra.

madamente un 25% y no est´ a influenciada apreciablemente por el pH de separaci´on.

b. Por diferencia

TABLA 6 El contenido de manganeso y a ´cido f´ıtico de harina de arroz rica en prote´ınas y concentrado de prote´ınas solubles del arroz usando varios pH de separaci´ on del producto digerido Muestra CPSA pH CPSA pH CPSA pH CPSA pH CPSA pH CPSA pH HARP —

7,65 7,5 7,0 6,0 5,0 3,0

Manganeso mcg/g de prote´ına 5,6 4,9 11,1 33,4 151 226 196

Acido f´ıtico mg/g de prote´ına 0,8 — 2,1 — 19,1 14,9 22,5

No se recomienda la separaci´ on a un alto nivel de pH debido al pardeo y otras reacciones indeseables. Con la finalidad de hacer m´ aximos los rendimientos de prote´ına, pueden lavarse los s´ olidos insolubles obtenidos del CPSA separado con agua lo que da lugar a una segunda fracci´ on de CPSA. En un ejemplo t´ıpico, el residuo insoluble del arroz se diluy´ o con agua corriente hasta un 6% p/p de s´ olidos totales y se centrifug´ o. La segunda fracci´ on del concentrado de prote´ınas solubles ten´ıa aproximadamente un 0.9% de prote´ınas y se combin´o con la fracci´ on primera del concentrado de prote´ınas solubles con un 4,4% de prote´ınas para proporcionar un concentrado con un 3,1% de prote´ınas y un rendimiento total de prote´ınas del 69%. Las Tablas 7 y 8 de m´as abajo muestran una comparaci´on representativa de los contenidos de prote´ınas, hidratos de carbono, grasas, cenizas, minerales traza y ´acido f´ıtico de harina de arroz sin procesar, harina de arroz rica en prote´ınas, arroz de cervecer´ıa y concentrado de prote´ınas solubles de arroz de la presente invenci´ on. Es evidente que, comparado con la HARP, el CPSA tiene niveles sustancialmente reducidos de todos los minerales traza y a´cido f´ıtico.

Composici´ on del concentrado de prote´ınas solubles de arroz (CPSA) comparado con harina de arroz y harina de arroz rica en prote´ınas (HARP)a

Prote´ına % p/p Hidrato de carbonob % p/p Grasa % p/p Ceniza % p/p

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TABLA 8 Comparaci´ on del contenido en minerales traza y acido f´ıtico de HARP y CPSA preparados de ´ muestras de arroz de cervecer´ıa

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Muestra Manganeso 1 mcg/g de 2 prote´ına 3 Aluminio 1 mcg/g de 2 prote´ına 3 Selenio 1 mcg/g de 2 prote´ına 3 Acido f´ıtico 1 mg/g de 2 prote´ına 3

Arroz cerve- HARP CPSA cer´ıa 210 190 12,4 180 200 7,2 230 230 7,1 53 40,1 no detectable 370 282 15 65 31 no detectable 3,8 3,5 2,3 2,1 2,1 1,4 2,6 1,8 1,9 23,6 20,7 0,8 24,1 20,1 0,7 24,9 23,2 1,0

La invenci´on presente produce un concentrado de prote´ınas solubles de arroz que tambi´en tiene prote´ınas altamente digeribles. Los resultados de la Tabla 9, m´as abajo, muestran que la digestibilidad “in vitro” del CPSA es aproximadamente del 96% mientras que la HARP baja en Mn es del 81%. Es tambi´en evidente que la prote´ına con menor digestibilidad est´ a concentrada en el RIA. Es deseable la prote´ına con alta digestibilidad para uso en productos de f´ormulas infantiles. TABLA 9

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Digestibilidad “in vitro” de muestras de prote´ınas de arroz No. de muestras Digestibilidad % Harina de arroz 6 87,8 ± 3,6 HARP baja en Mna 13 81,4 ± 3,5 CPSA 12 95,7 ± 3,9 RIA 3 64,7 ± 5,7

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TABLA 7

Composici´ on

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a. Puski y otros, patente de los EE.UU. No. 4.830.861 55

Harina de arroz 9,0

HARP

CPSA

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84,4 0,4 6,6

68,9 4,1 1,1

50,5 2,0 10,5

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El concentrado de prote´ınas solubles del arroz puede utilizarse como tal o despu´es de desecarlo para f´ ormular productos nutritivos. Una formulaci´ on t´ıpica LPU utilizando CPSA se muestra en la Tabla 10 m´as abajo. Este producto se formul´ o para 675 kcal por litro (20 kcal por onza fluida) y contiene 12 mg de hierro por aproximadamente un litro (cuarto de gal´ on). La composici´ on de este producto es un 1,7% de prote´ına, 3,54% de grasa, 0,39% de ceniza, 6,76% de hidratos de carbono y 12,39% de s´olidos totales calculado en base a p/p.

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TABLA 10 F´ ormula infantil basada en CPSA 675 kcal por litro (20 kcal por onza fluida), 12 mg de hierro por aprox. un litro (cuarto de gal´ on) Ingrediente Cantidad CPSA (40,2% de prote´ına, 55,4% de CHO, 408,5 g 4,4% de ceniza) S´ olidos de jarabe de arroz (98,3% de CHO, 431,64 g 1,3% de ceniza) Mezcla de grasas (55 de coco, 45% de soja) 353,73 g Emulsionantes 11,00 g Hidr´ oxido de calcio 4,47 g Fosfato de potasio, monob´ asico 2,86 g Fosfato de sodio, monob´ asico 2,97 g Acido c´ıtrico 7,36 g Cloruro de calcio 6,69 g Citrato de sodio 3,13 g Cloruro de magnesio 1,97 g Sulfato ferroso 0,64 g Premezcla seca de vitaminas 2,14 g Concentrado de vitaminas ADEK 0,32 g L - Lisina 4,27 g L - Treonina 1,48 g Premezcla de minerales traza 0,17 g Agua 8.757,18 g Total 10.000,01 g

Como se mencion´ o previamente, los niveles de manganeso, aluminio, selenio y ´acido f´ıtico suministrados por el CPSA de esta invenci´ on son apropiados para f´ ormulas infantiles. A este respecto, el nivel preferido de manganeso es menor de 50 microgramos por gramo de prote´ına. Para el aluminio, el nivel preferido es menor de 15 microgramos por gramo de prote´ına. Para el selenio, el nivel preferido es menor de 3,0 microgramos por gramo de prote´ına. Para el a´cido f´ıtico, el nivel preferido es menor de 15 miligramos por gramo de prote´ına y m´ as preferiblemente menor de 5 miligramos por gramo de prote´ına. El procedimiento y productos de esta invenci´on est´an ilustrados por los siguientes ejemplos que no tienen que ser interpretados como limitantes de la invenci´on en su campo u objetivos. Ejemplo 1 Efecto del tratamiento t´ermico del producto de digesti´ on con amilasa sobre el rendimiento del CPSA Este ejemplo da cuenta de que el tratamiento t´ermico del producto de digesti´ on con amilasa mejora sustancialmente el rendimiento en prote´ına del concentrado de prote´ınas solubles de arroz. Una papilla de arroz de cervecer´ıa (2,4 kg), cloruro de calcio (3,36 g) y Takalite L - 340 (8,25 g) en agua (9,6 kg) se calent´o a 90 - 95◦ C durante 60 minutos para permitir que la amilasa termostable digiriera e hidrolizara el almid´ on del arroz de cervecer´ıa. Despu´es del tratamiento con la amilasa, el producto de digesti´ on se trat´ o t´ermicamente a 107◦C durante 45 segundos por inyecci´on directa de vapor (IDV). El producto de digesti´on tratado por IDV, que conten´ıa alrede10

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dor de un 18% de s´ olidos, se enfri´ o r´ apidamente o aproximadamente hasta 75 - 85◦ C y se centrifug´ con una Centrifuga Internacional CRU - 5000, rotor 276 a 2300 rpm durante 12 minutos. La torta insoluble de la HARP conten´ıa aproximadamente un 28,5% de s´olidos (que habr´ıa tenido un contenido de 41,8% de prote´ına) mientras que el sobrenadante a base de hidratos de carbono contenia un 17,7% de s´olidos. Una porci´ on de 980 g de la torta de HARP se diluy´o hasta 2.000 g con agua doblemente destilada y la papilla se calent´ o a 45 - 50◦C y se ajust´ o a pH 8 con 8,3 g de hidr´ oxido de potasio del 20%. Se a˜ nadi´ o Pancreatin 8X (American Laboratories, Inc.) a un nivel de 2,3 g (2% de enzima en base a prote´ına) con el pH de la papilla mantenido en 8 con hidr´ oxido de calcio durante un per´ıodo de digesti´ on de 5 horas. El pH se redujo a 6,5 con a´cido fosf´ orico y el producto de digesti´on se calent´o a 85 - 90◦ C durante 10 minutos para inactivar la enzima. El producto de digesti´ on con proteasa se enfri´ o a 25 - 35◦ C y luego se fraccion´ o en una fracci´ on de prote´ına soluble y una fracci´ on de prote´ına insoluble por centrifugaci´ on con una centr´ıfuga Sorvall con rotor GS - 3 a 5.000 rpm durante 30 minutos. Despu´es de lavar el residuo insoluble de arroz con 800 ml de agua bidestilada y centrifugando una segunda vez, las fracciones sobrenadantes combinadas pesaron 2.561 g y ten´ıan un contenido de 3,4% de prote´ına y un 9,0% de s´ olidos. Basados en el contenido de prote´ına de la HARP, el rendimiento en prote´ına del concentrado solubilizado de arroz fu´e aproximadamente del 75%. El concentrado de prote´ına soluble de arroz puede utilizarse como fuente de prote´ınas en productos para f´ormulas infantiles. La f´ ormula infantil puede prepararse a partir del concentrado l´ıquido o del concentrado de prote´ına de arroz desecado por aspersi´ on. Con relaci´on al arroz de cervecer´ıa, el concentrado de prote´ınas solubles de arroz conten´ıa bajos niveles de minerales traza indeseables. Estos minerales se concentraron en la fracci´on insoluble del residuo de arroz. Cuando se llev´ o a cabo el procedimiento con tratamientos t´ermicos que oscilaron entre 107◦C y 127◦ C durante 45 segundos, los rendimientos y la cantidad de prote´ınas solubilizadas eran comparables. Sin embargo, cuando no se utiliz´ o el tratamiento t´ermico a 96◦ C durante 45 segundos antes del paso de la digesti´on con proteasa, la solubilizaci´on de la prote´ına fu´e mucho menor. Los resultados de estos estudios se muestran en la Tabla 11. TABLA 11 Efecto del tratamiento t´ermico del producto de digesti´ on con amilasa sobre la solubilidad de las prote´ınas 3 hr. 5 hr. Tratamiento t´ermico Digesti´ on Digesti´ on 96◦ C durante 45 seg. 61,6% — 107◦ C durante 45 seg. 76,2% 80,2% 118◦ C durante 45 seg. 77,2% 81,1% 127◦ C durante 45 seg. 77,2% 78,0% Ninguno 58,4% 60,9%

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Ejemplo 2 Preparaci´ on de un concentrado de prote´ınas solubles de arroz utilizando harina de arroz rica en prote´ınas a un nivel de s´ olidos del 19% Un lote de 400 g de una torta de HARP preparada de acuerdo con el Ejemplo 1 se a˜ nadi´ oa 510 g de agua desionizada a 50◦ C seguidos por 2,3 g de Pancreatin 8X. Se a˜ nadi´ o luego m´as HARP (580 g) a la mezcla de digesti´on aumentando el nivel de s´ olidos al 19%. Se ajust´ o el pH de la mezcla y se mantuvo en 8 hasta que se a˜ nadieron 32 g de KOH al 20% y 3,6 g de NaOH del 50%. Despu´es de la digesti´on durante 3 horas (el pH cay´o hasta 7,5), se ajust´o el pH a 6,9 con H3 PO4 del 85% y la mezcla se calent´o a 85 - 90◦C durante 10 minutos para inactivar la proteasa. Se enfri´ o la mezcla a temperatura ambiente y se separ´ o por centrifugaci´ on con una centr´ıfuga Sorvall con rotor GS - 3 a 6.000 rpm durante 20 minutos. El residuo insoluble de arroz se lav´ o con 1.600 g de agua desionizada y el sobrenadante se mezcl´o con la primera fracci´on soluble. El rendimiento total en prote´ınas fu´e de 67,2%. Este ejemplo da cuenta de que puede variarse el nivel de s´ olidos de la HARP sometida al tratamiento con proteasa de acuerdo con el procedimiento de la invenci´on. Ejemplo 3 Preparaci´ on de un concentrado de prote´ınas solubles de arroz utilizando proteasas bacterianas, vegetales o fungales Proteasa bacteriana alcalina - Se a˜ nadi´ o agua desionizada a un lote de 490 g de la HARP (28,5% de s´olidos) preparada de acuerdo con el Ejemplo 1 para dar una mezcla total de 1.000 g que o el pH de la mezse calent´o a 50◦ C. Se ajust´ cla a 8,0 con 3,8 g de KOH del 20% y se a˜ nadi´ o luego la proteasa Alcalase (Novo, Wilton, CT), 1,8 g. Se mantuvo el pH en 8,0 durante las primeras 1,5 horas de la digesti´ on, que requiri´ o la adici´on de 16,2 g de KOH del 20% a la mezcla. Despu´es de un per´ıodo de digesti´ on de 3 horas, el pH final de la mezcla de reacci´on cay´o hasta 7,6. Luego se ajust´o el pH a 7,1 - 7,2 con ´acido c´ıtrico y la mezcla se calent´o a 85 - 90◦ C durante 10 minutos, se enfri´ o a temperatura ambiente y se centrifug´ o utilizando un rotor GS - 3 de centrifuga Sorvall a 6.000 rpm durante 20 minutos. La torta residual se lav´ o con 400 g de agua destilada y se volvi´o a centrifugar. Basado en el contenido en prote´ına de la HARP, el rendimiento de prote´ına despu´es de la primera centrifugaci´on fu´e del 41,5% y despu´es de la segunda centrifugaci´ on el rendimiento total de prote´ına fu´e del 47%. Proteasa bacteriana neutra - La solubilizaci´ on de prote´ınas de la HARP se llev´ o a cabo como arriba con 1,8 g de Neutrase (Novo, Wilton, CT) a˜ nadida a la mezcla y se mantuvo el pH en 7,0 durante el per´ıodo de digesti´ on de 3 horas. El rendimiento total de prote´ına fu´e del 33,5%. Proteasa vegetal - La solubilizaci´ on de prote´ınas de la HARP se llev´o a cabo como antes con 0,3 g de papaina (Miles, Elkhart, IN) a˜ nadida a la mezcla con el pH mantenido en 7,0 a 60◦C durante el per´ıodo de digesti´ on de tres horas. El rendimiento en prote´ına fu´e del 17%. Proteasa fungal neutra - La solubilizaci´ on de prote´ınas de la HARP se llev´o a cabo con 1,2 g

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de Prozime 6 (Amano International Enzyme Co., Inc., Troy, VA) a˜ nadida a la mezcla. El rendimiento de prote´ına fu´e del 61%. Este ejemplo da cuenta de que pueden utilizarse varios tipos de proteasas en el procedimiento de esta invenci´on. Ejemplo 4 Preparaci´ on de un concentrado de prote´ınas solubles de arroz utilizando una mezcla de proteasas Se a˜ nadi´ o agua desionizada a un lote de 490 g de la HARP (27,2% de s´olidos que conten´ıan 42,4% de prote´ınas) preparada de acuerdo con el Ejemplo 1 para proporcionar una mezcla de 1.000 g que se ajust´ o a pH 7,0 con 4,1 g de KOH al nadieron 1,2 20% y se calent´o a 45◦C. Luego se a˜ g de Prozyme 6 y 0,3 g de Protease N (Amano International Enzyme Co., Inc., Iroy, VA) al material a digerir. El pH se mantuvo en 7,0 durante el per´ıodo de digesti´ on de 3 horas con 13,5 g de KOH al 20% hasta que se consumi´ o la base. El digerido se calent´o a 85 - 90◦ durante 10 minutos, se enfri´ o, se centrifug´ o, y se lav´ o la porci´on insoluble como en el Ejemplo 3. El rendimiento en prote´ına despu´es del primer peso de centrifugaci´ on fu´e del 68,0% y el rendimiento combinado despu´es del lavado fu´e de 73,6%. Este ejemplo da cuenta de que una combinaci´ on de dos enzimas es efectiva en la solubilizaci´on de la prote´ına de arroz. Ejemplo 5 Preparaci´ on de un concentrado de prote´ınas solubles de arroz a escala de planta piloto 22,7 kilos (50 libras) de harina de arroz y 40 g de la enzima amilasa Takalite L - 340 se dispersaron en 90,7 kilos (200 libras) de agua en un tanque con camisa exterior de 189,25 litros (50 galones). La papilla se calent´o a 91◦ C, que se mantuvieron durante 20 minutos, y luego se aplic´o un termotratamiento a 118◦C durante 45 segundos. La o con una mezcla se enfri´ o a 66◦C y se centrifug´ Sharpeles 660 a una velocidad de la cuba de 6.200 rpm y accionamiento inverso a 4.200 rpm (velocidad de flujo del producto de 0,5 gpm). Se recogi´ o la HARP y se enfri´ o con agua fr´ıa. Este procedimiento se repiti´o 5 veces. Los equivalentes de glucosa del jarabe de arroz sobrenadante oscil´ o entre 18 - 21. Se mezcl´o la HARP de los seis lotes y se ajust´o hasta el 14% de s´olidos totales con agua y la mezo a pH 8 con KOH cla se calent´o a 50◦C y se ajust´ del 30% antes de la adici´on de 192 g de la enzima proteasa pancreatin 8X. Durante un per´ıodo de digesti´on de 3 horas, se a˜ nadi´ o un total de 2.400 g de soluci´on de KOH al 30% para ajustar y mantener un pH 8,0. Al final de las tres horas de digesti´ on, se ajust´ o el pH a 6,5 con ´acido fosf´ orico y la mezcla se calent´o a 85◦C durante 10 minutos para inactivar la enzima y luego se enfri´o a 24◦C. La mezcla se centrifug´o con una Westphalia SA - 1 a una velocidad de flujo de 1/4 gpm con un intervalo de descarga de 3 minutos. El concentrado final de prote´ınas solubles de arroz se almacen´o a 4◦ C para su utilizaci´on como una fuente de prote´ınas en f´ormulas l´ıquidas infantiles. Alternativamente, el concentrado soluble de arroz se concentr´o m´as hasta un 35 - 40% de s´olidos totales en un evaporador y luego se desec´ o 11

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por aspersi´on para su uso en f´ ormulas infantiles. La Tabla 12 de m´ as abajo muestra los rendimientos de prote´ınas y s´ olidos de la HARP y de las fracciones de los productos de digesti´on (CPSA y RIA).

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TABLA 12 Rendimientos en prote´ınas y s´ olidos de HARP, CPSA y RIA Fracci´on HARP CPSA RIA

Rendimiento s´ olidos % 20 15 6

Rendimiento prote´ınas % 94 55 32

La Tabla 13 de m´as abajo demuestra que el procedimiento de la invenci´on presente suministra una reducci´ on marcada del manganeso encontrado en la HARP insoluble de la t´ecnica anterior. De este modo, el contenido de manganeso del CPSA fu´e solo de aproximadamente un 6% del correspondiente al HARP. Es tambi´en evidente que el manganeso encontrado en la HARP se concentra en los residuos insolubles del arroz. A´ un cuando los niveles de aluminio en el producto CPSA no eran detectables, el contenido total de aluminio en el RIA fu´e aproximadamente igual al contenido total de aluminio en la HARP lo que indica que esencialmente todo el aluminio se elimina del CPSA por el procedimiento presente. TABLA 13

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Contenido de minerales traza y a ´cido f´ıtico en HARP, CPSA y RIA Manganeso Aluminio Selenio Acido f´ıtico mcg/g mcg/g mcg/g mcg/g prote´ına prote´ına prote´ına prote´ına HARP 131 18,8 1,8 21,5 CPSA 8,3 no detec1,4 1,1 table RIA 360 60 2,8 35,8

Ejemplo 6 Reducci´ on de minerales y a ´cido f´ıtico Este ejemplo demuestra que en la preparaci´on del concentrado de prote´ınas solubles de arroz (CPSA) obtenido a partir de arroz de cervecer´ıa, se reduce marcadamente de minerales traza y acido f´ıtico y se concentra correspondientemente ´ en el residuo insoluble de arroz (RIA). El almid´ on del arroz se hidroliz´ o con amilasa en el primer paso del procedimiento como se describi´ o en el Ejemplo 1. Despu´es de la hidrolisis del almid´ on con amilasa, el producto de digesti´ on se trat´ o t´ermicamente por inyecci´on directa de o vapor a 118◦ C durante 45 segundos, se enfri´ r´ apidamente y se centrifug´ o en una Centr´ıfuga Internacional de laboratorio. La torta resultante de HARP ten´ıa un 28,6% de s´ olidos que conten´ıan un 47,1% de prote´ınas. Se a˜ nadi´ o agua desionizada a 490 g de la torta de HARP para preparar una papilla que pesaba 1.000 g. La papilla se calent´o a 45 - 50◦ C y se ajust´o a pH 8,0 con 4,5 g de KOH 12

del 20%. Se a˜ nadi´ o pancreatin 8X a un nivel de 1,15 g y se ajust´o y mantuvo el pH del producto en digesti´on a aproximadamente 8,0 con un total de 11,5 g de KOH del 20% que se consumi´o despu´es de 90 minutos de digesti´ on. Despu´es de tres horas de digesti´ on, el pH final cay´ o hasta 7,1 y el producto de la digesti´ on se trat´ o t´ermicamente luego a 85 - 90◦ C durante 10 minutos y se enfri´o a 25 - 35◦C. Se obtuvo la fracci´on de concentrado de prote´ınas solubles de arroz por centrifugaci´ on en una centr´ıfuga Sorvall con un rotor GS - 3 a 6.000 rpm durante 20 minutos. La fracci´ on del residuo insoluble de arroz se lav´ o con 400 ml de agua desionizada y se volvi´o a centrifugar. Los sobrenadantes combinados pesaron 1.173 g y ten´ıan un contenido en s´ olidos del 9,0% y un contenido en prote´ınas del 3,6%. El rendimiento total de prote´ınas solubles de arroz totales de los sobrenadantes combinados fu´e del 68,7%. El procedimiento usado para preparar un concentrado de prote´ınas solubles de arroz con niveles bajos de minerales traza y ´acido f´ıtico tambi´en produce una fracci´ on de hidratos de carbono (jarabe de arroz) y una fracci´ on insoluble (residuo insoluble de arroz). La mayor´ıa de los minerales traza indeseables y a´cido f´ıtico encontrados en la harina de arroz original permanece en el RIA. La Tabla 14 de m´ as abajo muestra la distribuci´ on de minerales traza entre las fracciones de arroz producidas en este ejemplo. La reducci´ on dram´ atica de minerales traza indeseables se advierte en la fracci´on de CPSA. Ejemplo 14 Contenido en minerales traza y a ´cido f´ıtico de CPSA, RIA, y jarabe de arroz preparados de arroz de cervecer´ıa

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Manganeso mcg/g de prote´ına Aluminio mcg/g de prote´ına Selenio mcg/g de prote´ına Acido f´ıtico mg/g de prote´ına

Arroz de Jarabe cervecer´ıa CPSA RIAa de arroz 210 12,4 600 1 53

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no 126 detectable 2,3 4,8 0,8

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a. Contenido t´ıpico de prote´ına, 65% p/p b. En base a s´ olidos. 55

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Ejemplo 7 F´ ormula infantil (LPU) preparada a partir de CPSA Este ejemplo proporciona los pasos del procedimiento necesarios para preparar un lote de 10.000 g de la f´ ormula infantil LPU utilizando un concentrado de prote´ınas solubles de arroz como fuente de prote´ınas. El primer paso consiste en dispersar 408 g de s´ olidos del concentrado de prote´ınas solubles de arroz (40,2% de prote´ınas, 55,4% de CHO) y 431,6 g de s´olidos del jarabe de arroz (98,3% de CHO) en 5.900 g de agua corriente a temperatura

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ambiente. Luego se a˜ nadieron 4,27 g de 1 - lisina y 1,48 g de 1 - treonina en 60 g de agua corriente junto con 4,5 g de hidr´oxido de calcio en 50 g de agua corriente. Se a˜ nadieron las sales, el fosfato de pot´ asico monob´asico (2,86 g) y el fosfato de sodio monob´ asico (2,97 g) conjuntamente en 60 g de agua corriente. Luego se disolvieron 7,4 g de ´acido c´ıtrico y 3,1 g de citrato de sodio en 100 g de agua corriente y se a˜ nadieron a la mezcla junto con 6,7 g de cloruro de calcio y 2 g de cloruro de magnesio disueltos en 90 g de agua corriente. Se disolvieron simult´ aneamente de 0,64 g de sulfato ferroso y 0,17 g de una premezcla de minerales traza en 10 ml de agua y se a˜ nadieron a la mezcla. En la segunda parte de este procedimiento la mezcla de prote´ınas, hidratos de carbono y minerales se calienta a 50 - 55◦C. La mezcla de grasas, compuesta por 354 g de un 55% de aceite de coco, 45% de una mezcla de aceites de soja, 11 g

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de emulsionantes y 0,32 g de un concentrado de una mezcla previa de las vitaminas, A, D, E y K nade en caliente a la se calienta a 60 - 70◦ C y se a˜ mezcla acuosa de prote´ınas, hidratos de carbono y minerales. La mezcla se calienta r´apidamente a 130◦ C, se mantiene durante 45 segundos y se enfr´ıa inmediatamente a 65 - 70◦ C. Esta mezcla tratada t´ermicamente se homogeniza luego [presi´on manom´etrica de 175/35 kg/cm2 (2500/500 psig), etapas primera y segunda, respectivamente]. Se homogeniza una segunda vez a las mismas presiones y se enfr´ıa inmediatamente a 2 - 5◦ C. La mezcla se ajusta a pH 7,4 con una soluci´ on al 10% de KOH y se disuelven 2,1 g de la mezcla previa de vitaminas en 50 ml de agua corriente y se a˜ nade a la mezcla homogeneizada. Se analizan los s´olidos de la mezcla y se ajustan hasta 12,4% a˜ nadiendo la cantidad apropiada de agua corriente. El producto acabado se envasa y esteriliza.

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REIVINDICACIONES 1. Concentrado de prote´ınas solubles de arroz con digestibilidad mejorada, en base a las prote´ınas, con un contenido sustancialmente reducido de manganeso, aluminio, selenio y a´cido f´ıtico, con relaci´on al contenido de arroz. 2. El concentrado de prote´ınas solubles de arroz de la reivindicaci´ on 1 que tiene un contenido de prote´ınas de m´as de un 16% en base a los s´olidos. 3. El concentrado de prote´ınas solubles del arroz de las reivindicaciones 1 o´ 2 que tiene un contenido de prote´ınas de 16 a 90% en base a los s´olidos. 4. El concentrado de prote´ınas solubles del arroz de las reivindicaciones 1, 2 ´o 3 que tiene un contenido de manganeso de menos de 50 microgramos por gramo de prote´ına. 5. El concentrado de prote´ınas solubles del arroz de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que tiene un contenido de aluminio de menos de 15 microgramos por gramo de prote´ına. 6. El concentrado de prote´ınas solubles de arroz de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que tiene un contenido de selenio reducido a un m´ınimo de 25% en base a las prote´ınas con relaci´ on a la materia prima de arroz. 7. El concentrado de prote´ınas solubles de arroz de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que tiene un contenido de ´acido f´ıtico de menos de 15 miligramos por gramo de prote´ına. 8. El concentrado de prote´ınas solubles de arroz de la reivindicaci´ on 7 que tiene un contenido de a´cido f´ıtico de menos de 5 miligramos por gramo de prote´ına. 9. El concentrado de prote´ınas solubles del arroz de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que tiene una digestibilidad superior al 90%. 10. Un procedimiento para la preparaci´ on de un concentrado de prote´ınas solubles de arroz a partir de la materia prima de arroz que contiene manganeso, aluminio, selenio y ´acido f´ıtico que comprende los pasos: (a) digesti´ on de la materia prima reducida a un tama˜ no de part´ıcula que permita una acci´on enzim´atica eficiente en un medio acuoso con una enzima alfa - amilasa a un pH y temperatura funcionales durante un per´ıodo de tiempo suficiente para solubilizar una porci´ on sustancial del almid´on de arroz y formar una papilla l´ıquida; (b) calentamiento de la papilla a 105◦C hasta

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(c) separaci´ on de harina de arroz rica en prote´ınas del hidrato de carbono solubilizado de arroz; (d) tratamiento de una papilla de la harina de arroz rica en prote´ınas con una enzima proteasa a pH y temperatura funcionales en una proporci´ on y durante un per´ıodo de tiempo suficientes para solubilizar las prote´ınas de arroz; (e) separaci´ on de la prote´ına de arroz solubilizada del residuo insoluble de arroz para proporcionar un concentrado de prote´ınas solubles de arroz con digestibilidad mejorada y un contenido reducido de manganeso, aluminio, selenio y ´acido f´ıtico. 11. El procedimiento de la reivindicaci´ on 10 en donde el concentrado de prote´ınas solubles de arroz separado es el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9. 12. El procedimiento de las reivindicaciones 10 o 11 en donde la materia prima de arroz se hidroliza hasta un contenido EG de 5 a 50. 13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 en donde la papilla de almid´ on de arroz se calienta por inyecci´on directa de vapor. 14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 en donde la papilla de almid´ on de arroz se calienta por inyecci´on directa de vapor a 105 - 130◦ C durante 30 - 60 segundos. 15. El procedimiento de la reivindicaci´ on 14 en donde la papilla de almid´ on de arroz se calienta por inyecci´on directa de vapor de 110◦C a 120◦C durante 40 - 50 segundos. 16. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15 en donde la separaci´ on de las prote´ınas de arroz solubilizadas del residuo insoluble de arroz se realiza a un pH de 6 a 8. 17. Una f´ ormula infantil l´ıquida lista para el uso, nutricionalmente completa basada en el arroz en donde la prote´ına se provee mediante un concentrado de prote´ınas solubles de arroz que tiene un contenido de prote´ınas de m´ as de un 16% en base a los s´olidos, un contenido de manganeso de menos de 50 microgramos por gramo de prote´ına, un contenido de aluminio de menos de 15 microgramos por gramo de prote´ına, un contenido de selenio de menos de 3 microgramos por gramo de prote´ına, un contenido de a´cido f´ıtico de menos de 15 miligramos por gramo de prote´ına y en donde la digestibilidad de la prote´ına es superior al 90%.

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