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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 207 252

51 Int. Cl. : A61K 31/4525

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A61P 17/00 A61K 7/48

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 99933032 .7

86 Fecha de presentación: 13.07.1999

87 Número de publicación de la solicitud: 1094813

87 Fecha de publicación de la solicitud: 02.05.2001

54 Título: Uso de piperina y sus derivados para tratar trastornos de pigmentación de la piel y cáncer de piel.

30 Prioridad: 13.07.1998 GB 9815177

73 Titular/es: BTG INTERNATIONAL LIMITED

10 Fleet Place, Limeburner Lane London EC4M 7SB, GB

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.05.2004

72 Inventor/es: Raman, Amala y

Lin, Zhixiu

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Polo Flores, Carlos

ES 2 207 252 T3

16.05.2004

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 207 252 T3 DESCRIPCIÓN Uso de piperina y sus derivados para tratar trastornos de pigmentación de la piel y cáncer de piel. 5

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La presente invención trata de medios para el tratamiento de trastornos de la piel y más particularmente de los trastornos que requieren la estimulación de la proliferación de los melanocitos. La invención es de aplicación especial en el tratamiento del vitíligo. El vitíligo es un frecuente trastorno de la pigmentación de la piel que se caracteriza por el desarrollo de lesiones parcheadas despigmentadas. Los tratamientos actuales, que incluyen el uso de fotosensibilizadores (por ejemplo, psoralenos) con radiación UVA (PUVA), corticoesteroides o injertos de piel, tienen tasas de éxito muy bajas y generalmente se acompañan de efectos secundarios desagradables. El vitíligo tiene un elevado impacto perjudicial sobre el bienestar emocional del enfermo, agravándose los efectos desfigurantes de la enfermedad por la ausencia de un tratamiento adecuado. Aunque no se cree que los parches producidos por el vitíligo contengan melanocitos (células productoras de pigmento), existe un reservorio en los folículos pilosos en la piel con vitíligo. Por tanto, la activación de los melanocitos de los folículos pilosos es un procedimiento crucial en la repigmentación de la piel con vitíligo. Durante mucho tiempo se han empleado ciertos remedios vegetales, por lo general administrados en forma de mezclas de hierbas o extractos, particularmente aquéllas usadas en la medicina tradicional china y en la medicina ayurvédica india, para tratar el vitíligo y en muchos casos en estudios realizados a pequeña escala han dado resultados positivos. Hierbas tales como Psoralea corylifolia L. y Vernonia anthelmintica Willd.(=Centratherum anthelminticum Kuntze) son bien conocidas para su uso en esta enfermedad. Los psoralenos, que se emplean en la PUVA moderna, y las quelinas, en el tratamiento KUVA, en un principio derivaban de fuentes vegetales (Psoralea corylifolia L y Ammi visnaga respectivamente) usadas en los remedios tradicionales para el vitíligo. Sin embargo, estos tratamientos dependen del uso de radiación UVA para su eficacia, que está asociada con la etiología del cáncer de piel. El fruto de la pimienta negra (Piper nigrum L.) y la pimienta larga (Piper longum L.) son hierbas medicinales importantes en los sistemas de medicina Ayurvédica y Unani (tradicional india), en los que los remedios generalmente consisten en mezclas de hierbas. Kirtikar y Basu (Indian Medicinal Plants, 2ª Edición, Vol.3, (1935), páginas 21282135) han informado acerca de un amplio abanico de usos medicinales de la pimienta negra, incluyendo su uso en el tratamiento de la leucodermia. También se ha implicado a la pimienta negra como un posible adyuvante de la Vermonia anthelmintica en el tratamiento de la leucodermia (Indian Medicinal journal, Vol.1, 3ª Edición, (1982), 1267-1270). Estas dos hierbas se usan como constituyentes de muchas de las preparaciones de hierbas tradicionales para una gran variedad de usos, incluyendo molestias gastrointestinales y cutáneas. En el tratamiento del vitíligo se han usado composiciones que comprenden pimienta negra, jengibre y pimienta larga (Ancient Science of Life, Vol.IX, Nº 4 (1990) 202-206; sin embargo, no se ha establecido la acción terapéutica específica de la pimienta negra en esta composición de administración oral. Por tanto, hay una necesidad de más compuestos y composiciones que sean capaces de estimular la proliferación de melanocitos. Preferiblemente, los compuestos y composiciones de la invención son capaces de estimular la proliferación de melanocitos sin producir significativos efectos secundarios adversos. La presente invención está dirigida hacia esa necesidad. Los presente inventores han investigado 30 extractos de hierbas que tradicionalmente se han usado en el tratamiento del vitíligo, usando un sistema de cultivo celular para evaluar si tienen la capacidad para estimular de forma directa la proliferación de melanocitos. Sorprendentemente se ha encontrado que componentes del fruto de Piper nigrum L. poseen actividad proliferante de melanocitos. En particular, se ha encontrado que el componente piperina puede estimular de forma significativa la producción de melanocitos. También se ha notificado que la piperina se produce en otras especies de Piper, es decir P. acutisleginum, album, argyrophylum, attenuatum, aurantiacum, betle, callosum, chaba, cubeba, guineense, hancei, khasiana, longum, macropodum, nepalense, novae hollandiae, peepuloides, retrofractum, sylvaticum. En el tratamiento de la tuberculosis y la lepra (documento EP 0650728) se han usado composiciones farmacéuticas que contienen piperina. También se ha sugerido que la piperina puede estimular la biodisponibilidad de los otros constituyentes de una composición farmacéutica (documento WO 96/25939). Un primer aspecto de la invención proporciona el uso en la preparación de un medicamento para estimular la proliferación de melanocitos de un compuesto de fórmula (I)

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ES 2 207 252 T3 en la que

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(a) n es 0, 1 ó 2, m es 2, los dos R1 juntos representan un grupo 3’-4’-metilendioxi, R2 y R3 junto con los átomos de carbono a los que están unidos forman un doble enlace carbono-carbono y, cuando n es 1 ó 2, R4 y R5 , junto con los átomos de carbono a los que están unidos, forman un doble enlace carbono-carbono y R6 es piperidino, o (b) n es 1 e (i) m es 3, los dos R1 juntos representan 3’-4’-metilendioxi y el otro 6’-metoxi; o (ii) m es 2, siendo el R1 3’-hidroxi-4’-metoxi; o (iii) m es 1 y el R1 es 4’-hidroxi; y R2 a R6 son como se ha definido en el caso (a) anteriormente;o

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(c) n es 1, R6 es pirrolidino, isobutilamino o metoxi y los otros símbolos son como se ha definido en el caso (a) anteriormente, o 15

(d) n es 1, R4 y R5 representan átomos de hidrógeno y o R2 y R3 también lo son o R2 y R3 junto con los átomos de carbono a los que están unidos, forman un doble enlace carbono-carbono; y m, R1 y R6 son como se ha definido en el caso (a) anteriormente;

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y en el caso (a), cuando n es 1, la molécula está en la configuración geométrica E,E, Z,Z, Z,E o E,Z, pero en caso contrario la molécula está en la configuración geométrica E,E o todos E. El compuesto de fórmula (I) puede usarse en forma aislada, pero se usa de forma más adecuada en combinación con un vehículo o excipiente y, opcionalmente, con uno o más ingredientes activos. Cuando sea adecuado, el compuesto también puede usarse en forma de un extracto vegetal, por ejemplo que derive de Piper nigrum.

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Debe apreciarse que la estimulación de la proliferación de melanocitos facilita en gran medida la repigmentación de la piel despigmentada. La despigmentación de la piel puede producirse, por ejemplo, a partir de tejido cicatricial formado como resultado de un traumatismo cutáneo tales como quemaduras u otras lesiones cutáneas, o puede deberse a trastornos de la piel como el vitíligo. Las composiciones que comprenden piperina o un análogo activo o derivados de la misma pueden por tanto usarse para volver a pigmentar la piel tras un traumatismo o una despigmentación, así como por trastornos tal como vitíligo.

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El medicamento puede estar en forma de un polvo sólido; una pasta, pomada o crema; un comprimido o cápsula; o una solución. La piperina o un derivado o un análogo de la misma puede administrase por vía oral, tópica, intravenosa o subcutánea (intramuscular). Se prefiere que el medicamento se aplique tópicamente en la zona de la piel despigmentada. También se incluyen en el alcance de la invención composiciones farmacéuticas usadas como medicamentos. Tales composiciones farmacéuticas comprenden un compuesto de fórmula (Ia) y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los compuestos de fórmula (Ia) son los mismos que aquéllos de fórmula (I) pero excluyen piperina y sus estereoisómeros Z, Z, Z, E y E, Z. En una primera forma de realización de la invención se proporciona el uso de un compuesto de fórmula (I) en la preparación de un medicamento para volver a pigmentar la piel despigmentada a causa de un traumatismo. Por el término “piel despigmentada tras un traumatismo” se debe entender la piel formada durante el proceso de cicatrización que se produce después de un traumatismo de la piel, tal como una quemadura o una lesión. En una segunda forma preferida de realización de la invención se proporciona el uso de un compuesto de fórmula (I) en la preparación de un medicamento para el tratamiento del vitíligo. Aunque las composiciones pueden administrarse por vía oral, se prefiere la administración tópica. La estimulación de la proliferación de melanocitos puede también usarse para aumentar o inducir la coloración natural de la piel y composiciones que comprendan un compuesto de fórmula I pueden usarse como agentes de pigmentación. La potenciación del color natural de la piel puede usarse con propósitos profilácticos o estéticos. Además otro aspecto de la invención proporciona un procedimiento para aumentar o inducir estéticamente la coloración de la piel mediante la administración a una persona que desee tal efecto una cantidad estéticamente eficaz de un compuesto de fórmula (I). La administración puede ser por vía oral o tópica.

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Debe apreciarse que aquí, los compuestos de fórmula (Ia) no se han usado con propósitos terapéuticos y otro aspecto de la invención proporciona un compuesto de fórmula (Ia) para usar en la estimulación de la proliferación de melanocitos. Asimismo, la invención proporciona un compuesto de fórmula (Ia) para usar en tratamiento. Entre los usos terapéuticos se incluyen la repigmentación de la piel despigmentada así como la inducción o aumento de la coloración de la piel. También se ha descubierto que la piperina inhibe la proliferación de células de melanoma. El compuesto de fórmula (I) puede también usarse en el tratamiento del cáncer de piel. Otro aspecto de la invención proporciona el uso de un compuesto de fórmula (I) en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir el cáncer de piel en un paciente humano o no humano. El tratamiento puede ejercer su efecto a través de la administración a dicho paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula (I).

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ES 2 207 252 T3 Otro aspecto de la invención proporciona el uso de un compuesto de fórmula (I) en la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de piel. 5

El compuesto de fórmula (I) puede administrarse por vía oral o tópica. Las formas de dosificación adecuadas pueden ser cualquiera de las comentadas anteriormente en la presente invención. La estructura de los compuestos que entran dentro de la definición del compuesto de fórmula (I) se proporciona a continuación

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Los compuestos 15 y 16 no entran dentro del alcance de la fórmula (I). 60

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Los compuestos naturales (incluyendo la piperina) pueden extraerse de fuentes vegetales adecuadas o sintetizarse usando procedimientos conocidos para un experto (véase, por ejemplo, Chapman y Hall, Combined Chemical Dictionary en CD-rom, 1:1 (1997) y el Índice Merck (1983), 10ª edición, Publ. Merck y Co., Rahway, EE.UU., págs. 14771078 (a excepción de los compuestos 2 y 3). Todos los compuestos excepto el 6, el 11, el 13, el 15 y el 16 se producen en P. nigrum o en otras especies de Piper (10 y 12).

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ES 2 207 252 T3 Los compuestos 2 y 3 se preparan mediante aislamiento de P. nigrum usando procedimientos conocidos para un experto (véase por ejemplo Cleyn R De y Verzele M (1975). Constituents of Peppers, parte VII. Spectroscopic Structure Elucidation of Piperina and its isomers. Bulletin de la Societe Chimique Belgique.84 435-438) 5

El compuesto 6 se prepara mediante hidrogenación de la piperina sobre el catalizador Adams usando procedimientos conocidos (véase por ejemplo Banerji A, Bandyopadhyay D, Sarkar M y col., (1985). Structural and Synthetic studies on the refractamides-amide constituents of Piper retrofactum, Phytochemistry, 24, 279-284). El compuesto 11 se prepara mediante metanólisis de piperina usando metóxido sódico.

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Los compuestos 13 y 15 se preparan a partir de 3-hidroxi-4-metoxibenzaldehído y benzaldehído respectivamente como materiales de partida, usando procedimientos análogos a los usados para la preparación de piperina. El compuesto 16 se prepara a partir de la reacción entre piperidina y cloruro de E,E-hexadienoilo. 15

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Los compuestos activos pueden formularse para su uso tópico en forma de cremas, parafina blanda o lociones. La crema BP acuosa o la parafina blanda amarilla BP pueden contener adecuadamente el material activo a 0,03-3,0 mg % en p/p o una cantidad equivalente de extracto vegetal. Una loción adecuada se prepara típicamente a partir de glicerol al 20% y etanol 1l 80% en agua purificada y contiene 0,03-3,0 mg % en p/p del material activo. Estas formulaciones tópicas pueden también contener estimuladores de la penetración, tales como ácido oleico, propilenglicol, etanol, urea, dietanolamida láurica o azona, dimetil sulfóxido decimetil sulfóxido o derivados de pirrolidona. También se pueden usar sistemas de liberación mediante liposomas. Entre las composiciones para la formulación oral se incluyen comprimidos o cápsulas que contienen 1,5-150 mg de material activo o una cantidad equivalente de extracto vegetal. Figuras y ejemplos

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Ahora se describirá la invención en referencia a los siguientes ejemplos no limitantes, en referencia a las tablas y figuras que los acompañan en las cuales: Figura 1: Curvas de crecimiento de melan-a en medios de diferente composición. Cada punto representa la media y la desviación estándar de 6 pocillos.

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Figura 2: Curvas de crecimiento de melan-a de diferentes densidades iniciales de cultivo en placas detectado con ensayo SRB. El medio se complementó con TPA 20 nM. El medio de las placas restantes de reemplazó al cuarto día. Cada punto muestra la media y la DE de 6 muestras repetidas. Figura 3: Efecto de extracto de P. nigrum sobre el crecimiento de células de melan-a. El cultivo se mantuvo durante 8 días. El medio y el extracto se reemplazaron con medio y extracto frescos al cuarto día. Cada punto designa la media y la DE de 6 pocillos, a excepción de 12 muestras repetidas sólo para células. Figura 4: Efecto de extracto de P. nigrum y TPA sobre la proliferación de la línea celular de melan-a. Cada punto muestra la media y la DE de 6 muestras repetidas a excepción de 12 pocillos usados solo para células.

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Figura 5: Efectos de piperina y TPA sobre el crecimiento de células melan-a en presencia de RO-31-8220, n = 6, para los pocillos tratados con piperina y TPA, mientras que n = 12 para RO-31-8220 solo. 50

Figura 6: Efectos de piperina y TPA sobre el crecimiento de melanoblastos humanos en presencia de ET3, *P< 0,05 cuando se compara con el control con vehículo (ANOVA de un factor seguido por el test de Dunnett). Figura 7: Efectos de piperina sobre el crecimiento de melanocitos humanos en presencia de ET1, *P< 0,05 cuando se compara con el tratamiento con ET1 1 nM (ANOVA de un factor seguido por el test de Dunnett).

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Para aquellos expertos en la técnica serán evidentes las variaciones de estos ejemplos. Ejemplos Muestras vegetales y preparación de los extractos

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El fruto de Piper nigrum L. (pimienta negra, Piperaceae), originariamente de India, se obtuvo de Food Centre, 70 Turnpike Lane, Londres N8, GB. El resto de las hierbas fueron suministradas por East-West Herbs, Kingham, Oxon, GB o por Cipla Ltd., Mumbai, India. 65

Para el programa de selección preliminar, se calentó la hierba seca en polvo (10 g) hasta ebullición en agua destilada (100 ml) y se dejó hervir durante 10 minutos usando una placa caliente como fuente de calor. Se filtró el material vegetal al vacío mediante papel de filtro (Whatman) y el filtrado se secó en frío. 5

ES 2 207 252 T3 Experimentos de cultivo celular Cultivo en microplacas y ensayo con sulforodamina B (SRB) 5

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Células de ratón de línea celular melan-a (pasos números 18-24), una de las primeras líneas conocidas de melanocitos de ratón pigmentados no tumorogénicos, se mantuvieron en un matraz usando RPMI 1640 (ICN, Costa, Mesa, CA, EE.UU.) como medio básico. Para los ensayos de proliferación en microplacas se añadió tripsina (0,25% de tripsina a 37ºC durante 5-10 minutos) a los cultivos subconfluentes de melan-a y se inocularon con una pipeta repetidora (Finn pipette, Labsystems, Finlandia) en placas de microtitulación de 96 pocillos (Costar, Cambridge, MA, EE.UU.). Las placas se incubaron a 37ºC en una atmósfera con 10% de CO2 y 90% de humedad en aire durante el periodo de tiempo programado. Al final de la incubación, se realizó un ensayo con SRB. Brevemente, las células ligadas al fondo de la placa se fijaron mediante adición de ácido tricloroacético frío (TCA, 4ºC, Aldrich, Dorset, GB) en la superficie del medio de crecimiento (TCA final 20% p/v). La placa se colocó a 4ºC durante 1 hora antes de lavarla suavemente cinco veces con agua corriente. Se la dejó secar al aire o se usó un secador de pelo para acelerar el proceso de secado. después a cada pocillo se añadieron 50 µl de SRB al 4% p/v disuelta en ácido acético y agua durante 30 minutos. Al final del periodo de tinción, se eliminó la SRB sin unir lavando cuatro veces con ácido acético al 1%. La placa se dejó secar al aire otra vez y a cada pocillo se añadieron 150 µl de base Tris acuosa 10 mM (Sigma-Aldrich Co. Ltd, Irvine, GB) para solubilizar la unión colorante-célula. Se procedió a agitar la placa durante 15 minutos en un agitador giratorio y después se procedió a la lectura de la densidad óptica (DO) a 550 nm en un espectrofotómetro de microplacas (Anthos Labtec HT3, versión 1.06). Ejemplo 1 Optimización de las condiciones de incubación-concentración de SBF y densidad de la siembra de células

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Antes de probar los extractos de hierbas, se establecieron las condiciones óptimas de cultivo. Los factores variables en relación con las condiciones de incubación incluyen la concentración de suero bovino fetal (SBF), la densidad inicial de la siembra de células y el periodo de incubación. Para determinar la concentración óptima de SBF, se usó SBF al 1%, 2% y 5% para cultivar la línea celular melan-a, el patrón de crecimiento de cada concentración de SBF se monitorizó mediante ensayo con SRB. Para determinar la densidad óptima de la siembra de células, se sembraron en placas de 96 pocillos con medio de cultivo complementado con SBF al 5% y acetato de tetradecanoilforbol (TPA) 20 nM una serie de densidad de siembra de 0,15 a 1,2 x 104 células por pocillo de células melan-a. El patrón de crecimiento se monitorizó mediante ensayo con SRB a intervalos diarios. El cultivo se extendió durante 8 días; al cuarto día, se reemplazó el medio de las placas restantes.

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Resultados Efecto de las concentraciones de SBF sobre el crecimiento de melan-a 40

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La concentración óptima para un control del experimento negativo es que las células no crezcan demasiado rápido ni disminuyan forma espectacular. Un crecimiento rápido podría enmascarar cualquier efecto estimulador sutil producido por los extractos de hierbas, mientras que una disminución espectacular en el número de células indica condiciones de cultivo desfavorables para la supervivencia de las células, lo que podría conducir a daño celular. La figura 1 muestra las curvas de crecimiento de la línea celular melan-a a tres concentraciones de SBF diferente. Ni el medio complementado con SBF al 1% ni con SBF al 2% fue capaz de mantener la supervivencia de las células; el número de células disminuyó significativamente en 4 días de cultivo. Sin embargo, el SBF al 5% fue capaz de mantener viva la línea celular melan-a con solo un pequeño incremento en el número de células, observado durante 4 días. El TPA (20 nM) fue capaz de producir más proliferación en presencia de SBF al 5%, lo que es indicativo de que las células podían responder a estímulos mitogénicos en presencia de SBF al 5%. Las observaciones morfológicas con microscopio revelaron que con el medio complementado con SBF al 1% y al 2%, los cuerpos celulares eran redondos, ligeramente pigmentados con pocos procesos dendríticos y el cultivo exhibió un patrón de crecimiento envejecido. Sin embargo, en presencia de SBF al 5%, las células poseían más melanosomas y algunas dendritas cortas sin aspecto envejecido. Por tanto, el SBF al 5% fue la concentración usada en todos los experimentos de selección de hierbas. Cultivos de crecimiento de línea celular melan-a con varias densidades de siembra En la figura 2 se representaron curvas de crecimiento durante 8 días con un número inicial de células diferente, para deducir el patrón de crecimiento de la línea celular melan-a en placas de 96 pocillos en presencia de SBF al 5% y TPA 20 nM. Se determinaron la densidad de células en la placa óptima inicial y el tiempo de recogida adecuado. Todos los números iniciales de células sembradas en la placa mostraron un crecimiento neto en presencia de medio complementado con TPA y de SBF al 5%, aunque la densidad de las placas más elevada de 1,2 x 104 células/pocillo agotó el medio de cultivo al tercer día del cultivo y las células pararon de crecer hasta que se reemplazó el medio. Con las menores densidades de las placas (2-4 x 103 células/pocillo), las lecturas de DO en el ensayo con SRB permanecieron relativamente bajas tras 8 días de cultivo. La densidad inicial de las placas de 6 x 103 células/pocillo exhibió un crecimiento exponencial y, tras 4 días de cultivo, la lectura de densidad óptica aumentó hasta un valor de alrededor de 0,4. Dado que los valores de DO más elevados están asociados con una mayor precisión y exactitud, se determinó que la inoculación inicial de 6 x 103 células/pocillo fuera la densidad óptima para los experimentos de prueba de hierbas. Para simplificar el experimento, el momento de recogida fue al cuarto día, ya que las células en este 6

ES 2 207 252 T3 estadio no eran confluentes y después de 4 días, el medio de cultivo tendía a agotarse y era necesario reemplazarlo para obtener más crecimiento. Ejemplo 2 5

Experimentos preliminares de selección de hierbas

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Las células melan-a se sembraron a una densidad de 6 x 103 /100µl/pocillo en medio estándar complementado con TPA 0 nM y SBF al 5%. Tras 4 horas de incubación, a cada pocillo se añadieron diferentes concentraciones de extractos de hierbas, reconstituidos en medio de crecimiento y esterilizados mediante filtración (tamaño de poro 0,2 µm). Las concentraciones finales del extracto vegetal fueron 0 (control negativo), 10, 100 y 1.000 µg de extracto seco por ml. Para concentración probada se usaron 6 pocillos replicados. El control negativo (12 pocillos), el control positivo (6 pocillos con TPA 20 nM) y los pocillos a probar se encontraban todos en la misma placa de 96 pocillos. El cultivo finalizó tras 4 días y el ensayo con SRB se llevó a cabo de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente.

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Resultados Efecto de 30 extractos de hierbas sobre la proliferación de la línea celular melan-a 20

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La tabla 1 muestra los resultados de una selección preliminar de 30 extractos de hierbas acuosos sobre la proliferación de la línea célula melan-a. Se observó que los extractos brutos de Astragalus membranaceous (Fisch.) Bunge, de Citrus reticulata Blanco verde, Dictamnus dasycarpus Turcz., Ophiopogon japonicus (Thunb.) Kergawe, Piper nigrum L., Poria cocos (Schw) Wolf y Tribulus terestris L. estimulaban la proliferación de melanocitos, en ocasiones incluso a los niveles de dosis más bajos de 10 µg/ml. Otros extractos o bien no tuvieron efectos significativos o bien eran citotóxicos. Entre estas respuestas positivas, la más pronunciada era la del extracto de Piper nigrum L. a 0,01 y 0,1 mg/ml. El extracto de Piper nigrum a estas dos concentraciones no solo estimulo de forma sorprendente en crecimiento celular, sino que también alteró la morfología de las células. En presencia de extracto de Piper nigrum, los cuerpos celulares eran más pequeños, con procesos bipolares o polidendríticos más numerosos y más largos y efectos similares a los observados con TPA.

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Ejemplo 3 Repetición de las pruebas con extracto de Piper nigrum sobre las células melan-a 35

Se probó un extracto de fruto de Piper nigrum de nueva preparación sobre un lote nuevo de línea celular melan-a, extendiendo el cultivo en microplacas hasta 8 días. Los efectos del extracto de Piper nigrum sobre el crecimiento de la línea celular melan-a se evaluaron mediante ensayo con SRB. Resultados

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Repeticiones de las pruebas con extracto de Piper nigrum sobre las células melan-a

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A la luz de los resultados positivos obtenidos en el experimento preliminar, se llevaron a cabo más investigaciones con el extracto de Piper nigrum. La figura 3 muestra que el resultado de la existencia de un efecto proliferante significativo producido por el extracto de Piper nigrum fue todavía más marcado al extender el periodo de incubación hasta 8 días de cultivo, el crecimiento fue el 272% del control (solo células). Microscópicamente, la morfología de las células se alteró como se observó en los experimentos preliminares. Ejemplo 4

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Confirmación del efecto proliferante de Piper nigrum mediante conteo con hemocitómetro

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Las células melan-a se cultivaron en placas de petri (∅ de 35 mm, Nuncion, Dinamarca) con una densidad de cultivo en placas de 2 x 104 /ml con extracto de Piper nigrum a concentraciones de 0,01 y 0,1 mg/ml. También se prepararon un cultivo negativo (solo células en medio) y TPA positivo (20 nM). Tras 4 días, se recogieron las células de cada placa y se procedió a su recuento con un hemocitómetro. Resultados

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Confirmación del efecto proliferante de Piper nigrum mediante conteo con hemocitómetro El ensayo con SRB estima de forma indirecta el número de células través de tinción de las proteínas y medidas espectrofotométricas. Para confirmar si el extracto de Piper nigrum estimula la proliferación de células melan-a se empleó un recuento celular directo don un hemocitómetro. La tabla 3 muestra el número de células en presencia de extracto de Piper nigrum y TPA 20 nM. El número de células bajo la influencia del extracto de Piper nigrum a 0,01 y 0,1 mg/ml aumento significativamente en comparación con el control, pero menos de lo que lo hizo con TPA 20 nM. Este resultado es consistente con el hallazgo en las microplacas de 96 pocillo en el ensayo con SRB. 7

ES 2 207 252 T3 Ejemplo 5 Efecto de la piperina sobre el crecimiento de la línea celular melan-a 5

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Se disolvió Piperina (Sigma-Aldrich Co. Ltd, Irvine, GB) en MeOH, esterilizada mediante filtración a través de una membrana (tamaño de poro de 0,2 µm) y diluida con medio de crecimiento estándar. Las concentraciones finales en el cultivo fueron de 0,1 y 1 µM. En otro experimento (datos no mostrados) se mostró que la concentración de MeOH presente en estos experimentos fue atóxica o proliferante para estas células. Resultados Efecto de la piperina sobre el crecimiento de la línea celular melan-a

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El efecto de este compuesto sobre la línea celular melan-a se muestra en la figura 4. La piperina, a las dos concentraciones probadas, estimuló de forma significativa la proliferación de melan-a. Este compuesto produjo cambios morfológicos en las células melan-a, con cuerpos celulares más pequeños, más y más largas dendritas celulares, similares a las alteraciones inducidas por el extracto de Piper nigrum y el TPA. Esto indica que la piperina es un principio activo responsable del efecto proliferante observado de Piper nigrum. Ejemplo 6 Pruebas de piperina en diferentes tipos celulares para determinar su especificidad

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Para determinar la especificidad de la piperina se usó una serie de diferentes tipos celulares para facilitar esta investigación. Entre estas se incluyeron líneas celulares melan-a, melan-c, SVK14, CSM, XB2, SC1, B16F10, OM9, CACO2, 3T3 Suiza y linfocitos humanos normales. También se probó TPA (20 nM) en estas células. La tabla 3 muestra el origen biológico de las células y esboza los protocolos del cultivo celular. Resultados

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En la tabla 4 se puede observar que la piperina tiene un efecto altamente selectivo sobre el crecimiento de una serie de tipos celulares, ya que a la concentración probada sólo estimula las líneas celulares melanocitos de ratón (melan-a, melan-c), melanoblastos humanos (FM21E), melanocitos humanos fetales (FM21E) y fibroblastos de ratón SC1. La línea celular SC1 puede tener una particular sensibilidad al TPA debido al modo por el que ha derivado, es decir se ha cultivado en presencia de TPA. Sin embargo, sobre otras células la piperina o no tiene efecto o éste es citotóxico. Este resultado implica que la piperina puede tener un índice de especificidad deseable para la proliferación de melanocitos en cultivo y no es un mitógeno general. En nuestro sistema de experimentos, el TPA, un activador de la PKC bien conocido y un agente inductor de tumores, tenía efectos similares a la piperina en todos los tipos celulares probados, a excepción de que el TPA estimuló de forma llamativa la proliferación de linfocitos humanos y de fibroblastos 3T3, mientras que la piperina obviamente carecía de tal actividad. Parece ser que la piperina es un estimulante menos potente que la TPA. Ejemplo 7

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Modo de acción Efecto de RO-31-8220 sobre el crecimiento de células melan-a con piperina y TPA

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En una placa de 96 pocillos se colocaron células melan-a cultivadas con piperina 1 µM y TPA 20 nM de forma separada, en los pocillos se introdujo con una microjeringuilla 1 µl de diferentes concentraciones de RO-31-8220 (Calbiochem-Novabiochem) en DMSO, para alcanzar las concentraciones finales de RO-31-8220 de 0 (control), 0,1, 1, 5, 10, 100 nM, con unas concentraciones finales de DMSO inferiores a 0,01% v/v, a las que el DMSO no mostró ni efectos proliferantes ni tóxicos en las células en un experimento distinto (datos no mostrados). Para cada concentración se usaron 6 pocillos de replicación. El cultivo se incubó durante 4 días antes de interrumpirlo y procesarlo con un ensayo con SRB para evaluar el crecimiento de células melan-a. Resultados Modo de acción

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Efecto de RO-31-8220 sobre el crecimiento de células melan-a con piperina y TPA

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La figura 5 muestra el efecto de RO-31-8220 sobre la supervivencia y crecimiento de la línea celular melan-a en presencia o ausencia de piperina y TPA. El Ro-31-8220 solo no tuvo ningún efecto citotóxico significativo en las células alas concentraciones de hasta 100 nM. Sin embargo, los efectos proliferantes de la piperina y del TPA (como indican los valores representados en el eje Y) sobre las células melan-a fueron inhibidos de forma eficaz por la presencia de RO-31-8220 a las concentraciones de 0,1-100 nM. Por tanto, parece ser que la piperina y el TPA ejercen sus efectos proliferantes a través de la activación de la ruta de señalización celular de la PKC. 8

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También se ha probado la selectividad de la piperina sobre el crecimiento de una serie de tipos celulares. Se ha encontrado que la piperina poseía una especificidad y selectividad bastante elevada para los melanocitos, ya que estimuló de forma significativa el crecimiento de células melan-a, melan-c y melanoblastos FM21E y melanocitos FM21E en cultivo, mientras que no estimuló las otras células, aparte de una línea de células fibroblastos sensibles al TPA. Se observó que la piperina tenía efectos inhibitorios sobre la línea de células de melanoma, que es singeneica con las células melan-a. Por tanto, ña piperina puede ser un estimulante específico de la proliferación de melanocitos en piel con vitíligo sin el riesgo de estimular las células de melanoma. Ejemplo 9

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Experimentos sobre melanoblastos humanos en cultivo

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Los melanoblastos humanos en cultivo de este experimento se obtuvieron de piel humana fetal. Melanoblastos subconfluentes mantenidos en medio MCDB 153 complementado con 10% de SBF, 10 ng/ml de factor de las células madre (FCM) y endotelina 3 1 nM se subcultivaron e inocularon en microplacas de 96 pocillos con 6 x 103 células/100 µl/pocillo. Tras incubación en atmósfera húmeda con un 10% de CO2 , a 37ºC durante 3-4 horas para permitir la fijación de las células a la placa se añadió a los pocillos piperina disuelta en MeOH y agua. Las concentraciones finales de piperina fueron 1, 5, 10, 100 µM, con TPA (20 nM) como control positivo. En cada grupo de tratamiento se usaron 6 replicados, con 12 pocillos usados para el control con vehículo. La incubación se llevó a cabo durante 5 días antes de recoger las células fijándolas con ácido tricloroacético frío (TCA, a 4ºC, concentración final de 20% v/v) y evaluarlas para determinar el número de células usando un ensayo con SRB. Para determinar la significación de cualquier diferencia entre los grupos de tratamiento y el control con vehículo se usaron ANOVA de un factor y el test de Dunnett. El crecimiento en presencia de piperina y TPA se expresó en forma de % de incubaciones control que no contienen ni piperina ni TPA. Los experimentos se repitieron usando melanoblastos procedentes de 3 donantes diferentes. Resultados

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La figura 6 muestra el efecto de la piperina sobre el crecimiento in vitro de melanoblastos humanos. Se descubrió que la piperina alas concentraciones de 1, 10, 100 µM causaba estimulación significativa en melanoblastos humanos en respuesta a dosis, con un rendimiento celular de 34% frente al control con vehículo cuando el cultivo se expuso a piperina 100 µM en cultivo durante 5 días. El TPA, un agentes estimulador del crecimiento melanocítico bien conocido, también fue capaz de causar crecimiento celular significativo a las concentraciones probadas, con un rendimiento celular de más de 50% observado cuando el cultivo se expuso a 20 nM durante 5 días. En otros experimentos repetidos, se observó de forma constante que la piperina inducía crecimiento celular significativo a concentraciones que oscilan entre 5-100 µM; generalmente estos efectos estimuladores fueron inferiores a los del TPA. Morfológicamente, en presencia de piperina, los melanoblastos parecían ser más dendríticos y los cuerpos celulares fueron más planos y más pequeños. Ejemplo 10 Experimentos sobre melanocitos humanos en cultivo

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Los melanocitos humanos usados en este experimento derivaban de la diferenciación inducida de melanoblastos humanos fetales. La característica clave de los melanocitos humanos que les diferencia de sus melanoblastos precursores es su capacidad para sintetizar melanina. La melanina es un marcador válido de melanocitos. El precipitado celular de melanocitos humanos exhibe un color de marrón a negro característico, mientras que los melanoblastos humanos no pueden producir melanina, por tanto están desprovistos de ese color marrón o negro en el precipitado celular. Para los experimentos con melanocitos humanos en cultivo se usaron dos protocolos. El primero empleaba placas de 24 pocillos y evaluó el número de células con un ensayo con SRB. El segundo usaba placas petri y el número de células se contó con una cámara de hemocitómetro. En el primer protocolo, en dos placas de 24 pocillos (Falcon) se subcultivaron melanocitos humanos subconfluentes mantenidos en una placa petri de ∅ de 100 mm usando un medio de cultivo básico de RPMI 1640 complementado con SBF (10%), bFGF (100 pM), CT (1 nM) y endotelina 1 (1 nM). La densidad inicial en las placas fue de 20.000 células/cm2 (38.200 células/pocillo), conteniendo cada pocillo 1000 µl de medio. Tras la incubación en una atmósfera húmeda con un 10% de CO2 , a 37ºC durante 2-3 horas para permitir la fijación de las células, se añadió a los pocillos piperina en 500 µl de medio para obtener las concentraciones finales de 0,1 m5, 10 y 100 µM. Las células solo con medio con los complementos mencionados sin endotelina 1 también se establecieron como control negativo. En cada grupo de tratamiento se usaron seis replicados y los cultivos se incubaron durante 5 días antes de recoger las células fijándolas con TCA frío (concentración final 20%) y procesándolas con ensayo con SRB. La solución con el colorante SRB solubilizado se transfirió a una placa de 96 pocillos para la lectura de la densidad óptica. En el segundo protocolo, se subcultivaron melanocitos humanos subconfluentes en placas petri de ∅ de 60 mm (28 cm2 , Falcon) con medio básico RPMI 1640 complementado con SBF (10%), bFGF (100 pM), CT (1 nM) y endotelina 1 (1 nM). La densidad inicial de las placas fue de 10.000 células/cm2 , con 5 ml de medio por placa. Las células se incubaron durante 2-3 horas, en atmósfera húmeda con 10% de CO2 a, 37ºC, seguido por la adición a las placas de 9

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solución de piperina, obteniendo unas concentraciones finales de 0, 1, 5, 10 y 100 µM. Asimismo, las células en el medio complementado sin endotelina 1 se establecieron como control negativo. Para cada tratamiento se usaron tres placas y el cultivo se mantuvo durante 5 días, antes de recoger las células, con adición de tripsina y recuento con una cámara de hemocitómetro. Para el experimento de producción de melanina, las células se recogieron y precipitaron. Después de retirar el medio con precaución, se usó NaOH (1 M) para solubilizar los precipitados celulares y se leyó la densidad óptica a 475 nm en un espectrofotómetro UV de Perkin-Elmer (modelo UV/VIS Lambda 2). Se calculó el contenido de melanina usando una ecuación de regresión y = 0,005 + 0,005x, correspondiente a la curva de calibración de la melanina sintética. Resultados La figura 7 delimita los efectos de la piperina sobre el crecimiento de melanocitos humanos cultivados en una placa de 24 pocillos. La piperina a las concentraciones de 5 y 10 µM estimula de forma marcada el crecimiento de estas células pigmentadas, con un rendimiento de 36% más células cuando el cultivo estaba bajo la influencia de piperina 10 µM durante 5 días. Sin embargo, a 100 µM, la piperina ejerció un efecto inhibidor sobre el crecimiento de estas células. Además, en presencia de endotelina 1 1 nM, el TPA a 20 nM no fue capaz de estimular el crecimiento celular en nuestro sistema de cultivo, un resultado que difiere bastante del observado para los melanoblastos humanos. La tabla 5 muestra los efectos de la piperina sobre el crecimiento de melanocitos humanos cultivados en placas petri. Es un hecho notable que en presencia de ET1 (1 nM), la piperina a las concentraciones de 5 y 10 µM estimuló de forma significativa el crecimiento de melanocitos humanos, con un número de células de más del doble de las del control ET1 (1 nM), cuando este celular melanocito se expuso a piperina 5 µM durante 5 días. Este resultado fue consistente con el obtenido en los experimentos con placas de 24 pocillos y sirvió para confirmar que los efectos estimuladores observados mediante ensayo con SRB se debieron al aumento de número de células en vez de al incremento en la producción proteica. (Tabla pasa a página siguiente)

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1. Uso en la preparación de un medicamento para estimular la proliferación de melanocitos de un compuesto de fórmula (I)

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en la que (a) n es 0, 1 ó 2, m es 2, los dos R1 juntos representan un grupo 3’-4’-metilendioxi, R2 y R3 , junto con los átomos de carbono a los que están unidos, forman un doble enlace carbono-carbono y, cuando n es 1 ó 2, R4 y R5 , junto con los átomos de carbono a los que están unidos, forman un doble enlace carbono-carbono y R6 es piperidino, o (b) n es 1 e (i) m es 3, dos R1 juntos representan 3’-4’-metilendioxi y el otro 6’-metoxi; o (ii) m es 2, siendo los R1 3’-hidroxi-4’-metoxi; o (iii) m es 1 y el R1 es 4’-hidroxi; y R2 a R6 son como se ha definido en el caso (a) anteriormente; o

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(c) n es 1, R6 es pirrolidino, isobutilamino o metoxi y los otros símbolos son como se ha definido en el caso (a) anteriormente, o (d) n es 1, R4 y R5 representan átomos de hidrógeno y o R2 y R3 también lo son o R2 y R3 junto con los átomos de carbono a los que están unidos, forman un doble enlace carbono-carbono; y m, R1 y R6 son como se ha definido en el caso (a) anteriormente; y en el caso (a), cuando n es 1, la molécula está en la configuración geométrica E,E, Z,Z, Z,E o E,Z, pero en caso contrario la molécula está en la configuración geométrica E,E o todos E.

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2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, de un compuesto de fórmula (I) en la preparación de un medicamento para volver a pigmentar la piel despigmentada. 3. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la piel despigmentada es una piel despigmentada tras un traumatismo. 4. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 de un compuesto de fórmula (I) en la preparación de un medicamento para el tratamiento del vitíligo.

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5. Uso en la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de piel de un compuesto de fórmula (I) como se ha definido en la reivindicación 1. 6. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el compuesto de fórmula (I) está en forma de un extracto vegetal.

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7. Un compuesto de fórmula (Ia)

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en la que (a) n es 0 ó 2, m es 2, los dos R1 juntos representan un grupo 3’-4’-metilendioxi, R2 y R3 , junto con los átomos de carbono a los que están unidos, forman un doble enlace carbono-carbono y, cuando n es 1 ó 2, R4 y R5 , junto con los átomos de carbono a los que están unidos, forman un doble enlace carbono-carbono y R6 es piperidino, o

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ES 2 207 252 T3 (b) n es 1 y (i) m es 3, dos R1 juntos representan 3’-4’-metilendioxi y el otro 6’-metoxi o (ii) m es 2, siendo los R1 3’-hidroxi-4’-metoxi; o (iii) m es 1 y el R1 es 4’-hidroxi; y R2 a R6 son como se ha definido en el caso (a) anteriormente; o 5

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(c) n es 1, R6 es pirrolidino, isobutilamino o metoxi y todos los otros símbolos son como se ha definido en el caso (a) anteriormente, o (d) n es 1, R4 y R5 representan átomos de hidrógeno y o R2 y R3 también lo son o R2 y R3 junto con los átomos de carbono a los que están unidos, forman un doble enlace carbono-carbono; y m, R1 y R6 son como se ha definido en el caso (a) anteriormente; y la molécula está en la configuración geométrica E,E o todos E, para su uso en tratamientos. 8. Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con la reivindicación 7 para volver a pigmentar la piel despigmentada.

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9. Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la piel despigmentada es piel despigmentada tras un traumatismo. 10. Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8 para el tratamiento del vitíligo. 20

11. Una composición farmacéutica que comprenda un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula (Ia) 25

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en la que 35

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(a) n es 0 ó 2, m es 2, los dos R1 juntos representan un grupo 3’-4’-metilendioxi, R2 y R3 , junto con los átomos de carbono a los que están unidos, forman un doble enlace carbono-carbono y, cuando n es 1 ó 2, R4 y R5 , junto con los átomos de carbono a los que están unidos, forman un doble enlace carbono-carbono y R6 es piperidino, o (b) n es 1 y (i) m es 3, dos R1 juntos representan 3’-4’-metilendioxi y el otro 6’-metoxi; o (ii) m es 2, siendo los R1 3’-hidroxi-4’-metoxi; o m es 1 y el R1 es 4’-hidroxi; y R2 a R6 son como se ha definido en el caso (a) anteriormente; o (c) n es 1, R6 es pirrolidino, isobutilamino o metoxi y todos los otros símbolos son como se ha definido en el caso (a) anteriormente, o

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(d) n es 1, R4 y R5 representan átomos de hidrógeno y o R2 y R3 también lo son o R2 y R3 junto con los átomos de carbono a los que están unidos, forman un doble enlace carbono-carbono; y m, R1 y R6 son como se ha definido en el caso (a) anteriormente; y la molécula está en la configuración geométrica E,E o todos E.

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12. Un procedimiento de potenciar estéticamente el color de la piel, que comprende la administración a un receptor que desea potenciar el color de la piel de una cantidad estéticamente eficaz de un compuesto de fórmula (I) como se define en la reivindicación 1.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluida en la mencionada reserva. 21

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