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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k 2 133 289 kInt. Cl. : A61K 31/195

11 N´ umero de publicaci´on: 6

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˜ ESPANA

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 91916683.5 kFecha de presentaci´on : 11.09.91 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 549 660 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 07.07.93

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54 T´ıtulo: Aumento de los niveles de glutati´ on con glutamina.

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73 Titular/es: THE BRIGHAM AND WOMEN’S

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72 Inventor/es: Wilmore, Douglas W.

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74 Agente: Curell Su˜ nol, Marcelino

30 Prioridad: 20.09.90 US 585846

HOSPITAL, INC. 75 Francis Street Boston, MA 02115, US

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.09.99

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

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16.09.99

Aviso:

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 133 289 T3 DESCRIPCION Aumento de los niveles de glutati´ on con glutamina. 5

La presente invenci´on se refiere al mantenimiento y al aumento de los niveles de glutati´on en plasma y tejidos de mam´ıferos. Antecedentes de la invenci´ on

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El glutati´ on es un trip´eptido, L-γ-glutamil-L-cisteinil-glicina, presente en concentraciones elevadas en la mayor´ıa de los tipos de c´elulas. En virtud de su grupo sulfhidrilo reactivo, el glutati´ on es capaz de donar un ion hidr´ ogeno y un electr´on desapareado y neutralizar per´ oxidos y radicales libres (Meister, A., Nutrition Reviews, 42:397-410 (1984); Meister, A., J. Biol. Chem. 263:17205-17208 (1988); Kosower et al., Int. Rev. Cytology, 54:109-160 (1978)). Datos experimentales demuestran que el glutati´on y sus enzimas de un sistema redox, el glutati´ on peroxidasa y la reductasa, proporcionan un sistema de protecci´ on amplio y esencial contra agresiones tanto end´ ogenas como ex´ogenas. En numerosos tipos de c´elulas, los niveles de glutati´ on normal o aumentado son protectores frente a lesiones celulares inducidas por una variedad de diferentes agentes (Harlan et al., J. Clin. Invest. 73:706-713 (1984); Roos et al., Agents and Actions 10:528-535 (1980); Weinberg et al.,J. Clin. Invest. 80:1446-1454 (1987); Babson et al., Biochem. Pharm. 30:2299-2304 (1981); Lash et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4641-4645 (1986); Szabo et al., Science 214:200-202 (1981)). A la inversa, se ha demostrado que el descenso de glutati´on sensibiliza a los tejidos a una lesi´on oxidativa aumentada debido a diversas situaciones de estr´es (Deneke et al., J. Appl. Physiol. 58:571-574 (1985); Davis et. al., Current Surgery 45:392-395 (1988); Chen et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 151:844-850 (1988)). La s´ıntesis de glutati´ on est´ a dirigida por las actividades secuenciales de la γ-glutamilcisteina sintetasa (GGCS) y el glutati´ on sintetasa. La GGCS es la enzima limitante de la velocidad y es inhibida por retroalimentaci´on por los niveles de glutati´ on intracelular. Adicionalmente, la velocidad de s´ıntesis puede estar regulada por la disponibilidad de substrato. Est´ a documentado que la ciste´ına es limitante de la velocidad de s´ıntesis de el glutati´ on. (Meister, A., Nutrition Reviews 42:397-410 (1984); Richman et al., J. Biol. Chem. 250:1422-1426 (1975)). La degradaci´on del glutati´ on es dependiente de la γ-glutamil transpeptidasa (GGTP), una enzima enlazada a la membrana, que cataliza la transferencia del grupo γ-glutamil del glutati´ on a una mol´ecula aceptora, bien un amino´ acido o agua, para formar un γ-glutamilamino´ acido o glutamato, respectivamente. La fracci´on de ciste´ına-glicina del glutati´ on degradada es r´ apidamente descompuesta por la dipeptidasa y cada amino´ acido es absorbido intracelularmente. El γ-glutamilamino´ acido es desplazado en la c´elula y la γ-glutamilciclotransferasa provoca la formaci´ on del amino´ acido libre y de oxoprolina. La oxoprolina (´ acido piroglut´ amico) es convertida en glutamato por la 5-oxoprolinasa. El glutamato puede entonces utilizarse para la s´ıntesis del glutati´ on hasta completar el ciclo (Meister, A., Nutrition Reviews 42:397-410 (1984)). Se ha demostrado la existencia del ciclo del γ-glutamilo en muchos tipos de c´elulas, pero su funci´ on fisiol´ ogica precisa no es bien conocida. Se ha propuesto que la formaci´ on de amino´ acido γ-glutamilo constituye una forma de un mecanismo de transporte de amino´ acidos (Griffith et al., Proc. Natl. Acad. nalado que bajo condiciones fisiol´ ogicas, la Sci. USA 76:6319-6322 (1979)). Sin embargo, otros han se˜ hidr´ olisis del complejo de γ-glutamilo con la formaci´on de glutamato es la reacci´on dominante (McIntyre et al., Int. J. Biochem. 12:545-551 (1980); Cook et al., Biochim. Biophys. Acta 884:207-210 (1986)). Se ha dicho que dosis t´ oxicas de endotoxina en ratones reducen significativamente la concentraci´ on de grupos sulfhidrilo enlazados a no-prote´ınas, de los que el glutati´ on comprende el noventa por ciento. Se demostr´o que el escaldado, la ligadura de la pata trasera, la administraci´ on de endotoxina, la exposici´ on al fr´ıo, el trauma por ca´ıdas y la hemorragia grave tienen como resultado una disminuci´ on significativa de los niveles de glutati´ on en h´ıgado. El mecanismo de dicho descenso y su significado no se entendieron (Beck et al., Proc. Soc. Expt. Biol. 81:291-294 (1952); Beck et al., Proc. Soc. Expt. Biol. 86:823-827 (1954)). Siguiendo las observaciones de Beck et al., otros investigadores examinaron los efectos del glutati´ on en un n´ umero de modelos de conmociones (“shocks”) en animales. La administraci´ on ex´ogena de glutati´ on a animales en shock por endotoxinas, (Szymanski et al., Proc. Soc. Expt. Biol. 129:966-968 (1968); Sumida et al., Jap. Circ. J. 45:1364-1368 (1981); Kosugi et al., “New Approaches to Shock Therapy: Reduced GSH”, en Molecular Aspects of Shock and Trauma, A.M. Lefer, ed., Alan R. Liss, Inc., New 2

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York (1983)), shock hemorr´ agico (Horejsi et al., Folia Haematol. 86:220-225 (1966); Yamada, H., Jap. J. Anesth. 26:640-645 (1977)), y shock cardiogn´enico (Galvin et al., Am. J. Physiol. 235:H657-H663 (1978)), atenu´ o significativamente la lesi´on en tejidos y mejor´ o la supervivencia. Adicionalmente, una evidencia reciente ha demostrado que el factor de necrosis tumoral puede inducir da˜ no en c´elulas por lesi´on oxidativa (Watanabe et al., Immunopharm. Immunotox. 10:109-116 (1988); Matthews et al., on aument´ o la mortaImmunology 62:153-155 (1987)), y que en ratas, el descenso de los niveles de glutati´ lidad a dosis anteriormente no letales del factor de necrosis tumoral (Zimmerman et al., J. Immunology 142:1405-1409 (1989)). Se ha demostrado asimismo que los niveles de glutati´on de la mucosa intestinal disminuyen significativamente despu´es de 24 a 48 horas de inanici´on (Ogasawara et al., Res. Exp. Med. 189:195-204 (1989); on en eritrocitos no cambian duSiegers et al., Pharmacology 39:121-128 (1989)). Los niveles de glutati´ rante dicho per´ıodo de inanici´ on, de acuerdo con la vida media intracelular m´as larga de cuatro d´ıas (Cho et al., J. Nutr. 111:914-922 (1981)).

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La terapia por irradiaci´ on es una forma de tratamiento por regiones para el control de c´anceres localizados. El ´exito de la radioterapia depende de la producci´ on de radicales libres por los encuentros ionizantes que suceden a la irradiaci´on. Los radicales libres resultantes y los agentes oxidantes producen roturas de la hebra de ADN y otros da˜ nos a mol´eculas de ADN en el c´ancer localizado. Sin embargo, la radioterapia est´ a asimismo asociada a da˜ nos acompa˜ nantes en tejidos normales y el da˜ no en tejidos normales aumenta con el tama˜ no del tumor. La prevenci´ on o la reducci´ on del da˜ no oxidativo en el tejido normal supondr´ıan un beneficio para el paciente que recibe la radioterapia. Muchas sustancias terap´euticas pueden producir da˜ nos en el h´ıgado en virtud de la producci´ on de metabolitos oxidativos. El acetaminofeno (paracetamol) es una preparaci´on analg´esica com´ unmente utilizada sin prescripci´ on m´edica y una causa frecuente de envenenamiento. Una ruta metab´ olica del acetaminofeno es una activaci´on catalizada por el citocromo P-450 que produce como resultado la formaci´on de un metabolito reactivo que se une a nucle´ ofilos celulares, particularmente glutati´ on reducido. Otra substancia com´ un que puede causar un da˜ no oxidativo en el h´ıgado es la acrole´ına, un metabolito del f´ armaco antic´ancer ampliamente utilizado la ciclofosfamida. La acrole´ına se une a sulfhidrilos celulares y puede disminuir el glutati´on intracelular, llevando a la muerte de la c´elula. (Dawson, J.R. et al., Arch. Toxicol. 55:11-15 (1984)). Las manifestaciones cl´ınicas tempranas de la toxicidad de la ciclofosfamida incluyen la cistitis hemorr´agica, la esterilidad y la alopecia. (Izard, C. et al., Mutation Research 47:115-138 (1978)). Los compuestos capaces de producir da˜ no oxidativo no est´ an limitados a productos farmac´euticos administrados de forma intencionada. El paracuat es un herbicida que tiene efectos t´ oxicos en la mayor´ıa de o´rganos incluyendo los pulmones, el h´ıgado, el coraz´on, el tracto gastrointestinal y los ri˜ nones. El paracuat sufre una reacci´ on de ciclaci´on redox que puede conducir a la producci´ on de especies de ox´ıgeno reactivo, incluyendo per´ oxido de hidr´ ogeno y el radical super´ oxido. (Dawson, J.R., et al., Mutation Research 47:115-138 (1978)). La N-acetilciste´ına tiene un efecto protector contra la toxicidad del acetaminofeno, la acrole´ına y el paracuat en hepatocitos aislados. Actuando como un precursor del glutati´ on, la N-acetilciste´ına disminuye la toxicidad del paracuat coincubado con los hepatocitos. (Dawson, J.R. et al., Arch. Tox. 55:11-15 (1984)). La N-acetilciste´ına es actualmente un tratamiento cl´ınico de elecci´on para pacientes que han ingerido cantidades en exceso de acetaminofeno. Sin embargo, en los Estados Unidos no se ha aprobado la utilizaci´on intravenosa de la N-acetilciste´ına y no est´ a disponible para pacientes que presentan una funci´ on gastrointestinal comprometida. En casos de sobredosis de acetaminofeno, la disminuci´ on del glutati´ on intracelular puede conducir a la muerte celular y a un da˜ no del h´ıgado. (Dawson, J.R. et al., Arch. Tox. 55:11-15 (1984)). S´olo en Gran Breta˜ na, mueren m´ as de 150 personas cada a˜ no como resultado de un envenenamiento con acetaminofeno. (Meredith, T.J. et al., Br. Med. J. 293:345-346 (1986)). En un estudio de 100 pacientes con fallo hep´ atico inducido por acetaminofeno, se observ´ o una mortalidad del 37 % a pesar de la administarci´ on del ant´ıdoto actualmente utilizado, la acetilciste´ına. La mortalidad fue de un 58 % entre pacientes que no recibieron el ant´ıdoto. (Harrison, P.M. et al., The Lancet:1572-1574 (30 de Junio, 1990)). Por lo tanto, aunque el tratamiento actualmente utilizado consigue cierta reducci´ on de la mortalidad, se necesita un tratamiento m´as eficaz para reducir a´ un m´ as la tasa de mortalidad. El acetaminofeno, la ciclofosfamida y otros f´ armacos que pueden metabolizarse a derivados t´ oxicos, 3

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se administran a menudo a pacientes ya bajo una estr´es f´ısico significativo debido a la enfermedad y a la falta de nutrici´ on. En dichos paciente, las reservas hep´ aticas de glutati´on pueden haber ca´ıdo por debajo de los niveles normales, disminuyendo la capacidad desintoxicadora del h´ıgado. El efecto de la inanici´ on en los niveles de glutati´ on en los tejidos es por lo tanto importante en vistas del estatus nutricional atenuado de los pacientes que reciben f´ armacos antic´ancer u otros agentes farmac´euticos potentes. Los niveles de glutati´ on hep´ aticos caen aproximadamente un 50 % entre las 24 y 48 horas de inanici´on o de una dieta baja en prote´ınas (Leaf et al., Biochem. J. 41:280-287 (1947); Cho et al., J. Nutr. 111:914-922 (1981); Strubelt et al., Toxic. Appl. Pharm. 60:66-77 (1981)). Lo anterior es consistente con la corta vida media del glutati´ on hep´ atico de aproximadamente 4 horas. Con la realimentaci´on, los niveles hep´ aticos de glutati´ on vuelven a la normalidad en 24 horas. La administraci´on ex´ogena de glutati´ on, tanto por v´ıa parenteral como intraperitoneal, es relativamente ineficaz en el aumento de los on plasm´atico niveles tisulares (Anderson et al., Arch. Biochem. Biophys 239:538-548 (1985)). El glutati´ se metaboliza r´apidamente y la mayor´ıa de los tejidos son incapaces de transportar grandes cantidades de glutati´ on ex´ogeno intacto. Las peque˜ nas cantidades de glutati´ on presentes en el plasma son debidas principalmente a una r´ apida s´ıntesis y liberaci´on hep´ atica y a una r´ apida degradaci´ on renal. Aunque los niveles plasm´aticos de glutati´ on son entre 100-500 veces inferiores a los niveles intracelulares, una cantidad significativa de glutati´ on es capaz de circular debido a su r´ apido flujo (Griffith et otesis de al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5606-5610 (1979)). Hirota et al. han establecido la hip´ que la liberaci´ on de glutati´ on plasm´atico por el h´ıgado es importante en la protecci´ on de las membranas celulares frente al da˜ no oxidativo. La disfunci´ on hep´ atica inducida por shock puede inhibir una s´ıntesis y liberaci´ on suficientes de glutati´ on plasm´atico, permitiendo que se produzca el consiguiente da˜ no oxidativo (Hirota et al., Gastroenterology 97:853-859 (1989); Keller et al., Arch. Surg. 120:941-945 (1985)).

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Los pacientes incapaces de tener una nutrici´ on adecuada son a menudo tratados con f´ ormulas de nutrici´ on parenteral totales. La administraci´ on parenteral de preparaciones farmac´euticas es asimismo adecuada para pacientes con disfunci´ on gastrointestinal. Sin embargo, el ant´ıdoto actualmente utilizado para la sobredosis de acetaminofeno, la N-acetilciste´ına, no est´ a aprobada para su utilizaci´ on intravenosa en los Estados Unidos. Por lo tanto, a los pacientes que presentan sistemas gastrointestinales no funcionales o disfuncionales asociados con la sobredosis de acetaminofeno no se les puede suministrar N-acetilciste´ına por v´ıa intravenosa. En vistas del papel crucial desempe˜ nado por el glutati´ on en la desintoxicaci´on de los metabolitos de f´ armacos y en la prevenci´on de la peroxidaci´on de componentes celulares, se necesita un m´etodo para mantener las reservas hep´aticas de glutati´ on, particularmente durante momentos de estr´es del cuerpo, incluyendo la quimioterapia. Sumario de la invenci´ on

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La presente invenci´on se refiere a la utilizaci´on de glutamina o un is´ omero o un derivado del mismo en la preparaci´ on de un agente para aumentar y opcionalmente mantener la concentraci´ on tisular o el nivel plasm´ atico de glutati´ on en un mam´ıfero. 45

Breve descripci´ on de las Figuras Figura 1. La Figura 1 es un gr´ afico que ilustra los niveles de glutati´ on hep´ atico en ratas tratadas con 5-fluorouracilo (5FU) y alimentadas con una TPN est´ andar o con una TPN suplementada con glutamina.

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Descripci´ on de las formas de realizaci´ on preferidas

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Mediante la utilizaci´on de glutamina, los niveles de glutati´on en el h´ıgado pueden mantenerse o aumentarse mediante la administraci´ on de glutamina. La glutamina se intenta utilizar en todas las condiciones fisiol´ ogicas y patol´ ogicas en las que se sepa o se sospeche que los niveles de glutati´on tisulares o sangu´ıneos han disminu´ıdo. Puede asimismo utilizarse conjuntamente con cualquier r´egimen terap´eutico que pueda reducir los niveles de glutati´ on hep´ aticos. Adicionalmente, puede utilizarse en condiciones en que las reservas de glutati´ on hep´ atico puedan reducirse como resultado de una malnutrici´ on, tanto sola como asociada a una condici´ on patol´ ogica.

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El mantenimiento de las concentraciones adecuadas de glutati´ on es crucial y el h´ıgado es capaz de sintetizar grandes cantidades de glutati´ on a una velocidad r´ apida durante el estr´es. En el caso del da˜ no tisular inducido por f´ armacos, el aumento de la velocidad de s´ıntesis de glutati´ on es necesario para 4

ES 2 133 289 T3 contrarrestar las grandes cantidades de conjugados f´ armaco-glutati´ on excretados por la orina tras el metabolismo del a´cido mercapt´ urico. La cantidad excretada puede superar en varias veces la cantidad total de glutati´ on originalmente presente en el h´ıgado. 5

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Sin embargo, una variedad de condiciones pueden disminuir el glutati´ on hep´ atico, dejando una peque˜ na reserva para las funciones de desintoxicaci´ on. El ayuno disminuye las concentraciones de glutati´on hep´ atico y el estr´es oxidativo conduce a un aumento del transporte de glutati´ on, en forma de disulfuro, desde el h´ıgado. Bajo condiciones de un aumento de demanda de la s´ıntesis de glutati´ on, el h´ıgado puede ser incapaz de satisfacer los requerimientos adicionales para su reserva de glutati´ on y la administraci´ on de una dosis no t´ oxica en otras condiciones de un f´ armaco puede conducir a una lesi´ on celular y tisular. Tal como se utiliza en la presente memoria, se entiende que el t´ermino “mam´ıfero” incluye seres humanos.

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Los is´omeros o derivados de la glutamina pueden asimismo mantener o aumentar la cantidad de glutati´ on en una c´elula de mam´ıfero o en tejido o en plasma, in vitro o in vivo. Por “mantener” la cantidad, el nivel o la concentraci´on de glutati´ on en una c´elula o en tejido o plasma se entiende la prevenci´on de un descenso parcial o completo de glutati´ on que de otra manera podr´ıa producirse en ausencia del tratamiento seg´ un la invenci´ on. Por “aumentar” la cantidad, el nivel o la concentraci´ on de glutati´ on en una c´elula o en tejido o plasma se entiende el aumento de la cantidad, del nivel o de la concentraci´on de glutati´ on sobre el que estaba presente en la c´elula, tejido o plasma antes del tratamiento.

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Por “tratamiento quimioterap´eutico” se entiende la administraci´on a un mam´ıfero de un f´ armaco o agente quimioterap´eutico para prevenir, aliviar o curar una enfermedad o una condici´ on patol´ ogica. Com´ unmente el agente quimioterap´eutico se administrar´ıa para tratar el c´ ancer, pero dentro del significado del t´ermino se incluyen otros agentes quimioterap´euticos. 30

Por “xenobi´ otico” se entiende cualquier compuesto al que es expuesto un mam´ıfero, pero que no se encuentra de forma natural en el mam´ıfero. El compuesto puede ser com´ unmente un f´ armaco, un agente quimioterap´eutico, un pesticida o un herbicida, pero puede ser asimismo cualquier otro compuesto que tenga un grupo nucleof´ılico, o que sea metabolizado a un derivado con un grupo nucleof´ılico. 35

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Por “cantidad supranormal” de glutamina se entiende una cantidad o concentraci´on de glutamina superior a la cantidad que un mam´ıfero recibir´ıa de otro modo en la dieta o de otra manera. En relaci´ on a un ser humano, una cantidad supranormal de glutamina es una cantidad superior a la encontrada en la dieta o a la proporcionada de otra manera a dicho ser humano, por ejemplo como componente de una formulaci´ on nutricional parenteral total o en una formulaci´ on diaria espec´ıfica. Por “shock” se entiende una disminuci´on o un cese parcial o total del flujo sangu´ıneo en un mam´ıfero. El t´ermino incluye el shock hemorr´ agico, el shock s´eptico y condiciones asociadas con el pinzamiento de los vasos sangu´ıneos durante un transplante de o´rganos.

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Por “enteral” se entiende la porci´on del canal alimentario que incluye el est´omago y la porci´ on distal del est´ omago. Por “parenteral” se entiende la regi´ on externa al tracto digestivo. 50

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Seg´ un un aspecto de la invenci´ on, se administra una cantidad supranormal de glutamina o un equivalente de la glutamina a una persona que est´ a recibiendo, o que recibir´ a, un tratamiento de quimioterapia o de irradiaci´ on para un estado canceroso. La administraci´ on de glutamina o de un equivalente a la glutamina antes, durante y/o despu´es del tratamiento de quimioterapia o de irradiaci´on aumenta las reservas hep´ aticas de glutati´on, con lo que se aumenta la capacidad del h´ıgado para desintoxicar los metabolitos que resultan del tratamiento de quimioterapia o de irradiaci´ on. El efecto de da˜ no a tejidos de los radicales libres generados durante el tratamiento de irradiaci´on puede asimismo mitigarse mediante dicha administraci´ on de glutamina o de un equivalente a la glutamina. La glutamina puede asimismo administrarse a una persona que haya ingerido o haya estado expuesta a un compuesto propenso a producir uno o m´ as metabolitos t´ oxicos. Por ejemplo, una sobredosis de acetaminofeno puede causar toxicidad hep´ atica debido a la saturaci´ on de la ruta metab´ olica principal por 5

ES 2 133 289 T3 el acetaminofeno.

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Normalmente, el acetaminofeno se elimina del cuerpo por conjugaci´ on con el a´cido glucur´ onico y con el sulfato, pero en casos de sobredosis, dichas v´ıas se saturan. El exceso de acetaminofeno es activado por el citocromo P-450 y el metabolito reactivo se une al glutati´ on reducido. En ausencia del glutati´ on adecuado, el metabolito reactivo se une a otros componentes celulares y provoca un da˜ no hep´ atico. Seg´ un la invenci´on, la administraci´ on de una cantidad supranormal de glutamina o de un equivalente de la glutamina tras la diagnosis de la sobredosis de acetaminofeno puede mitigar o evitar parte o todo el da˜ no hep´ atico que se producir´ıa de otro modo sin la administraci´on de glutamina.

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La cantidad de glutamina o de un equivalente de la glutamina eficaz para mantener o aumentar los niveles de glutati´ on tisulares o plasm´ aticos variar´a dependiendo de las necesidades del paciente. Para un paciente que reciba una quimioterapia prolongada, es preferible administrar la glutamina o el equivalente a la glutamina a intervalos frecuentes a lo largo del d´ıa para conseguir y mantener un nivel aumentado de glutati´ on. Dependiendo de la gravedad de la enfermedad, la glutamina puede administrarse por v´ıa intravenosa o puede incorporarse en la dieta. La cantidad de glutamina administrada puede variar entre 0,1 y 2,0 gramos por kilogramo de peso corporal por d´ıa, siendo un intervalo preferido el comprendido entre 0,3 y 0,5 gramos por kilogramo de peso corporal por d´ıa. En casos de envenenamiento agudo, tal como por exposici´on a paracuat o a cualquier otro compuesto que tenga un grupo nucleof´ılico o que sea metabolizado a un derivado nucleof´ılico, es preferible administrar una primera cantidad supranormal de glutamina o de equivalente a la glutamina, en el intervalo comprendido entre 0,5 y 2,0 gramos por kilogramo de peso corporal, para conseguir un r´ apido aumento del nivel hep´ atico de glutati´ on. Tras los tratamientos iniciales, se pueden administrar cantidades adicionales de glutamina o del equivalente a la glutamina, en el intervalo comprendido entre 70 y 500 mg por kilogramo de peso corporal por d´ıa, para mantener los niveles de glutati´ on. La ruta de administraci´ on depender´ a de la gravedad del envenenamiento y una administraci´ on intravenosa inicial puede ser seguida de posteriores dosis orales, solas o con alimento. La administraci´on de glutamina puede ser por medios enterales y parenterales. La administraci´ on enteral puede conseguirse mediante un entubado colocado a trav´es de la nariz en las regiones g´astricas o duodenales. Ejemplos de administraci´ on parenteral incluyen, aunque sin estar limitados a las mismas, rutas tales como la subcut´ anea, la intramuscular o la inyecci´on intravenosa, la absorci´ on nasofar´ıngea o mucosal o la absorci´on transd´ermica. Las preparaciones para la administraci´ on parenteral incluyen soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones y emulsiones est´eriles. Pueden utilizarse soportes o revestimientos oclusivos para aumentar la permeabilidad de la piel y mejorar la absorci´ on. La glutamina puede administrarse sola o como un suplemento de la dieta. Cuando se utiliza como suplemento de la dieta, la glutamina puede mezclarse con una dieta existente enteral o parenteral antes de su administraci´ on al paciente. Por ejemplo, la glutamina puede incorporarse en una formulaci´ on est´andar de nutrici´ on parenteral total (TPN). Alternativamente, la glutamina puede administrarse por separado sin mezclarse directamente con otros componentes de la dieta. Los m´etodos de la invenci´ on pueden asimismo practicarse con an´ alogos funcionales, productos de substituci´ on, is´ omeros u hom´ologos de la glutamina que retengan las caracter´ısticas funcionales equivalentes a la glutamina. En particular, un equivalente de la glutamina mantendr´ıa o aumentar´ıa de forma efectiva el nivel de glutati´ on en una c´elula hep´ atica, tanto en un ensayo in vitro como in vivo. La administraci´on de glutamina o un equivalente a la glutamina protege contra la toxicidad resultante del acetaminofeno. El acetaminofeno es un potente agente hepatot´ oxico com´ unmente utilizado como analg´esico, tanto solo como en combinaci´on con, por ejemplo, code´ına o hidrocloruro de pseudoepinefrina. Las composiciones farmac´euticas que contienen acetaminofeno est´an disponibles libremente como productos sin necesidad de prescripci´ on m´edica. La toxicidad hep´ atica, en ocasiones fatal, es un efecto conocido de la sobredosis de acetaminofeno. Las preparaciones habituales de acetaminofeno contienen entre 325-500 mg por comprimido o c´ apsula. La toxicidad hep´ atica puede producirse con la ingesti´ on de 10 gramos, que es equivalente a veinte comprimidos de 500 mg. Sin embargo, puede producirse la muerte tras la ingesti´ on de 15 gramos y no se 6

ES 2 133 289 T3 desconoce el consumo de 100 comprimidos (de 30 a 50 gramos de acetaminofeno) antes de la admisi´on en un hospital por sobredosis.

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En un estudio de 100 pacientes con fallo hep´ atico fulminante inducido por acetaminofeno, se determin´ o que la mortalidad fue de un 58 % en pacientes que no recibieron un ant´ıdoto de la acetilciste´ına y de un 37 % en pacientes que recibieron el ant´ıdoto entre 10-36 horas despu´es de la sobredosis. (Harrison, P.M. et al., The Lancet:1572-1574 (30 de junio, 1990)). Seg´ un la invenci´ on, la administraci´ on de glutamina disminuye la mortalidad asociada a la toxicidad del acetaminofeno. Diez horas despu´es del tratamiento con acetaminofeno, ratas previamente alimentadas con glutamina durante cinco d´ıas mostraron una recuperaci´ on casi normal de los niveles de glutati´ on hep´ atico, que se redujeron 6 horas despu´es de un tratamiento con acetaminofeno. Los niveles hep´ aticos de glutati´ on en ratas alimentadas con una dieta normal fueron menores que los niveles normales a las 10 horas.

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La diferencia en la recuperaci´ on de los niveles de glutati´ on fue acompa˜ nada con una mayor mortalidad (46 %) en el grupo de ratas que recibieron una dieta normal en comparaci´ on con una mortalidad del 15 % de las ratas que recibieron una dieta suplementada con glutamina. 20

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La administraci´on de cantidades supranormales de glutamina a un ser humano tras la ingesti´ on de una sobredosis de acetaminofeno est´ a asociada con el mantenimiento de la funci´on hep´ atica dentro de los l´ımites normales y la recuperaci´ on del paciente. En un paciente se inici´o un tratamiento con 40 gramos por d´ıa de glutamina 20 horas despu´es de ingerir 32,5 gramos de acetaminofeno (100 c´ apsulas de 325 mg). La glutamina se administr´ o por v´ıa intravenosa, en un total de 100 gramos de amino´ acidos por d´ıa, incluyendo 1 gramo de metionina. La administraci´ on enteral no fue posible debido a la falta de funci´ on del tracto gastrointestinal del paciente. La mayor´ıa de ensayos de la funci´ on hep´ atica estuvieron dentro de los l´ımites normales durante los cuatro d´ıas de la administraci´ on de glutamina y el tratamiento se interrumpi´ o despu´es de cuatro d´ıas en vistas de la recuperaci´on del paciente. Por lo tanto, la administraci´ on de cantidades supranormales de glutamina seg´ un la invenci´ on est´a asociada al mantenimiento de la funci´ on hep´ atica y a la recuperaci´ on de un paciente tras el consumo de una sobredosis potencialmente mortal de acetaminofeno. La administraci´on de glutamina reduce asimismo la toxicidad asociada a otro f´ armaco com´ unmente utilizado, el 5-fluorouracilo (5-fluoro-2,4 (1H,3H)-pirimidindiona, referido como 5FU). El 5FU es un potente agente quimioterap´eutico indicado para el tratamiento del carcinoma de colon, recto, pecho, est´ omago y p´ ancreas. Empezando d´ıas o semanas antes de la administraci´on del 5FU, pueden aumentarse los niveles tisulares de glutati´ on mediante la administraci´on de una cantidad supranormal de glutamina. La administraci´on de glutamina puede asimismo continuarse durante la terapia con 5FU para mantener los niveles de glutati´ on aumentados. En ratas alimentadas con una TPN suplementada con glutamina durante 5 d´ıas antes del tratamiento con 5FU, los niveles de glutati´on hep´ atico y yeyunal eran significativamente superiores a los niveles en ratas alimentadas con una TPN est´andar. El d´ıa 3 el ´ındice de supervivencia de las ratas a las que se les hab´ıa suministrado una TPN est´ andar fue de un 64 %, pero el ´ındice de supervivencia de las ratas a las que se les hab´ıa proporcionado una TPN suplementada con glutamina fue de un 88 %, un aumento significativo sobre el grupo de la TPN est´ andar. Por lo tanto, la administraci´ on de una cantidad supranormal de glutamina puede producir un aumento significativo en los niveles tisulares de glutati´ on y un aumento significativo en la supervivencia, en ratas expuestas a agentes terap´euticos habituales. Adicionalmente, la administraci´ on de una cantidad supranormal de glutamina est´ a asociada a la supervivencia y al mantenimiento de la funci´on hep´ atica normal, en un ser humano tras la ingesti´ on de una dosis potencialmente mortal de una hepatotoxina habitual, el acetaminofeno.

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Los siguientes ejemplos ilustran de forma adicional la capacidad de la administraci´ on de glutamina para aumentar los niveles de glutati´on tisulares y para disminuir la mortalidad asociada a la exposici´on de mam´ıferos a agentes capaces de causar una lesi´ on oxidativa en tejidos. Dichos ejemplos no deben considerarse limitativos en absoluto, sino que son simplemente ilustraciones de varias caracter´ısticas de la presente invenci´on.

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ES 2 133 289 T3 Ejemplo 1

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Ratas Wistar macho (n=69, 202±2 g) sufrieron una cateterizaci´ on venosa yugular y se dispusieron al azar en uno de dos grupos: (1) TPN est´ andar (STD) y (2) TPN suplementada con glutamina (GlutaminaTPN). Todas las dietas TPN fueron isonitr´ ogenadas e isocal´oricas. Al cabo de 5 d´ıas de alimentaci´on, se inyect´o 5FU (150 mg/kg) por v´ıa intraperitoneal. Los animales se sacrificaron de forma seriada a los 0 (l´ınea base, antes del 5FU), 1, 2 y 3 d´ıas despu´es de la administraci´on del 5FU. El tejido se cultiv´ o para determinar el glutati´ on hep´ atico y mucosal yeyunal y la glutamina plasm´ atica. El glutati´ on total se determin´ o mediante el m´etodo de Anderson (Anderson, M.E., “Enzymatic and chemical methods for the determination of glutathione”, en Glutathione; Dolphin et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York, Part A, p´ ags. 339-365 (1989)). Se estudiaron animales adicionales para obtener datos de supervivencia a las 72 horas. Los resultados se presentan como media ± SEM. Los niveles de glutati´on tisular de la l´ınea base fueron similares en ambos grupos (Figura 1). Tras la administraci´on de 5FU, disminuy´ o el glutati´ on hep´ atico hasta por debajo de los niveles normales en animales STD. En contraste, los animales glutamina-TPN fueron capaces de mantener el glutati´on hep´ atico a niveles significativamente superiores a los 2 y 3 d´ıas post-5FU (Figura 1). Result´ o evidente la diferencia significativa de la supervivencia entre grupos en los puntos de tiempo u ´ltimos. El glutati´ on yeyunal tendi´o a seguir un patr´ on similar (Tabla 1).

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La administraci´on de una TPN suplementada con glutamina tuvo como resultado el mantenimiento de unos niveles de glutati´ on hep´ atico y yeyunal mayores que los observados en animales que recibieron una TPN est´ andar. Por lo tanto, la administraci´ on de glutamina aumenta los niveles de glutati´ on tisular y proporciona efectos protectores contra la lesi´on oxidativa. 25

Ejemplo 2

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Despu´es de la cateterizaci´on de una vena yugular, unas ratas Wistar macho (n=97, 201±2 g) se dispusieron al azar en uno de dos grupos: (1) TPN suplementada con glutamina (GLN) y (2) TPN est´andar (STD). Todas las dietas parenterales fueron isonitr´ ogenadas e isocal´oricas. En el 5◦ d´ıa de alimentaci´on, se administr´ o acetaminofeno (400 mg/kg IP) y se sacrificaron los animales a las 0, 1, 6, 10 y 24 horas despu´es de la inyecci´on. Se cultiv´ o el tejido para determinar el glutati´ on hep´ atico y la histolog´ıa del h´ıgado. Se obtuvo plasma para la determinaci´ on de las enzimas hep´ aticas y el glutati´ on (total y oxidado).

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Tal como se muestra en la Tabla 2, los animales que recibieron glutamina ten´ıan unos niveles de glutati´ on hep´ aticos significativamente superiores en comparaci´on con los animales STD tanto a la 6 horas como a las 10 horas tras la administraci´ on de acetaminofeno. A las 24 horas, los animales que recibieron una TPN suplementada con glutamina ten´ıan niveles de enzimas hep´aticos en plasma significativamente inferiores as´ı como una mortalidad inferior en comparaci´on con los animales STD. Los niveles de glutamina en plasma se mantuvieron en los animales suplementados pero descendieron por debajo de lo normal en el grupo STD. Los datos indican que la administraci´ on de una TPN suplementada con glutamina produce como resultado la conservaci´ on de unos niveles de glutati´ on hep´ atico superiores, una protecci´on hep´ atica superior y una mortalidad inferior durante la lesi´ on hep´ atica inducida por acetaminofeno. Los datos indican asimismo que la supervivencia aumentada est´a relacionada con el suplemento de glutamina y el mantenimiento de la s´ıntesis de glutati´ on hep´ atico y que la administraci´on de una dieta suplementada con glutamina aumenta las defensas antioxidantes del hu´esped.

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Ejemplo 3

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Un hombre de 48 a˜ nos fue admitido en la Sala de Urgencias cinco horas despu´es de la ingesti´on de 100 c´apsulas que conten´ıan cada una 325 mg de acetaminofeno, en un intento de suicidio. En la admisi´ on, el nivel de acetaminofeno en suero del paciente era de 224 mg/dl. El paciente consumi´o asimismo una cantidad desconocida de barbit´ uricos y de ibuprofeno. La terapia est´ andar indicada para la sobredosis de acetaminofeno, la administraci´on enteral de N-acetilciste´ına, no era posible para dicho paciente debido a una disfunci´ on gastrointestinal. Doce horas despu´es de la admisi´on, se inici´o la administraci´ on intravenosa de una soluci´ on de dextrosa al 10 % que conten´ıa glutamina y otros amino´ acidos. Durante el curso de cuatro d´ıas, el paciente recibi´o 40 gramos de glutamina y 1 gramo de metionina por d´ıa, en un total de 100 gramos de amino´acidos por 8

ES 2 133 289 T3 d´ıa.

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La mayor´ıa de las pruebas de la funci´ on hep´ atica realizadas estaban dentro de los l´ımites normales durante los cuatro d´ıas de infusi´ on intravenosa de glutamina. Tal como se muestra en la Tabla 3, la bilirrubina total no aument´ o por encima de los niveles normales durante y despu´es del tratamiento con glutamina. El tratamiento se interrumpi´ o despu´es de cuatro d´ıas, momento en que el paciente presentaba una recuperaci´on substancial.

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Aunque la presente invenci´on se ha descrito con respecto a las formas de realizaci´on preferidas, se entiende que puede recurrirse a modificaciones y variaciones sin salirse del esp´ıritu y del alcance de la invenci´on. Dichas modificaciones se consideran dentro de la extensi´on y del alcance de la invenci´ on y de las reivindicaciones anexas. 15

TABLA 1 Grupo

GSH hep´ atica (µmol/g. peso h´ umedo)

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STD (n= 24) GLN-TPN (n= 28)

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GSH yeyunal (µmol/g. peso h´ umedo)

D´ıa 2

D´ıa 3

D´ıa 2

D´ıa 3

6,14 ± 28 6,99 ± 29∗

5,83 ± 42 7,38 ± 37∗

1,91 ± 14 2,09 ± 17

1,96 ± 14 2,27 ± 14

GLN en plasma (µM)

Supervivencia a los 3 d´ıas

671 ± 30 870 ± 47

64 % (21/33) 88 % (29/33)+

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