Tema 12 Química de los aminoácidos y péptidos

Estructura Átomo de carbono α

Cadena lateral

Grupo amino α

Un α-aminoácido Enlaces peptídicos

Una parte de un péptido

Alanina

Serina

Glicina

Los aminoácidos

Cisteina

Valina

Los α-aminoácidos • -NH2 en el carbono próximo al –COOH. • Glicina, NH2-CH2-COOH es el más sencillo. • Con cadena lateral, –R, la molécula es quiral. • La mayoría de los aminoácidos naturales son Laminoácidos, relacionados con el L-(-)gliceraldehido. • La dirección de la rotación óptica, (+) ó (-), debe determinarse experimentalmente.

La estereoquímica de los α-aminoácidos

(S)-alanina L-alanina

(S)-gliceraldehido L-(-)-gliceraldehido

Configuración (S) Un L-aminoácido

Los α-aminoácidos corrientes * 20 α-aminoácidos

* Difieren en la cadena lateral (H ó R, -OH, -SH, -COOH, -NH2) • 10 esenciales: Arginina (Arg), Treonina (Thr), Lisina (Lys), Valina (Val), Fenilalanina (Phe), Triptófano (Trp), Metionina (Met), Histidina (His), Leucina (Leu), Isoleucina (Ile) * Proteinas completas: aportan todos los aminoácidos esenciales, ej. Carne, pescado, leche y huevos.

Nomenclatura: Se nombran con tres letras ó con una sola letra relacionada con el nombre en inglés.

Aminoácidos raros • 4-Hidroxiprolina, 5-hidroxilisina del colágeno.

• El ácido D-glutámico de las paredes celulares de las bacterias. • La D-serina de los gusanos de tierra. • El ácido γ-aminobutírico, un neurotransmisor. • β-Alanina, constituyente del ácido pantoténico (vitamina B5)

Vitamina B5

Zwitteriones • Los

aminoácidos existen como iones dipolares.

• -COOH pierde H+, -NH2 gana H+ • La estructura real depende del pH

Estructura sin cargas

Ión dipolar ó zwitterión

(minoritario)

(mayoritario)

Propiedades de los aminoácidos • Altos puntos de fusión, > 200 ºC. • Más solubles en agua que en éter. • Mayores momentos dipolares que los ácidos ó que las aminas (μ=14D, vs 1,7 ó 1,4D). • Más ácidos que la mayoría de los ácidos carboxílicos y menos básicos que la mayoría de las aminas. pKa = 2-3 pKb = 4-5

Punto isoeléctrico • pH al que los aminoácidos existen como zwitterión

(neutros). • Depende de la estructura y de la cadena lateral. • Aminoácidos ácidos: pH isoeléctrico ~ 3. • Aminoácidos neutros: pH isoeléctrico ~ 5-6. • Aminoácidos básicos: pH isoeléctrico ~ 9.

Tabla 12-1.- Puntos isoeléctricos

~ 5-6

Tabla 12-1 (continuación)

Neutros: ~ 5-6

Ácidos: ~ 3

Básicos: ~ 7-11

Aminación reductiva • Es un proceso biomimético –imita los procesos biológicos-. • Un α-cetoácido reacciona con amoniaco; luego la imina se reduce con H2/Pd. • Se obtiene una mezcla racémica. O R C COOH

NH3

N H

_

R C COO NH4

+

H2 Pd

NH2 R C COO H

_

Síntesis vía ácidos α-halogenados • La reacción de Hell-Volhard-Zelinsky introduce Br en el carbono α de un ácido carboxílico. • El bromo es luego sustituido por reacción con amoníaco. • Se obtiene una mezcla racémica. PhCH2

CH2

COOH

1) Br2/PBr3 2) H2O

Br PhCH2

CH

COOH

Exceso NH3 excess

SN2

NH2 PhCH2

CH

_ + COO NH4

La síntesis de Gabriel – éster malónico •El grupo amino está protegido como imida. •El grupo carboxílico está protegido como éster. La posición α está activada por un grupo éster adicional y temporal.

Éster N-ftalimidomalónico

Alquilado

Hidrolizado

α-aminoácido

Síntesis de Strecker Paso 1: formación de la imina (química del carbonilo)

Aldehido

Imina

Paso 2: adición de cianhídrico

Imina

α-amino-nitrilo

Hidrólisis posterior del α-amino-nitrilo produce el aminoácido.

Resolución de aminoácidos. • Normalmente,

sólo el enantiómero L (S) es biológicamente activo.

• Convirtiendo el aminoácido en una sal, usando un ácido ó una base quiral produce una mezcla de sales diastereoisoméricas que pueden separarse por cromatografía.

Resolución de aminoácidos 1) Acetilar 2) Tratar con una acilasa, que reacciona sólo con un enantiómero. 3) Separar el aminoácido libre (L) del acetilado (D).

Acilasa

L-aminoácido

D-aminoácido Aminoácido racémico

L desacetilado

D acetilado Acetilado

Mezcla fácil de separar

Esterificación

Aminoácido

Alcohol

Aminoéster

• Se usa un fuerte exceso del alcohol y un catalizador ácido. • Los ésteres se usan como derivados protectores. • Por hidrólisis acuosa se recupera el aminoácido.

Acilación

Aminoácido

Agente acilante

Aminoácido acilado

• El grupo amino se convierte en amida. • Los agentes acilantes son los cloruros y anhídricos de ácido. • Debido a lo fácil que es de eliminar (H2, Pd), se usa el cloroformiato de bencilo, PhCH2OCOCl.

La reacción con la ninhidrina • Se utiliza para visualizar los aminoácidos separados

por cromatografía ó electroforesis. • Se forma un color purpúreo con trazas de cualquier aminoácido.

Piridina

Aminoácido

Ninhidrina

Púrpura de Ruhemann

El enlace peptídico Enlace peptídico

• Es una amida.

• Las amidas son muy estables y neutras.

Plano de la amida

Formación del enlace peptídico Enlace peptídico -H2O

• El grupo amino de una molécula se condensa con el grupo ácido de otra. • Los polipéptidos tienen pesos moleculares inferiores a 5000. • El peso molecular de las proteinas es de 6000-40,000,000.

Oligopéptidos • Cuatro a diez aminoácidos. • Sus estructuras se dibujan con el extremo N-terminal a la izquierda. • Se nombran de izquierda a derecha: Arg-Pro-Pro-Arg (Arginil-prolil-prolil-arginina)

Polipéptidos • Once a ochenta aminoácidos. • Sus estructuras se dibujan con el extremo N-terminal a la izquierda. • Sustancia P: transmisor de impulsos dolorosos: Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Glu-Phe-Phe-Gly-LeoMet-NH2 (Arginil-prolil- …..metionilamida)

Puentes disulfuro

Cadena peptídica

Oxidante [O]

Reductor [H]

Cadena peptídica

Dos unidades de cisteina

Puente disulfuro (cistina)

Oxitocina humana * Hormona que induce el parto * Nonapéptido.

Terminación N

Terminación C (amida)

Puente disulfuro (cistina)

Terminación N

Terminación C (amida)

Insulina bovina •Regula el metabolismo de la glucosa. • Cadena A: 21 aminoácidos. • Cadena B: 30 aminoácidos. Terminación N

Cadena A

Terminación C

Cadena B Terminación N

Terminación C

Determinación de la estructura de los péptidos * Romper los puentes disulfuro

* Determinar la composición de aminoácidos. * Secuenciar desde el aminoácido Nterminal. * Identificar el aminoácido C-terminal. * Hidrólisis parcial (enzimas).

Rompiendo los puentes disulfuro

Ácido cisteico

Ácido cisteico

Analizando los aminoácidos Disolución tampón

Hidrolizado Resina de cambio iónico

Disolución De ninhidrina

• Purificar la cadena peptídica • Hervir con HCl 6M (24 horas) • Separar en un analizador de aminoácidos.

Los aminoácidos se mueven a diferentes velocidades A b s or b a n ci a

Luz

Tiempo

Fotocélula Cromatograma Sumidero

Secuenciando desde el aminoácido N-terminal

* Degradación de Edman: reacción con isotiocianato de fenilo (Ph-N=C=S) seguido de hidrólisis separa el aminoácido N-terminal. El derivado de feniltiohidantoina se identifica por cromatografía. Aplicar a péptidos < 30 aminoácidos. * Método de Sanger: Utiliza como reactivo el 2,4dinitrofluorobenceno. Tras la hidrólisis se identifica el aminoácido terminal, marcado por el grupo 2,4dinitrofenilo.

Identificando el aminoácido N-terminal Método de Sanger Péptido

Péptido 2,4-Dinitrofluorobenceno (reactivo de Sanger)

HCl 6M, calor Péptido

Derivado

Aminoácidos

Derivado 2,4-Dinitrofenílico

Secuenciando desde el aminoácido C-terminal. • El

enzima carboxipeptidasa rompe el enlace peptídico del aminoácido C-terminal.

Carboxipeptidasa

Péptido

Péptido

Nuevo aminoácido a liberar

Aminoácido libre

Hidrolizando parcialmente • Se

rompe la cadena peptídica en pequeños fragmentos. • Tripsina: rompe por el grupo carboxílico de lisina (Lys) y arginina (Arg). • Quimotripsina: rompe en el grupo carboxílico de fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr) y triptófano (Trp). • Después de secuenciar cada fragmento, se unen como quien reconstruye un puzzle.

Síntesis de péptidos en fase sólida • La

cadena se construye desde el aminoácido C-terminal hasta el N-terminal.

• Los intermedios no tienen que ser purificados. • Los reactivos de exceso se lavan con un disolvente adecuado. • El procedimiento puede ser automatizado. • Pueden prepararse péptidos grandes.

Síntesis de péptidos en fase sólida • La resina de Merrifield (con terminaciones de cloruro de bencilo) se introduce en una columna. • El aminoácido C-terminal se ancla a la resina, protegido por el grupo t-butil-oxi-carbonilo (BOC). Unión del aminoácido C-terminal Grupo protector

Grupo protector

Resina

Resina

Síntesis de péptidos en fase sólida • El grupo BOC se elimina con CF3COOH. •La cadena peptídica se construye introduciendo los aminoácidos secuencialmente y formando los enlaces peptídicos. • Con HF se suelta el péptido final ya construido. Separación del péptido elaborado

Péptido

Péptido

Resina

Resina

Síntesis de péptidos en fase sólida * Los enlaces peptídicos se forman catalizados por la

N,N´-diciclohexilcarbodiimida (DCC).

Ácido

Amida

Amina

N,N´-diciclohexilcarbodiimida (DCC)

N,N´-diciclohexil-urea (DCU)

Formación de un acil derivado activado

Activado

Formación de la amida y pérdida de DCU

Amida

DCU

Estructura de las proteinas • Primaria:

secuencia de aminoácidos y puentes disulfuro. • Secundaria: estructura formada por los puentes de hidrógeno. Ejemplos: hélice-α y la lámina plegada. • Terciaria: la conformación 3-D completa. • Cuaternaria: asociación de dos o más cadenas peptídicas para formar la proteina.

La hélice-α Los puentes de hidrógeno se dan dentro de la cadena

C = gris N = azul O = rojo R = verde

La lámina plegada Los puentes de hidrógeno son intercadenas

Proteina globular: estructura terciaria * Se mezclan segmentos de hélice-α con segmentos de enrollamiento al azar en los puntos donde se dobla la hélice. Enrollamiento al azar

Terminación C

Hélice α

Terminación N

Estructura secundaria Estructura primaria

Estructura terciaria

Estructura cuaternaria