UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

ESTABLECIMIENTO Y USO DE LA TÉCNICA DE DIGESTIBILIDAD IN VITRO PARA EVALUAR NUTRICIONALMENTE MAÍZ FORRAJERO TRABAJO RECEPCIONAL EN LA MODALIDAD DE:

T E S I S COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL TITULO DE:

MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA P R E S E N T A :

Mercedes Mojica Mier A S E S O R E S :

MC. MARIBEL MONTERO LAGUNES DR. JOSÉ MANUEL MARTINEZ HERNÁNDEZ

H. VERACRUZ, VER.

FEBRERO 2010

INDICE GENERAL PÁGINA 1. Introducción 2. Antecedentes 2.1. Técnica in vivo. 2.2. Técnica in situ. 2.3. Técnica de producción de gas. 2.4. Técnica in vitro. 2.5. Importancia del animal canulado 2.6. Maíz forrajero. 3. Justificación 4. Hipótesis 5. Objetivos 5.1. Objetivo general 5.2. Objetivo específico 6. Material y métodos 6.1. Fase 1. Fistulación ruminal del animal bovino y colocación de la cánula ruminal. 6.1.1. Cuidados Preoperatorios. 6.1.2. Material. 6.1.3. Cirugía. 6.1.4. Cuidados posoperatorios. 6.2. Fase 2. Establecimiento de la técnica de digestibilidad in vitro con el equipo DaisyII de Ankom. 6.2.1. Equipo. 6.2.2. Preparación de soluciones digestoras. 6.2.3. Preparación de las bolsas filtro y muestra. 6.2.4. Preparación de la solución tampón. 6.2.5. Preparación del inoculo e incubación. 6.2.6. Procedimiento de operación del equipo DaisyII 6.2.7. Técnica de Fibra Detergente Neutro en bolsa filtro. 6.2.8. Material 6.2.9. Procedimiento de operación.

 

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6.2.10. Manejo de las muestras para pesaje final. 6.2.11. Cálculos. 6.3. Fase 3. Validación de la técnica de digestibilidad in vitro con muestras de planta completa de maíz forrajero del Campo Experimental Agrícola “Cotaxtla” Ver., del INIFAP.

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6.4. Fase 4. Determinación de la digestibilidad in vitro de planta com-

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pleta, grano y rastrojo de híbridos y variedades de maíz forrajero del Campo Experimental Agrícola “Iguala” Gro., del INIFAP., y de de planta completa de maíz del Campo Experimental Agrícola “Cotaxtla” Ver., del INIFAP. 6.5. Fase 5. Curso práctico de capacitación a investigadores del INIFAP. 7. Resultados y discusión 7.1. Fase 3. Validación de la técnica de digestibilidad in vitro con muestras de planta completa de maíz forrajero del Campo Experimental Agrícola “Cotaxtla” Ver., del INIFAP. 7.2. Fase 4. Determinación de la digestibilidad in vitro de planta completa, grano y rastrojo de híbridos y variedades de maíz forrajero del Campo Experimental Agrícola “Iguala” Gro., del INIFAP., y de planta completa de maíz del Campo Experimental Agrícola “Cotaxtla” Ver., del INIFAP. 7.2.1. Digestibilidad in vitro de Maíces de Cotaxtla. 7.2.2. Digestibilidad in vitro de Maíces de Iguala 7.2.3. Comparación de Digestibilidad in vitro de maíces de Cotaxtla vs Iguala 8. Conclusión 9. Literatura citada

 

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INDICE DE CUADROS PÁGINA Cuadro 1. Porcentaje de digestibilidad in vitro de híbridos y variedades de maíz forrajero (Planta completa) procedente del municipio de Cotaxtla, Ver. Cuadro 2. Porcentaje de digestibilidad in vitro de cada genotipo de híbridos y variedades de maíz forrajero (Planta completa) del municipio de Cotaxtla, Veracruz.

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Cuadro 3. Porcentaje de digestibilidad in vitro de grano, planta completa, y rastrojo cultivado en el municipio de Iguala, Gro.

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Cuadro 4. Porcentajes de digestibilidad in vitro de grano, planta completa y rastrojo de maíz forrajero de híbridos y variedades cultivados en el municipio de Iguala, Gro.

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Cuadro 5. Porcentaje de digestibilidad in vitro de genotipos de los híbridos y variedades de grano, planta completa y rastrojo de maíz cultivados en el municipio de Iguala, Gro.

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Cuadro 6. Porcentaje de digestibilidades in vitro de híbridos y variedades de maíz forrajero cultivadas en Cotaxtla e Iguala.

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Cuadro 7. Porcentaje de digestibilidad in vitro de híbridos y variedades de maíz forrajero por lugar de procedencia y grupo genético.

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Cuadro 8. Porcentaje de digestibilidad in vitro de híbridos y variedades de maíz forrajero cultivado en los municipios Cotaxtla, Veracruz vs Iguala, Gro.

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Cuadro 9. Porcentaje de digestibilidad in vitro de los genotipos de híbridos y variedades de maíz forrajero cultivado en el municipio de Cotaxtla, Ver., e Iguala, Gro.

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INDICE DE FIGURAS PÁGINA Foto 1: Bloqueo de nervios entre las apófisis transversas de las vertebras lumbares. Foto 2: Incisión de piel en la región del ijar izquierdo. Foto 3: Disección de músculos abdominales. Foto 4: Corte del peritoneo. Foto 5: Rumen exteriorizado. Foto 6: Rumen fijado en los extremos. Foto 7: Incisión de rumen. Foto 8: Fijación de rumen a la dermis. Foto 9: Mucosa ruminal adherida a la dermis. Foto 10: Rondana exterior colocada. Foto 11: Colocación del tapón de la cánula ruminal. Foto 12: Vaca fistulizada con cánula ruminal en posición final. Foto 13: Reactivos de la solución “A”. Foto 14: Reactivo de la solución “B”. Foto 15: Pesaje de los reactivos para la solución “A”. Foto 16: Trituración del reactivo 7 de la solución “B”. Foto 17: Colocando 1000 ml de agua destilada a un matraz identificado. Foto 18: Platina de agitación con control de temperatura. Foto 19: Bolsa filtro de nylon. Foto 20: Bolsas sumergidas en acetona. Foto 21: Peso de la bolsa filtro. Foto 22: Muestras de maíz a procesar. Foto 23: Muestras con peso registrado. Foto 24: Sellador modelo 1915/1920. Foto 25: Calentamiento de Soluciones “A” y “B” antes de mezclarlas. Foto 26: Mezclas en las jarra de la solución “A” y “B”. Foto 27: Muestras en las jarras digestoras en la solucione buffer. Foto 28: Jarras digestoras en la incubadora Daisy. Foto 29: Jarras térmicas. Foto 30: Recolección de líquido ruminal. Foto 31: Equipo distribuidor de CO2. Foto 32: CO2 en la licuadora. Foto 33: Vaciando líquido ruminal al vaso de la licuadora. Foto 34: Filtrando la mezcla licuada del inoculo ruminal con capas de gasas. Foto 35: Medición de líquido ruminal. Foto 36: liquido ruminal en jarras digestoras. Foto 37: Colocando jarras a incubar 48 horas.  

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Foto 38: Enjuagado las muestras digeridas. Foto 39: Inicio del ciclo. Foto 40: Fin del ciclo. Foto 41: Muestra congelada. Foto 42: Muestra en descongelándose. Foto 43: Eliminación del excedente de agua. Foto 44: Colocación de las muestras en las charolas del Ankon200. Foto 45: Introducción del contenedor de las charolas al Ankon200. Foto 46: Colocación de la pesa. Foto 47: Enjuagado con FND. Foto 48: Secado de muestras. Foto 49: Acetona para lavado. Foto 50: Muestras en reposo para evaporar la acetona. Foto 51: Muestras listas para entrar a la estufa de 100°C. Foto 52: Muestras en la estufa de secado por cuatro horas. Foto 53: Equipo Ankon200 analizador de fibra. Foto 54: Encender la Balanza. Foto 55: Desecadoras. Foto 56: Registro del peso final de la bolsita. Foto 57: Muestras pesadas. Foto 58: Curso de capacitación (Laboratorio). Foto 59: Curso de capacitación (Corrales). Foto 60: Curso de capacitación (Asistentes).

 

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DEDICATORIA

A lo largo de mi vida he comprendido que el hombre que se dedica a la sabiduría y medita sobre los cambios discurre con su inteligencia. La sabiduría hace honor a su nombre y cuando somos necios no la obtenemos. He buscado la instrucción desde la niñez para llegar a estos momentos que tan solo son un escalón más. Debo seguir cultivándome como el que ara y siembra, y cosechare generosos frutos, al tratar de cultivarme he trabajado y hoy, estoy cosechando los primeros productos. A la largo de mi vida hubo momentos difíciles por lo que sentía una carga que me oprimía y trate como muchos de abandonarla y quitarla pronto de encima pero, los deseos de cumplir mi meta me hacían retomar fuerzas para soportarla y seguir mi camino dejando atrás los obstáculos, lo cual me ayudó a madurar y valorar. Por ello hoy, disfruto de estos momentos en los que finalizo una de mis grandes metas, la cual he logrado con ayuda de mi familia. Doy gracias a mis padres por ayudarme en todas las etapas de mi vida y por haber depositado su confianza en mí, a mis hermanas, ya que siempre me apoyaron y me alentaron en los momentos difíciles. Gracias a Dios por concederme sabiduría y paciencia para poder llegar a este momento tan especial de mi vida.

 

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AGRADECIMIENTOS

A la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Veracruzana por brindarme una formación profesional, que me ayudara a desenvolverme en mi vida profesional. Me siento orgullosa de mi alma mater. Al Instituto Nacional de Investigadores Forestales, Agrícolas y Pecuarios. y la MC. Maribel Montero Lagunes por permitirme realizar este trabajo con muestras del proyecto a nivel nacional “Mejoramiento genético de maíz forrajero para su uso en la alimentación del ganado bovino”. Al Laboratorio de Nutrición Animal, de la Unidad de Diagnóstico de la Posta Zootécnica Torreón del Molino de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Veracruzana. Al PhD. Francisco I. Juárez Lagunes por asesorarme y brindarme su apoyo y colaboración en el transcurso de este trabajo, lo cual fue decisivo para culminarlo magistralmente. Al Dr. José Manuel Martínez Hernández por dedicarme su tiempo y amistad así como asesoría incondicional en el todo el tiempo que estuve en el “Torreón del Molino”. Al PhD. Eduardo Canudas Lara por brindarme acertadas sugerencias en la revisión de mi trabajo recepcional.

 

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RESUMEN MERCEDES MOJICA MIER. 2010. Establecimiento y uso de la técnica de digestibilidad In vitro para evaluar nutricionalmente maíz forrajero.Tesis de Licenciatura. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Veracruzana. Veracruz, Ver. México. El objetivo fue establecer la técnica de digestibilidad In Vitro utilizando el equipo Daisy de la compañía Ankom en el laboratorio de nutrición animal de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UV, para determinar los valores de digestibilidad in vitro de variedades e híbridos de maíz forrajero cultivados en clima tropical. El estudio comprendió 5 fases: Fase 1. Fistulación ruminal del animal bovino y colocación de la cánula ruminal. Fase 2. Establecimiento de la técnica de digestibilidad in vitro con el equipo Daisy de Ankom. Fase 3. Validación de la técnica de digestibilidad in vitro con muestras de planta completa de maíz forrajero del Campo Experimental Agrícola “Cotaxtla” Ver., del INIFAP. Fase 4. Determinación de la digestibilidad in vitro de planta completa, grano y rastrojo de híbridos y variedades de maíz forrajero del Campo Experimental Agrícola “Iguala” Gro., del INIFAP. Fase 5. Curso práctico de capacitación a investigadores del INIFAP. El promedio general de digestibilidad in vitro para planta completa de maíz fue de 63.19%. La validación de la técnica mostró una desviación estándar de 2.63 unidades de digestibilidad. Para un coeficiente de variación de 4.16%. Los híbridos son mas digestibles (P≤0.05) que las variedades 65.0 vs 63.1 % respectivamente. El grano tuvo digestibilidad de 93.26%, la planta completa de 64.15%, y el rastrojo de 57.71%. Siendo estas diferentes entre sí (P≤0.01). La localidad Cotaxtla (trópico subhúmedo) y la localidad Iguala (trópico seco) no tuvieron efecto sobre la digestibilidad de los diferentes genotipos de maíces forrajeros (63.7 vs 64.3%). Se concluye que el método Ankom es confiable para medir digestibilidad verdadera in vitro, y que hay diferencias en las digestibilidades de híbridos y variedades de maíz forrajero en el trópico.

 

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1. INTRODUCCIÓN Existe una gran demanda por forrajes de buena calidad en el sector de la ganadería. La palabra forraje se define como materia vegetal en estado fresco o preservado (seco o ensilaje) que se proporciona como alimento a los animales. Alimentar el hato con forraje de buena calidad es importante para obtener una buena producción y promover y mantener la buena salud, tanto en el ganado de carne como el ganado lechero. Algunos de los principales criterios de la calidad en el forraje, son el contenido de fibra y la digestibilidad. De la porción fibrosa del forraje, al ser consumida por los rumiantes, se pierde parte de la energía al liberarse ésta en forma de metano (gas combustible) y en forma de calor producido por el propio animal. La calidad del forraje se estima primeramente por el consumo voluntario y la digestibilidad de la fibra que contiene; A menor digestibilidad del forraje, menor es su calidad, y menor es su consumo voluntario. Por último, la calidad del forraje se describe en términos de producción de leche o carne. Desde el punto de vista de la alimentación, la productividad de un animal depende de la cantidad diaria de nutrimentos que consuma; esto se relaciona estrechamente con la digestibilidad del alimento y del consumo voluntario. Se ha medido la digestibilidad de los pastos; pero este valor cambia de acuerdo al medio ambiente y al manejo. La digestibilidad también varía de acuerdo al animal y a su estado fisiológico por consiguiente la digestibilidad de un pasto es dinámica y no es fácil de medir. En los últimos años la forma de evaluaciones de los forrajes ha ido evolucionando. Pocos laboratorios de análisis de forrajes han comenzado a evaluar los forrajes por la digestibilidad de su fibra detergente neutro (FDN). Esta

 

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evaluación de forraje basada en la digestibilidad de la FDN está siendo realizada para ayudar a predecir la digestibilidad total del forraje (Hoffman, et al., 2007). Desde hace varios años se han realizado investigaciones de digestibilidad in situ para pastos y diversos forrajes, esto es, trabajando directamente con el rumen. Actualmente, aunado al proceso in situ, se utiliza la técnica in vitro con diversas ventajas de ésta última por la cantidad de muestras a procesar por unidad de tiempo, tamaño de muestra a evaluar y origen del alimento para analizar. Por otra parte, hay que considerar que esta técnica puede estar sujeta a variaciones en diversas etapas del proceso y aún, en la evaluación estadística de los propios resultados (Pinos, et al., 2002). El maíz forrajero es el forraje ideal para utilizarse en la alimentación de bovinos. Es indispensable en los sistemas intensivos de producción de leche y de carne. Sin embargo, en condiciones tropicales no es común su uso. El potencial de producción de leche y carne en los trópicos se incrementaría sustancialmente con el uso del maíz forrajero, pero se desconoce que variedades o híbridos de maíz pudieran ser mas aptos desde el punto vista de valor nutritivo, y en particular de la digestibilidad de sus nutrimentos para bovinos. Por lo tanto el objetivo de este estudio fue establecer la técnica de digestibilidad in vitro con el incubador Daisyll y el analizador de fibra Ankon200 en el Laboratorio de Nutrición Animal, de la Unidad de Diagnóstico de la Posta Zootécnica Torreón del Molino de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Veracruzana, probando dicha técnica con muestras de grano, planta completa, y rastrojo de híbridos y variedades de maíz cultivados en los municipios de Iguala, Guerrero y Cotaxtla, Veracruz.

 

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2. ANTECEDENTES La mejor evaluación de calidad de los alimentos surge de la respuesta que es posible obtener con ellos. La repuesta productiva de los animales con forrajes esta determinada por el nivel de consumo (50-70% de impacto) la digestibilidad (2550%) y por la eficiencia de utilización (5-15%) (Mertens, 2000). La digestibilidad es una medición de uso común para determinar el grado de aprovechamiento de un alimento por el animal. Es un parámetro clave porque todos los sistemas de energía la utilizan como base y esta variable esta muy relacionada con la cantidad y calidad de los componentes de la pared celular (Zimmer, 1990). Existen diferentes métodos para medir digestibilidad, entre ellos se encuentra el propuesto por Van Soest (1966) en el cual, el alimento a evaluar es sometido a una fase de fermentación anaeróbica utilizando líquido ruminal de un animal fistulado y posteriormente, se determina el contenido de paredes celulares. Con esto se puede conocer exactamente la fracción no digerida por los microorganismos del rumen y por diferencia de la materia seca de la muestra inicial, puede conocerse el contenido de materia seca digerida, lo cual da por resultado el valor de la digestibilidad verdadera. Los laboratorios que brindan servicios de evaluación de alimentos usualmente estiman los parámetros nutricionales empleando las siguientes técnicas: in situ e in vitro (Wawrzkiewicz, 2009) pero existen diferentes maneras de determinar la digestibilidad de un forraje u otro tipo de alimento, entre ellas están los métodos in vivo, in situ e in vitro (Estremera, 2003).

 

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Técnica in vivo. Como técnica in vivo se puede determinar la digestibilidad de ciertas sustancias y fracciones del alimento como celulosa, materia orgánica, materia seca. Este método es ampliamente empleado para el estudio de la calidad y suele ser utilizado como el sistema patrón o de referencia con respecto a otros sistemas. Este consiste en medir directamente con el animal el efecto de la digestión en el pasto. Las pruebas que utilizan animales para la determinación del valor nutritivo de un alimento son probablemente las más idóneas ya que evalúan factores atribuibles tanto al animal como al alimento mismo. Este procedimiento requiere de instalaciones, personal entrenado y desafortunadamente es lento en su conducción además de tener un costo elevado. Por esta razón se han desarrollado otros tipos de técnicas para medir el valor nutritivo de los alimentos en una forma menos costosa y más rápida. (Contreras, 2001).

Técnica in situ. Con esta técnica, además de medir la digestibilidad propiamente dicha, se puede estudiar la extensión y velocidad de la digestión, efectos de la dieta y de la suplementación, entre otros aspectos. A pesar de lo antes señalado este método tiene varias fuentes de error. Entre ellos tenemos; la dieta del animal, tamaño, tipo y diámetro de la bolsa, tamaño y peso de la muestra, número de muestras, forma de la suspensión y tiempo de permanencia de la bolsa en el rumen, así como su modo de extracción. Todo esto hace que su estandarización sea laboriosa y que sin un adecuado trabajo sistémico la variación en los resultados sea grande. No obstante esta variante, es muy útil, sobre todo en aquellos casos en que la cantidad de muestra analizada es numerosa, como es el caso de los programas de mejora genética de pastos (Burton, 1970).  

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La técnica in situ o también llamada de la bolsita de nylon (Orskon et al., 1980), permite estudiar la cinética de desaparición del alimento en el rumen de animales fistulados. El alimento se coloca dentro de bolsitas de nylon cerradas y luego en el rumen de los animales, el retiro de distintas bolsitas a lo largo del tiempo permite medir la cantidad de material que ha desaparecido. La fracción del alimento que no se recupera dentro de las bolsitas se asume que ha sido degradado, de este se construye la curva de desaparición. Esta metodología representó un adelanto muy importante dentro del campo de la nutrición de rumiantes, debido a que permite el estudio de la cinética de degradación. Esta técnica ha mostrado un buen grado de asociación con el consumo y la digestibilidad para alimentos como forrajes frescos y henos (Orskon, 2000). En el caso de ensilajes y de maíz principalmente, es necesario realizar algunas modificaciones a la técnica (ej. Incubar material fresco y picado en reemplazo de seco y molido) para garantizar la veracidad de los resultados obtenidos. La necesidad de animales canulados, la limitación en el número de muestras a procesar por animal canulado, y los costos asociados son las principales razones por las que esta técnica sólo se emplea en centros de investigación y no resulta rentable para laboratorios de servicios.

Técnica de producción de gas: La técnica de producción de gas asume que el gas medido es consecuencia de la degradación de la muestra de alimento. Por lo tanto al medir la cantidad de gas producido durante la incubación, se asume que la degradación de la materia seca del alimento evoluciona de modo similar. Numerosas investigaciones encuentran aceptables predicciones de la DMS y del  

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consumo a través de información obtenida con la técnica de producción de gas para diversos tipos de alimento. Esta técnica tiene una amplia difusión en el área de la investigación en todo el mundo, pero no es utilizada en laboratorios comerciales, sin embargo existen trabajos que muestran su potencial empleo para estimar tanto DMS a nivel de mantenimiento y producción como el consumo voluntario del alimento. Hasta el momento la técnica de producción de gas ha demostrado ser la más promisoria (Wawrzkiewicz, 2009).

Técnica in vitro. Como su nombre lo indica, el método in vitro consiste en reproducir en cristal o en condiciones de laboratorios lo que sucede en el organismo animal mediante una reproducción, lo más fiel posible, de las condiciones y formas en que sucede lo que se desea conocer. Considerando esta situación, se recomienda que esta técnica sea utilizada para predecir el valor nutritivo de alimentos vegetales, especialmente forrajes, así como para estudiar factores que afecta la digestibilidad de los mismos (Castellanos el at., 1990). Esta técnica se sugiere para determinar la digestibilidad verdadera de la materia seca y orgánica de los forrajes, este proceso de laboratorio es útil para procesar gran cantidad de muestra. Por otro lado, el mayor factor determinante de la digestibilidad de alimentos para rumiantes es la fermentación de las paredes celulares por los microorganismos del rumen, y en el proceso in vitro obtenemos una respuesta fisiológico-químico que se asemeja parcialmente a lo que ocurre en el animal. Los métodos utilizados para determinar digestibilidad in vitro comprenden dos fases: a).- La fase bacteriana o celulítica (digestión por 48 horas)  

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y b).- La fase enzimática o de extracción con solución neutro detergente (Lavado por 60 min). Ambas tienen por lo menos dos puntos en común: 1.- La utilización de la misma muestra; 2.- El uso de una solución amortiguadora (Telley y Terry, 1963; Van Soest et al., 1966). La digestibilidad in vitro se basa en la primera etapa en una fermentación en un sistema cerrado, es decir, los productos de la fermentación no son removidos. La fermentación es producida por microorganismos añadidos con el líquido ruminal utilizado como inóculo. Sin embargo, la fermentación en estas condiciones no refleja de ninguna manera lo que realmente sucede en el rumen, ya que éste es un sistema abierto con condiciones muy especiales y por lo tanto, es incorrecto el término “rumen artificial” para describir esta técnica. En la siguiente etapa de esta técnica se lleva a cabo una segunda digestión con solución fibra detergente neutro (FDN), que tiene como objetivo eliminar la contaminación microbiana existente dejando únicamente la materia seca no digerida. Es importante señalar que la digestibilidad in vitro de la materia seca (DIVMS) no considera la digestión intestinal y aún más importante en este método no se toma en cuenta la excreción endógena producida en el animal. Sin embargo, este sistema está sujeto a toda una serie de variaciones que pueden alterar el verdadero resultado del análisis como son: a).- La concentración y cantidad de inóculo, b).- Dieta del animal donador, c).- condiciones y tiempo de incubación, d).- temperatura. e).-pH y anaerobiosis y f).- Peso y tamaño de la muestra. (Por ejemplo, debido a la alta proporción de alimentos concentrados en la ración de los animales donantes de liquido ruminal puede verse afectado negativamente, este hecho podría ser atribuido al menor número de algunos  

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microorganismos celulolíticos en el inóculo ruminal procedente de estos animales, como consecuencia del descenso del pH ruminal ocasionado por el consumo de altas cantidades de concentrado (Brochi-Brum, 1998). Por estas razones tiene que hacerse un estricto control de todos los factores que intervienen en esta técnica con el objetivo de obtener resultados confiables. El animal con fístula ruminal y canulado debe ser adulto, con una dieta controlada dependiendo el tipo de muestra que se desea evaluar, así reducimos factores negativos que pueden variar los resultados estadísticos. La técnica in vitro intenta simular el proceso de digestión que ocurre en el rumen donde se lleva a cabo la mayor parte de la degradación de los alimentos fibrosos (forraje fresco y conservado). Los sistemas modernos como el Daisyll y Ankon200 se utilizan como método alternativo para calcular la degradación del alimento en el rumen en condiciones de laboratorio (Ceballos et al., 2008). El método se basa en la incubación de la muestra contenida en una bolsa de nylon (Huhtanen et al., 2008) en frascos de incubación con capacidad de 25 muestras que se encuentran a 39°C y en agitación permanente en el incubador Daisyll. El Analizador de Fibra Ankon200 permite remover restos microbianos y algunos remanentes de fracción solubles para así finalmente obtener resultados en términos de digestibilidad verdadera in vitro de la materia seca (DVIVMS) lo que se considera como estimados de la digestibilidad real de los alimentos. Cuando los resultados se expresan en términos de digestibilidad aparente in vitro de la materia seca (DAIVMS) este paso en solución detergente neutro se omite (Giraldo et al., 2007). Mediante este sistema, las predicciones de la DIVMS tanto aparente como verdadera son relativamente precisas (Julier et al., 1999); y Vogel et al., 1999).  

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Mould y Nordheim, (1998). Adaptaron esta técnica para estimar la tasa de degradación del alimento ya que permite retirar las bolsas a diferentes tiempos de incubación. La mayor desventaja de esta técnica, así como la de la degradabilidad in situ, es la potencial perdida de partículas del alimento sin que estas hayan sido solubilizadas o degradadas. Sin embargo, representa una herramienta práctica y rápida para la evaluación de alimentos in vitro porque permite obtener tanto las tasas de digestión como la extensión de la misma. En nuestro país son escasos los laboratorios que cuentan con este equipo para brindar análisis a escala comercial.

Importancia del animal canulado. El uso de cánulas ruminales flexibles para realizar estudios en nutrición facilita la obtención de pequeñas muestras de contenido ruminal, y al mismo tiempo permite hacer infusiones directas en el rumen del animal. En el caso de investigaciones donde se requiere evaluar la dieta del animal mediante vaciados ruminales, digestibilidad in situ (con bolsas de nylon) o mediciones de la fracción liquida y solida de la ingesta, es recomendable utilizar una cánula de mayor diámetro que permita el acceso al rumen. La implantación de cánula ruminales en bovinos y ovinos es una de las técnicas quirúrgicas mas empleadas en la investigación en nutrición animal. El uso de animales canulados en el rumen, su empleo es apropiado en experimentos tendientes a conocer los fenómenos de digestibilidad in situ e in vitro. La principal ventaja de usar esta técnica radica en la rapidez con que se puede intervenir varios animales en un día (Hecker, 1969).

 

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Importancia del maíz. El maíz, Zea mays, se emplea en la alimentación humana y del ganado, y en la obtención de productos industriales; en la zona tropical su utilización es baja con relación a su impacto potencial para la intensificación de los sistemas de producción bovina; se considera como la principal fuente de energía para el ganado; se produce a menor costo porque se puede cosechar rápido. El maíz híbrido que produce gran cantidad de grano, buenas hojas y tallos, se prefiere para el ensilaje (Checa, 1998). La técnica de digestibilidad in vitro se validó con maíz forrajero ya que este cultivo representa una de las principales actividades productivas desarrolladas en Veracruz, tanto por productores como por empresarios; lo anterior subraya la importancia histórica, social y económica de esta gramínea. Su relevancia histórica se remota a la época prehispánica, cuando las culturas Totonaca y Olmeca que habitaron en el sureste del territorio Mexicano, lo utilizaron como alimento principal, y le dieron un significado divino, ya que creían que los dioses lo habían empleado para crear al hombre. Desde el punto de vista alimenticio, el grano de maíz sobresale por el consumo per cápita que va de 180 a 200 kilogramos por año y por su alta calidad energética, ya que se constituye en un 75% de almidón, 8% de fibra, 5% de aceite y solo 10% de proteína. El Instituto Nacional de investigadores Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), en colaboración con el Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo (CIMMYT) ha generado una serie de híbridos y variedades (por ejemplo: VS536, V-531 y V-537C) de maíz con alta calidad de proteína, adaptación y potencial productivo de regiones de clima cálido húmedo (Tinoco el at, 2002).  

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3. JUSTIFICACIÓN

Este trabajo es colaborativo entre el INIFAP y la FMVZ-UV. Se realizó con la finalidad de establecer la técnica de digestibilidad in vitro utilizando el equipo de incubación Daisyll de la compañía Ankon, en el Laboratorio de Nutrición Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Veracruzana, con el fin de evaluar la digestibilidad in vitro del maíz forrajero de diversas variedades e híbridos en condiciones tropicales, como parte de un proyecto a nivel nacional de mejoramiento genético de maíz forrajero para su uso en la alimentación del ganado bovino.

 

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4. HIPÓTESIS

Es posible obtener valores confiables de digestibilidad in vitro de maíz forrajero utilizando la incubador Daisy ll. Existen diferencias en la digestibilidad in vitro entre variedades e híbridos de maíz forrajero de acuerdo a los componentes de la planta analizados, es decir, planta completa, rastrojo y grano. La digestibilidad in vitro de maíz forrajero es diferente dependiendo del lugar donde se cultiva.

 

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5. OBJETIVOS

5.1. OBJETIVO GENERAL Establecer la técnica de digestibilidad in vitro utilizando el equipo Daisy de la compañía Ankom en el laboratorio de nutrición animal de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia para determinar los valores de digestibilidad in vitro de las variedades e híbridos de maíz forrajero.

5.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Establecer y validar la técnica de digestibilidad in vitro en el Laboratorio de Nutrición en la Unidad de Diagnóstico de la Posta Zootécnica Torreón del Molino de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Veracruzana. 2. Determinar los valores de Digestibilidad in vitro de planta completa, rastrojo y grano de híbridos y variedades de maíz forrajero cultivados en los municipios de Iguala, Guerrero; y Cotaxtla, Veracruz. 3. Impartir un curso de capacitación para investigadores pares del INIFAP.

 

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MATERIALES Y MÉTODOS

El estudio comprendió 5 fases: Fase 1. Fistulación ruminal del animal bovino y colocación de la cánula ruminal. Fase 2. Establecimiento de la técnica de digestibilidad in vitro con el equipo Daisy de Ankom. Fase 3. Validación de la técnica de digestibilidad in vitro con muestras de planta completa de maíz forrajero del Campo Experimental Agrícola “Cotaxtla” Ver., del INIFAP. Fase 4. Determinación de la digestibilidad in vitro de planta completa, grano y rastrojo de híbridos y variedades de maíz forrajero del Campo Experimental Agrícola “Iguala” Gro., del INIFAP., y de planta completa de maíz del Campo Experimental Agrícola “Cotaxtla” Ver., del INIFAP. Fase 5. Curso practico de capacitación a investigadores del INIFAP.

A continuación se describen los proceso que debe realizar para establecer la técnica de digestibilidad in vitro iniciando con el proceso de extracción del liquido ruminal del bovino, preparación de bolsitas filtro, peso e identificación de la muestra, elaboración de las soluciones A y B, Solución buffer y como utilizar el incubador Daisyll y analizador de fibra Ankon 200.

 

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6.1. FASE 1. FISTULACIÓN RUMINAL DEL ANIMAL BOVINO Y COLOCACIÓN DE LA CÁNULA RUMINAL. 6.1.1. CUIDADOS PREOPERATORIOS. Antes de llevar a cabo la fistulación de un animal experimental hay que tomar en cuenta la condición física, la docilidad y el estado de salud en que se encuentre. En algunos casos, cuando el animal destinado para este fin no llena dichos requisitos, pero tiene potencial para desarrollarse, éste se separa a una corraleta individual, se le proporciona una buena dieta, un mejor manejo, y al mismo tiempo lograr una buena condición corporal para una pronta recuperación en el período postoperatorio. La preparación del animal 24 horas antes de la operación, consiste en mantenerlo sin alimento ni agua. Momento antes de la intervención se siguen los procedimientos que a continuación se describen: Mantener al animal en decúbito costal derecho, o bien en pie y aplicar un tranquilizante (xilacina al 10%) intramuscular en la tabla del cuello, rasurar la parte superior del flanco izquierdo (hueco del ijar) y lavar con cepillo y jabón toda el área rasurada. Delimitar con un marcador el diámetro de la cánula. Se realiza el bloqueo con lidocaína en las apófisis transversas de las vertebras lumbares (Foto 1) distribuyendo 20 ml, 10 ml, 10 ml entre vertebra y vertebra e Infiltrar lidocaína en el ijar 10 ml. Desinfectar con cuaternarios de amonio (Benzalconio o tintura de iodo al 2%)

 

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6.1.2. MATERIAL a)Mango de bisturí; b) dos hojas de bisturí; c) seis pinzas de hemostasis; d) dos tijeras de punta roma; e) dos agujas curvas; f) Porta agujas; g) Gasas estéril; h) jeringa de 10 ml; i) Agujas para jeringas No. 16 ó 18 j) Cepilla de plástico; k) 500 ml de Cloruro de benzalconio; l) Charola para material; m) tres pinzas Allis; n) dos pinzas para rumen clamp; ñ) cánula; o) Pinzas de disección; p) Pinzas con diente de ratón; q) suturas (seda quirúrgica No. 0.1 y nylon). Es recomendable mantener todo el material en la solución desinfección por lo menos una hora antes de la intervención.

6.1.3. CIRUGÍA Para la cirugía se utilizo un bovino hembra adulto de 460 kg, la cual se coloco en un prensa manga y se procedió hacer una incisión en la piel de 6 a 8 cm de largo (Foto 2) depende del tamaño de la cánula que se desea colocar). Separar tejidos subcutáneos con tijeras de punta roma, desgarrar músculos abdominales (Foto 3) sin cortar (para este fin se utilizan las tijeras de punta roma o los dedos). Corte peritoneo (Foto 4) con tijeras y localice el rumen y proceda a exteriorizarlo con las pinzas de Allis, revise la posición del rumen (Foto 5) y de inmediato fijarlo con dos puntos en cada extremo de la incisión (Foto 6). Sujetar con puntos en “U” la pared visceral del rumen confrontada con la epidermis para evitar que este regrese a la cavidad. Una vez fijado el rumen se procede a realizar la incisión de 4 a 5 cm de longitud (Foto 7) invierta la mucosa ruminal y con súrgete continuo adhiérala a la dermis (Foto 8 y 9). Para colocar la cánula de plástico flexible previamente desinfectada se invierte la rondana exterior y se coloca en la incisión ruminal (Foto  

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10) ya puesta se procede a colocarle el tapón (Foto 11) al termino de la colocación de la cánula (Foto 12) aplique antibiótico local en el área (se recomienda usar Furacín pomada) e intramuscular durante 3 ó 4 días o más dependiendo el estado del animal (Gentamicina 20ml cada 24 hrs). Administrar analgésico, antipirético y antiinflamatorio vía intramuscular, cada tercer día rociar con Negasunt Aerosol en el contorno del la cirugía.

6.1.4. CUIDADOS POSTOPERATORIO Inmediatamente después de la intervención se recomienda alojar al animal en una corraleta individual y de ser posible mantenerlo con otro animal de menor talla. Dependiendo de la manipulación que se haya hecho durante la operación, los tres días siguientes habrá una ligera inflamación, la cual desaparece entre el sexto y séptimo día según el estado de fisiológico del animal. Normalmente después del octavo a décimo día aparecerá contenido ruminal en el flanco del animal y al mismo tiempo se observa una cicatrización de los bordes. Revise la cicatrización levantando las aletas de la cánula o ya sea retirándola para cerciorarse que la cicatrización sea favorable.

 

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A continuación se presenta en secuencia fotográfica el proceso de fistulación ruminal y colocación de la cánula

Foto 1: Bloqueo de nervios entre las apófisis transversas de las vertebras lumbares.

Foto 3: Disección abdominales .

de

Foto 5: Rumen exteriorizado.

 

Foto 2: Incisión.

músculos Foto 4: Corte del peritoneo.

Foto 6: Rumen fijado en los extremos.

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Continuación fotográfica de la fistulación ruminal y colocación de la cánula

Foto 7: Incisión del rumen.

Foto 8: fijación del rumen a la dermis.

Foto 9: Mucosa ruminal adherida a la dermis.

Foto 10: Rondana exterior colocada.

Foto 11: Colocación del tapón de la cánula ruminal.

Foto 12: vaca fistulizada con cánula ruminal en posición final.

 

 

 

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6.2. FASE 2. ESTABLECIMIENTO DE LA TÉCNICA DE DIGESTIBILIDAD IN VITRO CON EL EQUIPO DAISY DE ANKOM.

6.2.1. EQUIPO a) Incubadora Daisyll ;b) Bolsas filtro modelo F57; c) Sellador de bolsa de impulso y calor; d) Balanza analítica; e) Platinas de agitación; f) Analizador de fibra ANKOM200; g) Estufa de secado a 100°C; h) Licuadora; i) Tanque de CO 2 ; j) Jarras Térmicas; k) Temporizadores para peso constante. Equipo biológico a) Se utilizo un bovino hembra fistulizado del cual obtuvimos el líquido ruminal. Reactivos y soluciones (a) Solución “A” tampón: la cual contiene los siguientes reactivos (Foto13) 1. KH 2 PO 4

10.0 g/litro

2. MgSO 4 •7H 2 O

0.5 g/litro

3. NaCl

0.5 g/litro

4. CaCl 2 •2H 2 O

0.1 g/litro

5. Urea (grado reactivo)

0.5 g/litro

(b) Solución “B” contiene solo dos reactivos (Foto 14) 6. Na 2 CO 3 7. Na 2 S•9H 2 O

15.0 g/litro 1.0 g/litro

c) Solución para FDN. (Detergente neutro) d) Agua destilada.

 

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A continuación las fotos de los reactivos de las soluciones “A” y “B”

Foto 13: Reactivos de la solución “A”.

Foto 14: Reactivo de la solución “B”.

 

6.2.2. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DIGESTORAS A un matraz de 2000 ml colocado en una platina de agitación, se agregan todos los reactivos 1 al 5 previamente pesada la cantidad de cada reactivo (Foto 15) junto con 1000 ml de agua destilada (Foto 17). Se procede a disolverlos por agitación (Foto 18) y se rotula el matraz con la clave “A”. En otro matraz, se colocan los reactivos 6 y 7 (Foto 16) junto con 1000 ml de agua destilada y se procede a disolverlos de la misma manera, rotulando el matraz con la clave “B”.

 

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Secuencia fotográfica de la preparación de soluciones:

Foto 15: Pesaje de los reactivos para la Foto 16: Trituración del reactivo 7 de la solución “B”. solución “A”.

Foto 17: colocando 1000 ml de agua Foto 18: Platina de agitación con destilada a un matraz identificado. control de temperatura.

 

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6.2.3. PREPARACIÓN DE LAS BOLSAS DE FILTRO Y MUESTRA Es importante sumergir las bolsas filtro nuevas (Foto 19) en acetona durante tres a cinco minutos posteriormente colocarlas a secar al aire para permitir que la acetona se evapore (Foto 20). La acetona enjuaga y elimina un surfactante que inhibe la digestión microbiana. El siguiente paso es identificar y pesar en balanza analítica cada bolsa de filtro nylon para registrar su peso (Foto 21) (W 1 ). En cada bolsa se coloca medio gramo de muestra problema (Foto 22) y se procede a sellar la bolsa con calor utilizando una selladora de impulso-sellador de calor modelo 1915/1920 (Foto 24). Las bolsas filtro con muestra ya selladas, (Foto 23) pueden mantenerse en refrigeración entre 2 y 4°C hasta su proceso de digestión in vitro. Para iniciar la digestión en el incubador Daisy ll (hasta 25 muestras por frasco), las muestras deben estar distribuidas de manera uniforme en ambos lados de la división de la jarra de digestión. Incluir al menos una bolsa sellada en blanco para el factor de corrección (C 1 ) es necesario.

 

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Esquema de la preparación de las bolsas filtro F57.

 

Foto 19: Bolsas filtro de nylon.

Foto 20: acetona.

Bolsas

sumergidas

en

Foto 21: Pesaje de bolsa filtro

Foto 22: Muestras de maíz a procesar.

Foto 23: Muestras con peso registrado.

Foto 24: Sellador modelo 1915/1920.

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6.2.4. PREPARACIÓN DE (COMBINADO) SOLUCIÓN TAMPÓN Por cada frasco de la digestión: a) Pre-caliente a 39°C ambas soluciones tampón “A” y “B” (Foto 25) En

recipiente aparte mezclar 266 ml de la solución “B” con 1330 ml de la solución A (relación 1:5). La cantidad exacta de A y B debe ser ajustado para obtener un pH final de 6.8 a 39°C. añadir 1,600 ml de la combinación de A / B a cada frasco de la digestión (Foto 26). b) Coloque las jarras de digestión con las muestras y la solución buffer dentro

de la incubador Daisy encienda los interruptores de calor y agitación (Foto 27). c) Permita que la temperatura de los frascos de digestión se equilibre por al

menos veinte a treinta minutos (Foto 28).

Esquema fotográfico de la combinación de las soluciones A y B

Foto 25: Calentamiento de soluciones Foto 26: Mezclas en las jarra de la A” y “B” antes de mezclarlas. soluciones “A” y “B”.

 

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Continuación fotográfica de la combinación de las soluciones A y B

Foto 27: Muestras en las digestoras en la solución buffer.

jarras Foto 28: Jarras incubador Daisy.

digestoras

en

la

6.2.5. PREPARACIÓN DEL INOCULO E INCUBACIÓN: Después que el bovino se recupero del la fistulación ruminal se le proporciono una dieta de dos kilos de concentrado con 18% de proteína, durante una semana, para adaptar la flora ruminal. Después se le ofreció cuatro kilos diarios durante todo el experimento para mantener la florar ruminal y colectar liquido ruminal de calidad para la digestibilidad in vitro. Mantener toda la vidriería a 39 ° C. a) Precalentar dos botellas termos de dos litros por llenando de agua a 39°C (Foto 29). Vaciar el agua caliente justo antes de la colecta del inoculo ruminal. A partir de un bovino con cánula ruminal, colectar el suficiente inoculo ruminal y depositarlo en los termos (Foto 30). Al terminar de llenar cada termo con el líquido ruminal, se bloquea la entrada del propio termo con una porción de forraje ruminal de aproximadamente 80 g.

 

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b) Vacíe el inoculo ruminal de los termo a una licuadora (Foto 31). Adicione CO 2 al vaso recipiente de la licuadora (Foto 32 y 33) y mezcle a velocidad alta durante 30 segundos. La acción de mezclar sirve para desprender a los microbios que están adheridos a la fibra y asegurar un población microbiana representativa de la fermentación in vitro. Filtre la mezcla licuada del inoculo ruminal a través de cuatro capas de gasa en un matraz de cinco litros (previamente calentado a 39°C. NOTA: Es importante permitir que haya gasa extra alrededor de los bordes para facilitar el exprimido del material que se esté filtrando (Foto 34). El matraz Erlenmeyer debe ser purgado continuamente con CO 2 y continuar de esa manera durante el traslado del inoculo hacia la probeta donde se medirán 400 ml del filtrado mantenido en ambiente enriquecido de CO 2 (Foto 35). c) Retire uno de los frascos de digestión de la incubadora Daisyll y añada los 400 ml del inoculo a la solución buffer y muestras experimentales. Purgar la jarra de digestión con gas CO 2 durante treinta segundos y asegurar la tapa (Foto 36). d) Repita el proceso en todos los frascos que se vayan a usar. Nota: No permita que el gas de CO 2 burbujee a través del inoculo tamponado, y por el contrario, utilice el CO 2 gaseoso para formar una manta sobre el contenido de la jarra. e) Incubar durante 48 horas. El incubador Daisyll mantendrá una temperatura de 39,5ºC ± 0.5 (Foto 37). f) Al término de la incubación, retire los frascos de la cámara de calor y agitación del Daisyll y deseche el líquido de cada una de las jarras de  

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digestión. Enjuague cuidadosamente las bolsas nylon que contienen la muestra digerida, en una bandeja con agua fría y renuévela tres veces o hasta que el agua se mantenga clara, recordando eliminar el aire o gas que se encuentra dentro de cada bolsa (Foto 38). g) Las bolsas con la muestra digerida pueden o no ser procesadas para la determinación final de la digestibilidad verdadera, en caso de no ser así, pueden congelarse alrededor de los -20°C hasta su procesamiento. h) A la hora de determinar la digestibilidad verdadera, es necesario eliminar los microbios y cualquier resto de los desechos solubles de fracciones usando solución detergente neutro; por lo tanto se deriva a procesar las muestras siguiendo la técnica de Fibra Detergente Neutro para el Analizador de Fibra ANKOM200.

Secuencia fotográfica del proceso de la técnica in vitro

Foto 29: Jarras térmicas.

 

Foto 30: ruminal.

Recolección

de

líquido

28

Continuación fotográfica del proceso de la técnica in vitro

Foto 31: Equipo distribuidor de CO 2 .

Foto 32: CO 2 en la licuadora.

Foto 33: Vaciando líquido ruminal al Foto 34: Filtrando la mezcla licuada del vaso de la licuadora. inoculo ruminal con capas de gasa.

Foto 35: Medición de líquido ruminal.

 

Foto 36: digestora.

líquido

ruminal

en

jarra

29

Continuación fotográfica del proceso de la técnica in vitro

Foto 37: Colocando jarras a incubar 48 Foto 38: horas. digeridas.

Enjuagado

de

muestras

6.2.6. PROCEDIMIENTO DE OPERACIÓN DEL EQUIPO DAISY II. La incubador Daisy

II

está diseñado para proporcionar la agitación y la incubación

de muestras en un constante 39.5ºC ± 0.5. El controlador está configurado a 39.5°C. tecnología ANKON consultar si un ajuste es diferente temperatura deseada. Para iniciar el ciclo: 1) Encienda el interruptor principal de alimentación de energía eléctrica. 2) Coloque las jarras de digestión en los nichos correspondientes con la tapa hacia el frente (Foto 39). 3) Presione los botones de agitación y calor. Confirme visualmente la rotación de los frascos y el calor cuando las luces interiores de la cámara están encendidas.

 

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Para poner fin al ciclo:  1) Apague los interruptores de agitación y calor, seguidos del correspondiente de la alimentación principal de energía eléctrica (Foto 40).

Fotografías del esquema de operación Daisyll

Foto 39: Inicio del ciclo.

 

Foto 40: Fin del ciclo.

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6.2.7. TÉCNICA DE FIBRA DETERGENTE NEUTRO EN BOLSA FILTRO 6.2.8. Material: a) Analizador de fibra ANKOM200, b) Agua destilada, c) Acetona, d) Bolsas de filtro modelo F 57 con muestra para analizar, e) Solución detergente neutro, f) Charola. 6.2. 9. Procedimiento de operación Este procedimiento se puede realizar con las muestras al término de su proceso en el digestor Daisyll, o las muestras congeladas (Foto 41). Si las muestras son congeladas se colocan en un matraz con agua (Foto 42) para descongelarlas, ya descongeladas se retiran del agua y previamente colocación de guantes de látex, se presionan con las palmas de las manos extendidas para eliminar el excedente de agua y se ponen a secar (Foto 43). Se colocan tres muestras dentro de cada charola del suspensor que contiene las charolas de lavado el cual tiene la capacidad de analizar 24 muestras (Foto 44). Ya colocadas cerciórese que embonen todas las charolas e introduzca al analizador de fibra ANKOM (Foto 45) colocándole la pesa arriba de la última charola de lavado (Foto 46). Agregué 1800 ml de solución detergente neutro vertiendo con cuidado (Foto 47). Verifique que la solución cubra por completo la ultima charola, encienda el botón de agitación, asegúrese que no se derrame la solución detergente neutro, se ajusta el tornillo de la tapa del compartimento de lavado y se le da un tiempo de quince minutos para estabilizar la temperatura que llega a los 90-95 °C. Pasado este tiempo se marca una hora en la cual se estabiliza la temperatura a 100°C trascurrido el tiempo se le abre al paso de expulsión del agua permitiendo que por gravedad la solución caliente descienda a un recipiente con capacidad de diez  

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litros. Se cierra el paso, se le agrega 1800 ml agua destilada calentada previamente hasta los 90°C vertiéndola con cuidado y que cubra la ultima charola de lavado, encienda el botón de agitación asegúrese que no se derrame y ajuste el tornillo de la tapa del compartimento de lavado y marque cinco minutos en el cronometro de la maquina. En este tiempo se mantiene la temperatura entre los 90° a 100°C este paso de lavado se realiza tres veces con el mismo procedimiento. Al finalizar de enjuagar las muestras retire el suspensor de charolas de lavado del Analizador de fibra ANKOM. Se extraen las bolsas de filtro F57 de cada charola. Proceda a eliminarles el excedente de agua presionándolas con las palmas de las manos y se ponen a orear 10 minutos (Foto 48). Después en un matraz con acetona se colocan las muestras cinco minutos (Foto 49). Se sacan y coloque las muestras en una charola dejándolas reposar a temperatura del laboratorio para que se evapore la acetona de las muestras (Foto 50). Trascurrido este tiempo se colocan la charola que contiene las muestras en la estufa de 100°C por cuatro horas (Foto 51 y 52).

 

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Esquema de fotográfico del proceso de la técnica de Fibra Detergente Neutro y manejo de la muestra.

Foto 41: Muestras congeladas.

42: Muestra descongelándose.

Foto 43: Secado de muestras.

Foto 44: Colocación de las muestras en las charolas del Ankon200 .

Foto 45: Introducción el contenedor de Foto 46: Colocando la pesa. las charolas al Ankon200.

 

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Continuación del esquema fotográfico del proceso de la técnica de Fibra Detergente Neutro y manejo de la muestra

Foto 47: Enjuagado con FND.

Foto 48: Eliminando el excedente de agua.

Foto 49: Muestra en acetona.

Foto 50: Muestras en reposo para evaporar la acetona

Foto 51: Muestras lista para entrar a la Foto 52: muestras en la estufa de estufa de 100°C. secado por cuatro horas.  

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Para poner fin al ciclo: 1) Apague los interruptores de agitación y calor seguidos del correspondiente de la alimentación principal de energía eléctrica (Foto 53).

Foto 53: Equipo Ankon200 ,analizador de fibra.

6.2.10. MANEJO DE LAS MUESTRAS PARA PESAJE FINAL.

Balanza electrónica Mantenga la balanza en una mesa anti-vibratoria Encienda la balanza y espere que se auto calibre, asegúrese que la charola y la cámara de la balanza este limpia (Foto 54). Ya que las muestras estuvieron cuatro horas en la estufa de secado se retiran con ayuda de unas pinzas y se colocan en el desecador el cual contiene silica gel durante diez minutos. Colocando un máximo de 12 bolsas por cada ciclo de estabilización (Foto 55). Pasado los diez minutos pese cada muestra previamente identificada y registe su peso hasta diez milésima de gramo para realizar sus cálculos (Foto 56 y 57). Al término del pesaje de las muestras apague la balanza y desconecte de la fuente de energía eléctrica.  

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Proceso fotográfico de la técnica del manejo de la muestra

Foto 54: Encender la balanza.

Foto 55: Desecadoras.

Foto 56: Registro del peso final de la Foto 57: Muestras pesadas. bolsita.

 

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5.2.11. CÁLCULOS

Las siglas % DTIV significa digestibilidad total in vitro.

% DTIV (en base húmeda)= 100-(W 3 – (W 1 x C 1 )) x 100 W2 % DTIV (en base seca) = 100-(W 3 – (W 3 x C 1 )) x 100 (W 2 x DM)

Donde: W 1 = Peso de la bolsita tarada W 2 = Peso de la muestra W 3 = Peso final de la bolsa después de digestión in vitro y neutro detergente. C 1 = Corrección de la bolsa blanco

 

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6.3. FASE 3. VALIDACIÓN DE LA TÉCNICA DE DIGESTIBILIDAD IN VITRO CON MUESTRAS DE PLANTA COMPLETA DE MAÍZ FORRAJERO DEL CAMPO EXPERIMENTAL AGRÍCOLA “COTAXTLA” VER., DEL INIFAP. Se utilizaron 15 híbridos y 10 variedades de maíz forrajero cultivados en tres parcelas cada uno, siendo la parcela la repetición. Las muestras se analizaron por duplicado de tal forma que fueron 6 observaciones por grupo genético de maíz. Se estimaron los promedios, desviaciones estándar y los coeficientes de variación de las digestibilidades in vitro de las tres parcelas que se sembraron por cada grupo genético de maíz, y de los duplicados de cada parcela que se analizaron en el equipo Daisy.

 

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6.4. FASE 4. DETERMINACIÓN DE LA DIGESTIBILIDAD IN VITRO DE PLANTA COMPLETA, GRANO Y RASTROJO DE HÍBRIDOS Y VARIEDADES DE MAÍZ FORRAJERO DEL CAMPO EXPERIMENTAL AGRÍCOLA “IGUALA” GRO., DEL INIFAP., Y DE PLANTA COMPLETA DE MAÍZ DEL CAMPO EXPERIMENTAL AGRÍCOLA “COTAXTLA” VER., DEL INIFAP. Para la base de datos de Cotaxtla, Ver. Se utilizaron 15 híbridos y 10 variedades de maíz cultivados en tres parcelas cada uno. Se evaluó la planta completa para digestibilidad in vitro utilizando duplicados. Un análisis de varianza para los efectos de Híbridos Vs. Variedades, y para los grupos genéticos fue realizado. Si hubiere alguna significancia estadística, entonces se compararán las medias mediante la prueba de Tukey a una P≤0.05. Para la base de datos de Iguala, Gro. Se utilizaron 10 variedades y 5 híbridos de maíz cultivados en tres parcelas cada uno. Se evaluaron la planta completa, el grano, y el rastrojo para digestibilidad in vitro utilizando duplicados. Un análisis de varianza par los efectos de híbridos Vs. variedades; Planta completa Vs. Grano Vs. Rastrojo; la interacciones entre ellos, y genotipos fue realizado. Si hubiere alguna significancia estadística, entonces se compararán las medias mediante la prueba de Tukey a una P≤0.05. Se generó una base de datos para comparar Cotaxtla Vs Iguala. Para ello solo se consideró la planta completa de los genotipos (híbridos y variedades) que estuvieran representadas en las dos localidades, resultando 5 híbridos y 10 variedades los participantes. Un análisis de varianza para los efectos de genotipo (híbridos Vs. variedades), y de localidad (Cotaxtla Vs. Iguala) fue realizado. Si hubiere alguna significancia estadística, entonces se compararán las medias mediante la prueba de Tukey a una P≤0.05.

 

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7. RESULTADOS Y DISCUSION

7.1. FASE 3. VALIDACIÓN DE LA TÉCNICA DE DIGESTIBILIDAD IN VITRO CON MUESTRAS DE PLANTA COMPLETA DE MAÍZ FORRAJERO DEL CAMPO EXPERIMENTAL AGRÍCOLA “COTAXTLA” VER., DEL INIFAP. El promedio general de digestibilidad in vitro fue de 63.19%. Dentro de duplicado, la desviación estándar promedio fue de 2.63 unidades de digestibilidad. Para un coeficiente de variación de 4.16%. De acuerdo con Prand et al., (2002), la diferencia entre dos repeticiones no debe ser mayor de 3 unidades porcentuales de digestibilidad y el coeficiente de variación máximo permitido es de 5% para que la técnica sea aceptada por la norma ISO/IEC 17025:1999., por lo que la variación obtenida en este estudio está dentro del rango aceptable. No obstante, el usar tres replicas reduciría aun mas esta variación hacia valores más confiables. Dentro de repetición, la desviación estándar promedio fue de 1.84 unidades de digestibilidad. Para un coeficiente de variación de 2.91%. El usar tres repeticiones reduce considerablemente la variación en la estimación de la digestibilidad in vitro.

7.2. FASE 4. DETERMINACIÓN DE LA DIGESTIBILIDAD IN VITRO DE PLANTA COMPLETA, GRANO Y RASTROJO DE HÍBRIDOS Y VARIEDADES DE MAÍZ FORRAJERO DEL CAMPO EXPERIMENTAL AGRÍCOLA “IGUALA” GRO., DEL INIFAP., Y DE PLANTA COMPLETA DE MAÍZ DEL CAMPO EXPERIMENTAL AGRÍCOLA “COTAXTLA” VER., DEL INIFAP.

7.2.1 Digestibilidad in vitro de Maíces de Cotaxtla. Las medias ajustadas y las desviaciones estándar de las digestibilidades de maíz forrajero cultivados en la localidad de Veracruz se presentan en el Cuadro 1. Se observa que los híbridos son mas digestibles (P≤0.06) que las variedades. Aunque cabe mencionar que estos valores son inferiores a los maíces forrajeros cultivados en altiplano o con riego en zonas desérticas. Nuñez et al., (2006) reporta digestibilidades in vitro de 65.14% para la zona de La Laguna y 66.37% para Aguascalientes. Las principales razones de variación son debidas a las condiciones ambientales impuestas por el clima tropical, y por los suelos tropicales que en general son de menos calidad.

 

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Cuadro 1. Porcentaje de digestibilidad in vitro de híbridos y variedades de maíz forrajero (Planta completa) procedente del municipio de Cotaxtla, Ver. Grupo

Media

Desv.Est.

Hibrido

63.77a

0.4807

Variedad

62.31b

0.5887

Diferente literal indica diferencia estadística P≤0.06 

 

En el Cuadro 2 se muestran los promedios para los híbridos y variedades estudiados. El análisis de varianza no mostró diferencia estadística entre medias. Parte de la falta de sensibilidad del ANOVA para detectar diferencias fue debido a la variación detectada por el análisis de validación de la técnica de digestibilidad in vitro (Fase 3), en donde el uso de duplicados evidencia coeficientes de variación mayores a los del efecto de genotipo, confundiendo este último. Los genotipos se ordenaron de menor a mayor digestibilidad. Resultando que la variedad V556A80#C tuvo digestibilidad menor al 60%, y el híbrido H-358xHH551C tuvo digestibilidad mayor a 65%.

Cuadro 2. Porcentaje de digestibilidad in vitro de cada genotipo de híbridos y variedades de maíz forrajero (Planta completa) del municipio de Cotaxtla, Veracruz.

 

Genotipo

Media

V-556ª80#C

59.95

(LP15XLP21A)CP Amar

60.40

V-45480A#C

60.42

H-561

61.30

H-519C

61.56

42

Continuación del cuadro 2. Genotipo

Media

VS-536 Cot 08ª

62.12

(OPACOxCML144)Xh358

62.17

VS-55840 #C

62.27

V-526 77 #C

62.47

SINT 3 Cot 08A

62.68

H-553C

62.74

VS-535 Sel. PL

62.91

V-559 38 #C

63.22

V 531 35 34 #

63.31

H-562

63.39

(TTC23XCML144)CLOQ6203

63.43

H-564C

63.73

VS-537C 33 #C

63.75

H-516CP

64.68

H-520

64.92

H-563

65.20

H358xCML142

65.40

H-516

65.68

H-565

65.83

H-358xHH551C

66.08

Desviación Estándar ± 1.966.

 

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7.2.2 Digestibilidad in vitro de Maíces de Iguala, Gro. La digestibilidad de la planta de maíz esta influenciada por muchos factores tanto genéticos como agronómicos y ambientales. Pero también por la distribución de grano, hoja y tallo según el estado fenológico en que se encuentre. Para el caso de maíz para ensilar, este se cosecha cuando la línea del grano esta en su estado lechoso-masoso. En los maíces de Guerrero, se evaluaron la planta completa, el grano, y el rastrojo (Cuadro 3). El grano tuvo digestibilidad de 93.26%, la planta completa de 64.15%, y el rastrojo de 57.71%. Siendo estas diferentes entre si (P≤0.01). La digestibilidad de la planta completa es inferior a la reportada por Nuñez et al., (2006) para La laguna y Aguascalientes. La digestibilidad del grano es muy alta comparada con la encontrada en España por Gómez y Melisa (2003) que fue de 89.6%. Ellos mismos reportan digestibilidad del rastrojo de 46%, muy bajos comparados con los obtenidos en este estudio que fue de 57.71%. En EUA, las variedades de maíz presentan digestibilidades de 53 a 82% para planta completa (Hunt et al., 1992; Wolf et al., 1993) y de 46 y 48% para la digestibilidad del rastrojo (Fernandez y Klopfenstein, 1989). De igual manera en Europa, la digestibilidad in vitro de la materia seca de la planta de maíz en verde varía de 66 a 80% (Andrieu et al., 1993). En México, estudios realizados en la Comarca Lagunera (Nuñez et al., 1999; Contreras et al., 1999; Herrera et al., 1997) han reportado digestibilidades in vitro del forraje de maíz de 56 a 68% y Sánchez (1994) menciona para rastrojo de maíz de 44 a 50% de digestibilidad.

Cuadro 3. Porcentaje de digestibilidad in vitro de grano, planta completa, y rastrojo cultivado en el municipio de Iguala, Gro. Fracción

Media

Grano

93.26a

Planta

64.15b

Rastrojo

57.71c

Desv. Est.

0.540

P