UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE QUÍMICA FARMACÉUTICA BIOLÓGICA

ZONA XALAPA

Estudio comparativo del efecto producido por el 17β-estradiol y el fitoestrógeno genisteína sobre los niveles de ansiedad en la rata Wistar ovariectomizada

TESIS

Que para acreditar la Experiencia Recepcional de la carrera de:

QUÍMICO FARMACÉUTICO BIOLÓGO

PRESENTA: Andrea Santos Torres

DIRECTOR DE TESIS: Dr. Juan Francisco Rodríguez-Landa Laboratorio de Neurofarmacología, Instituto de Neuroetología, Universidad Veracruzana.

XALAPA, VERACRUZ.

JUNIO, 2014. I

II

AGRADECIMIENTOS La presente Tesis es un esfuerzo en cual, directa o indirectamente participaron varias personas; leyendo, opinando, corrigiendo, dándome ánimos. En primer lugar quiero agradecerle a DIOS por haberme permitido vivir esta experiencia tan importante en mi desarrollo profesional, porque sin nada de esto sería posible. Declaro mi amor infinito a ti señor.

Agradezco a mis padres su amor y sobre todo su confianza en mí. A mi madre por su infinita paciencia y todo el amor que me demuestra día con día, gracias por la fuerza y ayuda que me brindo. A mi padre porque a pesar de la distancia siempre he podido contar con su apoyo. No podía escribir en unas líneas todo lo que les debo y cuanto los amo.

A mi hermana, por todo su apoyo durante estos años, porque siempre ha sido ejemplo en mi vida, gracias por todo tu amor, y las palabras de aliento que me has brindado, te amo hermana. A toda mi familia, especialmente a mi abuelita clara, Katy y mis tíos, porque han estado cuando los necesito, por su amor y más, muchas gracias. A mi asesor de tesis, el gran Doctor Juan Francisco Rodríguez Landa, por su infinita paciencia para la realización de este trabajo, compartiéndome sus conocimientos, por su apoyo en todo momento. Recalco mi admiración a esta gran persona. A mis sinodales la Dra. Blandina y al MC. Arturo por el tiempo dedicado para que esta tesis llevara los menores errores posibles, y sobre todo al maestro Arturo, porque sin querer él fue una las personas que me ayudaron para no abandonar este sueño, gracias a él siempre seré Monse para algunos compañeros.

III

Al equipo estrella por todas las tardes de estudio, los grandes trabajos realizados, los momentos compartidos y por permitirme conocérselas, hicieron que estos años fueran menos difíciles. Gracias Elani, Yami, Dulce y Harumy. Se convirtieron en mi familia xalapeña. Gracias a todos compañeros, a Conchita, Cesi, Cristian, Emmanuel, Karla, Iván, Selene, Charly (te esperamos a tu regreso), por permitirme vivir momentos especiales en su vida, y a todos mis demás compañeros, que no me atrevo a nombrar para no dejar a nadie pendiente. Me llevo a todos en un lugar mi especial de mí. Generación 090. GRACIAS mamá, papá, hermana y Dr. Juan Francisco, sin ustedes nada de esto sería posible. Gracias totales.

IV

Resumen Introducción. La menopausia natural o quirúrgica conlleva a una amplia variedad de síntomas físicos y psicológicos, entre los que se encuentra una mayor vulnerabilidad para presentar alteraciones emocionales que incluyen irritabilidad, ansiedad y depresión; asociado al decline de las concentraciones de hormonas como el estradiol. El tratamiento de estas alteraciones incluye la terapia de reemplazo hormonal, pero su uso prolongado puede ejercer efectos colaterales que limitan su uso prolongado. Una alternativa podrían ser los fitoestrógenos como la genisteína, de los cuales se ha identificado que ejercen efectos fisiológicos parecidos al estradiol a nivel clínico y experimental. Sin embargo, aún no se han comparado los efectos producidos por dosis equiparables de ambas sustancias sobre la ansiedad en un modelo de menopausia quirúrgica en la rata. Objetivo. Comparar los efectos de dosis semejantes de 17βestradiol y el fitoestrógeno genisteína sobre la ansiedad inducida en un modelo de menopausia quirúrgica en la rata Wistar. Método. Se incluyeron siete grupos independientes de ratas con 12 semanas de ovariectomía, un grupo control y seis grupos experimentales; tres recibieron 17β-estradiol y tres recibieron genisteína en dosis de 0.045, 0.09 y 0.18 mg/kg, respectivamente, durante siete días. Los efectos de los tratamientos fueron evaluados en el laberinto de brazos elevados y la prueba de actividad locomotriz. Los datos se analizaron mediante ANOVA de una vía, se utilizó la prueba post hoc Student-Newman-Keuls cuando p < 0.05. Los resultados se presentan como la media ± el error estándar. Resultados. En el laberinto de brazos elevados las dosis de estradiol o genisteína de 0.09 y 0.18 mg/kg aumentaron el tiempo de permanencia y el número de entradas en los brazos abiertos. Las mismas dosis generaron un mayor porcentaje de entradas a los brazos abiertos con respecto al control. El número total de entradas a los brazos no fue afectado por los tratamientos. En la prueba de actividad locomotriz no se observaron diferencias estadísticamente significas en el número de cuadros cruzados, mientras que el tiempo de acicalamiento, fue mayor con los tratamientos, respecto al grupo control. Conclusión. El fitoestrógeno genisteína ejerce un efecto ansiolítico semejante al estradiol en ratas con “menopausia quirúrgica”, señalando su posible utilización a futuro en el manejo de las alteraciones asociadas con la “menopausia quirúrgica”. V

Abstract Introduction. Natural or surgical menopause leads a wide variety of physical and psychological symptoms, including an increased vulnerability to suffer emotional disorders such as irritability, anxiety and depression; which have been associated with decline of 17β-estradiol levels. Treatment of these alterations includes hormone replacement therapy, but prolonged use may produce side effects that limit their use. An alternative

could

be

the

phytoestrogen

genistein.

This

phytoestrogen

exerts

physiological effects similar to estradiol at clinical and experimental level. However, comparisons between similar doses of both substances on anxiety-like behavior, in longterm ovariectomized Wistar rats, remains to be explored. Objective. To compare the effects of similar doses of 17β-estradiol and phytoestrogen genistein on anxiety-like behavior in a surgical menopause model in the Wistar rat. Method. Seven independent groups of rats with 12-weeks pots-ovariectomy: a control group and six experimental groups, three received 17β-estradiol and the other three groups genistein at doses of 0.045, 0.09 and 0.18 mg/kg respectively, during seven consecutive days. The treatment effects were evaluated in the elevated plus-maze and subsequently in locomotor activity test. Data were analyzed by one-way ANOVA, and Student-Newman-Keuls post hoc test. Results are presented as mean ± standard error. Results. In the elevated plus maze, doses of 0.09 and 0.18 mg/kg of estradiol or genistein increased the time spent and number of entries into the open arms. The same doses produced higher percentage of entries into the open arms as compared with control group. The total number of arm entries was not affected by treatments. No statistical differences in the crossing in locomotor activity test were observed, but time spent in grooming was higher than the control group. Conclusion. Phytoestrogen genistein exerts an anxiolytic-like effect similar to estradiol in Wistar rats with “surgical menopause” showing the possibility that in the future could be used in the control of alterations associated with “surgical menopause.”

VI

ÍNDICE RESUMEN....................................................................................................................... II ABSTRACT .................................................................................................................... VI ÍNDICE DE FIGURAS ..................................................................................................... 9 ABREVIATURAS ........................................................................................................... 10 INTRODUCCIÓN........................................................................................................... 11 ANTECEDENTES ......................................................................................................... 13 Generalidades de la menopausia natural y quirúrgica ............................................... 13 Tratamientos de los trastornos asociados con la menopausia ................................... 16 Generalidades de los fitoestrógenos .......................................................................... 20 Modelo de menopausia quirúrgica y efecto de genisteína ......................................... 25 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ........................................................................... 29 HIPÓTESIS ................................................................................................................... 30 OBJETIVOS .................................................................................................................. 30 Objetivo general ......................................................................................................... 30 Objetivos específicos ................................................................................................. 30 MATERIAL Y MÉTODO ................................................................................................ 31 Ética ........................................................................................................................... 31 Condiciones de los sujetos experimentales ............................................................... 31 Ovariectomía .............................................................................................................. 31 Grupos experimentales .............................................................................................. 32 Laberinto de brazos elevados .................................................................................... 32 Prueba de actividad locomotriz en campo abierto ...................................................... 33 Análisis estadístico ..................................................................................................... 34 DIAGRAMA DE TRABAJO ............................................................................................ 35 7

RESULTADOS .............................................................................................................. 36 Prueba de laberinto de brazos elevados .................................................................... 36 Prueba de actividad locomotriz en campo abierto ...................................................... 40 DISCUSIÓN................................................................................................................... 43 CONCLUSIÓN............................................................................................................... 47 ÁPENDICE .................................................................................................................... 48 Ética en el trabajo con animales de laboratorio .......................................................... 48 Ética para modelos animales de ansiedad ................................................................. 50 REFERENCIAS ............................................................................................................. 52

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ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Esquema representativo de las fases que caracterizan a la etapa final del ciclo reproductivo en la mujer. ....................................................................................... 14 Figura 2. Clasificación de los fitoestrógenos................................................................. 21 Figura 3. Estructura bioquímica del 17β-estradiol y la genisteína................................. 22 Figura 4. Distribución anatómica de los receptores α y β de estrógenos en la mujer. .. 23 Figura 5. Mecanismo de acción de los fitoestrógeno. ................................................... 24 Figura 6. Prueba de laberinto de brazos elevados. ...................................................... 33 Figura 7. Prueba de actividad locomotriz en campo abierto. ........................................ 34 Figura 8. Tiempo de permanencia en el brazo abierto. ................................................ 36 Figura 9. Número de entradas a los brazos abiertos.. .................................................. 37 Figura 10. Total de entradas a los brazos. ................................................................... 38 Figura 11. Porcentaje de entradas a brazo abierto. ...................................................... 39 Figura 12. Número de cuadros cruzados. ..................................................................... 40 Figura 13. Tiempo empleado en el acicalamiento. ....................................................... 41 Figura 14. Tiempo empleado en la conducta vertical.. ................................................. 42

9

ABREVIATURAS

E2

17β-estradiol

TRH

Terapia de reemplazo hormonal

FSH

Hormona folículo estimulante

LH

Hormona luteinizante

LDL

Colesterol de baja densidad

HDL

Colesterol de alta densidad

SERM

Moduladores selectivos del receptor de estrógenos

OVX

Ovariectomia

mg

Miligramo

Kg

Kilogramo

DHEA

Dehidroepiandrosterona

REF

Presión arterial elevada

10

INTRODUCCIÓN La menopausia es un periodo que se presenta al final de la etapa reproductiva de la mujer y se caracteriza por un agotamiento folicular que conduce al cese de la menstruación (Sonigo et al., 2012). En esta etapa de transición fisiológica se observa una disminución de la inhibina, que conduce a incrementos en secreción de hormona estimulante del folículo y disminución de la producción de estradiol (Blake, 2006), principalmente. Se ha descrito como un trastorno de deficiencia hormonal asociada a una amplia variedad de síntomas físicos y psicológicos, incluyendo los sofocos, “bochornos”, sudores nocturnos, frecuencia urinaria, trastornos del sueño, cansancio, depresión y ansiedad (Sagsöz et al., 2001). En la transición a la menopausia, hay algunos indicios de que las mujeres se vuelven más vulnerables al desarrollo de episodios de ansiedad durante los momentos de bajo nivel de estrógeno y progesterona, hormonas ováricas que actúan como ansiolíticos o antidepresivos naturales (Toriizuka et al., 2000), bajo ciertas condiciones. Las hormonas esteroides secretadas por los ovarios, tales como el 17β-estradiol, pueden ejercer efectos contundentes en la función fisiológica y psicológica de las mujeres, los cuales son más evidentes durante el decline de la secreción ovárica de estradiol como ocurre en la menopausia. Alrededor del 75% de las mujeres que cursan por la menopausia buscan tratamiento para controlar las alteraciones físicas y psicológicas asociados a la baja hormonal, con la finalidad de mejorar su calidad de vida (Walf et al., 2009). La terapia de reemplazo hormonal es uno de los principales tratamientos que disminuyen la sintomatología de la ansiedad, asociada a una baja hormonal, como ocurre en la menopausia natural o quirúrgica. Pero actualmente, tiene un equilibrio complejo de beneficios y riesgos y no se recomienda de manera rutinaria para la mayoría de las mujeres durante o después de la transición a la menopausia. Los resultados recientes de la Iniciativa de Salud de las Mujeres y otros estudios sugieren que las características clínicas y biológicas de la mujer pueden modificar su salud con el reemplazo hormonal y que algunas mujeres pueden ser candidatas más adecuadas para la terapia, que otras (Manson, 2013). El uso prolongado de este tratamiento puede ejercer efectos colaterales que limitan su uso en la terapéutica, debido a que las 11

mujeres que tienen predisposición al cáncer dependiente de hormonas, lo pueden desarrollar al utilizar el reemplazo hormonal (Lethaby et al., 2007). Por otro lado, existen sustancias de origen natural, con actividad estrogénica, tal es el caso de los fitoestrógenos derivados de la soya como la genisteína o la daidzeina. Estos principios activos de origen vegetal, conocidos como fitoestrógenos, se clasificaron en dos grandes grupos: lignanos e isoflavonas, con peso molecular y estructuras parecidas al estradiol, una de las hormonas femenina más importantes en la fisiología de la mujer (Ludueña et al., 2007).

La genisteína es un fitoestrógeno estructuralmente similar al estradiol, que puede unirse a los receptores α y β de los estrógenos y evocar efectos estrogénicos y antiestrogénicos dependientes de la dosis (Morán et al., 2013). Es capaz de imitar la acción de los estrógenos sobre órganos diana, ejerciendo beneficios para la salud cuando se usa en algunas enfermedades dependientes de hormonas (Vitale et al., 2012). En diversos estudios se han descrito efectos fisiológicos y conductuales semejantes entre el estradiol y la genisteína, utilizando diferentes esquemas de tratamiento y metodologías en la rata y el ratón, principalmente. Por ejemplo, en un modelo de “menopáusica quirúrgica” en la rata, se encontró que la genisteína disminuye los niveles de ansiedad cuando se evalúan en el modelo luz/oscuridad (Rodríguez-Landa et al., 2007), efecto que fue mediado por los receptores β-estradiol (Rodríguez-Landa et al., 2012). Cabe señalar que este efecto también se ha detectado cuando se administra el estradiol a la rata (Hérnandez-Figueroa, 2007). No obstante, se carece de estudios que comparen dosis semejantes de estradiol y genisteína sobre los indicadores de ansiedad en el modelo de “menopausia quirúrgica”; lo cual limita de alguna manera la identificación de ventajas o desventajas sobre uno u otro. Por lo tanto, en el presente estudio se compararon tres dosis semejantes de estradiol y genisteína sobre los indicadores de ansiedad en ratas con “menopausia quirúrgica”, con la finalidad de ampliar la información sobre los efectos ansiolíticos de ambos compuestos estrogénicos; lo cual contribuye a identificar o refutar el potencial terapéutico del fitoestrógeno genisteína como una alternativa terapéutica para la ansiedad asociada al decline de hormonas esteroideas. 12

ANTECEDENTES Generalidades de la menopausia natural y quirúrgica Clínicamente hablando, la menopausia se inicia con el último ciclo menstrual de la mujer (Sonigo et al., 2012), implica el cese permanente de la función ovárica y el fin del período reproductivo de la mujer (Sherman, 2005). Este evento natural resulta de la decadencia en el número de folículos (Hamburguesa et al., 2002), a consecuencia del envejecimiento de los ovarios y de la función del eje hipotálamo-hipófisis-ovario. La menopausia constituye un evento natural y único en la vida de las mujeres, y corresponde al último sangrado uterino que se presenta debido a la disminución y posterior cese de las funciones tanto gametogénicas como esteroidogénicas de los ovarios (Sánchez-Ramírez et al., 2008), abarcando así, un período de cambios dinámicos en los tejidos reproductivos y no reproductivos (Sherman, 2005). En las mujeres mexicanas la menopausia ocurre alrededor de los 49 años de edad. A través de la historia, las actitudes y creencias respecto a la menopausia han variado ampliamente. La menopausia se ha considerado desde una enfermedad y un signo de decadencia en el siglo XIX, hasta una etapa de liberación en la que finaliza la etapa fértil de la mujer (Sánchez-Ramírez et al., 2008).

En la etapa final del ciclo reproductivo de la mujer se pueden identificar las siguientes etapas (Figura 1): a) el climaterio, una etapa de transición en la vida de la mujer, caracterizada por cambios físicos, psicológicos y sociales. Los cambios físicos se producen por una deficiencia en los niveles de estrógenos y afectan a cada mujer de manera diferente (Araya et al., 2006); es la etapa de transición que ocurre entre la madurez reproductiva y la pérdida de la función ovárica, incluye el período de inicio de las manifestaciones endocrinológicas, biológicas o clínicas, indicativas de que se aproxima la menopausia; b) la menopausia, es el último período, que marca el cese (espontáneo o artificial) de la función normal y cíclica del ovario. Se le determina cuando se observa el cese de la menstruación por un espacio mayor de un año, como consecuencia de la pérdida de la función ovárica; y c) la postmenopausia, período que se inicia un año después de la menopausia, en el cual persiste el déficit estrogénico y se acompaña de un incremento de los trastornos médicos relacionados con la edad 13

(osteoporosis y enfermedades cardiovasculares) y la deficiencia de estrógenos (Salvador, 2008).

La menopausia si se produce de forma natural o quirúrgicamente, se caracteriza por la pérdida de hormonas cíclicamente producidas por los folículos ováricos, incluyendo la progesterona y el estradiol, un estrógeno potente que además de regular los procesos reproductivos, también ejerce efectos sobre la función cerebral (Henderson et al., 2007).

Figura 1. Esquema representativo de las fases que caracterizan a la etapa final del ciclo reproductivo en la mujer. Modificado de Salvador (2008). La menopausia natural se diagnóstica después de doce meses de amenorrea no asociada a una causa patológica (Nelson, 2008), y la menopausia quirúrgica, es llamada así, por la pérdida abrupta de la función ovárica bilateral (Archer, 2010); entendiéndose esta última, como el cese de la menstruación tras la ablación quirúrgica de ambos ovarios o iatrogénica (quimioterapia o irradiación), con o sin histerectomía debido a causas patológicas (Becerra-Fernández, 2003). La menopausia espontánea o natural es consecuencia de la atresia folicular o del agotamiento folicular, de tal modo que no existen folículos ováricos que puedan responder a las gonadotropinas; por tal 14

motivo, el ovario pierde su función cíclica, desaparece la ovulación y se termina la etapa reproductiva de la mujer. En este período, los niveles de estradiol son muy bajos, se produce un aumento de la hormona folículo estimulante (FSH) y en menor medida de la hormona luteinizante (LH) (Salvador, 2008).

La menopausia quirúrgica se asocia con disminuciones dramáticas de los niveles de estrógenos, progesterona y testosterona (Morrie et al., 1999), se produce cuando a una mujer se le extirpan los dos ovarios, es decir, doble anexectomía (GómezCalcerrada, 2012; ver tabla 1). Sin embargo, otros autores establecen la menopausia quirúrgica como el resultado de una ooforectomía bilateral, es decir, la extirpación de ambos ovarios antes de la menopausia natural (Rosenthal, 2003).

Tabla 1. Tipo de intervención quirúrgica sobre el útero y ovarios*

* Modificada de Gómez-Calcerrada, 2012. La “menopausia quirúrgica” propicia que los síntomas físicos y psicológicos suelen ser más intensos, tempranos y se expresan de manera más crítica que durante la manopausia natural, debido a la ausencia de adaptación biológica del organismo. En este caso, la calidad de vida de la mujer se ve más afectada con respecto a las que 15

presentan menopausia natural; la sintomatología se ve complicada aún más si la ooforectomía se realizó para tratar o para prevenir alguna enfermedad neoplásica (Alba-Maldonado, 2007), como puede ser después de la terapia del cáncer o el resultado de un fallo ovárico después de una histerectomía (Rosenthal, 2003). Las mujeres con menopausia quirúrgica también parecen tener un mayor riesgo de enfermedades del corazón, fractura de cadera y otros resultados adversos para la salud como consecuencia de la falta de estrógenos. El envejecimiento cognitivo también se ve agravado, aunque se ha explorado con poca frecuencia (Henderson et al., 2007).

Las mujeres que sufren la menopausia quirúrgica deben ser tratadas como un grupo diferente. En estas mujeres influyen una serie de factores diferentes respecto a los encontrados en las mujeres con menopausia natural. En primer lugar, suelen ser de menor edad, como se mencionó anteriormente, precisan tratamiento hormonal sustitutivo con más frecuencia por la aparición de más complicaciones (osteoporosis, sofocos, por ejemplo), además de ser pacientes que han sido intervenidas por alguna enfermedad de mejor o peor pronóstico, pero que, en cualquier caso supone una fuente de estrés adicional. En general, el riesgo de presentar trastornos afectivos es mayor en estos casos que en la menopausia natural (Chinchilla-Moreno, 2008). Además de los cambios hormonales bruscos, las mujeres que se someten a la menopausia quirúrgica presentan problemas como la agitación, el insomnio, la ansiedad no específica, fobias, trastornos psicosomáticos y problemas psicosexuales, los cuales se han reportado después de la histerectomía y ooferectomía (Llaneza et al., 2012). Tratamientos de los trastornos asociados con la menopausia Los tratamientos para la sintomatología de la menopausia se dividen en farmacológicos y no farmacológicos. La intervención farmacológica más extendida es la terapia de reemplazo hormonal, pero también algunos antidepresivos y ansiolíticos benzodiacepinicos son utilizados. Dentro de los tratamientos no farmacológicos se encuentran los tratamientos psicológicos, y los tratamientos alternativos a la terapia de reemplazo hormonal (Gómez-Calcerrada, 2012) como lo son terapias a base de acupuntura; electropuntura e inserción superficial de agujas (Castellanos-López et al.,

16

2005); sin embargo, estos últimos estudios carecen de investigaciones controladas que validen su utilidad.

Uno de los factores de riesgos más reconocidos después de la menopausia es el hipoestrogenismo, al caer los estrógenos se eleva el colesterol de baja densidad (LDL) y disminuye el colesterol de alta densidad (HDL); esto favorece la formación de las placas de ateroma y la progresión de la ateroesclerosis coronaria; con ello, las enfermedades cardiovasculares se incrementan en forma sustancial en este período de la vida de la mujer (Salvador, 2008). Las características más importantes del efecto protector de la terapia con estrógenos son: menor morbilidad y mortalidad por cardiopatía isquémica en mujeres, disminuyendo la enfermedad después de la menopausia. Los estrógenos participan en el metabolismo de los lípidos y las lipoproteínas. La mayor parte de los estudios experimentales han demostrado que los estrógenos previenen el depósito de colesterol en la capa íntima de las arterias (Basavilvazo-Rodríguez et al., 2007), favorecen la función endotelial y la vasodilatación en las arterias sanas (Franco et al., 2003). El mecanismo protector de los estrógenos se debe a su efecto antioxidante en las LDL (Basavilvazo-Rodríguez et al., 2007).

Los medicamentos destinados para la osteoporosis postmenopáusica, se dividen en dos categorías: inhibidores de la resorción ósea y estimulantes de la formación ósea. En la primera categoría se encuentran los estrógenos, la calcitonina y los bifosfonatos (Botell-Lugones, 2001). Otros tratamientos incluyen la terapia de reemplazo hormonal, ranelato de estroncio y moduladores selectivos del receptor de estrógenos (SERM), tales como el raloxifeno. Varios estudios experimentales compararon los efectos de las terapias utilizadas actualmente para la osteoporosis en los animales ovariectomizados (OVX), pero los resultados fueron variables y se utilizaron diferentes dosis. Por otra parte, en la práctica clínica se ha encontrado que las mujeres que reciben tratamiento para la osteoporosis requieren regímenes de dosificación a largo plazo que no ofrecen ningún alivio sintomático y pueden causar efectos secundarios, incluidos pérdida progresiva de la masa ósea, y una disminución en la mineralización del tejido óseo (Bitto et al., 2008). Estos cambios, entre otros, pueden comprometer la resistencia 17

ósea, la cual conduce a un aumento del riesgo de fractura (Cano et al., 2008) y de otras enfermedades crónicas (Bitto et al., 2008).

Hay una serie de similitudes entre la pérdida ósea inducida por la ovariectomía en ratas y la generada por menopausia en la mujer. Diversos estudios han examinado los efectos de las isoflavonas sobre el hueso en ratas intactas y ovariectomizadas, sin embargo, la interpretación se ve obstaculizada por la variedad de formas en que la dosis de isoflavonas utilizadas ha sido reportada en la literatura. En algunos casos, la dosis de isoflavona se reporta como la cantidad de isoflavonas por kilogramo de dieta, en otros, como la cantidad de isoflavonas consumidas por Kg de peso corporal de la rata. Aunque ambos métodos son válidos, es difícil hacer comparaciones entre los ensayos, a menos que se proporcione información de apoyo como la cantidad de alimentos consumidos por los animales por día o el peso corporal de los animales (Poulsen et al., 2008).

En un estudio se compararon los efectos de la genisteína (5 mg/kg), el estradiol (0.1 mg/kg) y el raloxifeno (5 mg/kg) sobre el sistema esquelético en la rata OVX. La deficiencia de estrógenos resultó en el deterioro de la mineralización ósea y las propiedades mecánicas del hueso, mientras que la genisteína aumenta el efecto perjudicial de la deficiencia de estrógenos en la resistencia ósea. Es decir, no existieron efectos favorables de la genisteína sobre la mineralización ósea y propiedades mecánicas en ratas deficientes en estrógenos, que podrían ser el resultado de sus efectos sobre la expresión osteoblástica de las enzimas que participan en la mineralización ósea (Śliwiński et al., 2009).

La dehidroepiandrosterona (DHEA) ha sido considerada como una hormona alternativa para la terapia de remplazo de estrógenos, debido a sus efectos antioxidantes y metabólicos. DHEA y su forma sulfatada (DHEAS) son las hormonas más abundantes derivadas del colesterol en los seres humanos y sus concentraciones plasmáticas

disminuyen

progresivamente

con

la

edad.

Las

ratas

hembras

ovariectomizadas presentan disfunción endotelial y presión arterial elevada (REF). Por 18

lo tanto, DHEA evoca mecanismos benéficos que podrían reducir la disfunción endotelial y reducir el riesgo cardiovascular presente después de la menopausia quirúrgica en ratas (Gabriel-Camporez et al., 2011). Por lo general, la menopausia se asocia con una reducción en los niveles de endorfinas que se cree que está involucrado en la patogénesis del trastorno de estado de ánimo.

La razón para la mejora del estado de ánimo puede ser un aumento en los niveles de endorfina en plasma, que ha demostrado ser inducida con el uso de tibolona, la cual tiene efectos positivos en el estado de ánimo en comparación con un placebo (Karageyim-Karşıdağ et al., 2012). Estos hallazgos son compatibles con los resultados de otros estudios los cuales informan que la depresión y trastornos de estado de ánimo preexistente se han reducido de manera significativa por la tibolona, mientras que el estrógeno conjugado (0.625 mg) combinado con medrogestona secuencial parecía ser menos influyente (Fernández-Hernández, 2011). Sin embargo, los efectos de la tibolona en la mejora de los síntomas de ansiedad se sugieren como alternativa cuando se tienen en cuenta los posibles efectos secundarios de la combinación de estrógeno y progesterona o estrógenos solos (Karageyim-Karşıdağ et al., 2012).

Para el tratamiento farmacológico de la ansiedad en la menopausia se emplean sustancias que actúan a diferentes niveles de la neuroquímica cerebral. Las más utilizadas son las que ejercen efectos sobre el sistema GABAérgico, como las benzodiacepinas, las más recetadas son el diacepam, el oxacepam y el clonacepam. Otros fármacos que ejercen efectos ansiolíticos son los antidepresivos tricíclicos como la imipramina; los inhibidores selectivos de la recaptura de serotonina como la fluoxetina y la fluvoxamina; los agonistas de los receptores 5-HT1A como la buspirona y la gepirona, y los inhibidores de la enzima monoamino-oxidasa como la fenelzina. (Hernández-Figueroa, 2007). Por otro lado, en la rata, la administración de una dosis de estradiol de 0.09 mg/kg produce efectos de tipo ansiolítico, caracterizado por un mayor tiempo de permanencia en el compartimento iluminado, en el modelo de luz/oscuridad, y un efecto antidesesperanza, caracterizado por una disminución de la inmovilidad en el nado forzado, en comparación con un grupo control (Walf et al., 2009). 19

Finalmente, las hormonas y algunos neuroesteroides como el estradiol, la progesterona y la alopregnanolona también ejercen de manera directa o indirecta algunas de sus acciones sobre el sistema GABAérgico, lo que explica su participación en la regulación de la ansiedad y la depresión asociadas con las oscilaciones hormonales en el ser humano y en animales de experimentación (Hernández-Figueroa, 2007). Tanto la ansiedad como la depresión o la combinación de ambas son trastornos psicológicos comunes en las mujeres con menopausia natural o quirúrgica (Zhou et al., 2012). Se ha demostrado que la transición menopáusica se asocia con un mayor riesgo de depresión recurrente (Benicio et al., 2008); precedida en varios casos por ansiedad que puede desembocar en depresión mayor (Rodríguez-Landa et al., 2006; Chasquibol et al., 2003).

Generalidades de los fitoestrógenos El término fitoestrógeno se utiliza generalmente para definir una clase de compuestos esteroideos de origen vegetal o metabólicamente derivados a partir de precursores vegetales (Bedell et al., 2014). Tienen una estructura difenólica heterocíclica común a la cual se encuentran unidos grupos oxo, ceto, hidroxi y ésteres de metilo que le dan la actividad biológica específica. Su estructura bioquímica presenta una similitud con el anillo básico de los estrógenos, el ciclopentanoperhidrofenantreno, lo cual hace que sean afines con los receptores de estrógenos (Díaz-Yamal et al., 2009), aunque débilmente en comparación con los estrógenos naturales o sintéticos (Alonso et al., 2010). El interés en el papel fisiológico de estos compuestos bioactivos presentes en las plantas ha aumentado en la última década, los datos de estudios en animales o in vitro proporcionan mecanismos para explicar cómo los fitoestrógenos pueden influir en los estados fisiológicos y emocionales dependientes de hormonas (Cassidy, 2003).

Los

fitoestrógenos

evaluados

mediante

modelos

animales

y

en

las

investigaciones clínicas ejercen efectos protectores contra diversos tipos de cáncer dependientes de hormonas (por ejemplo, de mama y de próstata), enfermedades cardiovasculares, la osteoporosis y alivian los síntomas de la menopausia, como los 20

sofocos (Lephart et al., 2004). Se ha demostrado que los fitoestrógenos incluidos en los alimentos pertenecen a una de tres clases: isoflavonas, lignanos o coumestanos (Figura 2). Las isoflavonas se encuentran en las semillas de plantas de la familia de las leguminosas como las semillas de soya y sus derivados de la fuente dietética. Los lignanos se encuentran en los alimentos ricos en fibra como los cereales no refinados, el salvado y los frijoles, la linaza contiene la cantidad más grande. Los alimentos que contienen la mayor cantidad de isoflavonas incluyen brotes de alfalfa y de trébol, cantidades menores también se encuentran en guisantes, frijoles pintos y frijoles de lima (Bedell et al., 2014). Las isoflavonas son fitoestrógenos con potente actividad estrogénica; entre ellas están la genisteína, daidzeína y gliciteína que son las isoflavonas más activas que se encuentran en la soya (Vitale et al., 2012).

Figura 2. Clasificación de los fitoestrógenos. Traducida de Button et al., 2004. 21

La genisteína tienen similitud en la estructura con la hormona humana estradiol (figura 3) y se puede unir a los receptores α y β de los estrógeno (figura 4), además de imitar la acción de los estrógenos sobre órganos diana. Algunos estudios clínicos reportan beneficios de la genisteína y la daidzeína en la quimioprevención del cáncer de mama, la enfermedad cardiovascular (arteriopatía coronaria y la enfermedad vascular cerebral) y la osteoporosis, así como en el alivio de los síntomas climatéricos emocionales (Vitale et al., 2012). La capacidad de las isoflavonas para prevenir el cáncer y otras enfermedades crónicas en gran medida depende de las propiedades farmacocinéticas de estos compuestos, en particular, la absorción y distribución en el tejido diana (Navarro-Moll et al., 2006).

Figura 3. Estructura bioquímica del 17β-estradiol y la genisteína. Tomada de DíazYamal et al., 2009. Aunque no se conoce exactamente su mecanismo de acción, los fitoestrógenos han sido clasificados en el grupo de moduladores del receptor a estrógenos (SERM) por su perfil farmacológico. Su forma de unión al receptor de estrógenos hace que tengan una acción específica a nivel del ADN; por lo tanto, tienen efectos estrogénicos y antiestrogénicos. Esta selectividad está dada por las proteínas adaptadoras a nivel del complejo hormona-receptor (Díaz-Yamal et al., 2009). La similitud de los fitoestrógenos y el estradiol permite su unión al receptor estrogénico (Rueda-Beltz et al., 2003).

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Figura 4. Distribución anatómica de los receptores α y β de estrógenos en la mujer. Traducida de Biloni, 2010. La unión de las isoflavonas a los receptores estrogénicos da lugar a la formación de un complejo ligando-receptor capaz de inducir la actividad transcripcional correspondiente (figura 5). Sin embargo, su afinidad es notablemente menor que la del estradiol, siendo baja para los receptores α, y de mayor cuantía hacia los del tipo β. Esta circunstancia condiciona una mayor acción de las isoflavonas en los tejidos en los que los receptores tipo β, es decir en sistema nervioso central, hueso y pared vascular. No obstante, actúan también mediante otros mecanismos no mediados por los receptores estrogénicos, entre los que destacan su efecto inhibitorio sobre numerosas enzimas implicadas en procesos como son su actividad antioxidante, entre otros (Navarro-Moll et al., 2006).

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Fitoestrógeno

Estradiol Receptores de estrógenos

Núcleo

Promotor Transcripción

Traducción

Respuesta de células Proliferación Diferenciación sexual

Figura 5. Mecanismo de acción de los fitoestrógeno. ERE = elementos de respuesta a estrógenos. Líneas negras: mecanismo de acción del estradiol. Líneas gris mecanismos de acción de los fitoestrógenos. Tomada de Renata-Márquez, 2012. La menor actividad transcripcional de las isoflavonas queda parcialmente compensada por el hecho de que presentan una mayor afinidad por los receptores beta que el propio estradiol, ya que la fracción circulante libre de este último es tan sólo de un 4-5%, en tanto que en las Isoflavonas es superior al 50%, y su unión a las proteínas plasmáticas es menos fuerte que la del estradiol (Navarro-Moll et al., 2006). La genisteína (Stevenson, 2007), a nivel clínico produce una inhibición en la actividad osteoclástica, reduciendo la pérdida ósea en ratas ovariectomizadas (Yoon-Bok et al., 2004). Por otra parte, se ha encontrado que tiene un efecto anabólico sobre la formación ósea y la mineralización por las células óseas cultivadas, además de inhibir la resorción ósea en los tejidos femorales obtenidos a partir de ratas de edad avanzada. Por tal motivo, se ha considerado a la genisteína como un fármaco potencial para la prevención y tratamiento de la osteoporosis asociada a la menopausia (Miao et al., 2012). La genisteína in vitro relaja las arterias de la rata por un mecanismo dependiente de óxido nítrico y mejora la respuesta al dilatador acetilcolina de las arterias 24

ateroscleróticas, mejora la disfunción endotelial inducida por cualquier ooforectomía y reduce el tamaño del infarto en un modelo experimental de isquemia (Bitto et al., 2009). En ensayos preclínicos, existe controversia con respecto a los efectos de fitoestrógenos sobre el estado de ánimo. Las ratas alimentadas con una dieta rica en fitoestrógenos (200 a 600 mg/g) mostraron una reducción significativa de los indicadores sugerentes de ansiedad, en comparación con las ratas alimentadas con una dieta libre de fitoestrógeno; mientras que las ratas alimentadas con una dieta baja en fitoestrógeno (150 mg/g genisteína-daidzeína) durante 14 días emplearon menos tiempo en las interacciones sociales. Al parecer, la baja concentración de fitoestrógenos produce la inhibición de la aromatasa, que bloquea la conversión de testosterona a estradiol, mientras que, las altas concentraciones de fitoestrógenos producen acciones similares al estrógeno, lo que explica el efecto ansiolítico de fitoestrógeno en dosis más altas (Rodríguez-Landa et al., 2009).

Modelo de menopausia quirúrgica y efecto de genisteína Existen básicamente dos maneras de obtener un modelo animal de postmenopausia. La primera forma es permitiendo que el animal alcance la edad fisiológica en la cual pierde la capacidad reproductiva y presenta alteraciones bioquímicas y fisiológicas equiparables a las que presentan las mujeres en estado postmopáusico. La segunda forma, la cual también puede ocurrir en la mujer, es el resultado de la extracción quirúrgica de los ovarios por lo cual a largo plazo ocurren cambios fisiológicos y emocionales similares a los que se observan en mujeres que cursa por la postmenopáusia natural (Hernández-Aragón, 2005). Sin embargo, la desventaja de la primera forma de postmenopausia es que no se logran alcanzar los niveles muy bajos de estrógeno y en el segundo modelo la OXV carece de una fase de perimenopausia (Van Kempen et al., 2011).

Los roedores presentan ciclos ováricos de cuatro a cinco días y en cada ciclo se pueden distinguir cuatro fases: el diestro, proestro, estro y metaestro, y en cada una de ellas se pueden detectar cambios en los niveles plasmáticos de estrógenos y progesterona, encontrándose los niveles más altos durante el proestro y los más bajos 25

en el diestro. Al acercarse el envejecimiento reproductivo, alrededor de los 9-15 meses de edad, se inicia una etapa denominada estropausia, que se caracteriza por ciclos irregulares y niveles plasmáticos elevados de estradiol, lo que conduce a los animales a “estacionarse” en la etapa de estro durante un periodo largo. Después entran en un periodo llamado diestro constante en el que los niveles de hormonas disminuyen definitivamente. Considerando estos antecedentes y desde el punto de vista endocrino es evidente que la estropausia no es análoga a la menopausia y por lo tanto es necesario eliminar la secreción de estrógenos y progestinas mediante la remoción de los ovarios para tener una condición semejante a lo que ocurre en la menopausia. Una estrategia utilizada con frecuencia para reducir los niveles plasmáticos de estrógenos es la OVX. De hecho diversas evidencias muestran que la OVX induce, además de la disminución de estrógenos y progestinas, un aumento de los niveles de FSH y LH, un aumento en la temperatura corporal de la rata que es un equivalente a las alteraciones vasomotoras observadas en las mujeres perimenopáusicas “bochornos”, osteoporosis y un aumento en la ansiedad experimental; por lo que la OVX puede ser considerado como un modelo que simula algunos aspectos de la menopausia quirúrgica (EstradaCamarena, 2012).

En ratas, la ausencia a largo plazo de las hormonas ováricas inducida por la OVX se ha propuesto como un modelo de principios de postmenopausia, sin embargo, la OVX elimina abruptamente las hormonas ováricas, en oposición a la disminución gradual detectada en las mujeres menopaúsicas. Por lo tanto, la OVX en ratas está más cerca de considerarse un modelo de ooforectomía en los seres humanos, más que de menopausia. Sin embargo, la OVX ha permitido el estudio de algunas alteraciones que se producen después de la menopausia, tales como la osteoporosis y cambios en la sensibilidad del receptor GABA y dopaminérgico en el cerebro. Además, existen estudios en donde se evaluó el efecto a largo plazo de la ovariectomía sobre los indicadores de la ansiedad, en ratas que fueron sometidas a prueba de enterramiento defensivo (Picazo et al., 2006).

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Las ratas con doce semanas postovariectomia mostraron mayores indicadores de ansiedad que las ratas con tres semanas de postovariectomia. Estas observaciones apoyan la hipótesis de que las ratas con ausencia crónica de las hormonas ováricas, podrían ayudar a comprender los cambios de humor típicos de la menopausia de la mujer (Rodríguez-Landa et al., 2009). Las hormonas ováricas ejercen efectos antidepresivo, ansiolítico y beneficios cognitivos en varios estudios con animales ovariectomizados (Rahbi et al., 2013). Se asume que el estado emocional de ansiedad en humanos es equivalente a la respuesta de miedo en animales, por lo cual, las investigaciones con modelos animales permiten imitar los procesos psicológicos normales y anormales como síntomas o síndromes psicopatológicos humanos, debido a que algunos mecanismos básicos son compartidos entre las diferentes especies (Polanco et al., 2011).

En un estudio reciente se evaluó el efecto del fitoestrógeno genisteína en un modelo de post-menopausia quirúrgica en ratas de la cepa Wistar. En este estudio se encontró que diferentes dosis del fitoestrógeno genisteína (0.25, 0.5 y 1.0 mg/kg) incrementaron el tiempo de permanencia en el compartimiento iluminado en el modelo experimental de ansiedad luz/oscuridad, además de incrementar el número de cruces y de asomadas al compartimiento iluminado, lo cual, a nivel experimental es un indicador de un efecto ansiolítico. El efecto producido por la genisteína fue equiparable al efecto producido por el diazepam, un fármaco clínicamente eficaz como ansiolítico (RodríguezLanda et al., 2007); un efecto que es mediado por los receptores β-estradiol (Rodríguez-Landa et al., 2012). Teniendo en cuenta que los fitoestrógenos, y en particular la genisteína tienen una alta afinidad por los receptores de β-estradiol, se sugiere que esta interacción sustrato-receptor puede tener un papel causal en el efecto tipo ansiolítico (Navarro-Moll et al., 2006).

Por otro lado, la genisteína en líneas celulares humanas muestra efectos proliferativos y antiproliferativos dependiendo de la dosis. En líneas celulares de cáncer de mama, los receptores de estrógenos tienen efectos bifásicos y dependen de la concentración; así a altas concentraciones inhibe el crecimiento celular y a bajas 27

concentraciones lo estimula. Además, las isoflavonas promueven el almacenamiento de calcio, favorecen la disminución de la excreción de calcio debido al bajo contenido de aminoácidos sulfurados en la soya; y aumento de la densidad ósea debido a la acción de la genisteína y daidzeína sobre osteoblasto y osteoclastos, en el sentido de estimular a los primeros e inhibir a los segundos (Espitia de la Hoz, 2010). Los estudios aleatorizados disponibles muestran cómo dosis de isoflavonas de entre 34-100 mg/día consiguen mejorías en dicha sintomatología, mejorías que se traducen en una reducción considerable de los sofocos, presentes en la mujer menopáusica (GonzálezJiménez et al., 2010).

En resumen, los datos antes señalados sugieren efectos farmacológicos de la genisteína semejantes al estradiol producido de forma natural por los animales, a través de mecanismos neurobiológicos que involucran a los receptores de estrógenos; principalmente los β. Sin embargo, se carece de estudios controlados que comparen dosis equiparables de ambas sustancias en un modelo experimental de ansiedad; lo cual requiere ser explorado con la finalidad de extender la información sobre las propiedades estrogénicas de la genisteína y su relación con la regulación del estado emocional en ratas con ausencia crónica de hormonas ováricas.

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PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Diversos estudios in vitro e in vivo han mostrado que el fitoestrógeno genisteína ejerce efectos similares al 17β-estradiol. En este sentido, se ha sugerido que la genisteína podría ser de utilidad en el control de las alteraciones del estado emocional asociadas con la menopausia natural o quirúrgica, donde hay un descenso de las concentraciones de estradiol y otras hormonas. En efecto, utilizando a la rata ovariectomizada como un modelo de “menopausia quirúrgica” se ha identificado que tanto el estradiol como la genisteína ejercen efectos de tipo ansiolíticos. Sin embargo, esos estudios no permiten comparar los efectos producidos por ambas sustancias, debido a los diferentes esquemas de tratamiento, dosificación, vías de administración y edades de los animales, lo que limita ponderar cuales son los beneficios reales de la genisteína sobre el estradiol en el control de la ansiedad. Es por ello que en el presente estudio se compararon tres dosis equiparables de estradiol y genisteína sobre los indicadores de ansiedad en ratas con ausencia crónica de hormonas ováricas, con la finalidad de identificar si hay alguna ventaja de alguno de ellos sobre el control de la ansiedad a nivel experimental.

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HIPÓTESIS Dosis semejantes de 17β-estradiol y de genisteína ejercen efectos ansiolíticos similares en la rata Wistar ovariectomizada.

OBJETIVOS Objetivo general Demostrar que el perfil ansiolítico del fitoestrógeno genisteína es semejante al del estradiol en un modelo de menopausia quirúrgica en la rata Wistar.

Objetivos específicos Comparar con un estudio dosis-respuesta los efectos conductuales de tres dosis semejantes de 17β-estradiol y del fitoestrógeno genisteína en el laberinto de brazos elevados en ratas con 12-semanas postovariectomia.

Descartar efectos sobre la actividad motora espontanea de tres dosis semejantes de 17β-estradiol y del fitoestrógeno genisteína en el campo abierto.

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MATERIAL Y MÉTODO Ética Todas las manipulaciones experimentales fueron realizadas siguiendo estrictamente las recomendaciones del Código Ético para el Personal Académico del Instituto de Investigaciones Biomédicas de la UNAM (2007), de la la Guía para el Cuidado y el Uso de Animales de laboratorio (1996) promulgada por The National Institute of Health, así como de la legislación mexicana (NOM-062-ZOO-1999). Sujetos experimentales Se utilizaron 56 ratas hembras de la cepa Wistar con un peso aproximado de 200-250 gramos al inicio de los experimentos. Las ratas se mantuvieron en cajas de acrílico (44 x 33 x 20 cm) bajo condiciones estándar de bioterio (5-4 ratas por caja), con ciclo de luz/oscuridad de 12/12 horas, la fase de luz iniciaba a las 7:00 am. Las ratas tuvieron acceso ad libitum al agua y al alimento. La “cama” de las cajas (viruta fina de madera) fue reemplazada por una limpia cada tercer día. Ovariectomía Para producir el modelo de postmenopausia quirúrgica, las ratas fueron OVX por aproximación ventral y se esperaron 12 semanas para iniciar los tratamientos, de acuerdo a lo encontrado por Picazo et al., (2006). Para la ovariectomia, las ratas fueron anestesiadas con pentobarbital sódico (50 mg/kg, i.p.), previa administración de sulfato de atropina (0.03 mg/kg, i.p.). Una vez anestesiada, la rata fue rasurada en la parte ventral, para realizar una incisión longitudinal sobre la piel, de aproximadamente 5 mm, mediante una tijera recta de punta fina. Una vez realizada la incisión sobre la piel se procedió a separar la piel del músculo, sobre el músculo se realizó una incisión de aproximadamente 5 mm separando las fibras musculares sin cortarlas. Mediante una pinza curva para disección se identificaron los oviductos y se extrajeron, para localizar los ovarios, los cuales fueron ligados por separado y seccionados, a un 1 cm del ovario. Al finalizar la ovariectomía, se procedió a suturar el músculo y posteriormente la piel. Se limpió la herida con solución salina y se aplicó cloruro de benzalconio como antiséptico. Las ratas se dejaron en recuperación, una vez que aseguramos que no había hemorragia o alguna alteración conductual, fueron regresadas a su cajas de 31

estancia donde se mantuvieron por un periodo de 12 semanas para iniciar los tratamientos farmacológicos. Grupos experimentales Se realizó un estudio transversal con siete grupos independientes de ratas con 12 semanas post ovariectomía (n=8 cada grupo). Un grupo control recibió el vehículo (solución salina 0.9), tres grupos más recibieron dosis crecientes (0.045, 0.09 y 0.18 mg/kg) de estradiol y los otros tres grupos recibieron las mismas dosis (0.045, 0.09 y 0.18 mg/kg) pero del fitoestrógeno genisteína. Los tratamientos fueron administrados por vía subcutánea durante siete días consecutivos, cada 24 horas. Las dosis fueron seleccionadas de acuerdo a estudios en los cuales se ha demostrado que 0.09 mg/kg de E2 producen efectos ansiolíticos a nivel experimental (Walf et al., 2010). A partir de esa dosis, se decidió explorar la mitad y el doble de esta dosis, para compararlas con el efecto de dosis semejantes de genisteína. Los efectos fueron evaluados en el modelo de laberinto de brazos elevados y la prueba de actividad locomotriz en campo abierto, una hora después de la última administración de los tratamientos. Laberinto de brazos elevados El laberinto de brazos elevados (figura 6), fue construido con madera y situado en un cuarto tenuemente iluminado (40 lux). El aparato consistió en una cruz de dos brazos abiertos (sin paredes) y dos brazos cerrados (con paredes), los brazos fueron pintados de blanco y negro, respectivamente. Las dimensiones de los brazos abiertos fueron de 50 cm  10 cm (longitud  ancho), y los brazos cerrados 50 cm  10 cm x 40 cm (longitud  ancho x altura). El laberinto fue elevado a 50 cm sobre el nivel del suelo. Las ratas fueron colocadas individualmente en el centro del laberinto, con la cabeza orientada hacia un brazo abierto. La prueba tuvo una duración de 5 min y se evaluaron las siguientes variables: a) tiempo de permanencia en los brazos abiertos (s), b) número de entradas a los brazos abiertos (n), c) el número total de entradas a los brazos y d) el porcentaje de entradas a los brazos abiertos. Después de la sesión experimental de cada animal, el laberinto se limpió con solución etanólica al 5% y papel limpio y seco. Al finalizar la prueba en el laberinto, se 32

evaluó la actividad motora espontánea en la prueba de actividad locomotriz en campo abierto.

Figura 6. Prueba de laberinto de brazos elevados, prueba para evaluar la ansiedad experimental. Prueba de actividad locomotriz en campo abierto La prueba consistió en colocar a la rata, individualmente, durante 5 min en una caja de acrílico opaca (44 x 33 cm de base y 20 cm de altura), cuyo piso estuvo dividido en cuadros de 11 x 11 cm (figura 7). En esta prueba se evaluó el número de cuadros cruzados, tomando como criterio cuando la rata pasó al menos tres cuartas partes de su cuerpo de un cuadro a otro. Esta prueba se utilizó para descartar que los datos obtenidos en el laberinto de brazos elevados pudieran estar relacionados con cambios en la actividad locomotora generalizada (p. ej. hiperactividad o hipoactividad motora) y no con un efecto sobre el estado emocional del animal.

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Figura 7. Prueba de actividad locomotriz en campo abierto. Análisis estadístico Todos los datos fueron analizados estadísticamente por medio de ANOVA de una vía para grupos independientes, considerando al tratamiento como único factor. Cuando la ANOVA mostró valores de p≤ 0.05, se aplicó la prueba post hoc de StudentNewman-Keuls. Los resultados se presentan como la media ± el error estándar de cada variable evaluada.

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DIAGRAMA DE TRABAJO 56 ratas ovariectomizadas de la cepa Wistar (200-250 gramos)

12 semanas después de la ovariectomía

Siete días de administración con cada dosis

Vehículo (n=8)

Estradiol 0.045 mg/kg

Estradiol 0.09 mg/kg

Estradiol 0.18mg/kg

Genisteína 0.045 mg/kg

Genisteína 0.09 mg/kg

Genisteína 0.18 mg/kg

Laberinto de brazos elevados

Actividad locomotriz en campo abierto

Análisis estadístico ANOVA de una vía, post hoc de Student-Newman-Keuls.

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RESULTADOS Prueba de laberinto de brazos elevados Tiempo de permanencia en los brazos abiertos El análisis del tiempo de permanencia en los brazos abiertos en el laberinto de brazo elevados, reveló diferencias significativas entre tratamientos [F(6,49)=15.802, p